Submitted by Silvana Teresinha Dornelles Studzinski (sstudzinski) on 2017-02-08T15:41:51Z No. of bitstreams: 1 Wagner Lourenzi Simões_.pdf: 1389162 bytes, checksum: 302aec842d2f4e8b0a7c78ecbae24357 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-08T15:41:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Wagner Lourenzi Simões_.pdf: 1389162 bytes, checksum: 302aec842d2f4e8b0a7c78ecbae24357 (MD5) Previous issue date: 2016-12-06 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Neste estudo, foi desenvolvida uma ferramenta computacional baseada em metaheurísticas para a otimização do sequenciamento de produção em Flow Shop permutacionais aplicados à montagem de placas eletrônicas que operam em ambientes High-Mix, Low-Volume. O ambiente High-Mix, Low-Volume exige a realização de um grande número de setups para atender à flexibilidade exigida. Esse elevado número de sucessivos setups para a produção de pequenos lotes impacta negativamente nos custos operacionais da empresa. Uma das formas de se obter vantagem ao lidar com um grande mix de produção é explorando características similares entre os produtos, de forma que, através de um sequenciamento adequado, seja possível reduzir o tempo total de parada para setup e, por consequência, reduzir também o tempo total de processamento (makespan). A literatura apresenta muitos exemplos de sucesso na aplicação de técnicas de otimização para o sequenciamento da produção como forma de ganho de vantagem competitiva. Porém, a complexidade e o grande esforço computacional exigidos na solução deste problema, por muitas vezes, inviabilizam sua aplicação na rotina das indústrias. Neste contexto, as metaheurísticas emergem como uma opção para a viabilização de ferramentas para otimização do sequenciamento de produção. Dentre as abordagens metaheurísticas existentes, destacam-se as abordagens híbridas que combinam estratégias de busca local com algoritmos evolutivos como opções para a geração, de forma rápida, de boas soluções para o problema de sequenciamento, ainda que estes métodos não possam garantir a otimalidade da solução. A ferramenta desenvolvida, baseada no uso combinado das metaheurísticas Busca Tabu e Algoritmo Genético, busca a melhor sequência possível dentro do tempo computacional disponível de forma a reduzir os tempos gastos com operações de tempo de setup, e consequentemente o makespan. O Algoritmo Hibrido foi avaliado utilizando instâncias da literatura e instâncias advindas de um caso real. Os resultados dos testes indicam a superioridade da abordagem híbrida sobre as abordagens canônicas do algoritmo Genético e Busca Tabu. Os resultados obtidos na avaliação de instâncias reais indicam a aplicabilidade da ferramenta em ambientes reais, obtendo bons resultados na otimização dos tempos de setup, mesmo para o sequenciamento de grandes quantidades de produtos diferentes. / This work proposes the development of a metaheuristics based computation tool, to solve the permutation flow shop scheduling problem (PFSSP) in the electronic manufacturing operating in High-mix, Low-volume enviroment. To operate in HMLV enviroment is demanded a large number of setup changes to comply the flexibility required. This elevated number of successive setup changes to produce little batches have negative impacts on the operation costs. One way for to obtain advantages handling a large product mix is to explore the similar features between this products. Through a proper scheduling we can reduce the total downtime to setup changes, and consequently reduces the process time (makespan). The literature brings many success examples in the production scheduling optimization as a way to obtain competitive advantages. But, the complexity and the computational effort demanded to solve this problems, sometimes, turns the practical application unfeasible in the factories routine. In this contexto emerges the metaheuristics as an option to viability this type of application. Among the mataheuristics approaches, outstands the hybrid approaches that combine local search strategies with evolutionary algorithms as a way to obtain good and fast solutions for the scheduling problems, although the optimality is not been guaranted. The tool proposed combine the metaheuristics Genetic Algorithm and Tabu Search to optimize the flow shop scheduling in the shortest possible time to allow the practical application in industry. The tool was evaluate based on quality metrics like makespan and mean setup time. The Hybrid Algorithm has been evaluated using instances of the literature and instances arising from a real case. The results of the tests indicate a superiority of the hybrid approach over canonical approaches of the Genetic algorithm and Tabu Search. The results obtained in the evaluation of real instances indicate an applicability of the tool in real environments, obtaining good results in the optimization of textit setup times, also for the sequencing of large products. The Hybrid Algorithm has been evaluated using instances of the literature and instances arising from a real case. The tests results indicate a superiority of the hybrid approach over canonical approaches of the Genetic algorithm and Tabu Search. The results obtained in the evaluation of real instances indicate an applicability of the tool in real environments, obtaining good results in the setup time optimization, also for the sequencing of large products.

