Análises de diversidade em feijão comum (Phaseolus vulgaris L.), envolvendo caracteres morfológicos e marcadores moleculares, têm mostrado uma estruturação em dois pools gênicos principais, um Mesoamericano e outro Andino, os quais diferem, dentre vários aspectos, quanto à morfologia e fisiologia do grão. Uma nova abordagem que vem sendo usada para estimar a variabilidade genética entre acessos de feijoeiro é a prospecção de polimorfismos de base única (SNPs), tanto em sequências arbitrárias do genoma quanto em sequências gênicas de interesse. Também, o estudo de sequências nucleotídicas que codificam proteínas importantes, tais como a faseolina e a ferro redutase, codificadas, respectivamente, pelos genes Phs e FRO1, deve permitir a geração de novos e informativos marcadores e promover um melhor entendimento da variação existente em P. vulgaris. Assim, os objetivos deste trabalho foram obter as sequências dos genes - Phs e FRO1, acessar a frequência de SNPs em regiões codantes e não-codantes de ambos os genes, e avaliar a utilidade desses polimorfismos para investigar a diversidade genética em 31 genótipos cultivados de feijão comum e um acesso de P. lunatus. Para tanto, primers específicos foram desenhados e as sequências obtidas foram alinhadas, permitindo a identificação de vários sítios polimórficos. Parâmetros moleculares foram estimados pelo software Arlequin e MEGA. As análises de agrupamento foram conduzidas através do método Neighbor-joining. Foram detectadas 361 bases polimórficas, das quais 260 foram do tipo substituição e 101, indel. A frequência de SNPs em regiões não codantes foi duas vezes maior do que em regiões traduzidas, em ambos os genes; também, a substituições do tipo transição foram mais freqüentes do que as do tipo transversão. Os polimorfismos em regiões codantes levaram à substituição de 17 aminoácidos na proteína faseolina, e 14 na enzima ferro redutase. Tais modificações incluem, na maioria das vezes, alterações de aminoácidos com propriedades similares. Vale destacar que sequência predita de aminoácidos da faseolina exibiu uma diversidade elevada entre os acessos investigados, sendo que alguns desses polimorfismos se prestaram para tipificar alguns acessos. Em contrapartida, a enzima ferro redutase exibiu um padrão de aminoácidos mais homogêneo, principalmente para os acessos andinos. As análises de agrupamento revelaram dois clusters bem definidos: um que agrupou os acessos Mesoamericanos e as cultivares brasileiras, e outro que agrupou os Andinos, sugerindo que sequências gênicas são úteis na distinção dos pools gênicos de Phaseolus. Todavia, os polimorfismos do gene -Phs permitiram uma melhor resolução das relações entre os acessos dentro de cada pool gênico, em comparação com os do gene FRO1. / Diversity analysis in common bean (Phaseolus vulgaris L.), based on morphological traits and molecular markers, has revealed the existence of two major gene pools, the Mesoamerican and Andean pools, which differ in several features, including the grain morphology and physiology. A novel approach to estimating genetic variability is in silico mining for single nucleotide polymorphisms (SNP). Arbitrary genome sequences as well as genic sequences were used for this purpose. Additionally, the investigation of nucleotide sequences that code for important proteins, such as phaseolin and iron-reductase, encoded respectively by the Phs and FRO1 genes, should allow new and informative markers to be generated, helping us to gain a better understanding of intraspecific variation in P. vulgaris. Therefore, the aims of this study were to sequence the -Phs and FRO1 genes, to assess SNP frequencies in coding and non-coding regions of both genes, and to assess the possible use of these polymorphisms for investigating the genetic diversity of 31 cultivated genotypes of common bean and one of P. lunatus. Specific primers were designed and the sequences obtained were aligned, allowing us to identify several polymorphic sites. Molecular parameters were estimated using the Arlequin and MEGA software packages. Cluster analyses were conducted using the neighborjoining method. We detected 361 polymorphic sites, consisting of 260 base substitutions and 101 indels. The frequency of SNPs in non-coding regions was twice the frequency in translated regions in both genes. In addition, the occurrence of base transitions was higher than transversions. Polymorphisms in coding regions lead to 17 amino acid substitutions in the phaseolin protein and 14 in the iron reductase enzyme. Most substitutions of this kind include changes that preserve the respective protein functions. The predicted amino acid sequence of phaseolin exhibited high diversity, and some polymorphisms allowed us to typify some accessions. In contrast, the iron reductase enzyme exhibited a more homogeneous pattern of amino acids, especially in the Andean accessions. Cluster analyses revealed two well-defined clusters, one containing the Mesoamerican accessions with the Brazilian cultivars, and another containing the Andean accessions, suggesting that gene sequences are useful for distinguishing the Phaseolus gene pools. Interestingly, the polymorphisms detected in the -Phs gene allowed better visualization of the relationships between accessions in the same pool, in comparison to FRO1.

Estudos de variações genéticas raras têm caracterizado com sucesso regiões do genoma e processos biológicos envolvidos no risco de desenvolver transtornos psiquiátricos. Dentro deste contexto, o sequenciamento de nucleotídeos em larga escala de exons do genoma inteiro para a observação de variações raras, conhecidas em inglês como single-nucleotide variation (SNV), e mutações espontâneas (\"de novo\" - DNM) tornou-se uma abordagem essencial na descoberta de novos genes de risco para transtornos psiquiátricos. Até o presente momento, nenhum estudo de SNV e variações de novo com sequenciamento de todas as regiões codificantes foi relatado no transtorno obsessivo-compulsivo (TOC). No presente estudo, este sequenciamento foi feito em 20 casos esporádicos de TOC e seus pais, para investigar a presença de variações raras de novo e herdadas nos probandos. A partir da observação de que os produtos de genes (proteínas) associados a uma mesma doença interagem em uma rede de interação proteína-proteína (IPP), foi feita uma rede de IPP com os genes (proteína) que apresentaram variações de novo não sinônimas, para observar dentre estes genes o de maior importância na rede de IPP. A fim de investigar a relevância desta rede, foi aplicado um algoritmo de grau informativo para redes, baseado na priorização de genes relacionados com doenças (Degree-Aware Algorithms for Network-Based Disease Gene Prioritization - DADA) que ordenou os genes com variações de novo não sinônimas, embasado na associação destes com uma lista de genes envolvidos em conferir risco para TOC provenientes de uma meta-análise de genética em TOC. Além disso, foi feita uma análise de processos biológicos envolvidos com os genes que apresentavam variações raras herdadas. No total, 10 variações de novo não sinônimas (9 missense e 1 nonsense) foram validadas utilizando-se o sequenciamento Sanger. Os genes WWP1, AP1G1 e CR1, advindos da lista inicial de genes com variações não sinônimas, foram altamente conectados na rede de IPP. O gene WWP1 foi o gene com maior pontuação no ranking de resultados do algoritmo DADA. Os resultados de processos biológicos envolvendo estes genes sugerem o envolvimento do sistema imunológico em TOC. Além disso, todos os genes com variações de novo não sinônimas, exceto um, são genes com expressão no cérebro e envolvidos com sinaptogênese e morte neuronal / Studies of rare