Os hormônios tireoidianos (HTs) desempenham um papel importante em diversos processos, tais como o crescimento, desenvolvimento e metabolismo dos tecidos em geral. Embora estudos tenham demonstrado que os HTs agem diretamente nas células foliculares da tireoide reduzindo sua resposta ao TSH, pouco se sabe, a nível molecular, sobre essa e outras ações dos HTs na própria glândula tireoide. Nesse sentido, o objetivo do presente trabalho foi avaliar alterações no perfil de expressão gênica nas células foliculares tireoidianas (células PCCl3) em reposta ao tratamento com triiodotironina (T3). Após atingir confluência desejada, as células PCCl3 foram mantidas em meio depletado de HTs (grupo Hipo) por 24h. Após esse período, parte das células foi tratada com 10-7M de T3 (grupo T3) por 24 h. As células foram, então, lisadas para extração de RNA total para análise do transcriptoma, por RNAseq. Foi obtido como resultado, uma lista de genes diferencialmente expressos da qual foram selecionados cinco genes para validação in vitro (novo lote de células PCCl3 submetidas às mesmas condições descritas acima) e in vivo [ratos Wistar (250g), tratados por 4 semanas com T3 (1,5 μg/100g de peso corporeo; grupo hipertireoideo) ou PTU (10 μg/100g de peso corporeo; grupo hipotireoideo): o Slc16a1, que codifica o MCT8, responsável pelo transporte de T3 através da membrana, o Snrpd1, 9-March, Pfdn1 e Fam103a1, que codificam proteínas envolvidas no controle pós-transcricional e pós-traducional da expressão gênica. O tratamento com T3 estimulou a expressão dos genes Snrpd1, Pfdn1 e Fam103a1, enquanto reduziu a expressão de 9-March e Slc16a1. Juntos esses resultados demonstram a existência de um efeito autócrino exercido pelo T3 sobre o controle do seu próprio turnover proteico. / Thyroid hormones (HTs) play an important role in many processes, such as growth, development and metabolism of tissues in general. Although studies have shown that HTs act directly on follicular thyroid cells reducing their response to TSH, little is known, at the molecular level, about this and other actions of HTs in the thyroid gland itself. In this sense, the aim of the present study was to evaluate changes in the gene expression profile in the thyroid follicular cells (PCCl3 cells) in response to triiodothyronine (T3) treatment. After reaching 60% confluence, PCCl3 cells were maintained in HT depleted medium (Hypo group) for 24h. After this time, part of the cells was treated with 10-7M T3 (T3 group) for 24 h. Cells were then lysed for total RNA extraction for transcriptome analysis by RNAseq. As a result, a list of differentially expressed genes from which five genes for in vitro validation (PCCl3 cells under the same conditions described above) and in vivo [Wistar rats (250g), treated for 4 weeks with T3 (1.5 &um;g / 100 g body weight, hyperthyroid group) or PTU (10 &um;g / 100 g body weight; hypothyroid group): Slc16a1, which encodes MCT8, responsible for the transport of T3 through the membrane, Snrpd1, 9-March, Pfdn1 and Fam103a1, which encode proteins involved in post-transcriptional and post-translational control of gene expression. T3 treatment stimulated the expression of the Snrpd1, Pfdn1 and Fam103a1 genes, while reducing the expression of 9-March and Slc16a1. Together these results demonstrate the existence of an autocrine effect exerted by T3 on the control of its own protein turnover.

Orientador: Erick da Cruz Castelli / Resumo: O Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) é um complexo gênico que está intimamente envolvido com a regulação do sistema imune. Esse complexo comporta o sistema de Antígenos Leucocitários Humano (HLA), cuja principal importância está relacionada com o reconhecimento do que é próprio ou não do organismo. HLA-C é o gene polimórfico menos variável dos genes HLA clássicos e o que tem menor expressão nos tecidos, exceto na interface materno-fetal, em que é o único gene clássico expresso. A molécula codificada por esse gene possui significante função na apresentação antigênica e regulação da atividade de células NK, o que permite uma íntima associação com situações fisiológicas, como gestação, e patológicas, como doenças infecciosas, autoimunes, inflamatórias, neoplasias e rejeições a enxertos transplantados. Sua porção gênica mais estudada é a que codifica a fenda de ligação a peptídeos antigênicos, devido sua destacada importância na apresentação de antígenos a células T citotóxicas. No entanto, outras regiões do gene, que são negligenciadas nos estudos de variabilidade, também merecem destaque por influenciarem na sinalização e modulação da citotoxicidade de células efetoras, na ancoragem e estabilidade da molécula na membrana plasmática e na internalização e reciclagem da molécula HLA-C. Desta maneira, nós exploramos a variabilidade dos segmentos que codificam α3 (éxon 4), transmembrana (éxon 5) and cauda citoplasmática (éxon 6 and éxon 7) da molécula HLA-C em uma popu... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The Major Histocompatibility Complex (MHC) is a gene complex closely involved in the regulation of the immune system. This complex includes the Human Leukocyte Antigen (HLA) system, whose main role is related to the recognition of self/non-self structures of humans. HLA-C is the least variable polymorphic gene of classical HLA genes and has the lowest expression in tissues, except at the maternal-fetal interface, where it is the only classical HLA class I expressed gene. The molecule encoded by this gene has a significant role in the antigen presentation and regulation of NK cells activities, which allows an intimate association with physiological conditions, such as pregnancy, and pathological conditions like infectious, autoimmune, and inflammatory diseases, cancer, and transplantation rejection. The most studied HLA-C portion is that encoding the peptide-binding groove, due to its outstanding importance in presentation of antigens to cytotoxic T cells. However, other regions of the gene, which are neglected in the variability studies, are also important in influencing the signaling and modulation of effector cell cytotoxicity, in the anchorage and stability of the molecule on the cell surface, and in the internalization and recycling of the HLA-C molecule. Here, we explore the variability of the segments encoding the α3 (exon 4), transmembrane (exon 5) and cytoplasmic tail (exon 6 and exon 7) domains of the HLA-C molecule in an admixed population sample from Southeastern B... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Os sarcomas uterinos são tumores mesodérmicos raros que compreendem cerca de 3% de todos os cânceres nesse órgão. Apresentam diversidade histológica, comportamento agressivo, disseminação precoce e altas taxas mortalidade. Recentemente, os carcinossarcomas (CS) foram reclassificados histologicamente como carcinomas. Neste trabalho, os CS foram incluídos na casuística tanto para fins de comparação de seu componente mesenquimal, como por ainda fazerem parte da maioria dos estudos sobre sarcomas de corpo uterino e também da última classificação da WHO (Word Health Organization). Devido à sua diversidade e raridade, não há consenso relacionado aos fatores de risco para pior prognóstico e tratamento adequados para esses tumores. Informações sobre seus perfis gênicos e proteicos poderiam contribuir na caracterização de marcadores moleculares que auxiliassem no diagnóstico e prognóstico desses tumores, bem como no entendimento de sua biologia e comportamento clínico. Assim, nos propusemos a avaliar a presença de alterações gênicas nesses tumores, utilizando um painel de 409 genes, oncogenes e supressores de tumor, frequentemente mutados em tumores sólidos. Para isso, foram selecionadas 66 amostras, das quais 14 foram sequenciadas, incluindo, 5 carcinossarcomas (CCS), 4 leiomiossarcomas (LMS), 4 sarcomas de estroma endometrial (SEE) e 1 adenossarcoma (ADS). As reações foram realizadas utilizando a plataforma Ion Proton System (ThermoFisher) de Sequenciamento de Nova Geração. Nas 14 amostras encontramos 27 LoF e 40 mutações missenses, numa média de 39 inserções e 52 deleções por amostra, totalizando 70 mutações. Dessas, 25 encontram-se no banco de dados COSMIC. Os genes mais comumente mutados em nossa amostragem foram: TP53 (50%), KMT2D (36%), ATM (29%), DICER1 (21%), PIK3CA (21%), TRRAP (21%). Nosso objetivo principal era encontrar mutações específicas para cada subtipo histológico, porém apenas os SEEs (PDE4DIP) e os CCS (ERBB4 e PIK3CA) tiveram mutações especificas. Em outra análise, observamos que todos os subtipos histológicos compartilham o gene KMT2D. Embora não tenha sido possível estabelecer um perfil mutacional para cada subtipo histológico avaliado, nossos resultados abrem perspectivas para uma nova linha de pesquisa nos sarcomas de corpo do útero e certamente contribuem para um melhor entendimento dessas neoplasias / Uterine sarcomas are rare mesodermal tumors that comprise about 3% of all cancers in this organ. They present histological diversity, aggressive behavior, early dissemination and high mortality rates. Recently, carcinosarcomas (CCS) were histological reclassified as carcinomas. Here, we have included them in our series for purposes of comparison of the mesenchymal component and also because these tumors still form part of both the majority of studies and the WHO\'s latest classification for uterine sarcomas (Word Health Organization). Because of their diversity and rarity, there is no consensus regarding the risk factors for poor prognosis and appropriate treatment for these tumors. Thus, information about their gene and protein profiles can help in the diagnosis and prognosis of these tumors, as well as in the understanding of their biology and clinical behavior. We performed the New Generation Sequencing of 14 samples of uterine sarcomas (5 CCS, 4 LMS, 4 SEE and 1 ADS, using the Ion Proton System platform (ThermoFisher).) Among the 14 samples, we found 27 LoF (loss of gene function) and 40 missense mutations, with a mean of 39 insertions and 52 deletions per sample, totaling 70 mutations, 25 described in the COSMIC database. The most commonly mutated genes in our sample were TP53 (50%), KMT2D (36%), ATM (29%), DICER1 (21%), PIK3CA (21%), TRRAP (21%).Our main objective was to find specific mutations for each histological subtype, but only SEEs (PDE4DIP) and CCS (ERBB4 and PIK3CA) had specific mutations. In another analysis, we observed that all the histological subtypes share the KMT2D gene, which will be studied in future analyzes. Others analyzes, using a custom panel, are necessary to understand these mutations and its biological implication in uterine carcinosarcoma and sarcomas

Submitted by Livia Mello (liviacmello@yahoo.com.br) on 2016-10-14T19:44:04Z No. of bitstreams: 1 TeseBGR.pdf: 2376550 bytes, checksum: 4ee6a0f02e589ae693965093fa4f2f42 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-11-08T18:48:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseBGR.pdf: 2376550 bytes, checksum: 4ee6a0f02e589ae693965093fa4f2f42 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-11-08T18:48:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseBGR.pdf: 2376550 bytes, checksum: 4ee6a0f02e589ae693965093fa4f2f42 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-08T18:48:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseBGR.pdf: 2376550 bytes, checksum: 4ee6a0f02e589ae693965093fa4f2f42 (MD5) Previous issue date: 2016-03-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / The Human Papiloma Virus (HPV) is a Sexually Transmitted Disease (STD) very common in the world. It infects the human epithelium may persisting of asymptomatic form or causing some neoplasia. Many studies report the association between HPV and many kinds of cancer such as: lap utero, anus, penis, vagina and vulva. According to INCA data for the year of 2016 are expected 16.340 new cases of lap utero cancer, being the second most frequent case in the female population in Brazil. For the recognition of the virus, there`s a lots of tracking methods, as morphological test (pap test), that observes cytopathic effects caused by the virus on human cells, suggesting the existence of infection, however this type of test presents low results and has shown high taxes of false negative and positive results. To overcome this problems, countless studies has shown the effect of molecular techniques utilization to increase the sensibility and especially, getting recognize and genotyping the HPV virus. On this recent studies, were tested distinct molecular techniques for typing the HPV virus, as Conventional PCR