O diabetes mellitus tipo MODY (maturity-onset diabetes of the young) é caracterizado por defeito na secreção de insulina, herança autossômica dominante, hiperglicemia de início precoce e anticorpos anti-células beta negativos. Até o momento, já foram descritas mutações em 14 genes diferentes. A confirmação do diagnóstico de MODY é feita por estudo genético-molecular, tradicionalmente pelo método de Sanger. Diante da grande heterogeneidade genética de MODY, acrescida da dificuldade de estudo de alguns genes por seu grande tamanho e ausência de hotspots, o sequenciamento em larga escala (SLE) mostra-se promissor para uma análise genética custo-efetiva na suspeita de MODY. No Brasil, existem poucos estudos genéticos de rastreamento de MODY e uma alta prevalência de casos sem mutações identificadas nos genes testados (MODY X). Os objetivos deste estudo foram: 1) analisar simultaneamente todos os genes associados a MODY em uma coorte de pacientes com suspeita clínica, utilizando um painel de SLE; 2) avaliar a patogenicidade das variantes alélicas identificadas de acordo com os critérios da Sociedade Americana de Genética Médica (ACMG). Foram selecionados 80 casos com fenótipo de MODY e análise prévia negativa dos 2 genes mais prevalentes, GCK e HNF1A, pelo método de sequenciamento de Sanger. Estes casos foram analisados pelo método de SLE, direcionado para regiões gênicas alvo, por meio de um painel customizado, com sequenciamento simultâneo de 51 genes nucleares e do genoma mitocondrial. As mutações identificadas foram correlacionadas com o fenótipo e foi realizada a segregação familiar. Uma cobertura de no mínimo 20x foi obtida em 98% das regiões alvo. Dos 80 pacientes avaliados, foram detectadas variantes patogênicas/potencialmente patogênicas em 16 casos (20%), confirmando o diagnóstico genético de MODY. Em 15 dos 80 pacientes foram identificadas 16 variantes de significado incerto, restando ainda 42 casos com diagnóstico molecular não esclarecido. Dos 16 casos confirmados geneticamente: 6 foram no gene GCK, 1 no HNF1A, 1 no HNF4A, 1 no HNF1B, 6 em genes raros associados a MODY (1 no ABCC8, 1 no KCNJ11, 1 no PDX1, 2 no PAX4, 1 no NEUROD1), e 1 no NEUROG3, gene associado a diabetes neonatal. Dentre estas 16 variantes, 2 não haviam sido descritas previamente. As 6 mutações no GCK não tinham sido detectadas na análise prévia por: a) 4 casos falso negativos no sequenciamento por Sanger (3 devido ao fenômeno genético de allelic dropout e 1 por erro na leitura do eletroferograma); b) 2 erros na hipótese clínica inicial do subtipo de MODY (baseada no padrão glicêmico e na resposta terapêutica dos pacientes), levando ao sequenciamento prévio de outro gene. A variante no HNF1A não foi detectada previamente por erro na leitura do eletroferograma (caso falso negativo no Sanger). Uma variante foi identificada no gene HNF4A, que não tinha sido sequenciado anteriormente e apresenta fenótipo semelhante ao do HNF1A. O paciente com variante no HNF1B não apresentava relato prévio de cistos renais ou malformações genito-urinárias e por isso não tinha sido considerada a hipótese clínica de MODY5. Além disso, o SLE confirmou o diagnóstico genético de 6 pacientes com variantes em genes de MODY considerados raros, que habitualmente não são sequenciados na rotina de Sanger e ainda detectou uma variante em um gene de diabetes neonatal (sendo necessário maiores estudos para estabelecer uma relação causal com MODY). Em 13 dos 16 casos índices diagnosticados, os familiares encontravam-se disponíveis para exame genético e a co-segregação foi concordante em 8 famílias. Todos os probandos avaliados apresentavam características clínico-laboratoriais típicas de MODY. Os achados deste estudo mostraram que o SLE foi capaz de aumentar a acurácia no diagnóstico de MODY, permitindo a confirmação molecular de 20% dos casos antes negativos e reduzindo, assim, o número de casos MODY X no Brasil. A abordagem genética por painel de SLE para diagnosticar casos com suspeita clínica de MODY mostrou-se promissora para elucidar as bases genéticas desse tipo de diabetes monogênico / Diabetes mellitus type MODY (maturity-onset diabetes of the young) is characterized by defects in insulin secretion, autosomal dominant inheritance, early onset of hyperglycemia, and negative anti-beta cell antibodies. To date, mutations in 14 genes are associated with MODY. The definitive diagnosis relies on genetic tests, traditionally by Sanger sequencing. However, given the genetic heterogeneity of this condition, added to the difficulty of studying some genes due to their large size and lack of hotspots, large-scale sequencing (LSS) seems promising for cost-effective genetic analysis on suspicion of MODY. In Brazil, there are few cohorts screened for MODY and a high prevalence of MODY X (unclear genetic diagnosis). This study aimed to analyze simultaneously all MODY genes in a cohort of clinically suspected patients using a LSS panel; and to evaluate the pathogenicity of identified allelic