variations have been used successfully to characterize regions of the genome and molecular pathways conferring risk for developmental neuropsychiatric disorders. Within this context, whole-exome sequencing for rare single-nucleotide variation (SNV) and de novo mutation (DNM) mutation has become an essential approach for gene discovery in psychiatric disease. To date, few if any studies of SNVs and de novo variation using this technology have been reported for obsessive-compulsive disorder (OCD). In the present study, all coding regions of the genome were sequenced for 20 sporadic probands with OCD and their parents, to investigate de novo and inherited rare variations in probands. Subsequently, based on the observation that the products of genes associated with similar diseases are likely to interact with each other heavily in a network of proteinprotein interactions (PPIs), a PPI network was generated, with the genes (protein) with non-synonymous de novo variation, to observe the most important genes in the network. To investigate the relevance of this network to OCD further, degree-aware disease gene prioritization (DADA) was applied, to rank all genes with non-synonymous de novo variation based on their relatedness to a set of genes previously identified in an OCD genetics meta-analysis. In addition, pathway analyses using de novo and inherited variation were completed. Altogether, 10 non-synonymous de novo variations (9 missense, 1 nonsense) were successfully validated by Sanger sequencing. We found that the genes WWP1, AP1G1 and CR1, from the initial non-synonymous de novo variation gene list, were highly interconnected in the PPI. The WWP1 gene had the highest rank in the DADA analyses. Results of the pathway analyses suggest the enrichment of genes involved in immunological systems. In short, almost all genes involved in the DNMs of the present study are expressed in the human brain and implicated in synaptogenesis and neuronal apoptosis

Aproximadamente 4% das pacientes com câncer de mama têm o diagnóstico abaixo dos 36 anos. Mutação germinativa nos genes BRCA1 ou BRCA2 pode ser um dos fatores de predisposição e a identificação de pacientes carreadoras pode permitir o direcionamento do tratamento e o aconselhamento familiar para medidas de prevenção e detecção precoce. Entretanto, a maioria das pacientes apresenta câncer esporádico e fatores predisponentes são menos evidentes. Para estas pacientes, a identificação de mutações somáticas pode permitir a melhor compreensão da biologia da doença e o desenvolvimento de tratamentos dirigidos a alvos moleculares. Assim, nossos objetivos foram avaliar em pacientes jovens com câncer de mama: história familiar, hábitos de vida, mutação germinativa nos genes BRCA1 e BRCA2 e mutações somáticas no tumor. Oitenta e três pacientes diagnosticadas com câncer de mama entre 18-35 anos foram entrevistadas usando um questionário. O DNA foi extraído do sangue periférico e toda região codificadora dos genes BRCA1/2 foi sequenciada pelo método de sequenciamento de Sanger e a pesquisa de grandes deleções e inserções foi realizada por Amplificação Dependente da Ligação de Múltiplas Sondas (MLPA). Os resultados foram analisados utilizando-se os programas Mutation Surveyor v.3.20 e Chromas version 2.13 e as mutações foram caracterizadas utilizando-se os bancos de dados BIC, LOVD, LOVD-IARC, UMD e ClinVar. O sequenciamento completo do exoma foi realizado em amostras de sangue e tumor fresco congelado de oito pacientes (receptor hormonal positivo, HER2 negativo e BRCA1/2 tipo selvagem) usando Nextera Rapid Capture Enrichment e sequenciadas no Illumina HiSeq 1000. Para detecção de alterações somáticas provenientes do sequenciamento completo do exoma, foi utilizado o programa SomaticSniper (v1.0.2). Foi também analisada a presença de mutação somática no gene PIK3CA em amostras tumorais em blocos de parafina de pacientes jovens e pacientes mais idosas com câncer de mama. Além disso, foi realizada uma meta análise para avaliar se mutação somática nos cinco genes mais frequentemente mutados em câncer de mama estão associados à idade precoce. A idade mediana das 83 pacientes ao diagnóstico foi 32 anos (22-35 anos); idade mediana da menarca foi 13 anos (8-19 anos); 71,1% já passaram por pelo menos uma gestação a termo com idade mediana de 22 anos (14-34 anos); 80,7% nunca fumaram; 74,7% não ingerem bebida alcoólica regularmente; a média para índice de massa corpórea foi 25,26 (10,78-41,57). A maioria das pacientes teve diagnóstico de carcinoma ductal invasivo (89,3%), grau histológico III (49,4%), subtipo luminal (65,9%) e com expressão de Ki67 >14% (89,2%). Aproximadamente 52% das pacientes relataram história familiar para câncer de mama, ovário ou próstata. Mutações deletérias nos genes BRCA1/2 foram detectadas em 13 pacientes (BRCA1, n= 4 e BRCA2, n= 9). Uma mutação nova, que gera um códon de terminação (c.483T>A; p.Cys161Ter), foi detectada no exon 6 do gene BRCA2. O sequenciamento do exoma foi realizado em amostras de oito pacientes carreadoras de BRCA1/2 tipo selvagem e tumor subtipo luminal e revelou uma média de 39 alterações somáticas por tumor (variando entre 19-74). Foram observadas alterações com potencial driver em 53 genes, como PIK3CA, PRKD1, PRKAR1A e PIK3AP1, que codificam proteínas tirosina quinase ou proteínas envolvidas na regulação de proteínas quinases; e no gene POLD1, que codifica a subunidade catalítica da polimerase delta, com papel na replicação e reparo do DNA. Em uma meta análise observamos que a mutação somática no gene PIK3CA é relativamente frequente em pacientes jovens e idosas. Concluindo, mais de 15% das pacientes jovens são carreadoras de mutação deletéria nos genes BRCA1 ou BRCA2. Em pacientes com câncer esporádico foram encontradas mutações somáticas em genes que codificam proteínas tirosina quinase ou proteínas envolvidas em reparo de DNA. Em consonância com o observado em tumores de pacientes mais idosas, mutação somática no gene PIK3CA é relativamente frequente em tumores de pacientes jovens / Approximately 4% of the breast cancer patients have their diagnosis under the age of 36 years and germline mutations in BRCA1 or BRCA2 genes is one of the predisposing factors. Identification of patients who are mutation carriers may contribute for the adoption of targeted therapies and for genetic counseling of their family members for early detection or preventive measures. However, most patients present with sporadic cancer where predisposing factors are less understood. In the latter group of patients, the identification of somatic mutations may contribute to a better understanding of the biology of the disease and to the development of molecular targeted therapies. Therefore, our goals were to characterize early onset breast cancer patients for family history, lifestyle, germline mutations in BRCA1 and BRCA2 genes and somatic mutations. Eighty-three breast cancer patients aged 18-35 years were interviewed using a questionnaire. DNA was extracted from peripheral blood and all coding regions of BRCA1/2 genes were screened by Sanger sequencing and large deletions and insertions were examined by Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA). Results were analyzed through Mutation Surveyor v.3.20 and Chromas version 2.13 and searched in BIC Database, LOVD, LOVD-IARC, UMD and ClinVar. Whole exome sequencing was performed in blood and fresh-frozen tumor samples from eight patients (hormone receptor positive, HER2 negative and BRCA1/2 wild type) using Nextera Rapid Capture Enrichment in an Illumina HiSeq 1000. To detect somatic SNVs from whole exome sequencing data, SomaticSniper (v1.0.2) was used. Somatic mutation in PIK3CA gene was then