Os rotavírus do grupo A (RVA) são importantes causadores de diarreias virais em crianças e animais jovens de diferentes espécies, com impactos na saúde pública e animal. Visando contribuir para o entendimento e prevenção das rotaviroses assim como suas possíveis relações zoonóticas, caracterizou-se os 11 segmentos de dsRNA de rotavírus codificadores das proteínas estruturais e não estruturais presentes em amostras fecais positivas de suínos coletadas nos anos de 2012-2013, em 2 estados brasileiros. Mediante o emprego de RT-PCR, sequenciamento nucleotídico e análises filogenéticas, todos os segmentos genéticos oriundos de 12 amostras de RVA detectados em suínos foram analisados e comparados com os de outras amostras descritas previamente. As sequências obtidas para os genes codificadores das proteínas NSP2, NSP3 e VP6 contemplaram a open reading frame (ORF) completa do gene, enquanto que a ORF parcial foi determinada para os genes codificadores das proteínas VP1, VP2, VP3, VP4, VP7, NSP1, NSP4, NSP5 e NSP6. Os genotipos de rotavírus suíno provenientes das regiões amostradas concordam com os mais frequentemente descritos nesta espécie animal, apresentando, assim, uma matriz genética suína com a maioria dos segmentos pertencentes à constelação genotípica 1, com exceção dos genes codificadores das proteínas VP6 e NSP1, os quais foram os genotipos I5 e A8, respectivamente. Apesar de predominar o genotipo 1 (Wa-like) nas sequências deste estudo, a análise genômica sugere a existência de uma variação intragenotípica no genoma do rotavírus do grupo A atualmente circulante nas populações suína amostradas dos estados de São Paulo e Mato Grosso. Adicionalmente, buscou-se identificar os aminoácidos relacionados com a adaptação dos rotavírus no hospedeiro e assinaturas genéticas que distinguissem RVA suíno e humano. Para isso, as sequências obtidas neste estudo foram comparadas com outras cepas de RVA detectadas nestas duas espécies e pertencentes ao genotipo 1 (Wa-like) disponíveis no Genbank. Como resultados foram encontrados mais de 75 sítios de mudanças deaminoácidos que diferenciam RVA suíno e humano além de sítios de substituiçãopresentes em algumas proteínas virais que frequentemente covariaram entre elas. Estes resultados proporcionam um maior entendimento da diversidade viral circulante em unidades de produção suína e uma melhor compreensão dos animaiscomo reservatórios genéticos de cepas de rotavírus emergentes em humanos. / Group A rotaviruses (RVA) are leading causes of viral diarrhea in children and in the young of many animals species with impacts on public and animal health. To contribute to the understanding and prevention of rotaviruses as well as its possible zoonotic relationships, it was characterized the 11 segments of dsRNA rotavirus encoding the structural and nonstructural proteins present in positive fecal samples from pigs collected in the years 2012-2013 in 2 Brazilian states. Using RT-PCR, nucleotide sequencing, and phylogenetic analyses, all gene segments from 12 RVA samples detected in pigs were analyzed and compared with the other samples as described previously. The sequences obtained for the NSP2, NSP3, and VP6 coding genes covered the complete open reading frame (ORF), while the partial ORF was determined for the VP1, VP2, VP3, VP4, VP7, NSP1, NSP4, NSP5 and NSP6 coding genes. The genotypes of porcine rotavirus from the sampled regions agree with the most frequently reported in this species, presenting thus a porcine-RVA-like backbone with most segments being designated as constellation genotype 1, with the exception of the VP6 and NSP1 coding genes, which were genotypes I5 and A8, respectively. Although genotype 1 (Wa-like) sequences were predominant in this study, the genomic analysis suggests the existence of a intragenotypic variation in group A rotavirus genome currently circulating in swine populations sampled in the states of São Paulo and Mato Grosso. In addition, we sought to identify the amino acids related to the adaptation of rotavirus in the host and genetic signatures that distinguish RVA pig and human. For this, the sequences obtained in this study were compared with other strains of RVA detected in these two species, belonging to genotype 1 (Wa-like) available in Genbank. The following results were found more than 75 sites of amino acid changes that differentiate RVA pig and human as well as substitution sites present in some viral proteins that often covaried between them. These results provide a greater understanding of the current viral diversity in swine production units and a better understanding of animals as genetic reservoirs emerging rotavirus strains in humans.

