Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Alguns Bastonetes Gram-negativos não fermentadores (BGNNF) costumam ser considerados clinicamente pouco significantes e a sua implicação em infecções é subestimada. Devido à similaridade fenotípica, mudanças taxonômicas, baixa reatividade bioquímica e limitações nos bancos de dados em sistemas comerciais, a identificação de BGNNF é frequentemente equivocada, culminando com a denominação de diferentes micro-organismos apenas como BGNNF, por falta de melhor diferenciação. O objetivo desse estudo foi avaliar, por métodos fenotípico convencional, proteômico e molecular, a identificação de BGNNF incomuns isolados em hemoculturas de pacientes atendidos em um hospital universitário no Rio de Janeiro. Foram selecionadas 78 amostras isoladas de hemoculturas caracterizadas no laboratório clinico como BGNNF para a identificação por sequenciamento dos genes 16S RNA e recA, por um conjunto amplo de testes fenotípicos manuais e por MALDI-TOF MS. Os micro-organismos predominantes na amostragem foram genotipados pela técnica de eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). Pelo sequenciamento do gene 16S rRNA, a maioria das amostras (n=31; 40%) foi incluída no gênero Burkholderia, seguido de Pseudomonas stutzeri (10%) e Delftia acidovorans (4%). Os demais isolados foram agrupados em 27 diferentes espécies. O sequencimento do gene recA identificou a maioria das espécies de Burkholderia como Burkholderia contaminans (n=19; 24%). Os testes fenotípicos incluíram as 31 amostras apenas no CBc e para as outras 47 amostras, a concordância com o sequenciamento do gene 16S rRNA em nível de espécie foi de 64% (n=30) e apenas em gênero a concordância foi de 17% (n=8). A análise comparativa geral da identificação por MALDI-TOF MS com o sequenciamento do gene16S rRNA mostrou que 42% (n=33) das 78 amostras foram concordantes em nível de espécie e 45% (n=35) apenas em gênero. Excluindo as amostras do CBc, houve um aumento da concordância em nível de espécie para 60%. As discordâncias parecem ser devido às diferenças nos perfis proteicos das amostras em relação às amostras-referência do banco de dados do equipamento e podem ser aprimorados com a atualização de perfis no sistema. A análise do polimorfismo genético de B. contaminans mostrou a ausência de um clone disseminado causando surto, além da provável origem ambiental das infecções. Os setores de nefrologia e hemodiálise contribuíram com maior número de pacientes com amostras positivas (5 pacientes e 9 amostras). Os grupos clonais BcoD e BcoE foram encontrados em pacientes assistidos no mesmo setor com diferença de quatro meses (BcoD, nefrologia) e 1,5 ano (BcoE, hemodilálise), entre as culturas, respectivamente. As discordâncias entre as técnicas ocorreram principalmente devido a dificuldade de identificação das espécies do CBc. Os BGNNF incomuns são de difícil caracterização independente da metodologia usada e nenhum método por si só foi capaz de identificar todas as amostras. / Some nonfermenting Gram-negative Bacilli (NFGNB) are considered of low clinical significance, and their implication in infections is usually underestimated. Due to their phenotypic similarities, frequent taxonomic changes and low biochemical reactivity, as well as to limitations of bacterial identification commercial system databases, these NFGNB are frequently misidentified and are collectively referred to as NFGNB group, in the lack of a better differentiation. The aim of the present study was to evaluate the performance of the conventional phenotypic method, the proteomic matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectometry method (MALDI-TOF MS) and of molecular methods (16S RNA and recA gene sequencing) in the identification of 78 unusual NFGNB isolated from blood cultures of pacients treated at an university hospital in Rio de Janeiro. Clonality of the predominant species identified within these isolates was determined by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). By the 16S rRNA gene sequence analysis, most strains (n = 31; 40%) were included in the Burkholderia spp. followed by Pseudomonas stutzeri (n = 8; 10%), Delftia acidovorans (n = 3; 4%) and Stenotrophomonas maltophilia (n = 3; 4%). The remaining bacterial isolates were included in 27 different species. By the recA gene sequencing technique, most bacteria from the Burkholderia cepacia complex (BCC), samples were classified as Burkholderia contaminans (n=19; 24%). Phenotypic tests provided accurate identification of all 31 isolates included in the BCC by the 16S rRNA gene sequence analysis. For the other 47 samples, agreement of the results obtained with these two techniques in species and genus level identifications occurred in 30 (63,8%) and 17 samples (36,2%), respectively. The results obtained by the MALDI-TOF MS and 16S rRNA gene sequencing methods agreed at species and genus levels in 33 (42%) and 35 isolates (45%), respectively. When bacteria from the BCC were excluded from the analysis, the agreement between the two techniques at species level increased to 60%. Misidentification by the MALDI-TOF MS method may be due to differences in protein spectra between the samples and the reference strains in the equipment database. PFGE analysis of B. contaminans isolates revealed the absence of a disseminate clone causing an outbreak, and the probable environmental source of infections. The nefrology ang dialisis sectors contributed to the greatest number of patients with positive cultures (5 pacients and 9 isolates). Clones BcoD and BcoE were found in blood cultures of pacientes treated in a same sector with differences of 4 months (BcoD, nefrology) and 1.5 year (BcoE, dialisis). The misidentifications occurred mainly due to the hard differentiation of BCC species. Unusual NFGNB are of difficult characterization whatever the methodology used and no method alone was able to identify all the isolates.