searched in Formaldehyde Fixed-Paraffin Embedded samples from another group of young and older breast cancer patients. In addition, a metaanalysis was performed to evaluate whether somatic mutations in the five genes most frequently mutated in breast cancer patients were associated with an early age onset. Median age of 83 patients at diagnosis was 32 years (22-35y), median age of menarche was 13 years (8-19y); 71.1% patients had at least one born child, median age of first pregnancy was 22 years (14-34y); 80.7% were never smokers; 74.7% reported no regular alcoholic drinking; median body mass index was 25.26 (10.78-41.57). Most patients presented with invasive ductal carcinoma (89.3%), histological grade III (49.4%), luminal subtype (65.9%) and Ki67 expression > 14% (89.2). Approximately 52% of the patients reported a positive family history for breast, ovarian or prostate cancer. Deleterious mutations in BRCA1/2 genes ware detected in 13 patients (BRCA1, n= 4 and BRCA2, n= 9). One novel mutation was detected in BRCA1 gene: a stop codon in exon 6 (c.483T > A; p.Cys161Ter). Exome sequencing was evaluated in eight luminal tumors fromBRCA1/2 wild type patients and a median of 39 somatic alterations/tumor was detected, varying from 17 to 74. Potential driver alterations were detected in 53 genes, such as PIK3CA, PRKD1, PRKAR1A and PIK3AP1, that encode tyrosine kinase proteins or proteins involved in tyrosine kinases regulation; and POLD1 gene, that encodes the catalytic subunit of DNA polymerase delta which plays a critical role in DNA replication and repair. A Meta-analysis showed that somatic mutation in PIK3CA gene was frequently detected in both young and older patients. In conclusion, more than 15% of the young breast cancer patients are BRCA1 or BRCA2 mutation carriers. In patients with sporadic cancer somatic mutations were found in genes that encode tyrosine kinase proteins or are involved in the DNA repair. In agreement with what was observed in tumors from older patients, somatic mutation in PIK3CA gene is relatively frequent in tumors from young patients

A malária causada pelo Plasmodium falciparum (P. falciparum) e a bilharzíase urogenital causada pelo Schistosoma haematobium (S. haematobium) constituem duas doenças infecciosas tropicais alarmantes, sendo ambas endêmicas no Benin. Considerando que a malária (Th1) e a esquistossomose (Th2) apresentem perfis de citocinas divergentes, na presença de co-infecção, o S. haematobium poderia modular as respostas especificamente dirigidas contra o P. falciparum. Uma vez que, os genes que codificam as moléculas nãoclássicas de histocompatibilidade (HLA-G/-E/-F) possuam propriedades imunomoduladoras, pouca atenção tem sido dedicada ao estudo desses genes em populações da África Subsaariana, que são as de maior diversidade genética. O objetivo deste estudo foi avaliar a variabilidade dos genes HLA-G/-E/-F na população Toffin do Benin, e identificar fatores genéticos de suscetibilidade/resistência à malária causada pelo P. falciparum e/ou bilharziose urogenital, usando uma coorte de crianças (de 4 a 8 anos de idade) não aparentadas. Foram avaliados os segmentos codificantes e reguladores, englobando aproximadamente 5.1 kb do HLA-G, 7.7 kb do HLA-E e 6.2 kb do HLA-F, usando sequenciamento da nova geração. As frequências alélicas e haplotípicas do HLA-G/-E/-F, a diversidade genética, a diversidade nucleotídica, o equilíbrio de Hardy-Weinberg (HW) e de Tajima\'s D foram realizados utilizando o software ARLEQUIN v3.5.2. O desequilíbrio de ligação (LD) entre sítios variáveis com frequência alélica mínima (MAF) acima de 1% foi avaliado calculando o coeficiente de correlação r2 e os gráficos de LD foram visualizados usando o software Haploview 4.2. O estudo de associação foi implementada nos softwares PLINK v1.90b4.6 e R v3.4.2, usando modelos de regressão linear ou logística múltipla. 96, 37 e 68 sítios variáveis foram detectados ao longo de HLA-G/-E- F, respectivamente. Foram identificados 16, 19 e 15 haplótipos da promotora, 19, 15 e 29 haplótipos da codificadora, 12, 7 e 2 haplótipos da região 3\' não traduzida (3\'UTR), respectivamente, e ainda, 33 , 31 e 32 haplótipos estendidos, respectivamente. Todos os haplótipos promotores/codificadores/3\'UTR respeitaram os padrões já descritos na população mundial. O HLA-E foi o mais conservado, exibindo principalmente duas proteinas (E*01:01 e E*01:03), seguido do HLA-F, três proteínas (F*01:01, F*01:02 e F*01:03) e HLA-G, quatro proteínas: três normais (G*01:01, G*01:03 eSONON, P. Resumo xi G*01:04) e uma truncada (G*01:05N). Embora os alelos do HLA-G-E/-F observados na população Toffin tenham sido os mais frequentemente observados em vários países do mundo, as frequências dos haplótipos da região codificadora foram semelhantes às descritas para outras populações africanas (Guiné-Conakry e Burkina-Faso), quando comparadas com os países não-Africanos (Brasileiros), indicando que as variações ao longo desses genes estavam presentes nos Africanos antes da dispersão humana. Foram analisados 105 polimorfismos (MAF> 5%, valor P de HW> 0.05 e qualidade de genótipos> 97%) e 56 haplótipos com frequência mínima de 5%. Consideramos significativos, apenas os resultados exibindo valores de P <0.01 para polimorfismos e valores de P <0.01 antes da correção e valores de P <0.05 após correção de Bonferroni, para haplótipos. Encontramos as seguintes associações: i) o alelo inserção de 14 pares de bases do HLA-G (14 pb Ins) (em modelo dominante) foi associado ao risco de ocorrência de infecção por P. falciparum (infecções totais como infecções sintomáticas) e ao número de episódios de infecção (número elevado de episódios de infecções totais como de infecções sintomáticas), ii) polimorfismos HLA-G (- 1155 A e +755 A, em completo LD) (em modelo recessivo), e iii) haplótipo E.01.03.05- compatível em sinergia com o alelo -1988 C do HLA-E (em modelo aditivo) foram associados à proteção contra malária (em níveis de infecção como de densidade parasitária), e iv) o haplótipo E.Promo.2 foi associado à protecção contra a co-infecção do P. falciparum em crianças infectadas por S. haematobium. Excetuando o 14 pb Ins, estudos funcionais adicionais são necessários para revelar o papel desses marcadores na expressão dos genes HLA-G, -E e -F, para entender melhor o mecanismo de associação com doenças. / Plasmodium falciparum (P. falciparum) malaria and the urogenital bilharziasis caused by Schistosoma haematobium (S. haematobium) infection constitute the two alarming tropical infectious diseases; and both are endemic in Benin. Considering that malaria (Th1) and schistosomiasis (Th2) have divergent cytokine profiles, the presence of co-infection could modulate the responses specifically directed against P. falciparum. We hypothesize that the non-classical genes and molecules (HLA-G, -E and -F) of major histocompatibility complex (MHC) could be involved in this immunomodulation. Although these molecules have well known immunomodulatory properties, little attention has been devoted to the study of these non-classical class I HLA genes in sub-Saharan African populations. This study aimed to evaluate the diversity of HLA-G, -E and -F gene variable sites in the Beninese Toffin population, and to identify susceptibility/resistance genetic factors associated with P. falciparum malaria and/or urogenital bilharziasis in a Beninese cohort of unrelated schoolaged children (4 to 8 years old). We evaluated the complete gene variability (5.1 kb for HLAG, 7.7 kb for HLA-E and 6.2 kb for HLA-F) in the Beninese Toffin population using massive parallel sequencing. HLA-G, -E and -F allele and haplotype frequencies, gene diversity, average nucleotide