variants according to the criteria of the American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG). We selected 80 subjects with MODY phenotype and negative previous analysis of the 2 most prevalent genes, GCK and HNF1A, by Sanger sequencing method. These cases were analyzed by LSS method, with simultaneous sequencing of target genes. We designed a customized panel, including 51 nuclear genes and the mitochondrial genome. The identified mutations were correlated to the phenotype and family segregation was evaluated. At least 20x coverage was obtained in 98% of the targeted regions. Of 80 evaluated subjects, pathogenic/probably pathogenic variants were detected in 16 cases (20%), confirming the genetic diagnosis of MODY. In 15 of 80 patients, 16 variants of uncertain significance were identified, remaining 42 cases with unexplained molecular diagnosis. Of the 16 genetically confirmed cases: 6 were in the GCK gene, 1 in HNF1A, 1 in HNF4A, 1 in HNF1B, and 6 in rare genes associated with MODY (1 in ABCC8, 1 in KCNJ11, 1 in PDX1, 2 in PAX4 and 1 in NEUROD1), and 1 in NEUROG3, a gene associated with neonatal diabetes. Of these 16 variants, 2 had not been previously described. Those 6 variants in GCK were not detected in the prior analysis because of: a) 4 false negative cases in Sanger sequencing (allelic dropout had occurred in 3 cases and one variant was overlooked, due to electropherogram interpretation failure); b) 2 errors in the initial clinical hypothesis of the MODY subtype (based on the glycemic pattern and therapeutic response), leading to the prior sequencing of another gene. The variant in HNF1A was not previously identified due to misinterpretation in electropherogram (Sanger false negative case). One variant were detected in the HNF4A gene, not formerly sequenced, and had a similar phenotype to that of HNF1A. The patient with HNF1B variant did not have a previous report of renal cysts or genito-urinary malformations and therefore the clinical hypothesis of MODY5 was not considered. In addition, LSS confirmed the genetic diagnosis of 6 patients harboring variants in MODY genes considered to be rare, which are not usually sequenced in the Sanger routine, and also detected one variant in a neonatal diabetes gene (further studies are necessary to establish a causal relationship with MODY). Relatives were available for genetic testing in 13 of these 16 index cases diagnosed and co-segregation was concordant in 8 families. All probands evaluated showed typical clinical and laboratory characteristics of MODY. These study findings showed that targeted-LSS could increase accuracy in MODY diagnosis, enabling molecular confirmation of 20% of previous negative cases and thus reducing the number of MODY X cases in Brazil. The genetic approach of LSS panel to diagnose cases with clinical suspicion of MODY has shown promise for elucidating the genetic basis of this type of monogenic diabetes

Os vetores retrovirais representam uma das melhores opções para transferência e terapia gênica, pois fornecem expressão do transgene em longo prazo. Entretanto, a inserção do provírus pode causar mutagênese insercional, induzindo proto-oncogenes. Eventos deste tipo têm sido descritos em protocolos clínicos para o tratamento de SCID-X1, doença granulomatosa crônica e talessemia beta, quando vetores retrovirais (oncorretrovirus) foram utilizados. Atualmente, existem poucos métodos simples e rápidos para revelar e quantificar a expansão clonal. Assim, descrevemos a construção uma biblioteca de vetores contendo uma marcação aleatória, denominada código de barras. O sequenciamento do código de barras permitirá revelar, caracterizar e até quantificar a expansão clonal de uma população de células transduzidas. Esta metodologia ajudará a testar novos arranjos de promotores e genes terapêuticos, para o desenvolvimento de vetores mais seguros contribuindo para a redução da probabilidade de um evento de proliferação clonal desencadeado pela mutagênese insercional. / Retroviral vectors represent one of the best options for gene transfer and therapy, where long-term transgene expression is required. However, insertion of the provirus can cause insertional mutagenesis, which may have adverse consequences, such as induction of proto-oncogenes. Such events have been described in clinical trials for the treatment of SCID-X1, chronic granulomatous disease and beta thalessemia with some retroviral vectors. Currently, there are few simple and quick methods that can reveal and quantify clonal expansion. Thus, we describe the construction of a vector library containing random markers, called \"barcodes\". The sequencing of the barcode could reveal, characterize and quantify the clonal expansion of a transduced cells population. This methodology will be valuable to test new arrangements of promoters and therapeutic genes, allowing the development of safer vectors, helping to reduce the probability of clonal proliferation events triggered by insertional mutagenesis.