followed by Sanger Sequencing , Real time PCR (SYBRGreen® e Taqman ®) and Sequencing of New Generation. Altogether were collected 318 samples pf cervix grated, and from this material were collected the DNA using an adapted protocol (POWELL; GANNON, 2002). Using the conventional PCR technique followed by Sanger Sequencing we obtained 65 positives samples for the HPV(21%), in 49 samples(75,3%) it was possible to identify the HPV type, in the other 16 samples(24,7%) it was not possible the identification, probably because the infection was formed for two or more types of the virus. With the real time PCR technique using SYBRGreen®, were accomplished an experimente with 30 samples, which was possible to confirm the results in 28 of it, using Sanger Sequencing. In two samples the results are not confirmed, being possible to positive the sample, showing high sensibility of the real time PCR technique. The methodology of New Generation Sequencing (NGS) it showed useful for HPV identification, being one of the first studies published for routine use. And it has great prospects because besides HPV can identify other microorganisms in the sample and quantifies them as well. / O Papilomavírus humano conhecido como HPV é uma doença sexualmente transmissível frequente em todo mundo, ele infecta o epitélio de seres humanos, podendo persistir de forma assintomática ou causar neoplasias. Diversos estudos relatam a associação entre o HPV (Alto Risco) e diversos tipos de câncer como: colo de útero, ânus, orofaringe, pênis, vagina e vulva. Segundo dados do INCA para o ano de 2016, são esperados 16.340 novos casos de câncer de colo de útero, sendo de maior frequência na população feminina no Brasil. Para a identificação do vírus existem inúmeros métodos de rastreio como testes morfológicos (exame do Papanicolau), que observam os efeitos citopáticos que o vírus provoca nas células sugerindo a existência da infecção, mas este tipo de teste apresenta baixa especificidade e vem apresentando altas taxas de falsos-negativos e positivos. Para contornar estes problemas inúmeros estudos têm demostrando a eficácia da utilização de técnicas moleculares, para aumentar a sensibilidade e especificidade, conseguindo identificar e genotipar o vírus do HPV. No presente estudo foram testadas diferentes técnicas moleculares para a identificação do vírus do HPV como: PCR convencional seguida por sequenciamento Sanger, PCR em tempo real (SYBRGreen® e Taqman®) e sequenciamento de nova geração. Ao todo foram coletadas 318 de amostras de raspado do colo cervical. Deste material foi extraído o DNA utilizando um protocolo adaptado (POWELL, GANNON, 2002). Utilizando a técnica da PCR convencional seguida por sequenciamento Sanger obtivemos 65 amostras positivas para o HPV (21%), destas 49 amostras (75,3%) foi possível identificar o tipo do HPV e em 16 casos (24,7%) não foi possível identificar o vírus, sendo possivelmente uma infecção formada por dois ou mais tipos do vírus. Com a técnica de PCR em tempo real utilizando SYBRGreen® foi realizado um experimento com 30 amostras sendo possível confirma o resultado destas com o sequenciamento Sanger em 28 casos. Em duas amostras os resultados não corroboraram, sendo possível positivar a amostra. Mostrando a maior sensibilidade da técnica de PCR em tempo real. A metodologia de sequenciamento de nova geração (NGS) se mostrou útil para identificação do HPV, demonstrada neste trabalho de maneira inédita. O uso do NGS apresenta boas perspectivas pois além do HPV pode identificar outros microrganismos na amostra e quantifica-los.

Submitted by Aelson Maciera (aelsoncm@terra.com.br) on 2017-04-25T19:44:33Z No. of bitstreams: 1 DissVSK.pdf: 2947181 bytes, checksum: 3c3bd8a24247cda4927887b3e6e3218b (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-05-02T13:09:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissVSK.pdf: 2947181 bytes, checksum: 3c3bd8a24247cda4927887b3e6e3218b (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-05-02T13:10:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissVSK.pdf: 2947181 bytes, checksum: 3c3bd8a24247cda4927887b3e6e3218b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-02T13:14:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissVSK.pdf: 2947181 bytes, checksum: 3c3bd8a24247cda4927887b3e6e3218b (MD5) Previous issue date: 2016-09-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / The relationship between latitude and microbial diversity in the ocean is controversial. Niche models predict higher richness at high latitudes in winter, while snapshot field-sampling point towards higher richness at intermediate latitudes, with lower values both towards equatorial and Polar Regions. However, given the dynamic nature of ocean’s ecosystem it is difficult to account for temporal variations in empirical assessments of microbial biodiversity. Here, we compared the components of diversity (richness and evenness) and microbial population stability (coefficient of variation) in two coastal ocean observatories with similar trophic state located in contrasting latitudes, one located in the Equatorial Atlantic Ocean, and one temperate located in the Northwestern Mediterranean Sea, to evaluate which factors drive the dynamics of microbial communities in each site. Our observations support the view that, as animals and plants, microbial communities exhibit higher (or at least similar) richness towards the equator, at least in the coastal ocean. We also found evidence of increasing stability with increasing evenness in tropical microbial communities when compared to the temperate ones. Temperature and silicates drove temperate free-living prokaryotic communities, while tropical ones were driven by stochastic factors such as biotic interactions with eukaryotes. We propose a conceptual framework where microbial community composition would be driven by deterministic factors in higher latitudes and once the factor temperature is removed moving towards the equator, more stochastic factors such as biotic interactions would emerge as the main factors shaping microbial communities. This study highlights the importance of comparative studies on Eulerian time-series distributed at different latitudes to fully understand the diversity patterns of microbial communities in the ocean. / A relação entre a latitude