O patógeno Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae causa a mancha oleosa ou bacteriose do maracujazeiro, uma doença que acarreta prejuízos à cultura em decorrência da baixa produção de frutos, podendo causar a morte das plantas. Uma coleção de 87 isolados deste patovar, oriundos de 22 cidades dos Estados de São Paulo, Minas Gerais e Paraná e do Distrito Federal, foi usada para estudar a diversidade genética por rep-PCR e AFLP. Nove isolados de outros patovares foram incluídos nas análises genéticas. A técnica rep-PCR revelou pouca diversidade entre os isolados do patovar passiflorae, mas diferenciou, claramente, os diferentes patovares. Todavia, a técnica AFLP revelou considerável diversidade genética entre os isolados do patovar passiflorae. A análise molecular da variância mostrou que a maior parte da diversidade (49,4%) se encontra entre as cidades de coleta. O agrupamento gerado com base nos coeficientes de similaridade e os resultados do teste de atribuição pelo programa Structure revelaram clusters genotípicos homogêneos. Isto evidencia que a variação está mais associada à geografia, ou seja, às cidades de coleta, e que o fluxo desses isolados é pequeno. Cinco conjuntos de primers foram desenhados para a detecção do patógeno em plantas. Desses, um conjunto de primers foi desenhado a partir da seqüência intergênica 16S-23S rRNA e se mostrou específico para o patovar passiflorae. Nenhum amplicon foi detectado nos patovares controles. O restante dos primers foi desenhado a partir do seqüenciamento de locos de AFLP, monomórficos para o patovar passiflorae e ausentes nos demais patovares. Estes primers não foram totalmente específicos; no entanto, todos podem ser recomendados para o diagnóstico da mancha oleosa, uma vez que não há registros de outras Xanthomonas em pomares de maracujá. / The pathogen Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae is responsible for the bacterial leaf spot of passion fruits, a disease that provokes commercial losses due to low levels of fruit production and even plant death. A group of 87 isolates of this pathovar, collected from 22 localities of São Paulo, Minas Gerais and Paraná States as in the Federal District was used to evaluate the genetic diversity based on rep-PCR and AFLP. Isolates from other nine pathovars were included in the genetic analyses. Low level of genetic diversity was revealed by the rep- PCR technique, which clearly distinguished the different pathovars. However, considerable diversity between isolates of the pathovar passiflorae was revealed by the AFLP technique. The analysis of molecular variance showed that differences between localities contributed to most part of the variance (49.4%). Groups generated based on similarity coefficients as well as results produced by the software Structure assigning isolates to groups, revealed homogeneous genotypic clusters. This confirms that variance is associated with geographic origin e.g. sampling localities, and that flow of isolates is restricted among localities. Five primer sets were designed for pathogen detection in plants; a primer set was designed for PCR amplification of the intergenic sequence 16-23S rRNA, which was shown to be specific to the pathovar passiflorae. No amplicons were detected in the controls. The remaining primers were designed after sequencing AFLP bands that were monomorphic within the pathovar passiflorae but absent in the other pathovars. These primers were not absolutely specific but all could be recommended for diagnosis of leaf spot as there is no report on the occurrence of other Xanthomonas species in passion fruit orchards.

Aplicou-se duas metodologias para isolamento de bactérias ainda \"não-cultivadas\" em amostras de água do mar de Ubatuba (SP, Brasil) e da Baía do Almirantado (Antártica). Pela adaptação do método de cultivo de alto desempenho (HTC), foi possível isolar 4 culturas bacterianas, nas quais duas podem ser consideradas ainda não-cultivadas e foram identificadas através das análises filogenéticas do gene rRNA 16S. Ao aplicar o método de inóculo em meio de cultura diluído 1/10, nas amostras de água do mar antártico, 81 isolados bacterianos foram identificados (gene rRNA 16S), sendo que um deles, é candidato a um isolado \"não-cultivado\". Outras abordagens fenotípicas e genômicas serão necessárias para definir a caracterização taxonômica destas bactérias \"não-cultivadas\" obtidas. A presença dos genes alk foi detectada em 11 isolados bacterianos antárticos, destes, um representante apresentou similaridade com uma sequência de gene alkM, recém-descrita em estudo prévio, em um dos clones de bibliotecas metagenômicas de sedimentos, na mesma região de amostragem. / Two different methods were applied for culturing marine bacteria in order to isolate uncultured representatives from Ubatuba seawater (SP, Brazil) and from Admiralty Bay (Antarctica). The adapted high-throughput culturing (HTC) procedures allowed to obtain four isolates. Two of them are uncultured bacteria candidates from coastal seawater studied and they were identified by phylogenetic analysis for 16S rRNA genes. The use of traditional plating on 1/10 dilution of agar media for the Antarctica seawater samples, allowed to isolate 81 cultures that were identified (16S rRNA gene), and one of these isolates is most likely to be an uncultured micro-organism. For taxonomic purposes, several others phenotypic and genomic methods must be applied for the further characterization of these uncultured bacteria. The alk genes were detected in eleven bacterial isolates from Antarctic. One of them, showed similarity to the sequence of an alkM gene, described in previous work in environmental clones libraries od sediments, from the same sampling area.