Orientador: Semíramis Guimarães Ferraz Viana / Resumo: Giardia duodenalis é um dos principais agentes etiológicos de diarreia infecciosa, sobretudo em crianças em idade pré-escolar que vivem em comunidades de baixa renda. Estudos da diversidade genética de G. duodenalis ampliaram o conhecimento da epidemiologia nas infecções humanas, entretanto um dos temas mais interessantes e menos conhecidos é a possível interação de Giardia com o microbioma do hospedeiro e com patógenos concomitantes. No presente estudo, avaliou-se a composição e a diversidade da comunidade bacteriana de crianças saudáveis e crianças com diarreia, parasitadas por Giardia e outros protozoários intestinais. Os isolados de Giardia obtidos nessa população foram caracterizados geneticamente. Amostras de fezes foram obtidas de 181 crianças de 0 a 6 anos de idade, das quais 156 crianças hígidas atendidas em centros de educação infantil e 25 crianças com diarreia atendidas no PS Infantil Municipal. Cada amostra de fezes foi processada para o exame microscópico e submetida à extração de DNA a ser empregado em duas etapas distintas: (1) amplificação e sequenciamento Sanger para a caracterização genética de Giardia e o diagnóstico de Blastocystis sp, Dientamoeba fragilis, Enterocytozoon bieneusi e Cryptosporidium spp. e (2) amplificação do gene 16s RNA ribossomal e sequenciamento de nova geração (plataforma Illumina MiSeq) para a caracterização da microbiota intestinal. Giardia (36,5%) e Blastocystis (41,7%) foram os parasitas mais prevalentes. A caracterização genética... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Giardia duodenalis is one of the major etiological agents of infectious diarrhea, especially in preschool children living in low-income settings. Studies focused on genetic diversity of G. duodenalis have provided insights for a better understanding of epidemiology in human infections. However, one of the most interesting and least known issues is the possible interplay between Giardia and the host microbiome and concomitant pathogens. In this work, we evaluated the diversity and composition of bacterial community of healthy children and children presenting with diarrhea infected by Giardia and/or other intestinal protozoa. In addition, Giardia isolates infecting this population were genotyping. A total of 181 stool samples from children aged 0 to 6 years old (156 from daycare children and 25 from diarrheic children attending in an emergence pediatric center) were tested by microscopic examination and submitted to DNA extraction for the following steps: (1) conventional PCR/sequencing for Giardia genotyping and the diagnosis of Blastocystis sp, Dientamoeba fragilis, Enterocytozoon bieneusi and Cryptosporidium spp and (2) next-generation sequencing (Illumina MiSeq) based analysis of intestinal microbiota. Giardia (36.5%) and Blastocystis (41.7%) were the most prevalent parasites. Analysis of Giardia sequences retrieved from 61 isolates revealed infections by assemblages A (31%), B (69%) and mixed infections A+B (3%). Metagenomic analyzes revealed similarity of bacterial microb... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Resumo: O cultivo intensivo agrícola, apesar de altamente produtivo, possui diversos pontos questionáveis, como suplementação acentuada de insumos sintéticos, além da aplicação de defensivos para o controle de pragas que muitas vezes são danosos ao meio ambiente. Como alternativa, a agricultura orgânica propõe uma forma de manejo menos agressiva, que promove o uso sustentável dos recursos naturais renováveis, como o aproveitamento de resíduos orgânicos, além de possuir um maior valor agregado no produto final. No presente estudo, investigamos por meio de uma abordagem metagenômica os efeitos do manejo (orgânico ou convencional) na microbiota da rizosfera de cana-de-açúcar, região da planta que notoriamente causa um grande impacto no seu desenvolvimento e produtividade. Identificamos a abundância maior na rizosfera com manejo orgânico de porções genômicas que codificam enzimas associadas ao metabolismo do nitrogênio e enxofre, sendo que estes são nutrientes fundamentais para o sucesso da planta e assim, seu desenvolvimento e produtividade em campo. Contraditoriamente, encontramos também que os genomas da microbiota orgânica possuem conteúdo ligado a um potencial mais acentuado para a degradação de compostos xenobióticos, que são ativamente aplicados no manejo convencional. De acordo com nossa predição, os microrganismos dessa microbiota poderiam realizar sua completa mineralização, o que é muito favorável na remoção desses resíduos no ambiente. Esses achados indicam que há um potencia... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Modern industrialized agriculture although highly productive, has several sustainability problems such as the for intense supplementation of synthetic inputs, beyond the application of pesticides for pest control. Which are often harmful to environment. As an alternative to this system, organic agriculture is considered more environmentally progressive, having several characteristics favorable to the crop producer, promotes sustainable use of renewable natural resources, such as the use of organic waste, besides that a higher aggregated value in the final product. This study investigates the changes that an organic system brings when compared to conventional management for the sugarcane rhizosphere microbiome, a plant region known to be determinant of plant development and associated with net productivity, using a metagenomic approach. We identified a higher abundance of genomic portions which encode enzymes associated with nitrogen and sulphur metabolism, which are fundamental nutrients for plant success and subsequently, crop productivity. Conversely, we also found that genomes of the organic microbiome contain higher portions linked to xenobiotic degradation, compounds that are actively applied in conventional management. Microorganisms from this sequenced microbiome could perform complete mineralization of these damaging compounds, which is desirable in their removal from the environment. These findings indicate that there is a unique potential for exploitation of organic... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