e diversidade microbiana no oceano é controversa. Modelos de nicho preveem maior riqueza em altas latitudes no inverno, enquanto amostragens pontuais indicam uma maior riqueza em latitudes intermediárias, com valores mais baixos para regiões equatoriais e polares. No entanto, dada a natureza dinâmica do ecossistema oceânico, é difícil explicar variações temporais da biodiversidade microbiana nas avaliações empíricas. Nesse trabalho comparamos os componentes da diversidade (riqueza e equitabilidade) e estabilidade das populações microbianas (coeficiente de variação) em dois observatórios oceânicos costeiros com estados tróficos semelhantes, localizados em latitudes contrastantes: um localizado no Oceano Atlântico Equatorial e um em clima temperado localizado no noroeste do Mar Mediterrâneo, a fim de avaliar quais fatores estruturam a dinâmica das comunidades microbianas em cada local. Observamos que tal como animais e plantas, as comunidades microbianas exibem maior (ou pelo menos similar) riqueza no equador pelo menos em águas costeiras. Também encontramos evidências de aumento da estabilidade com o aumento da uniformidade nas comunidades microbianas tropicais, quando comparadas com as de clima temperado. De modo geral, temperatura e silicatos foram as variáveis que condicionaram as comunidades procariotas de vida livre no observatório da região temperada, enquanto que no observatório tropical, fatores estocásticos tais como interações bióticas com eucariotos, foram os fatores que mais influenciaram as comunidades bacterianas. Assim, propomos um quadro conceitual onde a composição da comunidade microbiana seria impulsionada por fatores determinísticos em latitudes mais elevadas, enquanto que em latitudes menores, seriam determinados por fatores mais estocásticos, como interações bióticas. Nosso estudo destaca a importância de estudos comparativos utilizando series temporais Eulerianas em diferentes latitudes para entender os padrões de diversidade das comunidades microbianas no oceano.

Submitted by Simone Souza (simonecgsouza@hotmail.com) on 2018-05-02T17:09:56Z No. of bitstreams: 1 DISS_2015_Mayara Inácio Vincenzi da Silva.pdf: 1467868 bytes, checksum: 1589e777267d83f74d5b55da57e6a5db (MD5) / Approved for entry into archive by Jordan (jordanbiblio@gmail.com) on 2018-05-16T15:13:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISS_2015_Mayara Inácio Vincenzi da Silva.pdf: 1467868 bytes, checksum: 1589e777267d83f74d5b55da57e6a5db (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-16T15:13:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISS_2015_Mayara Inácio Vincenzi da Silva.pdf: 1467868 bytes, checksum: 1589e777267d83f74d5b55da57e6a5db (MD5) Previous issue date: 2015-08-07 / CAPES / Ferro (Fe) é um elemento essencial e a capacidade de adquiri-lo in vivo têm sido descrita em diversos agentes patogênicos através de fatores de virulência. Análises globais de transcritos durante a privação de ferro tem sido descritos através da técnica de “microarray”, entretanto através da técnica de RNA-seq recentemente tem demonstrado resultados superiores. O isolado de Pasteurella multocida (Pm 16759) altamente patogênica em suínos foi cultivado em duas condições com diferentes concentrações de Fe (controle e privação) com o objetivo de analisar transcritos diferencialmente expressos. O RNA total das duas condições foi extraído e sequenciado através da plataforma de nova geração Ion Torrent. Os dados foram analisados no Software Ion Reporter™ e processados no programa Rockhopper. Foram obtidas 1.341.615 leituras com tamanho médio de 81pb, com 96% de alinhamento com o genoma de Pasteurella multocida subsp. multocida 3480 e 98,8% de acurácia. No mapeamento das leituras das duas condições, observou-se 2,652 transcritos e destes, 177 (6,7%) foram diferencialmente expressos, sendo 93 na condição controle (Fe+) e 84 na condição de privação (Fe-). Na condição de privação de ferro, o perfil de transcritos foram associados a função de transporte celular (fbpABC, high-affinity Fe2+/Pb2+ permease e periplasmic protein probably involved in hight-affinity Fe2+), reguladores transcricionais e proteínas hipotéticas. O perfil na condição controle (Fe+) apresentou transcritos diferencialmente expressos associados ao RNAs anti-sense (asRNA) e genes do metabolismo energético (fructose-1,6-bisfosfatase). A técnica de RNA-seq mostrou-se eficiente na identificação de transcritos diferencialmente expressos por P. multocida em condições de privação de Fe, o que pode auxiliar nos estudos de patogenicidade. / Iron (Fe) is an essential element and the ability to acquire it, in vivo, have been described in several pathogens such as virulence factors. Global analyses of transcripts during iron deprivation have been described by microarray studies, however, recently RNA-seq analysis shows superior results. The high pathogenic swine strain of Pasteurella multocida (BRMSA 1113) was grown in the two conditions with different concentrations of Fe (control and deprivation) in order to analyze the differentially expressed transcripts. The total RNA of the two conditions was extracted and sequenced by new generation Ion Torrent plataform. Data were analyzed in Ion Reporter ™ Software and processed in Rockhopper software. Sequence analysis shows 1,341,615 readings with median length of 81pb, with 96% of alignment to the reference genome Pasteurella multocida strain 3489, and 98.8% accuracy. Reads mapping to genome of P. multocida in these two conditions, detected 2,652 transcripts, which , 177 (6.7%) were differentially expressed, with 93 in the control condition (Fe +) and 84 provided with iron deprivation condition (Fe-). In condition (Fe-), differential expressed transcript profile were associated to function of cellular transport (fbpABC,, high-affinity Fe2+/Pb2+ permease and periplasmic protein probably involved in hight-affinity Fe2+), transcptional regulators and hypothetical proteins. The control condition (Fe+) shows differential expressed transcripts profile associated to RNA anti-sense (asRNA) energetic metabolism genes (fructose-1,6-bisphosphatase). The technique of RNA-seq proved effective in identifying novel differentially expressed transcripts by P. multocida (BRMSA 1113) under conditions of Fe deprivation, which can assist in pathogenicity studies.