O problema de dimensionamento e sequenciamento de lotes vem sendo extensivamente estudado por pesquisadores da área de Pesquisa Operacional e há uma tendência de que tais trabalhos passem a cada vez mais integrar aspectos reais dos processos produtivos. Entretanto, percebe-se que os estudos conduzidos em alguns setores industriais negligenciam importantes restrições tecnológicos dos processos de produção e isso afasta esses trabalhos de Pesquisa Operacional de uma aplicação efetiva, como é o caso da indústria de embalagens de vidro. Neste contexto, propõe-se um modelo de programação inteira mista e um método de solução para o problema de dimensionamento e sequenciamentos de lotes na indústria de embalagens de vidro, sendo que este trabalho diferencia-se dos demais existentes na literatura por agregar restrições tecnológicas específicas desse processo produtivo. O modelo proposto, denominado CLSD-GCST, foi amplamente validado com base em um conjunto de testes com 40 instâncias de um problema real de uma grande empresa do setor no pacote comercial IBM ILOG CPLEX Optimization Studio Versão 12.5. A validação do modelo incluiu ainda uma análise de ganhos potenciais para o negócio de baseada no modelo SCOR. Já o método de solução proposto consiste em uma metaheurística de Busca em Vizinhança Variável (VNS) e se mostrou promissor para a solução do problema estudado, proporcionando resultados de qualidade em um baixo tempo computacional. Além disso, o VNS superou o Branch-and-Cut do CPLEX para grandes instâncias, nas quais o pacote comercial encontrou dificuldades. Por fim, o VNS proposto também foi validado por meio da análise de testes computacionais e suas principais características foram avaliadas sistematicamente, gerando um conjunto de informações que pode direcionar a utilização e, até mesmo, a evolução desse método em pesquisas futuras. / Lot sizing and scheduling problem has been extensively studied by Operations Research scientists and there is a tendency of incorporating more production processes real aspects in these researches. However, it can be noticed that studies conducted in some industrial sectors neglect important production process technological constraints and it keeps the Operations Research works away from an effective application, as happens with the glass containers industry. In this context, a mixed integer programming model and a solution method were proposed for glass containers industry lot sizing and scheduling problem, the main difference between this work and the others in literature is the inclusion of process specific technological constraints. The proposed model, named CLSD-GCST, was widely validated by a set of tests performed with 40 instances from a large company real problem using the commercial package IBM ILOG CPLEX Optimization Studio Version 12.5. The model validation also included a potential business earnings analysis based on SCOR framework. About the proposed solution method, it consists of a Variable Neighborhood Search (VNS) metaheuristic and it proved to be promising for the studied problem solution, providing good quality results in low computational time. Moreover, VNS overcame the CPLEX Branch-and-Cut for large instances, in which the commercial package found difficulties. Lastly, the proposed VNS was validated by means of computational tests analysis and its main characteristics were systematically evaluated, generating an information set that may direct this method application and even its evolution in future researches.

A galactosemia clássica ou tipo I (GC) é um erro inato do metabolismo da galactose causada pela deficiência da enzima galactose-1-fosfato uridiltransferase (GALT). É transmitida como uma doença autossômica recessiva e é tipicamente caracterizada pela intolerância neonatal a galactose, com complicações que vão desde icterícia, para os casos mais leves, à insuficiência hepática nos mais graves, e às complicações tardias, como disfunções motoras e reprodutivas. A galctosemia também é heterogénea do ponto de vista molecular, com 266 mutações diferentes descritas no gene GALT, algumas específicas para certas populações, refletindo o que se espera de alguns eventos de efeito fundador. O objetivo deste trabalho foi avaliar o perfil de mutações no gene GALT, dos pacientes brasileiros com galactosemia clássica e fazer um estudo da correlação do genótipo com o fenótipo, uma vez que se sabe que parte da variação observada na evolução clínica está relacionada com o nível de atividade residual da enzima e do genótipo. Para tanto, foram incluídos no estudo 31 pacientes com o diagnóstico bioquímico de galactosemia de diversas regiões do Brasil, que tiveram seus dados clínicos obtidos a partir de revisão de prontuários médicos e preenchimento de ficha clínica. Foi realizado o sequenciamento genético direto bidirecional do gene GALT e também estudos adicionais, como genotipagem do gene GALK1 de um paciente, estudo de ancestralidade de sete pacientes, além de simulações de patogenicidade in silico das novas mutações identificadas. Os principais achados clínicos dos pacientes que participaram deste estudo foram hepatomegalia, icterícia, baixo ganho pondero-estatural, vômito recorrente, anemia e catarata. As principais mutações que causam GC descritas na literatura foram identificadas neste estudo, como por exemplo, a p.Q188R, p.S135L e p.K285N, bem como o alelo Duarte 2 e seis mutações