The soybean crop is one of the main agricultural crops, with high global economic relevance. The large area under soybean cultivation in Brazil, including the incorporation of new areas in the northern and midwestern regions, mostly under monoculture and non-tillage system, has been affected the prevalence and the intensity of diseases. Among these, one of most prominent is anthracnose, mainly associated with the fungal species Colletotrichum truncatum. Knowledge of the genetic structure of plant pathogen populations can be used to infer their life histories and the evolutionary processes that shape populations in the agroecosystems, which can help to implement effective disease management strategies. However, the genetic structure of C. truncatum populations associated with soybean remains unknown. We collected C. truncatum isolates from 10 sites representing two of main areas of soybean producing in Brazil and used microsatellite markers and whole-genome sequencing to investigate the population biology and evolutionary history of this important pathogen. The multilocus microsatellite typing of 237 isolates revealed high gene and haplotypic diversity within populations, as well low genetic differentiation and sharing of multilocus haplotypes among populations and regions. In addition, three distinct genetic clusters were detected, coexisting in syntopy in the soybean fields, without evidence of admixture between them. Such finding suggesting that Brazilian C. truncatum populations resulted from at least three founder events, which led to three genetic lineages that spread throughout the country. However, the genetic makeup of these lineages remains unknow, and their extreme geographic proximity raises the question of the maintenance of their genetic integrity in the face of admixture. In order to gain insights into the evolutionary history of C. truncatum lineages and to investigate in more details the possibility of a lack of genetic exchanges between them, we employed a population genomic approach. For that, we produced a draft genome sequence of a typical strain of the species associated with soybean anthracnose, which was used as the reference genome. Eighteen representative C. truncatum isolates from the three lineages were submitted to whole genome sequencing, aligned against the reference genome, and variants were identified. Our population genomic analyzes revealed that the genetic structure of C. truncatum pathogen causing soybean anthracnose is formed by three deeply divergent lineages with levels of genetic diversity consistent with repeated introduction events for each lineage. We also found evidence for sexual recombination within and between lineages, with multiples isolates displaying signatures of admixture. Our findings support a scenario in which the three lineages initially diverged in allopatry before experiencing hybridization following secondary contact. Monitoring of the pathogen\'s diversity over time is needed to reveal whether these lineages maintain or fuse, which can impact the disease control methods currently employed. / A soja é uma das principais culturas agrícolas, com alta relevância econômica global. A grande área sob cultivo de soja no Brasil, incluindo a incorporação de novas áreas nas regiões norte e centro-oeste, principalmente sob monocultura e plantio direto, tem afetado a prevalência e a intensidade das doenças. Entre elas, uma das mais proeminentes é a antracnose, principalmente associada à espécie fúngica Colletotrichum truncatum. O conhecimento da estrutura genética das populações de patógenos de plantas pode ser usado para inferir suas histórias de vida e os processos evolutivos que moldam as populações nos agroecossistemas, o que pode ajudar a implementar estratégias eficazes de manejo da doença. No entanto, a estrutura genética das populações de C. truncatum associadas à soja permanece desconhecida. Coletamos isolados de C. truncatum em 10 áreas, representando duas principais regiões produtoras de soja no Brasil. Utilizamos marcadores microssatélites e sequenciamento do genoma completo para investigar a biologia populacional e a história evolutiva desse importante patógeno. A tipagem de microssatélites multilocus de 237 isolados revelou alta diversidade genética e haplotípica nas populações, bem como baixa diferenciação genética e compartilhamento de haplótipos entre populações e regiões. Além disso, foram detectados três grupos genéticos distintos, coexistindo nas mesmas áreas, sem evidência de mistura entre eles. Isto sugere que as populações C. truncatum no Brasil resultaram de pelo menos três eventos fundadores, o que levou á formação das três linhagens genéticas que se espalharam pelo país. No entanto, a composição genética dessas linhagens permanece desconhecida, e sua extrema proximidade geográfica levanta a questão sobre a manutenção de sua integridade genética em face a mistura entre elas. A fim de analisar a história evolutiva das linhagens de C. truncatum e investigar a possibilidade de ausência de trocas genéticas entre elas, empregamos uma abordagem genômica populacional. Para isso, produzimos uma versão preliminar do genoma completo de um isolado típico da espécie, o qual foi utilizado como genoma de referência. Dezoito isolados representativos das três linhagens foram submetidos ao sequenciamento completo, alinhados ao genoma de referência, e variantes foram identificados. Nossas análises genômicas populacionais revelaram que a estrutura genética do patógeno é formada por três linhagens profundamente divergentes, com níveis de diversidade consistentes com repetidos eventos de introdução para cada linhagem. Também encontramos evidências de recombinação sexual dentro e entre linhagens, com múltiplos isolados apresentando assinaturas de mistura. Nossas descobertas sugerem um cenário no qual as três linhagens divergiram inicialmente em alopatria antes de experimentar hibridação, após contato secundário. O monitoramento da diversidade do patógeno ao longo do tempo é necessário para revelar se essas linhagens se mantêm geneticamente separadas ou se fundem, o que pode afetar os métodos de controle da doença atualmente empregados.