INTRODUÇÃO: A doença de Chagas é causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi (T. cruzi) e ainda hoje representa um grande problema de saúde pública tendo infectado mais de oito milhões de pessoas. A patogênese da cardiomiopatia chagásica ainda não é completamente compreendida. A inflamação no miocárdio é intensa em relação ao número de parasitos presentes e também se observa um dano progressivo em outros órgãos como esôfago e cólon em 30% a 40% dos casos em que se diagnosticou a doença. Alguns estudos começaram a mostrar que a resposta imunológica a um parasita pode depender da microbiota intestinal; porém, ainda não existem estudos com a tecnologia de sequenciamento de nova geração (NGS) que descrevam a microbiota intestinal em doença de Chagas. É possível que uma pequena alteração do peristaltismo intestinal, decorrente da infecção por T. cruzi possa alterar a colonização de algumas bactérias as quais podem causar mudanças na reatividade do sistema imune como aumentar a resposta autoimune, gerando maior dano ao coração. OBJETIVO: Este trabalho objetivou descrever a microbiota intestinal de acordo com a forma clínica da doença de Chagas, através da amplificação do gene 16s RNA ribossomal e avaliar seu papel na patogênese da doença. MÉTODO: Foram selecionados 114 indivíduos, sendo 30 portadores da forma cardíaca da doença, 11 com a forma digestiva (megacólon), 32 com a indeterminada e 31 indivíduos saudáveis (controles). De cada um deles, foram coletadas amostras de fezes para a análise da microbiota por meio de técnicas de sequenciamento de nova geração Ion Torrent. Os resultados obtidos foram analisados pelo software QIIME para determinar a população de bactérias presentes nas amostras. A análise estatística foi realizada utilizando-se os testes não paramétricos de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney U-test. RESULTADOS: A frequência relativa do filo Verucomicrobia foi significantemente menor no grupo cardíaco em comparação ao grupo controle e as outras formas clínicas: indeterminada e digestiva. Apesar da abundância relativa desse filo ser menor do que 1%, a diferença observada se manteve significante, mesmo após a correção de Bonferroni. CONCLUSÕES: Nosso estudo sugere que uma menor proporção do filo Verrucomicrobia possa estar relacionada ao processo inflamatório na forma cardíaca; porém, ainda pouco se conhece sobre este grupo de bactérias e seus componentes, que nos permita afirmar o seu efetivo papel na forma cardíaca da doença de Chagas / INTRODUCTION: Chagas disease is caused by the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi (T.cruzi) and still represents a major public health problem with more than eight million people infected. Chagas cardiomyopathy pathogenesis is still not completely understood. Inflammation in the myocardium is intense in relation to the number of parasites present and progressive damage is also observed in other organs such as the esophagus and colon in 30% to 40% of the cases. Some studies are beginning to show that the immune response to a parasite may depend on the intestinal microbiota. However, there are no studies using NGS technology that describes the intestinal microbiota of Chagas disease. It is possible that a small change in intestinal peristalsis due to T cruzi infection may alter the colonization of some bacteria. These changes could cause changes in the reactivity of the immune system such as increasing the autoimmune response causing greater damage to the heart. OBJECTIVE: This study aimed to describe the intestinal microbiota according to the clinical form of Chagas disease, through amplification of the 16s ribosomal RNA gene and to evaluate its role in the pathogenesis of the disease. METHODS: A total of 114 individuals were selected, 30 of cardiac form of the disease, 11 with the digestive form (megacolon), 32 with indeterminate form and 31 healthy individuals (controls). Stool samples were collected and analysed for the microbiota using Ion Torrent sequencing technique. The results were analyzed by the QIIME software to determine the population of bacteria present in the samples. Statistical was performed using Kruskal-Wallis non-parametric test and Mann-Whitney U-test. RESULTS: The relative frequency of the Verrucomicrobia phylum was significantly lower among the cardiac group when compared to control, indeterminate and digestive form. Our study suggest that the phylum Verrucomicrobia may play a role in the miocardio inflammation process in Chagas disease, however little is known about these bacteria to infer the mechanism

O gene fator regulador de interferon 4 (IRF4), localizado na região cromossômica 6p25- p23, é um membro da família de fatores reguladores de interferon (IRF), um grupo de fatores de transcrição de ligação ao DNA, sendo IRF4 primariamente associado ao desenvolvimento e resposta imune e expresso exclusivamente em células do sistema imunológico e em linhagens melanocíticas. Embora muitos estudos tenham associado IRF4 a diversas condições, como melanoma e leucemia linfocítica crônica, um recente Genome-Wide Association Study (GWAS) identificou que alelos do SNP rs12203592 (intron 4) estão associados com variação fenotípica em relação à presença de sardas, pigmentação da pele, cabelos e olhos. Estudos funcionais realizados em células melanocíticas humanas e de camundongos revelaram que este SNP está diretamente envolvido na regulação da expressão de IRF4, sugerindo uma clara função na pigmentação do melanócito. Apesar destes achados, a diversidade das regiões regulatórias e codificadora de IRF4 não foi até o momento analisada em populações miscigenadas. A fim de avaliar se outros sítios de variação ao longo do gene IRF4 podem estar associados à pigmentação humana, as regiões regulatórias (promotora e 3´UTR) e codificadora (9 exons e regiões intrônicas flanqueadoras, incluindo o SNP rs12203592) foram analisadas por sequenciamento de nova geração em uma amostra miscigenada