Submitted by Francine Silva (francine.silva@unipampa.edu.br) on 2016-09-28T20:54:58Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Análise Transcricional de Physcomitrium Acutifolium Broth. Por meio da Técnica de RNA-SEG um enfoque sobre o estresse por frio em plantas.pdf: 2456403 bytes, checksum: f125855c91a08aa6e84cb53239871aa3 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-28T20:54:58Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Análise Transcricional de Physcomitrium Acutifolium Broth. Por meio da Técnica de RNA-SEG um enfoque sobre o estresse por frio em plantas.pdf: 2456403 bytes, checksum: f125855c91a08aa6e84cb53239871aa3 (MD5) Previous issue date: 2015-05-29 / Os estresses abióticos são responsáveis pela indução de adaptações em plantas. Estas quando submetidas ao estresse, respondem através de mecanismos de sinalização nas rotas fisiológicas, desencadeando um processo de aclimatação. Entretanto, nem sempre este potencial de adaptação é expresso, mas se persistir ao longo do desenvolvimento da planta, torna-se uma adaptação oriunda de mudança genética. Consequentemente, essas alterações incipientes possam ser identificadas em nível transcricional, os precursores de algumas alterações genéticas importantes tais como splicing alternativo. Em ambientes polares a expressão de genes permitiu a adaptação das plantas a temperaturas de congelamento. Entre estas plantas estão os musgos, presentes nos ambientes de climas contrastantes, isto sugere que estes organismos tenham plasticidade fenotípica e genotípica. Ainda que haja poucos estudos destes organismos em relação a diferentes agentes estressores, é amplamente difundido que estes possuem potenciais de resistência aos estresses ambientais. Para descobrir estes potenciais de resistências é necessário estudar os genes relacionados especificamente com o fator estressor em questão, neste caso o estresse ao frio. Para tanto é necessário um processo de sequenciamento dos genes expressos quando a planta é submetida ao estresse. Neste estudo foram realizados testes com explantes cultivados in vitro do musgo Physcomitrium acutifolium Broth. em diferentes temperaturas, com 6 tratamentos variando de 0 a 25 ºC, seguidos das análises fenotípicas e posteriormente genômicas, incluindo processo de sequenciamento e identificação de genes expressos. Os resultados sugerem relação do estresse por baixas temperaturas e o potencial de expressão de genes relacionados ao estresse por frio neste musgo, principalmente por uma identificação de maiores ocorrências de splicing alternativo nas plantas cultivadas a temperatura mais baixa testada. Assim, o uso potencial de espécies de musgo em estudos relacionados à resistência ao congelamento em plantas, torna-se como uma alternativa interessante em processos de biotecnologia vegetal. / The abiotic stresses are responsible for inducing adaptations in plants. When subjected to stress, plants respond by signaling mechanisms in physiological pathways, starting a process of acclimatization. However, not every adaptation potential is identified in phenotypic level, but if the selection pressure led by the stress persist over plant development, there may be a change in genotypic level. Consequently, these incipient changes can be identified in transcriptional level, the precursors of some important genetic changes such as alternative splicing. In polar environments are noted that the plants were adapted to survive at low temperatures, this adjustment is related to the expression of genes, which confer them resistance to freezing. Among these plants are mosses, present in the environments of contrasting climates, this suggests that these organisms have phenotypic and genotypic plasticity. Even if there are few studies of these organisms in relation to different stressors, we know that these have the potential for resistance to environmental stresses. To discover these potential resistance is necessary to study the genes specifically related to the stressor in question, this study is the cold stress. Then you need a sequencing process is necessary genes expressed when the plant is subjected to stress. In this study were performed tests with cultured explants in vitro moss Physcomitrium acutifolium Broth. at different temperatures, with 6 treatments ranged from 0°C to 25°C, followed by phenotypic analysis and subsequently transcriptome analysis based in RNA sequencing process aiming to identify a differential gene expression. The results suggest stress relationship for low temperatures and the potential for expression of genes related to cold stress in this moss, mainly by an identification of a higher occurrences of alternative splicing in plants growing at lowest temperature tested. Thus, the potential use of moss species in studies related to plant resistance to freeze temperatures becomes as an interesting alternative in plant biotechnology processes.