novas, p.M1T, p.R33S, p.P73S, IVS3+1G>A, IVS4+4A>C e p.Q169P. Este resultado era esperado, dada a elevada miscigenação da população brasileira. Alguns indivíduos foram diagnosticados através do teste de triagem neonatal expandido, que não está disponível rotineiramente a todos os recém-nascidos, portanto, começaram o tratamento dietético antes de desenvolverem os sinais e sintomas da doença. Para estes indivíduos não foi possível fazer uma análise da relação genótipo-fenótipo. Para os demais indivíduos esta relação foi consistente com o que é descrito na literatura, com os indivíduos homozigotos para a mutação p.Q188R com uma evolução mais grave do que os indivíduos que tinham pelo menos uma mutação p.S135L. Para os indivíduos com as mutações novas, foi observado um amplo espectro de fenótipos, como de pacientes que foi a óbito por insuficiência hepática e sepse à um caso assintomático. Este estudo amplia o espectro de mutação no gene GALT descrito na literatura e reforça a importância tanto do diagnóstico precoce quanto da introdução do tratamento dietético; também acrescenta mais evidências para a discussão sobre a introdução da galactosemia no programa de triagem neonatal do Brasil, onde a incidência da doença é estimada em cerca de 1:20.000. / Classical galactosemia (CG) or type I galactosemia is an inborn error of galactose metabolism caused by the deficiency of the galactose-1-phosphate uridyltransferase enzyme (GALT). It is transmitted as an autosomal recessive disease and is typically characterized by neonatal galactose intolerance, with complications ranging from neonatal jaundice and liver failure to late complications, such as motor and reproductive dysfunctions. Galactosemia is also heterogeneous from a molecular standpoint, with 266 mutations described to date in the GALT gene, some of them specific to certain populations, reflecting what is expected as some events of founder effect. The objective of this study was to evaluate the profile of mutations in the GALT gene of Brazilian patients with classical galactosemia and perform a genotype-phenotype correlation study, since it is known that part of the observed variation in clinical outcome is related to the level of residual enzyme activity and genotype. Therefore, this study included 31 patients with biochemical diagnosis of galactosemia from different regions of Brazil, who had their clinical data obtained from review of medical records and from a standardized case report form. We conducted a direct bidirectional sequencing of the GALT gene and also additional studies, as GALK1 genotyping for a patient, ancestrality study of seven patients and in silico simulation of pathogenicity for the new mutations identified. The main clinical features of the patients in this study were hepatomegaly, jaundice, low weight and height gain, recurrent vomiting, anemia and cataract. The major CG causing mutations described in the literature have been identified in this study, for example, p.Q188R, p.S135L and p.K285N, as well as the Duarte 2 allele and six novel mutations: p.M1T; p.R33S; p.P73S; IVS3+1G>A; IVS4+4A>C and p.Q169P. This result was expected, given the high miscegenation of the Brazilian population. Some individuals were diagnosed through expanded newborn screening test, which is not available routinely to all newborns, and so began dietary treatment before they develop signs and symptoms of the disease. For these individuals, was not possible to analyze the genotype-phenotype correlation. For other individuals this relationship was consistent with what is described in the literature, with the homozygous for p.Q188R mutation presenting a more severe phenotype than individuals who had at least one p.S135L mutation. For individuals with new mutations, was observed a wide range of phenotypes, from patients who died due to liver failure and sepsis to an asymptomatic case. This study expands the spectrum of mutations in the GALT gene described in the literature and reinforces the importance of early diagnosis and the introduction of dietary treatment; also adds more evidence to the discussion on the introduction of galactosemia in the neonatal screening program of Brazil, where the incidence of the disease is estimated at about 1:20,000.

As lagoas salino-alcalinas (salinas) da sub-região Nhecolândia do Pantanal, Mato Grosso do Sul, combinam valores de pH elevados com a presença de altas concentrações de sal, assemelhando-se aos lagos de soda da África Oriental. O entendimento atual dos mecanismos físicos, químicos e biológicos nestes ambientes extremos do Brasil é limitado. Embora os micro-organismos estejam envolvidos nos processos biogeoquímicos em ecossistemas aquáticos, investigações sobre os grupos bacterianos que contribuem para a diversidade e funções específicas nessas salinas inexistem. Assim, a presente dissertação centrou-se na avaliação da comunidade bacteriana de duas salinas (Salina Verde e Salina Preta), localizadas na sub-região da Nhecolândia. Especificamente, investigou-se a diversidade e a estrutura das comunidades bacterianas, os perfis metabólicos das lagoas e genes funcionais que codificam enzimas relacionadas a transformação do nitrogênio, mercúrio, selênio e arsênio. As amostras de água foram coletadas durante a estação seca (setembro de 2012) na Salina Verde (pH 9,5, E.C. 2575 mS cm-1), caracterizada pela presença constante de floração de cianobactérias