diversity, Tajima\'s D and Hardy-Weinberg (HW) equilibrium were performed using ARLEQUIN v3.5.2 software. The linkage disequilibrium (LD) pattern among variable sites with a minimum allele frequency (MAF) above 1% was evaluated computing the correlation coefficient r2 and the LD plots were visualized using Haploview 4.2 software. The genetic association study was implemented on PLINK v1.90b4.6 and R v3.4.2 softwares using multiple logistic or linear regression models. Overall, 96, 37 and 68 variable sites were detected along the entire HLA-G, -E and -F, respectively, arranged into regionspecific haplotypes; i.e., promoter haplotypes (16, 19, and 15, respectively), coding haplotypes (19, 15, and 29, respectively), 3\' untranslated region (3\' UTR) haplotypes (12, 7 and 2, respectively) and extended haplotypes (33, 31 and 32, respectively). All promoter/coding/3\'UTR haplotypes followed the patterns already described in worldwide populations. Among the three genes, HLA-E was the most conserved, exhibiting mainly two full-length encoded-molecules (E*01:01 and E*01:03), followed by HLA-F (three full-lengthSONON, P. Abstract xiii proteins; F*01:01, F*01:02 and F*01:03) and HLA-G (four proteins; three full-length (G*01:01, G*01:03 and G*01:04) and one truncated (G*01:05N)). Although HLA-G/E/F alleles in the Toffin population were the most frequently observed worldwide, the frequencies of the coding haplotypes were closely similar to those described for other West African populations (Guinea-Conakry and Burkina-Faso) than for non-African ones (Brazilian population), indicating that variable sites along these genes were present in Africa before human dispersion. A total of 105 polymorphisms and 56 haplotypes were analyzed in the genetic association study to malaria and schistosomiasis susceptibility. Only results exhibiting respectively P-values < 0.01 and P-values < 0.05 (after Bonferroni correction) for polymorphisms and for haplotypes were considered as significant. The following associations were observed: i) HLA-G 14 base pairs (14bp) insertion was associated (under dominant model) with the risk of the occurrence of P. falciparum infection (all infections and symptomatic infections) and with high number of infection episodes (all infections and symptomatic infections), ii) HLA-G -1155 A and +755 A alleles (under recessive model) and iii) E.01.03.05-compatible haplotype in synergy with HLA-E -1988 C allele (under additive model) were associated with protection against P. falciparum (at infection as well as parasitic levels), and finally iv) the E.Promo.2 haplotype was associated with protection against malaria-schistosomiasis co-infection. The functional role of the genetic markers (alleles or haplotypes) associated with malaria and schistosomiasis suceptibility/resistance need to be investigated to better understand the mechanism that may explain these associations.

A genética forense vem se desenvolvendo cada vez mais, com novas tecnologias e implementação de novos conjuntos de marcadores de DNA com maiores níveis de informatividade. Os marcadores genéticos são amplamente usados na identificação humana, pois permitem distinguir indivíduos com alta acurácia. Duas classes de marcadores muito utilizadas atualmente são os STRs (Short Tandem Repeats) e os SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms). Os STRs são altamente informativos e, portanto, úteis para a prática forense. Kits mais novos como GlobalFiler (Thermo Fisher Scientific) e PowerPlex Fusion System (Promega) apresentam a análise de mais de 20 loci STRs de uma só vez. Já os SNPs, por possuírem sua informatividade mais reduzida (necessita de mais loci analisados), são menos utilizados, porém apresentam vantagem em amostras degradadas de DNA; assim, conjuntos de identificação como o 52-plex desenvolvido pelo consórcio SNPforID e o conjunto IISNPs, vêm sendo estudados em várias populações do mundo. Com o desenvolvimento de técnicas de sequenciamento de nova geração (NGS Next Generation Sequencing) para análise de DNA, a obtenção de perfis de DNA se tornou mais acurada. Algumas plataformas permitem gerar perfis de até 96 indivíduos simultaneamente. Este estudo tem por objetivo principal analisar 171 marcadores genéticos (Amelogenina, Y-INDEL, 30 STRSs e 139 SNPs) em 340 indivíduos miscigenados da região da cidade de Ribeirão Preto (SP) utilizando a plataforma de sequenciamento de nova geração MiSeq Personal Sequencer (Illumina Inc.), bem como calcular as frequências alélicas e genotípicas, verificar a aderência ao equilíbrio de HardyWeinberg e estimar parâmetros forenses para os diferentes conjuntos de marcadores. Análises de ancestralidade foram realizadas para os conjuntos de SNPs. Para o preparo das bibliotecas de amostras a serem sequenciadas, foi utilizado o kit HaloPlex (Agilent Technologies, Inc), onde foram incluídos os marcadores dos kits GlobalFiler e PowerPlex Fusion System, e os SNPs existentes no conjunto do consórcio SNPforID (52-plex) e IISNPs (92 SNPs). De todos os marcadores incluídos no ensaio, apenas um SNP (rs763869) presente no conjunto SNPforID não pôde ser analisado devido a questões técnicas. Dos 139 SNPs analisados apenas seis apresentaram desvios significativos em relação ao equilíbrio de Hardy-Weinberg,número este esperado devido ao acaso. Os conjuntos de SNPs apresentam elevada informatividade com Probabilidade de Match de 6,48 x 10-21 (52-plex) a 4,91 x 10-38 (IISNP), e Poder de Exclusão de 0,9997 (52-plex) e 0,99999997 (IISNP). De modo geral, as inferências de ancestralidade obtida utilizando estes conjuntos, indicaram elevada contribuição europeia (superior a 70%) e baixa contribuição ameríndia (inferior a 10%) na população, enquanto que as análises de mistura individual se mostraram consistentes, com a maioria dos indivíduos apresentando elevada ancestralidade europeia. Os resultados dos marcadores relativos ao sexo (Amelogenina, Y-INDEL e DYS391) foram consistentes com o sexo dos doadores das amostras. As frequências alélicas e parâmetros forenses foram calculados para os STRs, revelando uma alta informatividade. A Probabilidade de Match combinada e o Poder de Exclusão combinado foram de 1,19 x 10-36 e 0,999999999997 respectivamente. Dos 29 STRs autossômicos presentes, seis apresentaram desvios ao equilíbrio de Hardy-Weinberg, refletindo possíveis falhas no sequenciamento e genotipagem destes marcadores / The field of forensic genetics has developed increasingly with the implementation of new sets of DNA markers with higher levels of informativeness. The genetic markers are widely used in human identification as they allow distinguishing individuals with high accuracy. Two of the most commonly used markers are the Short Tandem Repeats (STRs) and the Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs). Newer kits such as GlobalFiler (Thermo Fisher Scientific) and PowerPlex Fusion System (Promega) can analyze more than 20 STRs loci at once. When comparing with STRs, the SNPs are less informative and many more loci are needed to reach the same informativeness of STR kits. However, they are advantageous when using degraded DNA samples. The identification sets such as the 52-plex developed by the SNPforID Consortium and the IISNPs have been analyzed in many worldwide populations. With the development of next generation sequencing techniques (NGS Next Generation Sequencing), obtaining DNA profiles has become more accurate and some platforms allow generating profiles of up to 96 individuals simultaneously. The main goal of this study is to analyze 171 markers (Amelogenin, Y-INDEL, 30 STRs and 139 SNPs) in 340 admixed individuals from Ribeirão Preto, SP, using the NGS platform MiSeq Personal Sequencer (Illumina