da população brasileira. A amostra populacional foi composta por 228 indivíduos não aparentados de Ribeirão Preto, estado de São Paulo, Brasil, os quais foram estratificados de acordo com a pigmentação da pele (clara, média e escura), olhos (azul, verde, castanho-claros e castanho-escuros), cabelo (ruivo, loiro-claro, loiroescuro, castanho-claro, castanho-escuro e preto) bem como em relação à presença de sardas e intensidade de cabelos grisalhos. Bibliotecas de DNA foram preparadas utilizando o Sistema de Enriquecimento de Alvo Haloplex (Agilent Technologies) e sequenciadas na plataforma MiSeq (Illumina). Os pacotes de software CutAdapt, BWA and GATK foram utilizados, respectivamente, para trimagem das sequências dos adaptadores, alinhamento e identificação de variantes. Haplótipos e alelos não identificados foram inferidos pelo método PHASE, embora a fase conhecida entre os sítios de variação (obtida pelo GATK) tenha sido levada em consideração. Um total de 105 sítios de variação foram identificados. Apenas dois deles apresentaram frequências genotípicas que não atendem ao esperado pelo equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW). Dezoito destes SNPs apresentaram forte associação a pelo menos uma característica de pigmentação. Entretanto, se a conservadora correção de Bonferroni para múltiplos testes for levada em consideração, apenas duas associações, ambas envolvendo o SNP rs12203592, permanecem significativas: a associação do alelo T com pele clara e olhos azuis. Este resultado está de acordo com estudos prévios, que reportam que o alelo rs12203592*T leva a uma menor ativação de IRF4 e a uma expressão reduzida da tirosinase, resultando em sensibilidade ao sol e olhos azuis. Foi inferido um total de 101 haplótipos, estando a distribuição destes de acordo com o esperado pelo EHW. Quando os haplótipos foram divididos em haplótipos da promotora, codificadora e 3´UTR foram observadas, respectivamente, 17, 29 e 37 diferentes combinações haplotípicas. Várias associações foram identificadas, particularmente envolvendo o haplótipo mais frequente da promotora, os dois haplótipos mais frequentes da codificadora e o haplótipo mais frequente da 3´UTR, todos associados com pele clara, olhos azuis, cabelos castanhos e cabelos grisalhos. Estes resultados sugerem que outras variantes além de rs12203592, quando consideradas em um contexto haplotípico, são associadas com a pigmentação humana. / The Interferon Regulatory Factor 4 (IRF4) gene, located at chromosomal region 6p25- p23, is a member of the interferon regulatory factor (IRF) family, a group of DNAbinding transcription factors, with the IRF4 primarily associated with immune system development and response and expressed exclusively in immune system cells and melanocytic lineages. Although many studies have shown that IRF4 is associated with many human conditions, such as melanoma and chronic lymphocytic leukemia, a recent Genome-Wide Association Study (GWAS) identified that alleles from the SNP rs12203592 (intron 4) is also associated with phenotypic variation regarding presence of freckles, hair, eye and skin pigmentation. Functional studies in human and mice melanin-containing cells revealed that such SNP is directly involved in the regulation of IRF4 expression, suggesting a clear role in melanocyte pigmentation. In spite of these findings, the regulatory and coding IRF4 diversities in admixed populations have not been evaluated so far. In order to verify if other variation sites spread across the IRF4 gene may be associated with human pigmentation, the regulatory (promoter and 3\'UTR regions) and coding (9 exons and flanking intronic regions, including the SNP rs12203592) regions were analyzed by next-generation sequencing procedures in a Brazilian admixed population sample. The population sample was composed of 228 unrelated individuals from the Ribeirão Preto area, São Paulo State, Brazil, which were stratified according to eye (blue, green, hazel, light-brown, and dark-brown), hair (red, blond, dark-blond, light-brown, dark-brown and black) and skin (light, intermediate and dark) pigmentation, as well as regarding the presence of freckles and intensity of hair greying. DNA libraries were prepared using the Haloplex Target Enrichment System (Agilent Technologies) and sequenced at the MiSeq platform (Illumina). CutAdapt, BWA and GATK software packages were used for trimming adaptor sequences, alignment and genotype calling, respectively. Missing alleles and haplotypes were inferred by using the PHASE method, although the known phase between variable sites (obtained by GATK) was taken into account. A total of 105 variation sites were identified. Only two of them presented genotype frequencies that did not fit Hardy- Weinberg equilibrium (HWE) expectations. Eighteen of these SNPs presented strong association with at least one pigmentation feature. However, if the conservative Bonferroni correction for multiple tests is taken into account, only two associations, both of them involving the rs12203592 SNP, remain significant: allele T associated with light skin and blue eyes. This result is in agreement with previous reports that the rs12203592*T allele leads to reduced IRF4 activation and reduced tyrosinase expression, leading to sun sensitivity and blue eyes. A total of 101 different haplotypes were inferred, and haplotype distribution was in agreement to HWE expectations. When haplotypes were subdivided in promoter, coding and 3\'UTR haplotypes, 17, 29 and 37 different haplotypes were observed, respectively. Various associations were identified, particularly involving the most frequent promoter haplotype, the two most frequent coding (only one of them with allele rs12203592*T), and the most frequent 3\'UTR, all of them with light skin, blue eyes, brown hair and hair greying. These results suggest that other variation sites besides rs12203592, when considered in a haplotypic background, are associated with human pigmentation.