Os hormônios tireoidianos (HTs) desempenham um papel importante em diversos processos, tais como o crescimento, desenvolvimento e metabolismo dos tecidos em geral. Embora estudos tenham demonstrado que os HTs agem diretamente nas células foliculares da tireoide reduzindo sua resposta ao TSH, pouco se sabe, a nível molecular, sobre essa e outras ações dos HTs na própria glândula tireoide. Nesse sentido, o objetivo do presente trabalho foi avaliar alterações no perfil de expressão gênica nas células foliculares tireoidianas (células PCCl3) em reposta ao tratamento com triiodotironina (T3). Após atingir confluência desejada, as células PCCl3 foram mantidas em meio depletado de HTs (grupo Hipo) por 24h. Após esse período, parte das células foi tratada com 10-7M de T3 (grupo T3) por 24 h. As células foram, então, lisadas para extração de RNA total para análise do transcriptoma, por RNAseq. Foi obtido como resultado, uma lista de genes diferencialmente expressos da qual foram selecionados cinco genes para validação in vitro (novo lote de células PCCl3 submetidas às mesmas condições descritas acima) e in vivo [ratos Wistar (250g), tratados por 4 semanas com T3 (1,5 μg/100g de peso corporeo; grupo hipertireoideo) ou PTU (10 μg/100g de peso corporeo; grupo hipotireoideo): o Slc16a1, que codifica o MCT8, responsável pelo transporte de T3 através da membrana, o Snrpd1, 9-March, Pfdn1 e Fam103a1, que codificam proteínas envolvidas no controle pós-transcricional e pós-traducional da expressão gênica. O tratamento com T3 estimulou a expressão dos genes Snrpd1, Pfdn1 e Fam103a1, enquanto reduziu a expressão de 9-March e Slc16a1. Juntos esses resultados demonstram a existência de um efeito autócrino exercido pelo T3 sobre o controle do seu próprio turnover proteico. / Thyroid hormones (HTs) play an important role in many processes, such as growth, development and metabolism of tissues in general. Although studies have shown that HTs act directly on follicular thyroid cells reducing their response to TSH, little is known, at the molecular level, about this and other actions of HTs in the thyroid gland itself. In this sense, the aim of the present study was to evaluate changes in the gene expression profile in the thyroid follicular cells (PCCl3 cells) in response to triiodothyronine (T3) treatment. After reaching 60% confluence, PCCl3 cells were maintained in HT depleted medium (Hypo group) for 24h. After this time, part of the cells was treated with 10-7M T3 (T3 group) for 24 h. Cells were then lysed for total RNA extraction for transcriptome analysis by RNAseq. As a result, a list of differentially expressed genes from which five genes for in vitro validation (PCCl3 cells under the same conditions described above) and in vivo [Wistar rats (250g), treated for 4 weeks with T3 (1.5 &um;g / 100 g body weight, hyperthyroid group) or PTU (10 &um;g / 100 g body weight; hypothyroid group): Slc16a1, which encodes MCT8, responsible for the transport of T3 through the membrane, Snrpd1, 9-March, Pfdn1 and Fam103a1, which encode proteins involved in post-transcriptional and post-translational control of gene expression. T3 treatment stimulated the expression of the Snrpd1, Pfdn1 and Fam103a1 genes, while reducing the expression of 9-March and Slc16a1. Together these results demonstrate the existence of an autocrine effect exerted by T3 on the control of its own protein turnover.