Inc.). This will allow the calculation of allele and genotype frequencies, the verification of adherence to Hardy-Weinbergs equilibrium and the estimation of forensic parameters for each set of marker. Ancestry analysis was performed for the sets of SNPs. The HaloPlex kit (Agilent Technologies, Inc) was used for library preparation including the STRs from the kits GlobalFiler and PowerPlex Fusion System and the SNPs from the SNPforID consortium (52-plex) and IISNPs (92 SNPs) identification sets. A single SNP (rs763869) from the SNPforID set was not analyzed due to technical issues. Only six of the 139 analyzed SNPs presented significant deviation from the Hardy-Weinberg equilibrium expectations, which is expected by chance alone. The SNPs sets exhibited high informativeness, with matchprobability ranging from 6.48 x 10-21 (52-plex) to 4.91 x 10-38 (IISNPs) and exclusion power of 0.9997 (52-plex) and 0.99999997 (IISNPs). In general, ancestry estimates obtained using these sets indicated a high European contribution (higher than 70%) and low Amerindian contribution (less than 10%) in the population sample, while the individual admixture analyses exhibited were highly consistent, with the majority of individuals presenting high European ancestry. The results of the sex markers (Amelogenin, Y-INDEL and DYS391) were in agreement with the reported sexes from sample donors. The allele frequencies and forensic parameters calculated for the STRs revealed high informativeness. The combined match probability and the combined exclusion power were 1.19 x 10-36 and 0.999999999997 respectively. Six of the 29 autosomal STRs presented significant deviations from the HardyWeinberg equilibrium expectations, reflecting possible failures in sequencing and genotyping of these markers

Orientador: Camila Marconi / Resumo: A microbiota vaginal normal é composta predominantemente por Lactobacillus spp. que conferem proteção contra infecções por patógenos, por meio da produção de ácido lático, peróxido de hidrogênio e bacteriocinas. Diferentemente, a vaginose bacteriana (VB) é caracterizada pela substituição da microbiota de Lactobacillus spp. por bactérias anaeróbias em sua maioria. A VB é a alteração de microbiota vaginal mais comum em mulheres de idade reprodutiva, acometendo aproximadamente 30% dessa população. Além disso, a VB é fator de risco para aquisição de infecções sexualmente transmissíveis (IST). Diversas características da população já foram associadas à VB, como idade, etnia, comportamentos sexual e de higiene. Entretanto, a real composição da microbiota vaginal só foi possível em 2011 com estudo utilizando o sequenciamento de nova geração do gene bacteriano RNA ribossômico 16S. Foi demonstrado que o microbioma vaginal pode ser classificado em cinco tipos de comunidades bacterianas (community-state types, CST). Quatro dessas CSTs tem predomínio de Lactobacillus: L. crispatus (CSTI), L. gasseri (CST II), L. iners (CST III) e L. jensenii (CST V), enquanto que a CST IV apresenta grande diversidade bacteriana e engloba a maioria dos casos de VB. Apesar de quatro CSTs apresentarem predomínio de Lactobacillus, o papel protetor da CST III, dominada por L. iners, contra aquisição de IST tem se demonstrado menor que os demais. Embora os estudos de microbioma tenham possibilitado conhecer me... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The normal vaginal microbiota is predominantly composed of Lactobacillus spp. which confer protection against pathogen infections through the production of lactic acid, hydrogen peroxide and bacteriocins. Differently, bacterial vaginosis (BV) is characterized by the replacement of the microbiota of Lactobacillus spp. by anaerobic bacteria for the most part. BV is the most common vaginal microbiota alteration in women of reproductive age, affecting approximately 30% of this population. In addition, BV is a risk factor for the acquisition of sexually transmitted infections (STIs). Several characteristics of the population have already been associated with BV, such as age, ethnicity, sexual and hygiene behaviors. However, the actual composition of the vaginal microbiota was only possible in 2011 with study using the new generation sequencing of the bacterial 16S ribosomal RNA gene. It has been shown that the vaginal microbiome can be classified into five types of community-state types (CST). Four of these CSTs have a predominance of Lactobacillus: L. crispatus (CSTI), L. gasseri (CST II), L. iners (CST III) and L. jensenii (CST V), while CST IV shows great bacterial diversity and involve most cases of BV. Although four CSTs have a predominance of Lactobacillus, the protective role of CST III, dominated by L. iners, against IST acquisition has been shown to be lower than the others are. Although microbiome studies have made it possible to know better the relationship between bact... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: João Pessoa Araujo Junior / Resumo: O Vírus da Anemia Infecciosa Equina (VAIE) é um lentivírus que infecta equídeos causando a Anemia Infecciosa Equina. A doença possui distribuição mundial e o principal método de controle empregado é a eutanásia dos animais positivos, uma vez que não existe cura ou vacina disponível. No Brasil, a região do Pantanal é endêmica para a doença e, somente nessas áreas, a eutanásia não é obrigatória. A alta variação genética de lentivírus durante uma infecção prolongada é bem conhecida em várias espécies e também descrita em sequências de VAIE de outros países. Não há sequência genômica brasileira completa descrita ou mesmo um estudo da variação genética do vírus em um ambiente endêmico como o Pantanal Brasileiro. Com isso, este trabalho teve como objetivos a caracterização molecular do VAIE em equinos da região do Pantanal Brasileiro, e a padronização da PCR quantitativa (qPCR) para detecção do DNA proviral de VAIE. Duas amostras de plasma equino positivas para VAIE foram submetidas ao sequenciamento do genoma completo utilizando uma combinação de técnicas tradicionais e de nova geração. O genoma a partir do RNA viral foi obtido, anotado e comparado com sequências virais obtidas de animais naturalmente infectados em outros países. As sequências provenientes do Pantanal apresentaram identidade entre 75 e 77 % com sequências de outros países e 88,54 % entre si, classificando-as em um clado individual na árvore filogenética dos vírus já descritos, exibindo a maior variação genética de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Equine infectious anemia virus (EIAV) is a lentivirus that infects equids and causes equine infectious anemia (EIA). This disease presents worldwide distribution and the main control method is the euthanasia of positive animals, since there is no cure or vaccine available. The Pantanal region in Brazil is endemic for the disease, and euthanasia is not mandatory in this area. The high lentivirus genetic variation during a prolonged infection is well known in several species and also described in EIAV sequences in other countries. There are no Brazilian viral genomic sequences available or even a study of genetic variation in an environment such as Brazilian Pantanal. This work aimed to characterize the EIAV complete genome in equines from Brazilian Pantanal and to standardize a quantitative real time PCR (qPCR) for detection of EIAV proviral DNA. Two plasma samples of EIAV positive horses were submitted to massive sequencing by combination of Sanger and NGS sequencing. The complete genome from viral RNA was obtained, annotated and compared with viral sequences of naturally infected animals from other countries. Sequences from Pantanal showed identity between 75% and 77% with other countries sequences and 88.54% with each other, classifying them into an individual cluster in EIAV cladogram and exhibiting the greatest genetic variation between sequences from the same country. With viral envelope gene analysis, both Brazilian sequences were classified as two quasispecies. A qPCR ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