Aproximadamente 4% das pacientes com câncer de mama têm o diagnóstico abaixo dos 36 anos. Mutação germinativa nos genes BRCA1 ou BRCA2 pode ser um dos fatores de predisposição e a identificação de pacientes carreadoras pode permitir o direcionamento do tratamento e o aconselhamento familiar para medidas de prevenção e detecção precoce. Entretanto, a maioria das pacientes apresenta câncer esporádico e fatores predisponentes são menos evidentes. Para estas pacientes, a identificação de mutações somáticas pode permitir a melhor compreensão da biologia da doença e o desenvolvimento de tratamentos dirigidos a alvos moleculares. Assim, nossos objetivos foram avaliar em pacientes jovens com câncer de mama: história familiar, hábitos de vida, mutação germinativa nos genes BRCA1 e BRCA2 e mutações somáticas no tumor. Oitenta e três pacientes diagnosticadas com câncer de mama entre 18-35 anos foram entrevistadas usando um questionário. O DNA foi extraído do sangue periférico e toda região codificadora dos genes BRCA1/2 foi sequenciada pelo método de sequenciamento de Sanger e a pesquisa de grandes deleções e inserções foi realizada por Amplificação Dependente da Ligação de Múltiplas Sondas (MLPA). Os resultados foram analisados utilizando-se os programas Mutation Surveyor v.3.20 e Chromas version 2.13 e as mutações foram caracterizadas utilizando-se os bancos de dados BIC, LOVD, LOVD-IARC, UMD e ClinVar. O sequenciamento completo do exoma foi realizado em amostras de sangue e tumor fresco congelado de oito pacientes (receptor hormonal positivo, HER2 negativo e BRCA1/2 tipo selvagem) usando Nextera Rapid Capture Enrichment e sequenciadas no Illumina HiSeq 1000. Para detecção de alterações somáticas provenientes do sequenciamento completo do exoma, foi utilizado o programa SomaticSniper (v1.0.2). Foi também analisada a presença de mutação somática no gene PIK3CA em amostras tumorais em blocos de parafina de pacientes jovens e pacientes mais idosas com câncer de mama. Além disso, foi realizada uma meta análise para avaliar se mutação somática nos cinco genes mais frequentemente mutados em câncer de mama estão associados à idade precoce. A idade mediana das 83 pacientes ao diagnóstico foi 32 anos (22-35 anos); idade mediana da menarca foi 13 anos (8-19 anos); 71,1% já passaram por pelo menos uma gestação a termo com idade mediana de 22 anos (14-34 anos); 80,7% nunca fumaram; 74,7% não ingerem bebida alcoólica regularmente; a média para índice de massa corpórea foi 25,26 (10,78-41,57). A maioria das pacientes teve diagnóstico de carcinoma ductal invasivo (89,3%), grau histológico III (49,4%), subtipo luminal (65,9%) e com expressão de Ki67 >14% (89,2%). Aproximadamente 52% das pacientes relataram história familiar para câncer de mama, ovário ou próstata. Mutações deletérias nos genes BRCA1/2 foram detectadas em 13 pacientes (BRCA1, n= 4 e BRCA2, n= 9). Uma mutação nova, que gera um códon de terminação (c.483T>A; p.Cys161Ter), foi detectada no exon 6 do gene BRCA2. O sequenciamento do exoma foi realizado em amostras de oito pacientes carreadoras de BRCA1/2 tipo selvagem e tumor subtipo luminal e revelou uma média de 39 alterações somáticas por tumor (variando entre 19-74). Foram observadas alterações com potencial driver em 53 genes, como PIK3CA, PRKD1, PRKAR1A e PIK3AP1, que codificam proteínas tirosina quinase ou proteínas envolvidas na regulação de proteínas quinases; e no gene POLD1, que codifica a subunidade catalítica da polimerase delta, com papel na replicação e reparo do DNA. Em uma meta análise observamos que a mutação somática no gene PIK3CA é relativamente frequente em pacientes jovens e idosas. Concluindo, mais de 15% das pacientes jovens são carreadoras de mutação deletéria nos genes BRCA1 ou BRCA2. Em pacientes com câncer esporádico foram encontradas mutações somáticas em genes que codificam proteínas tirosina quinase ou proteínas envolvidas em reparo de DNA. Em consonância com o observado em tumores de pacientes mais idosas, mutação somática no gene PIK3CA é relativamente frequente em tumores de pacientes jovens / Approximately 4% of the breast cancer patients have their diagnosis under the age of 36 years and germline mutations in BRCA1 or BRCA2 genes is one of the predisposing factors. Identification of patients who are mutation carriers may contribute for the adoption of targeted therapies and for genetic counseling of their family members for early detection or preventive measures. However, most patients present with sporadic cancer where predisposing factors are less understood. In the latter group of patients, the identification of somatic mutations may contribute to a better understanding of the biology of the disease and to the development of molecular targeted therapies. Therefore, our goals were to characterize early onset breast cancer patients for family history, lifestyle, germline mutations in BRCA1 and BRCA2 genes and somatic mutations. Eighty-three breast cancer patients aged 18-35 years were interviewed using a questionnaire. DNA was extracted from peripheral blood and all coding regions of BRCA1/2 genes were screened by Sanger sequencing and large deletions and insertions were examined by Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA). Results were analyzed through Mutation Surveyor v.3.20 and Chromas version 2.13 and searched in BIC Database, LOVD, LOVD-IARC, UMD and ClinVar. Whole exome sequencing was performed in blood and fresh-frozen tumor samples from eight patients (hormone receptor positive, HER2 negative and BRCA1/2 wild type) using Nextera Rapid Capture Enrichment in an Illumina HiSeq 1000. To detect somatic SNVs from whole exome sequencing data, SomaticSniper (v1.0.2) was used. Somatic mutation in PIK3CA gene was then searched in Formaldehyde Fixed-Paraffin Embedded samples from another group of young and older breast cancer patients. In addition, a metaanalysis was performed to evaluate whether somatic mutations in the five genes most frequently mutated in breast cancer patients were associated with an early age onset. Median age of 83 patients at diagnosis was 32 years (22-35y), median age of menarche was 13 years (8-19y); 71.1% patients had at least one born child, median age of first pregnancy was 22 years (14-34y); 80.7% were never smokers; 74.7% reported no regular alcoholic drinking; median body mass index was 25.26 (10.78-41.57). Most patients presented with invasive ductal