A imunodeficiência combinada grave (SCID) é uma doença caracterizada por profunda deficiência de células T, que afeta as imunidades celular e humoral e gera anormalidades graves no desenvolvimento e funções do sistema imune. Recém-nascidos com SCID apresentam a doença nos primeiros meses de vida e tem grande susceptibilidade a infecções. Sem tratamento, essas condições são invariavelmente fatais, porém se reconhecidas precocemente, há a possibilidade da realização do transplante de células-tronco hematopoiéticas, o tratamento curativo, o que torna a SCID uma emergência pediátrica. A investigação do defeito genético é uma prerrogativa para o condicionamento adequado do transplante, a terapia gênica, o aconselhamento genético e o diagnóstico pré-natal. No Brasil, o conhecimento sobre SCID é incipiente e não existem dados moleculares sobre pacientes com a doença. Sendo assim, este estudo teve por objetivo investigar defeitos genético-moleculares de pacientes brasileiros com SCID. Foram incluídos 13 pacientes, todos com início precoce dos sintomas e manifestações clínicas esperadas em SCID (principalmente infecções respiratórias, de pele, diarreia crônica e atraso de crescimento). Os patógenos isolados foram vírus, bactérias e fungos oportunistas comumente encontrados em pacientes SCID. A partir da quantificação de TRECS e KRECs e imunofenotipagem de linfócitos, foi montado o perfil imunológico de cada paciente, que guiou o sequenciamento direto de Sangerdos genes mais frequentemente mutados em cada imunofenótipo de SCID. Mutações em 3 pacientes foram identificadas por Sanger e, posteriormente, 8 pacientes cujas mutações não foram encontradas no Sanger foram encaminhados para o sequenciamento completo de exoma, que resultou na identificação do gene afetado em 62,5% dos casos. Ao todo, foram identificadas mutações patogênicas em 8 dos 13 pacientes. Os resultados revelaram 6 alterações em 5 genes de SCID clássica (IL7R, RAG2, DCLRE1C, JAK3, IL2RG), 1 mutação no gene CD3G e 2 alterações em CECR1. Das 9 mutações encontradas, 5 não possuíam registro na literatura. O estudo genético de SCID em nosso país é problemático, principalmente porque ainda hoje, a esmagadora maioria dos pacientes não é diagnosticada. A implementação da quantificação de TRECs e KRECs como triagem neonatal para linfopenias graves é uma ferramenta fundamental para que os pacientes SCID possam ser identificados, investigados e tratados adequadamente. / Primary immunodeficiencies are a heterogeneous group of genetic diseases that lead to increased susceptibility to infections and affect mostly children. Severe Combined Immunodeficiency (SCID) is the most severe of all these diseases and is characterized by profound T cell deficiency, which affects cellular and humoral immunities and leads to severe abnormalities in the development and function of the immune system. Newborns with SCID present the disease in the first months of life and are highly susceptible to infections. Without treatment, these conditions are invariably fatal, but if recognized early, there is the possibility of hematopoietic stem cell transplantation, the curative treatment, which makes SCID a pediatric emergency. Identifying the genetic defect of SCID patients is a prerequisite for proper transplant conditioning, gene therapy, genetic counseling and prenatal diagnosis. Knowledge about SCID is still incipient in Brazil, and there are virtually no molecular data on patients with the disease. Therefore, this study aimed to investigate genetic-molecular defects of Brazilian patients with SCID. Thirteen patients were recruited, all with early onset of symptoms and clinical manifestations expected of classic SCIDs (mainly respiratory and skin infections, chronic diarrhea and failure to thrive). The pathogens isolated were opportunistic viruses, bacteria and fungi often reported in SCID patients. The immunological profile from each patient was defined by the quantification of TRECS and KRECs and lymphocyte immunophenotyping, which was meant to guide direct sequencing by Sanger of the most frequently mutated genes of each SCID immunophenotype. Mutations in 3 patients were identified by Sanger and, subsequently, 8 patients whose mutations were not identified by Sanger were referred for whole exome sequencing, which resulted in the identification of the affected gene in 62,5% of cases. Pathogenic mutations were identified in 8 of the 13 patients. The results revealed 6 mutations in 5 genes associated to classical SCID genes (IL7R, RAG2, DCLRE1C, JAK3, IL2RG), 1 mutation in the CD3G gene, and 2 mutations in CECR1. Five of the 9 mutations found had no record in the literature. SCID genetic investigation in our country is troublesome, mainly because even nowadays, the vast majority of patients are not diagnosed properly. Newborn screening for SCID and other severe lymphopenias by the quantification of TRECs and KRECs is key for the identification, investigation and proper treatment of SCID patients.