e na Salina Preta (pH 8,9, E.C. 1500 mS cm-1), sem registro de ocorrência de floração. As amostragens foram realizadas em triplicatas em duas profundidades (superfície e fundo) e duas vezes no dia (10:00 h e 15:00 h) devido à ocorrência natural de saturação de oxigênio observada na Salina Verde. O DNA total de cada amostra ambiental foi extraído e a diversidade bacteriana e funcionalidade foram acessadas por pirosequenciamento do gene de 16S RNAr e sequenciamento metagenômico. A análise de PCR quantitativa do gene de 16S RNAr foi realizada de forma a quantificar a comunidade bacteriana. A abundância bacteriana foi maior na Salina Verde do que na Salina Preta (1010 e 109 cópias mL-1, respectivamente). As sequências parciais do gene de 16S RNAr obtidas no pirosequenciamento mostraram a dominância de táxons do gênero Anabaenopsis sp. na floração da Salina Verde, englobando até 92% do total de sequências. A comunidade bacteriana da Salina Preta apresentou os maiores índices de diversidade e riqueza, sendo dominantes os filos Proteobacteria, Bacteroidetes, Acidobacteria e Verrucomicrobia. Apenas a Salina Preta mostrou diferenças na comunidade bacteriana de acordo com as profundidades amostradas. Na superfície desta lagoa, os filos Actinobacteria e Verrucomicrobia predominaram, enquanto no fundo, prevaleceram os filos Proteobacteria e Chlamydiae. A temperatura foi detectada como o fator abiótico que influenciou a heterogeneidade espacial da Salina Preta. Por sua vez, a alcalinidade e o pH foram os fatores que impulsionaram as diferenças e variações das comunidades bacterianas em ambas as lagoas. Genes bacterianos envolvidos nos ciclos biogeoquímicos do nitrogênio, mercúrio e arsênio foram encontrados nas salinas Verde e Preta, sugerindo uma elevada redundância funcional nas transformações desses elementos. Não foram encontrados genes microbianos envolvidos no ciclo do selênio. Os dados gerados revelaram uma comunidade microbiana taxonômica e funcionalmente complexa que habita as salinas. Os resultados deste estudo fornecem uma avaliação aprofundada baseada em abordagens independentes de cultivo, sendo este um passo importante na compreensão da dinâmica funcional desses ambientes no Pantanal brasileiro. / The saline-alkaline lakes (salinas) of the Nhecolândia sub-region of the Pantanal, Mato Grosso do Sul state, combine high pH values with the presence of high salt concentrations, resembling the soda lakes of East Africa. The current understanding of physical, chemical and biological mechanisms in these extreme environments is limited. Although microorganisms are involved in biogeochemical processes in aquatic ecosystem, researches on the bacterial groups that contribute to diversity and specific functions in these salinas are scarce. This dissertation therefore focused on the evaluation of bacterial community of two salinas (Salina Verde and Salina Preta) located in the Nhecolândia subregion. Specifically, it was investigated the diversity and structure of bacterial communities, the metabolic profile of the lakes and functional genes that encode the nitrogen, mercury and arsenic-transforming enzymes. Water samples were collected during the dry season (September 2012) from Salina Verde (pH 9.5, E.C. 2575 mS cm-1), characterized by constant presence of cyanobacterial bloom, and from Salina Preta (pH 8.9, E.C. 1500 mS cm-1), with no report of bloom occurrence. Triplicate samplings were carried out in two depths (surface and bottom) and twice a day (10 AM and 3 PM) due to naturally occurrence of oxygen saturation, observed at Salina Verde. Total DNA of each environmental sample was extracted and bacterial diversity and functionality were accessed by 16S rRNA gene pyrosequencing and metagenomic sequencing. Analysis of quantitative PCR of the 16S rRNA gene was performed in order to quantify the bacterial community. Bacterial abundance was higher in the Salina Verde than in the Salina Preta (1010 and 109 copies mL-1, respectively). The partial sequences of the 16S rRNA gene obtained in the pyrosequencing revealed the genus Anabaenopsis sp. as the dominant taxa in the Salina Verde bloom, encompassing up to 92% of the total bacteria. Bacterial community of the Salina Preta showed the highest diversity and richness index, with dominant phyla Proteobacteria, Bacteroidetes, Acidobacteria and Verrucomicrobia. Only the Salina Preta showed differences in bacterial community in accordance with the depths sampled. On the surface of this lake, the phyla Actinobacteria and Verrucomicrobia predominated, while in the bottom, Proteobacteria and Chlamydiae prevailed. The temperature was detected as the abiotic factor influencing the spatial heterogeneity at Salina Preta. On the other hand, alkalinity and pH were the factors driving the differences and variation of bacterial community in both lakes. Bacterial genes involved in the biogeochemical cycles of nitrogen, mercury and arsenic were found in Salina Verde and Salina Preta, suggesting a high metabolic redundancy in the transformation these elements. No microbial genes involved in selenium cycle were found. The data showed a taxonomic and functional complex microbial community inhabiting salinas. The results of this study provide a detailed assessment based on culture-independent approaches, which is a stepping stone to understand the functional dynamics of these environments in the Brazilian Pantanal.