Submitted by CARLOS EDUARDO GAMERO AGUILAR (kadugamero@hotmail.com) on 2018-06-10T16:48:07Z No. of bitstreams: 2 Tese Final - Corrigida.pdf: 1023064 bytes, checksum: d4d8bbb2e4f336192b04f878d0224be3 (MD5) Tese Final - Corrigida.doc: 3348480 bytes, checksum: bd9bbd6f82d4e2dc607526653a130694 (MD5) / Approved for entry into archive by Alexandra Maria Donadon Lusser Segali null (alexmar@fcav.unesp.br) on 2018-06-12T17:38:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 aguilar_ceg_dr_jabo.pdf: 1023064 bytes, checksum: d4d8bbb2e4f336192b04f878d0224be3 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-12T17:38:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 aguilar_ceg_dr_jabo.pdf: 1023064 bytes, checksum: d4d8bbb2e4f336192b04f878d0224be3 (MD5) Previous issue date: 2018-05-04 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As espécies do grupo do Bacillus cereus estão na cadeia produtiva do leite associadas a problemas tecnológicos por produzirem metaloproteínases. O controle deste microrganismo se faz necessário devido aos prejuízos causados por perdas. Com o objetivo de verificar a presença do gene npr (produção de metaloproteínases), Plcr (regulador pleitrópico) e cspa (assinatura psicrotrófica), avaliar fenotipicamente os isolados quanto à capacidade proteolítica e mensurar a atividade deteriorante da mencionada enzima sobre a kappa-caseína, foram isolados da cadeia produtiva de lácteos, identificados e sequenciados genomicamente, microrganismos pertencentes ao grupo do Bacillus cereus que comprovadamente possuiam características proteolíticas e psicrotróficas. De 466 amostras, obteve-se 69 isolados de Bacillus cereus, sendo que o gene npr, fenótipo proteolítico e Plcr estavam presentes em, respectivamente, 97,1%, 92,7% (64) e 88,4% (61) das amostras. O gene cspa foi identificado em 100% das amostras. Entretanto, fenotipicamente apenas um isolado comportou-se como tal, sugerindo a existência de outros fatores para expressão desta característica. A concentração de ácido siálico elevou-se durante o tempo de prateleira do produto, na média, de 3,99 µg/mL para 4,45 µg/mL no primeiro e último dia, respectivamente. Assim, devido a ampla distribuição do Bacillus cereus associada a sua resistência térmica e a elevada frequência de características proteolíticas, faz-se necessário a obtenção higiênica do leite, minimizando contaminações, para que produtos de qualidade possam ser elaborados. / The species included in Bacillus cereus group are widespread in the dairy production chain and are often associated with technological failures in dairy products, due to the production of metalloproteinases. Controlling this microorganism is necessary due to economic losses. In order to assess the presence of npr gene (metalloproteinases production), Plcr (pleiotropic regulator) and cspa (psychotropic signature), proteolytic activity on plates and the spoilage potential of the enzyme on kappa-casein, Bacillus cereus samples which had proteolytic and psychotropic characteristics were isolated from dairy production chain and sequenced. A set of 69 isolates were obtained from 466 samples and the frequency of npr gene, proteolytic activity and Plcr were observed in, respectively, 97.1%, 92,7% and 88,4% of the samples. The cspa gene was present in all samples. However, only one sample demonstrated the psychotropic phenotype, suggesting the existence of other factors involved in the expression of this characteristic. Concentration of free sialic acid during the shelf life of pasteurized milk ranged from 3,99 µg/ml to 4.45 µg/ml in the first and last days of the storage period, respectively. Therefore, due to the wide distribution of Bacillus cereus associated with thermal resistance and high frequency of proteolytic features, hygienic milking practice is critical to decrease contamination and produce milk with higher quality. / FAPESP: 15/20874-0