O gene fator regulador de interferon 4 (IRF4), localizado na região cromossômica 6p25- p23, é um membro da família de fatores reguladores de interferon (IRF), um grupo de fatores de transcrição de ligação ao DNA, sendo IRF4 primariamente associado ao desenvolvimento e resposta imune e expresso exclusivamente em células do sistema imunológico e em linhagens melanocíticas. Embora muitos estudos tenham associado IRF4 a diversas condições, como melanoma e leucemia linfocítica crônica, um recente Genome-Wide Association Study (GWAS) identificou que alelos do SNP rs12203592 (intron 4) estão associados com variação fenotípica em relação à presença de sardas, pigmentação da pele, cabelos e olhos. Estudos funcionais realizados em células melanocíticas humanas e de camundongos revelaram que este SNP está diretamente envolvido na regulação da expressão de IRF4, sugerindo uma clara função na pigmentação do melanócito. Apesar destes achados, a diversidade das regiões regulatórias e codificadora de IRF4 não foi até o momento analisada em populações miscigenadas. A fim de avaliar se outros sítios de variação ao longo do gene IRF4 podem estar associados à pigmentação humana, as regiões regulatórias (promotora e 3´UTR) e codificadora (9 exons e regiões intrônicas flanqueadoras, incluindo o SNP rs12203592) foram analisadas por sequenciamento de nova geração em uma amostra miscigenada da população brasileira. A amostra populacional foi composta por 228 indivíduos não aparentados de Ribeirão Preto, estado de São Paulo, Brasil, os quais foram estratificados de acordo com a pigmentação da pele (clara, média e escura), olhos (azul, verde, castanho-claros e castanho-escuros), cabelo (ruivo, loiro-claro, loiroescuro, castanho-claro, castanho-escuro e preto) bem como em relação à presença de sardas e intensidade de cabelos grisalhos. Bibliotecas de DNA foram preparadas utilizando o Sistema de Enriquecimento de Alvo Haloplex (Agilent Technologies) e sequenciadas na plataforma MiSeq (Illumina). Os pacotes de software CutAdapt, BWA and GATK foram utilizados, respectivamente, para trimagem das sequências dos adaptadores, alinhamento e identificação de variantes. Haplótipos e alelos não identificados foram inferidos pelo método PHASE, embora a fase conhecida entre os sítios de variação (obtida pelo GATK) tenha sido levada em consideração. Um total de 105 sítios de variação foram identificados. Apenas dois deles apresentaram frequências genotípicas que não atendem ao esperado pelo equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW). Dezoito destes SNPs apresentaram forte associação a pelo menos uma característica de pigmentação. Entretanto, se a conservadora correção de Bonferroni para múltiplos testes for levada em consideração, apenas duas associações, ambas envolvendo o SNP rs12203592, permanecem significativas: a associação do alelo T com pele clara e olhos azuis. Este resultado está de acordo com estudos prévios, que reportam que o alelo rs12203592*T leva a uma menor ativação de IRF4 e a uma expressão reduzida da tirosinase, resultando em sensibilidade ao sol e olhos azuis. Foi inferido um total de 101 haplótipos, estando a distribuição destes de acordo com o esperado pelo EHW. Quando os haplótipos foram divididos em haplótipos da promotora, codificadora e 3´UTR foram observadas, respectivamente, 17, 29 e 37 diferentes combinações haplotípicas. Várias associações foram identificadas, particularmente envolvendo o haplótipo mais frequente da promotora, os dois haplótipos mais frequentes da codificadora e o haplótipo mais frequente da 3´UTR, todos associados com pele clara, olhos azuis, cabelos castanhos e cabelos grisalhos. Estes resultados sugerem que outras variantes além de rs12203592, quando consideradas em um contexto haplotípico, são associadas com a pigmentação humana. / The Interferon Regulatory Factor 4 (IRF4) gene, located at chromosomal region 6p25- p23, is a member of the interferon regulatory factor (IRF) family, a group of DNAbinding transcription factors, with the IRF4 primarily associated with immune system development and response and expressed exclusively in immune system cells and melanocytic lineages. Although many studies have shown that IRF4 is associated with many human conditions, such as melanoma and chronic lymphocytic leukemia, a recent Genome-Wide Association Study (GWAS) identified that alleles from the SNP rs12203592 (intron 4) is also associated with phenotypic variation regarding presence of freckles, hair, eye and skin pigmentation. Functional studies in human and mice melanin-containing cells revealed that such SNP is directly involved in the regulation of IRF4 expression, suggesting a clear role in melanocyte pigmentation. In spite of these findings, the regulatory and coding IRF4 diversities in admixed populations have not been evaluated so far. In order to verify if other variation sites spread across the IRF4 gene may be associated with human pigmentation, the regulatory (promoter and 3\'UTR regions) and coding (9 exons and flanking intronic regions, including the SNP rs12203592) regions were analyzed by next-generation sequencing procedures in a Brazilian admixed population sample. The population sample was composed of 228 unrelated individuals from the Ribeirão Preto area, São Paulo State, Brazil, which were stratified according to eye (blue, green, hazel, light-brown, and dark-brown), hair (red, blond, dark-blond, light-brown, dark-brown and black) and skin (light, intermediate and dark) pigmentation, as well as regarding the presence of freckles and intensity of hair greying. DNA libraries were prepared using the Haloplex Target Enrichment System (Agilent Technologies) and sequenced at the MiSeq platform (Illumina). CutAdapt, BWA and GATK software packages were used for trimming adaptor sequences, alignment and genotype calling, respectively. Missing alleles and haplotypes were inferred by using the PHASE method, although the known phase between variable sites (obtained by GATK) was taken into account. A total of 105 variation sites were identified. Only two of them presented genotype frequencies that did not fit Hardy- Weinberg equilibrium (HWE) expectations. Eighteen of these SNPs presented strong association with at least one pigmentation feature. However, if the conservative Bonferroni correction for multiple tests is taken into account, only two associations, both of them involving the rs12203592 SNP, remain significant: allele T associated with light skin and blue eyes. This result is in agreement with previous reports that the rs12203592*T allele leads to reduced IRF4 activation and reduced tyrosinase expression, leading to sun sensitivity and blue eyes. A total of 101 different haplotypes were inferred, and haplotype distribution was in agreement to HWE expectations. When haplotypes were subdivided in promoter, coding and 3\'UTR haplotypes, 17, 29 and 37 different haplotypes were observed, respectively. Various associations were identified, particularly involving the most frequent promoter haplotype, the two most frequent coding (only one of them with allele rs12203592*T), and the most frequent 3\'UTR, all of them with light skin, blue eyes, brown hair and hair greying. These results suggest that other variation sites besides rs12203592, when considered in a haplotypic background, are associated with human pigmentation.