Os microrganismos representam a forma de vida mais abundante e diversificada do planeta. A atividade agrícola leva a uma redução da biodiversidade do solo e a menor diversidade microbiana pode resultar na diminuição da ciclagem de nutrientes e no crescimento das plantas. Como forma de avaliar alterações na atividade microbiana e na estrutura das comunidades de bactérias do solo, decorrentes do cultivo da cana-de-açúcar, foram conduzidos dois experimentos. O primeiro, no município de Novo Horizonte (SP), com o objetivo de determinar ação da queima da cana-de-açúcar sobre a comunidade de bactérias do solo e o segundo experimento, nos municípios de Pirassununga (SP) e Jaboticabal (SP), com o objetivo de verificar o efeito da adubação nitrogenada sobre a comunidade bacteriana do solo. Amostras de terra foram coletadas nas profundidades 0-10 e 10-20 cm, na linha e entrelinha de plantio. No primeiro experimento foram utilizadas três cultivares de cana-de-açúcar (SP81-3250, SP80-1842 e RB72-454) sob os sistemas de manejo de colheita sem queima (mecanizada) e com queima (manual) prévia a colheita. Nesse experimento foram avaliadas a diversidade metabólica (Biolog) e a estrutura das comunidades bacterianas por meio da PCR-DGGE do gene rRNA 16S. A mudança no manejo de colheita da cana-de-açúcar provocou modificações no metabolismo heterotrófico do solo, alterando a diversidade metabólica. No entanto, não houve mudanças na estrutura das comunidades bacterianas do solo com e sem queima sob a variedade SP801842. Dessa forma, a primeira queima da cana-de-açúcar previamente à colheita alterou a capacidade e a diversidade metabólica microbiana, mas não mudou a estrutura das comunidades de bactérias em relação à área sem queima. No segundo experimento foram avaliadas amostras de terra, de duas áreas experimentais, sob cultivo de cana-de-açúcar (SP813250), com diferentes doses de N (0, 40, 80 e 120 kg de N ha-1) na forma de uréia, aplicadas no sulco de plantio. Para verificar possíveis alterações na comunidade bacteriana desses solos, foram avaliadas a estrutura das comunidades bacterianas por PCR-DGGE e a diversidade de bactérias oxidadoras de amônio (AOB), pelo seqüenciamento de bibliotecas do gene rRNA 16S, utilizando oligonucleotídeos iniciadores específicos. As doses de N alteraram a estrutura das comunidades bacterianas do solo nas duas áreas experimentais, determinadas por PCR-DGGE, entretanto, a adubação nitrogenada não alterou a diversidade de AOB no solo, das duas áreas. A estrutura da comunidade de AOB no solo da USA, sem adubação nitrogenada e com 80 kg de N ha-1 diferiu estatisticamente. Nas duas áreas, as unidades taxonômicas operacionais mais abundantes se relacionam filogeneticamente a Nitrosospira multiformes. / The microorganisms are the most abundant and diverse living creatures on earth. The agricultural practices reduce the soil biodiversity and a lower microbial diversity can result in a nutrient cycling and plant growth reduction. Two sugarcane crops experiments were investigated to evaluate modifications in the microbial activity and soil bacterial communities structure. The first of them was done at municipality of Novo Horizonte, Sao Paulo State (SP), and it has the aim to determine the sugarcane burn effects on soil bacterial community. The second experiment was introduced at municipalities of Pirassununga (SP) and Jaboticabal (SP) with the objective to verify the nitrogen fertilizing effect on soil bacterial community. The soil samples were taken in 0-10 cm and 10-20 cm depth, between and in the planting furrows. We used three sugarcane varieties (SP81-3250, SP80-1842 e RB72-454) in the first experiment under unburned and burned sugarcane pre-harvest. We evaluated metabolic diversity (Biolog) and the bacterial community structure performing PCR-DGGE of 16S rRNA gene in the first experiment. The sugarcane harvest management had modified the soil heterotrophic metabolism by altering its diversity. In spite of that, there is no difference between the burned and unburned soil bacterial communities under the variety SP80-1842. For that reason, the first year pre harvest burn altered the microbial metabolic diversity and capacity but did not change the bacterial community structure when related with unburned area. In the second experiment, soil samples under the SP81-3250 variety were analyzed from two sites. Each site received different levels of urea as nitrogen fertilization (0, 40, 80 e 120 kg de N ha-1) applied at planting furrows. The PCR-DGGE was applied to verify changes in the bacterial communities structure in these soils. The ammonia-oxidizing bacteria (AOB) diversity was evaluated by sequencing of 16S rRNA gene libraries after the amplification with specific primers. The levels of nitrogen fertilization altered the soil bacterial communities structure in both study sites, by PCRDGGE evaluation. However, the nitrogen application did not alter the soil AOB diversity in those two sites. The soil AOB community structure under no nitrogen and 80 kg N ha-1 application was different from the community structure under the other levels of fertilization in one of the two sites. The operational taxonomic unit are phylogenetically related to Nitrosospira multiformes in the two sites.