Orientador: Ana Maria Centola Vidal / Resumo: As espécies do grupo do Bacillus cereus estão na cadeia produtiva do leite associadas a problemas tecnológicos por produzirem metaloproteínases. O controle deste microrganismo se faz necessário devido aos prejuízos causados por perdas. Com o objetivo de verificar a presença do gene npr (produção de metaloproteínases), Plcr (regulador pleitrópico) e cspa (assinatura psicrotrófica), avaliar fenotipicamente os isolados quanto à capacidade proteolítica e mensurar a atividade deteriorante da mencionada enzima sobre a kappa-caseína, foram isolados da cadeia produtiva de lácteos, identificados e sequenciados genomicamente, microrganismos pertencentes ao grupo do Bacillus cereus que comprovadamente possuiam características proteolíticas e psicrotróficas. De 466 amostras, obteve-se 69 isolados de Bacillus cereus, sendo que o gene npr, fenótipo proteolítico e Plcr estavam presentes em, respectivamente, 97,1%, 92,7% (64) e 88,4% (61) das amostras. O gene cspa foi identificado em 100% das amostras. Entretanto, fenotipicamente apenas um isolado comportou-se como tal, sugerindo a existência de outros fatores para expressão desta característica. A concentração de ácido siálico elevou-se durante o tempo de prateleira do produto, na média, de 3,99 µg/mL para 4,45 µg/mL no primeiro e último dia, respectivamente. Assim, devido a ampla distribuição do Bacillus cereus associada a sua resistência térmica e a elevada frequência de características proteolíticas, faz-se necessário a obtenção higiênic... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The species included in Bacillus cereus group are widespread in the dairy production chain and are often associated with technological failures in dairy products, due to the production of metalloproteinases. Controlling this microorganism is necessary due to economic losses. In order to assess the presence of npr gene (metalloproteinases production), Plcr (pleiotropic regulator) and cspa (psychotropic signature), proteolytic activity on plates and the spoilage potential of the enzyme on kappa-casein, Bacillus cereus samples which had proteolytic and psychotropic characteristics were isolated from dairy production chain and sequenced. A set of 69 isolates were obtained from 466 samples and the frequency of npr gene, proteolytic activity and Plcr were observed in, respectively, 97.1%, 92,7% and 88,4% of the samples. The cspa gene was present in all samples. However, only one sample demonstrated the psychotropic phenotype, suggesting the existence of other factors involved in the expression of this characteristic. Concentration of free sialic acid during the shelf life of pasteurized milk ranged from 3,99 µg/ml to 4.45 µg/ml in the first and last days of the storage period, respectively. Therefore, due to the wide distribution of Bacillus cereus associated with thermal resistance and high frequency of proteolytic features, hygienic milking practice is critical to decrease contamination and produce milk with higher quality. / Doutor

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-09-05T18:15:16Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 693325 bytes, checksum: 2afbc494cbadf4704a75769d027d64d1 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-05T18:15:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 693325 bytes, checksum: 2afbc494cbadf4704a75769d027d64d1 (MD5) Previous issue date: 2015-02-24 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Actinobacillus pleuropneumoniae é o agente etiológico da pleuropneumonia suína, uma severa enfermidade que acomete suínos de todas as idades, gerando perdas econômicas significativas para a suinocultura mundial. Embora os 15 sorotipos conhecidos dessa bactéria possam causar a doença, existem diferenças marcantes de virulência entre eles. A virulência de A. pleuropneumoniae é multifatorial e está relacionada à composição e estrutura de polissacarídeos da cápsula, LPS, e toxinas da família RTX, além desses fatores, a aderência em forma de biofilme e a resistência a agentes antimicrobianos podem ser determinantes para virulência. Este trabalho estabeleceu um modelo de infecção alternativo para o estudo de A. pleuropneumoniae, utilizando larvas de Galleria mellonella e, posteriormente esse modelo foi usado para investigar a virulência de isolados clínicos de A. pleuropneumoniae sorotipo 8. Os mesmos isolados foram avaliados quanto ao potencial de formação de biofilme e resistência a antimicrobianos comumente empregados em campo. A partir dessas informações, isolados clínicos com diferenças significativas na virulência, no potencial de formação de biofilme e no perfil de