A malária causada pelo Plasmodium falciparum (P. falciparum) e a bilharzíase urogenital causada pelo Schistosoma haematobium (S. haematobium) constituem duas doenças infecciosas tropicais alarmantes, sendo ambas endêmicas no Benin. Considerando que a malária (Th1) e a esquistossomose (Th2) apresentem perfis de citocinas divergentes, na presença de co-infecção, o S. haematobium poderia modular as respostas especificamente dirigidas contra o P. falciparum. Uma vez que, os genes que codificam as moléculas nãoclássicas de histocompatibilidade (HLA-G/-E/-F) possuam propriedades imunomoduladoras, pouca atenção tem sido dedicada ao estudo desses genes em populações da África Subsaariana, que são as de maior diversidade genética. O objetivo deste estudo foi avaliar a variabilidade dos genes HLA-G/-E/-F na população Toffin do Benin, e identificar fatores genéticos de suscetibilidade/resistência à malária causada pelo P. falciparum e/ou bilharziose urogenital, usando uma coorte de crianças (de 4 a 8 anos de idade) não aparentadas. Foram avaliados os segmentos codificantes e reguladores, englobando aproximadamente 5.1 kb do HLA-G, 7.7 kb do HLA-E e 6.2 kb do HLA-F, usando sequenciamento da nova geração. As frequências alélicas e haplotípicas do HLA-G/-E/-F, a diversidade genética, a diversidade nucleotídica, o equilíbrio de Hardy-Weinberg (HW) e de Tajima\'s D foram realizados utilizando o software ARLEQUIN v3.5.2. O desequilíbrio de ligação (LD) entre sítios variáveis com frequência alélica mínima (MAF) acima de 1% foi avaliado calculando o coeficiente de correlação r2 e os gráficos de LD foram visualizados usando o software Haploview 4.2. O estudo de associação foi implementada nos softwares PLINK v1.90b4.6 e R v3.4.2, usando modelos de regressão linear ou logística múltipla. 96, 37 e 68 sítios variáveis foram detectados ao longo de HLA-G/-E- F, respectivamente. Foram identificados 16, 19 e 15 haplótipos da promotora, 19, 15 e 29 haplótipos da codificadora, 12, 7 e 2 haplótipos da região 3\' não traduzida (3\'UTR), respectivamente, e ainda, 33 , 31 e 32 haplótipos estendidos, respectivamente. Todos os haplótipos promotores/codificadores/3\'UTR respeitaram os padrões já descritos na população mundial. O HLA-E foi o mais conservado, exibindo principalmente duas proteinas (E*01:01 e E*01:03), seguido do HLA-F, três proteínas (F*01:01, F*01:02 e F*01:03) e HLA-G, quatro proteínas: três normais (G*01:01, G*01:03 eSONON, P. Resumo xi G*01:04) e uma truncada (G*01:05N). Embora os alelos do HLA-G-E/-F observados na população Toffin tenham sido os mais frequentemente observados em vários países do mundo, as frequências dos haplótipos da região codificadora foram semelhantes às descritas para outras populações africanas (Guiné-Conakry e Burkina-Faso), quando comparadas com os países não-Africanos (Brasileiros), indicando que as variações ao longo desses genes estavam presentes nos Africanos antes da dispersão humana. Foram analisados 105 polimorfismos (MAF> 5%, valor P de HW> 0.05 e qualidade de genótipos> 97%) e 56 haplótipos com frequência mínima de 5%. Consideramos significativos, apenas os resultados exibindo valores de P <0.01 para polimorfismos e valores de P <0.01 antes da correção e valores de P <0.05 após correção de Bonferroni, para haplótipos. Encontramos as seguintes associações: i) o alelo inserção de 14 pares de bases do HLA-G (14 pb Ins) (em modelo dominante) foi associado ao risco de ocorrência de infecção por P. falciparum (infecções totais como infecções sintomáticas) e ao número de episódios de infecção (número elevado de episódios de infecções totais como de infecções sintomáticas), ii) polimorfismos HLA-G (- 1155 A e +755 A, em completo LD) (em modelo recessivo), e iii) haplótipo E.01.03.05- compatível em sinergia com o alelo -1988 C do HLA-E (em modelo aditivo) foram associados à proteção contra malária (em níveis de infecção como de densidade parasitária), e iv) o haplótipo E.Promo.2 foi associado à protecção contra a co-infecção do P. falciparum em crianças infectadas por S. haematobium. Excetuando o 14 pb Ins, estudos funcionais adicionais são necessários para revelar o papel desses marcadores na expressão dos genes HLA-G, -E e -F, para entender melhor o mecanismo de associação com doenças. / Plasmodium falciparum (P. falciparum) malaria and the urogenital bilharziasis caused by Schistosoma haematobium (S. haematobium) infection constitute the two alarming tropical infectious diseases; and both are endemic in Benin. Considering that malaria (Th1) and schistosomiasis (Th2) have divergent cytokine profiles, the presence of co-infection could modulate the responses specifically directed against P. falciparum. We hypothesize that the non-classical genes and molecules (HLA-G, -E and -F) of major histocompatibility complex (MHC) could be involved in this immunomodulation. Although these molecules have well known immunomodulatory properties, little attention has been devoted to the study of these non-classical class I HLA genes in sub-Saharan African populations. This study aimed to evaluate the diversity of HLA-G, -E and -F gene variable sites in the Beninese Toffin population, and to identify susceptibility/resistance genetic factors associated with P. falciparum malaria and/or urogenital bilharziasis in a Beninese cohort of unrelated schoolaged children (4 to 8 years old). We evaluated the complete gene variability (5.1 kb for HLAG, 7.7 kb for HLA-E and 6.2 kb for HLA-F) in the Beninese Toffin population using massive parallel sequencing. HLA-G, -E and -F allele and haplotype frequencies, gene diversity, average nucleotide diversity, Tajima\'s D and Hardy-Weinberg (HW) equilibrium were performed using ARLEQUIN v3.5.2 software. The linkage disequilibrium (LD) pattern among variable sites with a minimum allele frequency (MAF) above 1% was evaluated computing the correlation coefficient r2 and the LD plots were visualized using Haploview 4.2 software. The genetic association study was implemented on PLINK v1.90b4.6 and R v3.4.2 softwares using multiple logistic or linear regression models. Overall, 96, 37 and 68 variable sites were detected along the entire HLA-G, -E and -F, respectively, arranged into regionspecific haplotypes; i.e., promoter haplotypes (16, 19, and 15, respectively), coding haplotypes (19, 15, and 29, respectively), 3\' untranslated region (3\' UTR) haplotypes (12, 7 and 2, respectively) and extended haplotypes (33, 31 and 32, respectively). All promoter/coding/3\'UTR haplotypes followed the patterns already described in worldwide populations. Among the three genes, HLA-E was the most conserved, exhibiting mainly two full-length encoded-molecules (E*01:01 and E*01:03), followed by HLA-F (three full-lengthSONON, P. Abstract xiii proteins; F*01:01, F*01:02 and F*01:03) and HLA-G (four proteins; three full-length (G*01:01, G*01:03 and G*01:04) and one truncated (G*01:05N)). Although HLA-G/E/F alleles in the Toffin population were the most frequently observed worldwide, the frequencies of the coding haplotypes were closely similar to those described for other West African populations (Guinea-Conakry and Burkina-Faso) than for non-African ones (Brazilian population), indicating that variable sites along these genes were present in Africa before human dispersion. A total of 105 polymorphisms and 56 haplotypes were analyzed in the genetic association study to malaria and schistosomiasis susceptibility. Only results exhibiting respectively P-values < 0.01 and P-values < 0.05 (after Bonferroni correction) for polymorphisms and for haplotypes were considered as significant. The following associations were observed: i) HLA-G 14 base pairs (14bp) insertion was associated (under dominant model) with the risk of the occurrence of P. falciparum infection (all infections and symptomatic infections) and with high number of infection episodes (all infections and symptomatic infections), ii) HLA-G -1155 A and +755 A alleles (under recessive model) and iii) E.01.03.05-compatible haplotype in synergy with HLA-E -1988 C allele (under additive model) were associated with protection against P. falciparum (at infection as well as parasitic levels), and finally iv) the E.Promo.2 haplotype was associated with protection against malaria-schistosomiasis co-infection. The functional role of the genetic markers (alleles or haplotypes) associated with malaria and schistosomiasis suceptibility/resistance need to be investigated to better understand the mechanism that may explain these associations.