Submitted by Jorge Silva (jorgelmsilva@ufrrj.br) on 2018-01-24T17:49:23Z No. of bitstreams: 1 2017 - Leandro Martins Ferreira.pdf: 2738374 bytes, checksum: a6ccde64b30f6cd52122b9030ab6c92e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-24T17:49:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017 - Leandro Martins Ferreira.pdf: 2738374 bytes, checksum: a6ccde64b30f6cd52122b9030ab6c92e (MD5) Previous issue date: 2017-02-22 / CAPES / Faperj / CNPq / Among the abiotic stress, drought is a major environmental stress seriously limiting plant growth and crop productivity. Rice is one of the most important staple food crops in the world and requires a larger quantity of water to produce, once it is a crop extremely sensitive to drought stress. For this reason, to obtain rice plants that cope with drought stress without major reduction in productivity is the challenge for breeding programs nowadays. This work aimed: (i) identify upland rice varieties with contrasting drought tolerance through the evaluation of morphological and physiological traits, (ii) analyse root parameters which could explain the differences between tolerant and sensitive varieties to the drought stress and, (iii) identify new biotechnological targets related with the tolerance through transcript profile analysis in the contrasting varieties. Six experiments were performed, two in greenhouse and four in growth chamber conditions. The experimental design adopted was completely randomized. The first experiment started with ten rice varieties submitted to control and stress conditions during the reproductive stage. The contrasting varieties were selected based on morphological and physiological traits. Experiments from II to IV aimed to correlate the tolerance to the drought stress with the root development and morphology. Experiment V aimed to evaluate the regulation of genes related to the drought tolerance and the experiment VI aimed to analyse the differential expression of genes through the RNAseq analysis in rice roots. Data obtained from the productivity components, tolerance index and multivariate analysis through the evaluation of morphological and physiological traits allowed to identify Catet?o and Piau? variety as the most tolerant and Quebra Cacho and Mira as the most sensitive. Drought tolerance was correlated with a lower root angle and increase in the root density and emission of lateral roots by Catet?o variety during drought stress. Moreover, Catet?o variety has showed higher expression levels and early induction of genes and transcription factors related with drought tolerance. The RNAseq analysis allowed to identify several potential genes which can be used in future breeding programs aimimg the improvement of drought tolerance in rice. / Dentre os estresses abi?ticos que podem limitar o crescimento das culturas agr?colas, a seca ? considerada um dos principais, sendo capaz de reduzir consideravelmente a produ??o global de alimentos. O arroz ? uma das mais importantes culturas agr?colas do mundo e sua produ??o demanda grande quantidade de ?gua, pois ? uma esp?cie extremamente sens?vel ao d?ficit h?drico. Portanto, a obten??o de plantas de arroz que lidam com o estresse h?drico, sem redu??o significativa de produtividade ? um desafio para os programas de melhoramento atuais. Este trabalho teve como objetivos: (i) identificar variedades de arroz de sequeiro contrastantes quanto ? toler?ncia ao estresse h?drico por meio da avalia??o de caracter?sticas morfol?gicas e fisiol?gicas, (ii) analisar par?metros radiculares que possam explicar a diferen?a entre variedades tolerantes e sens?veis ao estresse h?drico e, (iii) identificar novos alvos biotecnol?gicos envolvidos com essa toler?ncia por meio da an?lise do perfil de transcritos nas variedades de arroz contrastantes. Foram realizados seis experimentos, sendo dois em casa de vegeta??o e quatro em c?mara de crescimento. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado. O primeiro experimento iniciou com dez variedades de arroz submetidas a condi??o controle e estresse h?drico durante o per?odo reprodutivo. As variedades contrastantes foram selecionadas com base em caracter?sticas morfol?gicas e fisiol?gicas analisadas. Os experimentos II a IV foram realizados a fim de correlacionar a toler?ncia ao estresse com o desenvolvimento e morfologia do sistema radicular. O experimento V foi realizado para avaliar a regula??o de genes relacionados a toler?ncia ao estresse h?drico e o experimento VI teve como objetivo analisar a express?o diferencial de genes por meio da t?cnica de RNA-seq em ra?zes de arroz. Os dados obtidos dos componentes de produtividade, ?ndices de toler?ncia ao estresse e an?lise multivariada das caracter?sticas morfol?gicas e fisiol?gicas permitiram identificar as variedades Catet?o e Piau? como as mais tolerantes ao estresse h?drico, e Quebra Cacho e Mira como as mais sens?veis. Foi observado que a toler?ncia ao estresse h?drico est? correlacionada com o menor ?ngulo radicular, aumento da densidade e emiss?o de ra?zes laterais em condi??es de d?ficit h?drico na variedade Catet?o. Al?m disso, essa variedade mostra indu??o r?pida e elevados n?veis de express?o de genes e fatores de transcri??o relacionados ? toler?ncia ao estresse h?drico em arroz. Por meio do sequenciamento do RNA foi poss?vel identificar diversos genes com potencial para serem utilizados em programas de melhoramento visando o aumento da toler?ncia ao estresse h?drico em arroz.