carcinoma (89.3%), histological grade III (49.4%), luminal subtype (65.9%) and Ki67 expression > 14% (89.2). Approximately 52% of the patients reported a positive family history for breast, ovarian or prostate cancer. Deleterious mutations in BRCA1/2 genes ware detected in 13 patients (BRCA1, n= 4 and BRCA2, n= 9). One novel mutation was detected in BRCA1 gene: a stop codon in exon 6 (c.483T > A; p.Cys161Ter). Exome sequencing was evaluated in eight luminal tumors fromBRCA1/2 wild type patients and a median of 39 somatic alterations/tumor was detected, varying from 17 to 74. Potential driver alterations were detected in 53 genes, such as PIK3CA, PRKD1, PRKAR1A and PIK3AP1, that encode tyrosine kinase proteins or proteins involved in tyrosine kinases regulation; and POLD1 gene, that encodes the catalytic subunit of DNA polymerase delta which plays a critical role in DNA replication and repair. A Meta-analysis showed that somatic mutation in PIK3CA gene was frequently detected in both young and older patients. In conclusion, more than 15% of the young breast cancer patients are BRCA1 or BRCA2 mutation carriers. In patients with sporadic cancer somatic mutations were found in genes that encode tyrosine kinase proteins or are involved in the DNA repair. In agreement with what was observed in tumors from older patients, somatic mutation in PIK3CA gene is relatively frequent in tumors from young patients

A mastite bovina é considerada a doença de maior impacto nos rebanhos leiteiros, exercendo efeito econômico negativo sobre a produtividade e perdas significativas à indústria de laticínios. Tendo em vista os impactos na sanidade animal e os prejuízos econômicos acarretados, o objetivo deste estudo foi caracterizar de forma mais abrangente a comunidade microbiana presente em rebanhos leiteiros com mastite subclínica utilizado o sequenciamento parcial do gene 16S ribossomal RNA (rRNA). Especificamente, foram caracterizadas as comunidades bacterianas presentes em amostras de leite vindas de três fazendas comerciais, sendo que cada fazenda contribuiu com amostras com alta contagem de células somáticas (CCS > 200.000 cel./mL) e com baixa contagem (CCS < 200.000 cel./mL) perfazendo um total de 57 animais. O DNA total foi extraído e amplificado com os oligonucleotídeos iniciadores da região V3 e V4 do gene 16S rRNA. O sequenciamento foi realizado utilizando a tecnologia de sequenciamento de nova geração através do equipamento MiSeq (Illumina - San Diego, EUA). Para efeito de comparação, alíquotas de todas as amostras foram destinadas ao cultivo microbiológico para identificação de bactérias causadoras da mastite. Os fragmentos amplicons de todas as amostras foram submetidos a uma série de análises computacionais utilizando o programa QIIME. Após a avaliação adicional das sequências em nível de espécie, verificou-se que em geral as bactérias diagnosticadas por cultura geralmente não corresponderam com as sequências mais abundantes detectadas pelo sequenciamento. A análise da composição da microbiota de amostras de leite provenientes de animais saudáveis revelou a presença de uma grande diversidade de espécies bacterianas, mesmo que nenhuma bactéria tenha sido detectada por técnica de cultura. A espécie bacteriana mais abundante em todas as amostras foi Staphylococcus chromogenes. Staphylococcus aureus também foi detectada na grande maioria das amostras As diferenças na composição microbiana foram observadas entre as amostras quando a comparação foi feita de forma individual. Estas diferenças foram notórias em composição taxonômica e foram refletidas por intermédio das estimativas de alfa e beta diversidade. Quando a comparação foi realizada por separação de grupos com alta e baixa CCS, essa diferença não foi tão evidente. Com este estudo será possível compreender a diversidade dos microrganismos presentes na glândula mamária de animais saudáveis e com mastite subclínica. Essas informações podem ser úteis podendo contribuir no planejamento de medidas terapêuticas e preventivas mais eficazes da doença. / Bovine mastitis is considered the most impact disease in dairy herds, exerting negative economic effect on productivity and significant losses to the dairy industry. In view of the impact on animal health and carted economic losses, the objective of this study was to characterize more comprehensively the microbial community present in dairy herds with subclinical mastitis using the partial sequencing of 16S ribosomal RNA gene (rRNA). Specifically, the bacterial communities present in samples of milk coming from three commercial farms were identified, and each farm contributed samples with high somatic cell count (SCC> 200,000 cel./mL) and low count (SCC <200,000 cel./ml) for a total of 57 animals. Total DNA was extracted and amplified with primers of the V3 and V4 region of the 16S rRNA gene. Sequencing was performed using the new generation of sequencing technology through MiSeq equipment (Illumina - San Diego, USA). For comparison, aliquots of all samples were intended for microbiological culture for identification of bacteria which cause mastitis. The amplicon fragments of all samples were subjected to a series of computer analyzes using the QIIME program. After further evaluation of the sequences at the species level, it was found that in general the bacteria do not generally diagnosed by culture corresponded to the most abundant sequences identified by sequencing. The analysis of milk samples from microbial composition from healthy animals revealed the presence of a diversity of bacterial species, even though no bacteria have been detected by culture technique. The most abundant bacterial species in all samples was Staphylococcus chromogenes. Staphylococcus aureus was also detected in most samples differences in microbial composition were found between the samples when a comparison was made individually. These differences were noticeable in taxonomic composition and were reflected by means of the estimates of alpha and beta diversity. When comparison was performed by separation of high and low groups with CCS, this difference was not so evident. This study will be possible to understand the diversity of microorganisms present in the mammary gland of healthy animals and with subclinical mastitis. This information can be useful and can contribute in the planning of more effective therapeutic and preventive measures of the disease.