O material lignocelulósico, presente na biomassa vegetal, representa uma importante fonte de energia, entretanto necessita da ação das enzimas lignocelulolíticas para sua degradação. A busca por novas enzimas que atuam na quebra da parede celular da planta em comunidades microbianas evoluídas naturalmente em um ambiente de degradação de biomassa como o rúmen oferece uma estratégia promissora para a prospecção de genes. Com isso, o projeto teve como objetivo a identificação de genes degradarores de biomassa vegetal em microrganismos do rúmen de ovinos usando a abordagem metagenômica. Para tanto, foram coletadas amostras da fase sólida do rúmen de 6 animais fistulados (Ovis aries) divididos em dois grupos e submetidos a duas dietas por 60 dias: tratamento controle e tratamento com dieta contendo bagaço de cana-de-açúcar. O DNA metagenômico total das amostras foi extraído e sequenciado na plataforma MiSeq Personal Sequencer (Illumina&reg;). A análise dos dados para a anotação taxônomica e funcional foi realizada no software MG-RAST. A caracterização dos genes degradadores de biomassa vegetal foi feita na plataforma CLC Genomic Workbench v.5.5.1(CLC Bio, Denmark) e a anotação de 4,68 gigabases de dados foi feita no banco de dados CAZy. A análise taxonômica mostrou uma predominância do domínio Bacteria compondo mais de 96% de todas as amostras, sendo os filos mais abundantes Bacteroidetes, Firmicutes, seguido de Proteobacteria. Entre todos os filos anotados, cinco tiveram a abundância aumentada no tratamento com adição de bagaço de cana-de-açúcar na dieta, Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria, Spirochaetes e Verrucomicrobia, e dois filos foram mais abundantes no tratamento controle, Bacteroidetes e Synergistetes. De modo geral, a análise de ordenação não mostrou correlação entre a composição do microbioma e o tipo de dieta, porém, na análise funcional, essa correlação foi observada uma vez que houve separação entre os tratamentos. A abundância relativa das famílias de enzimas relacionadas à degradação de carboidratos segue um padrão similar em todas as amostras metagenômicas. O módulo catalítico da família de Glycoside Hydrolases (GH), o qual foi anotado em 129 subfamílias diferentes, foi o mais abundante em todas as amostras (45,5%), seguido da família GT (Glicosyl Tranferase), anotada em 97 subfamílias diferentes e CBM (Carbohydrete-Bining Module), em 78 subfamílias. A montagem do metagenoma resultou em aproximadamente 110.000 contigs e possibilitou a identificação de 15 diferentes genes completos codificados nas subfamílias GH1, GH2, GH3, GH16, GH20, GH25, GH32, GH97 e GH127. A análise comparativa dos diferentes tratamentos mostrou uma maior abundância dessas enzimas no rúmen dos animais alimentados com a dieta enriquecida com bagaço de cana-de-açúcar. Em conclusão, a manipulação da dieta de ovinos por meio da substituição de parte da fração fibrosa da dieta por bagaço de cana-de-açúcar promove o enriquecimento de enzimas que degradam a biomassa vegetal no rúmem, favorecendo a prospecção e identificação de genes ativos em carboidratos. / The lignocellulose present in the plant biomass is a promising source of energy generation. However, the breakdown of plant biomass into simple sugars for bioethanol production is still inefficient and costly due to the recalcitrant nature of the plant fiber. The sheep rumen microbiome is specialized in degradation of plant material, but most members of this complex community are uncultured in the laboratory. Therefore, the search for new lignocellulolytic enzymes in microbial communities naturally evolved in biomass degradation environments, such as the rumen, using the exploration of the metagenome, is a promising strategy for identifying new genes. In this context, this study aimed to prospect plant biomass-degrading genes, selected from the sheep rumen microorganisms. The rumen samples were collected from 6 fistulated animals (Ovis aries), divided into two groups and subjected to two diets: control treatment and a treatment with a diet amended with sugarcane bagasse. The animals were fed for 60 days before sampling. To characterize the composition and functions of the rumen microbiome followed by the search of biomass-degrading genes, the metagenomic DNA was extracted from the solid contents of rumen and sequenced in MiSeq Personal Sequencer platform (Illumina&reg;). The taxonomic and functional data were performed using MG-RAST software. For the characterization of the plant biomass degrading genes, they were analyzed on the CLC platform Genomic Workbench v.5.5.1 (CLC Bio, Denmark) and 4.68 gigabases of data was annotated against the CAZy database. The taxonomic analysis showed a predominance of the Bacteria domain composing more than 96% of all the samples, being the most abundant phyla Bacterioidetes, Firmiutes, followed by Proteobacteria. Five bacterial phyla were significantly more abundant in the treatment were sugarcane bagasse was added, Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria, Spirochaetes and Verrucomicrobia, and two phyla were more abundant in the control treatment, Bacteroidetes and Synergistetes. In general, the ordination analysis did not show correlation between diet type and rumen microbiota, but in the functional analysis, this correlation was observed since there was separation between the treatments. The relative abundance of enzyme families related to carbohydrate degradation follows a similar pattern of abundance across all metagenomic samples. The catalytic module of the GH (Glycoside Hydrolases) family, which was annotated in 129 different subfamilies, was the most abundant in all samples (45.5%), followed by the GT family (Glycosyltransferase), annotated in 97 different subfamilies and CBM (Carbohydre-Bining Module) in 78 sub-families. Metagenome assembly resulted in ~110,000 contigs enabled the retrieval of 15 complete different genes encoded in the subfamilies GH1, GH2, GH3, GH16, GH20, GH25, GH32, GH97 and GH127. A comparative analysis between the groups of animals in the different treatments showed a greater abundance of enzymes, with no metagenome of the fiber proven from the group of animals fed a diet enriched with sugarcane bagasse. These results show the sheep rumen microbiome as an untapped source of potential new fibrolytic enzymes. Using a diet amended with sugarcane bagasse increases the abundance of CAE and provide a substantially expanded catalog of genes participating in the deconstruction of plant biomass.