Orientador: Erick da Cruz Castelli / Resumo: O Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) é um complexo gênico que está intimamente envolvido com a regulação do sistema imune. Esse complexo comporta o sistema de Antígenos Leucocitários Humano (HLA), cuja principal importância está relacionada com o reconhecimento do que é próprio ou não do organismo. HLA-C é o gene polimórfico menos variável dos genes HLA clássicos e o que tem menor expressão nos tecidos, exceto na interface materno-fetal, em que é o único gene clássico expresso. A molécula codificada por esse gene possui significante função na apresentação antigênica e regulação da atividade de células NK, o que permite uma íntima associação com situações fisiológicas, como gestação, e patológicas, como doenças infecciosas, autoimunes, inflamatórias, neoplasias e rejeições a enxertos transplantados. Sua porção gênica mais estudada é a que codifica a fenda de ligação a peptídeos antigênicos, devido sua destacada importância na apresentação de antígenos a células T citotóxicas. No entanto, outras regiões do gene, que são negligenciadas nos estudos de variabilidade, também merecem destaque por influenciarem na sinalização e modulação da citotoxicidade de células efetoras, na ancoragem e estabilidade da molécula na membrana plasmática e na internalização e reciclagem da molécula HLA-C. Desta maneira, nós exploramos a variabilidade dos segmentos que codificam α3 (éxon 4), transmembrana (éxon 5) and cauda citoplasmática (éxon 6 and éxon 7) da molécula HLA-C em uma popu... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The Major Histocompatibility Complex (MHC) is a gene complex closely involved in the regulation of the immune system. This complex includes the Human Leukocyte Antigen (HLA) system, whose main role is related to the recognition of self/non-self structures of humans. HLA-C is the least variable polymorphic gene of classical HLA genes and has the lowest expression in tissues, except at the maternal-fetal interface, where it is the only classical HLA class I expressed gene. The molecule encoded by this gene has a significant role in the antigen presentation and regulation of NK cells activities, which allows an intimate association with physiological conditions, such as pregnancy, and pathological conditions like infectious, autoimmune, and inflammatory diseases, cancer, and transplantation rejection. The most studied HLA-C portion is that encoding the peptide-binding groove, due to its outstanding importance in presentation of antigens to cytotoxic T cells. However, other regions of the gene, which are neglected in the variability studies, are also important in influencing the signaling and modulation of effector cell cytotoxicity, in the anchorage and stability of the molecule on the cell surface, and in the internalization and recycling of the HLA-C molecule. Here, we explore the variability of the segments encoding the α3 (exon 4), transmembrane (exon 5) and cytoplasmic tail (exon 6 and exon 7) domains of the HLA-C molecule in an admixed population sample from Southeastern B... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

[pt] Oleodutos têm um papel importante no transporte de petróleo e de seus derivados, pois são a maneira mais eficaz de transportar grandes volumes por longas distâncias. A motivação deste trabalho é que uma parte não negligenciável do preço final de um derivado de petróleo é influenciada pelo custo de transporte. Apesar disso, até onde sabemos, apenas alguns autores trabalharam neste problema específico, a maioria utilizando técnicas de programação inteira. Este trabalho analisa a utilização de técnicas de inteligência artificial, arcabouços de software e simulação discreta orientada a eventos para a construção de planejadores automáticos capazes de lidar com instâncias reais de problemas de transporte em oleodutos. A primeira contribuição dessa tese é a especificação de um novo domínio para problemas de planejamento, denominado PIPESWORLD. Este domínio é inspirado no problema de transporte em oleodutos e especificado em PDDL. Por sua estrutura original, ele foi incorporado ao benchmark oficial da 4th International Planner Competition, evento bi-anual que compara o desempenho de diversos planejadores automáticos de propósito geral. Mesmo sendo uma simplificação do problema original, o PIPESWORLD se mostra um domínio bastante desafiador para o estado da arte dos planejadores. É demonstrado também que problemas de decisão derivados de diversas configurações do Pipesworld são NP-Completos. A segunda contribuição dessa tese é o arcabouço de software PLANSIM. Este framework incorpora uma máquina de busca que pode utilizar diversas estratégias, e define uma estrutura que facilita a construção de planejadores automáticos baseados em busca heurística direta que utilizam como modelo do processo a ser planejado simuladores orientados a eventos discretos. São apresentadas instanciações do PLANSIM para a construção de planejadores para problemas clássicos de como o das Torres de Hanoi e Blocksworld. A terceira contribuição da tese é a instanciação do PLANSIM para a construção de um planejador automático capaz de tratar instâncias reais de planejamento de transporte em oleodutos, denominado PLUMBER 05. A utilização de técnicas de simulação discreta orientada a eventos para a representação do modelo do sistema a ser planejado permite que este seja bastante fiel ao problema original. Isto somado ao uso do PLANSIM facilita a construção de planejadores capazes de lidar com instâncias reais. / [en] Pipelines have an important role in oil and its derivatives transportation, since they are the most effective way to transport high volumes through long distances. The motivation for this work is that a non negligible part of the final price for those products are due to transportation costs. Few authors have addressed this problem, with most of the previous work using integer programming techniques. This work analyses the use of Artificial Intelligence techniques, discrete event simulators and software frameworks for building automated planners that are able to deal with real-world oil pipeline transportation instances. The first contribution of this thesis is the specification of a new planning domain called PIPESWORLD. This domain is inspired by the oil pipeline transportation problem, and is defined in PDDL. Due to its original structure, the PIPESWORLD domain has been incorporated to the 4th International Planning Competition benchmark. Even being a simplification of the original problem, PIPESWORLD instances in the benchmark are challenging to state of art solvers. It is also shown that decision problems based on PIPESWORLD configurations are NP-Hard. The second contribution of this thesis is the PLANSIM opensource framework. This framework incorporates a search engine that may use several different strategies, and defines a structure that facilitates the construction of automated planners based on heuristic forward search that use discrete event simulators as the model for the process to be planned. The third contribution of this thesis is a PLANSIM instantiation that results in an automated planner able to deal with real-world oil pipeline transportation instances, called PLUMBER 2. The use of discrete event simulation techniques for the model of the system to be planned allows this model to be very close to the original problem. This, in conjunction with PLANSIM usage, facilitates the construction of planners that are able to cope with real-world instances.