Os sarcomas uterinos são tumores mesodérmicos raros que compreendem cerca de 3% de todos os cânceres nesse órgão. Apresentam diversidade histológica, comportamento agressivo, disseminação precoce e altas taxas mortalidade. Recentemente, os carcinossarcomas (CS) foram reclassificados histologicamente como carcinomas. Neste trabalho, os CS foram incluídos na casuística tanto para fins de comparação de seu componente mesenquimal, como por ainda fazerem parte da maioria dos estudos sobre sarcomas de corpo uterino e também da última classificação da WHO (Word Health Organization). Devido à sua diversidade e raridade, não há consenso relacionado aos fatores de risco para pior prognóstico e tratamento adequados para esses tumores. Informações sobre seus perfis gênicos e proteicos poderiam contribuir na caracterização de marcadores moleculares que auxiliassem no diagnóstico e prognóstico desses tumores, bem como no entendimento de sua biologia e comportamento clínico. Assim, nos propusemos a avaliar a presença de alterações gênicas nesses tumores, utilizando um painel de 409 genes, oncogenes e supressores de tumor, frequentemente mutados em tumores sólidos. Para isso, foram selecionadas 66 amostras, das quais 14 foram sequenciadas, incluindo, 5 carcinossarcomas (CCS), 4 leiomiossarcomas (LMS), 4 sarcomas de estroma endometrial (SEE) e 1 adenossarcoma (ADS). As reações foram realizadas utilizando a plataforma Ion Proton System (ThermoFisher) de Sequenciamento de Nova Geração. Nas 14 amostras encontramos 27 LoF e 40 mutações missenses, numa média de 39 inserções e 52 deleções por amostra, totalizando 70 mutações. Dessas, 25 encontram-se no banco de dados COSMIC. Os genes mais comumente mutados em nossa amostragem foram: TP53 (50%), KMT2D (36%), ATM (29%), DICER1 (21%), PIK3CA (21%), TRRAP (21%). Nosso objetivo principal era encontrar mutações específicas para cada subtipo histológico, porém apenas os SEEs (PDE4DIP) e os CCS (ERBB4 e PIK3CA) tiveram mutações especificas. Em outra análise, observamos que todos os subtipos histológicos compartilham o gene KMT2D. Embora não tenha sido possível estabelecer um perfil mutacional para cada subtipo histológico avaliado, nossos resultados abrem perspectivas para uma nova linha de pesquisa nos sarcomas de corpo do útero e certamente contribuem para um melhor entendimento dessas neoplasias / Uterine sarcomas are rare mesodermal tumors that comprise about 3% of all cancers in this organ. They present histological diversity, aggressive behavior, early dissemination and high mortality rates. Recently, carcinosarcomas (CCS) were histological reclassified as carcinomas. Here, we have included them in our series for purposes of comparison of the mesenchymal component and also because these tumors still form part of both the majority of studies and the WHO\'s latest classification for uterine sarcomas (Word Health Organization). Because of their diversity and rarity, there is no consensus regarding the risk factors for poor prognosis and appropriate treatment for these tumors. Thus, information about their gene and protein profiles can help in the diagnosis and prognosis of these tumors, as well as in the understanding of their biology and clinical behavior. We performed the New Generation Sequencing of 14 samples of uterine sarcomas (5 CCS, 4 LMS, 4 SEE and 1 ADS, using the Ion Proton System platform (ThermoFisher).) Among the 14 samples, we found 27 LoF (loss of gene function) and 40 missense mutations, with a mean of 39 insertions and 52 deletions per sample, totaling 70 mutations, 25 described in the COSMIC database. The most commonly mutated genes in our sample were TP53 (50%), KMT2D (36%), ATM (29%), DICER1 (21%), PIK3CA (21%), TRRAP (21%).Our main objective was to find specific mutations for each histological subtype, but only SEEs (PDE4DIP) and CCS (ERBB4 and PIK3CA) had specific mutations. In another analysis, we observed that all the histological subtypes share the KMT2D gene, which will be studied in future analyzes. Others analyzes, using a custom panel, are necessary to understand these mutations and its biological implication in uterine carcinosarcoma and sarcomas

O CBC é o câncer mais comum hoje, causado pela UV que ao atingir a pele origina mutações no DNA que se não reparadas podem levar a tumorigênese. Este estudo avalia seqüências repetitivas (microssatélites e RAPD) na busca de marcadores moleculares e de genes envolvidos no surgimento deste tipo de tumor. Os padrões foram obtidos por PCR utilizando como molde DNA genômico de tumores, pele normal e leucócitos. Foram avaliados 34 tumores. Alterações nos microssatélites foram correlacionadas com o CBC esclerodermiforme e nos RAPD (OPB-08) com tumores micronodulares. Alterações de microssatélites e RAPDs apresentam correlação com o maior número de lesões em um mesmo paciente. Indicando um acompanhamento mais atento de pacientes mais alterados. A busca de novos genes envolvidos no CBC identificou DENND1A no cromossomo 9, putativamente menos expresso em cânceres de pele, porém com relação indeterminada com a carcinogênese e BANP/SMAR1, supressor tumoral que atua na via do p53, afeta a transcrição da ciclina D1 e inibe a sinalização da via TGFb promovendo a carcinogênese / BCC is the most common cancer today, caused by UV that generates mutation on the DNA of skin cells, which if not repaired may lead to tumorigenesis. This study evaluates repetitive sequences (microsatellites and RAPD) searching for molecular markers and genes involved in the development of this tumor. The patterns were obtained by PCR using as template genomic DNA from 34 tumors, normal skin and leucocytes. Microsatellite alterations are correlated with sclerosing BCC and RAPDs with micronodular BCC (OPB-08). Alterations in microsatellites and RAPD are correlated with an increase in the number of tumors in a patient. This indicates a more careful follow up for the more altered patients. The search for new genes involved with BCC identified DENND1A on chromosome 9, putatively less expressed in skin cancers, whose relation to carcinogenesis is undetermined and BANP/SMAR1, a tumor suppressor acting on the p53 pathway, affecting cyclin D1 transcription and inhibiting TGFb signaling pathway, promoting carcinogenesis