resistência foram selecionados para o sequenciamento genômico. Os resultados mostraram que o modelo de infecção A. pleuropneumoniae – G. mellonella é capaz de diferenciar níveis de virulência de isolados clínicos de mesmo sorotipo, além de permitir a avaliação da eficiência de agentes antimicrobianos contra este patógeno. O modelo também mostrou eficiência para diferenciar virulência entre linhagens selvagem e mutante da mesma bactéria. Uma análise de correlação entre os dados de virulência, formação de biofilme e resistência a antimicrobianos permitiu que seis isolados fossem selecionados para o sequenciamento. Com a montagem e anotação foi possível verificar que os genomas de A. pleuropneumoniae sorotipo 8 apresentam tamanho de 2,2 ± 0,004 Mpb, com o conteúdo GC de 40,33% ± 0,263 e regiões codificadoras com uma média de tamanho de 817,3 ± 6,8 pb. As regiões codificadoras correspondem a 89,05% ± 0,13 do genoma, das quais a maior parte foi anotada como genes funcionais, o que permitirá a realização de estudos comparativos. Estes genomas apresentam em média 79,5 ± 24,05 genes exclusivos, revelando a alta variabilidade genética dessa espécie, que pode estar relacionada com a variação da virulência entre os isolados estudados. / Actinobacillus pleuropneumoniae is the etiological agent of porcine pleuropneumonia, a severe disease that affects pigs of all ages, causing significant economic losses to the swine industry worldwide. Although the 15 serotypes of this bacterium are known to cause the disease, there are marked differences in virulence between them. A. pleuropneumoniae virulence is multifactorial and involves capsular polysaccharides, LPS, and toxins of the RTX family. In addition to these factors, the adhesion in biofilm form and resistance to antimicrobial agents may be determinant for virulence. This work has established an alternative infection model for the study of A. pleuropneumoniae, using larvae of Galleria mellonella and this model was subsequently used to investigate the virulence of clinical isolates of A. pleuropneumoniae serotype 8. The same isolates were evaluated for biofilm formation potential and resistance to antimicrobials commonly used in the field. From this information, clinical isolates with significant differences in virulence, biofilm formation potential and resistance profile were selected for genomic sequencing. Results show that the A. pleuropneumoniae - G. mellonella infection model is capable of differentiating levels of virulence of clinical isolates of the same serotype. Furthermore, it can be used to evaluate the effectiveness of antimicrobial agents against this pathogen. The model also showed efficiency to differentiate the virulence between wild and mutant strains of the same bacteria. A correlation analysis between the virulence data, biofilm formation and antibiotic resistance allowed six isolates to be selected for genome sequencing. With the assembly and annotation, we found that the genomes of A. pleuropneumoniae serotype 8 present size of 2.2 ± 0.004 Mpb, with GC content of 40.33% ± 0.263 and coding regions with an average size of 817.3 ± 6.8 bp. The coding regions correspond to 89.05 ± 0.13% of the genome, most of which was recorded as functional genes, enabling the comparative studies with these genomes. These genomes have 79.5 ± 24.05 exclusive proteins, revealing the high genetic variability of the species, which may be related to the variation in virulence between these isolates.

Os rotavírus do grupo A (RVA) são importantes causadores de diarreias virais em crianças e animais jovens de diferentes espécies, com impactos na saúde pública e animal. Visando contribuir para o entendimento e prevenção das rotaviroses assim como suas possíveis relações zoonóticas, caracterizou-se os 11 segmentos de dsRNA de rotavírus codificadores das proteínas estruturais e não estruturais presentes em amostras fecais positivas de suínos coletadas nos anos de 2012-2013, em 2 estados brasileiros. Mediante o emprego de RT-PCR, sequenciamento nucleotídico e análises filogenéticas, todos os segmentos genéticos oriundos de 12 amostras de RVA detectados em suínos foram analisados e comparados com os de outras amostras descritas previamente. As sequências obtidas para os genes codificadores das proteínas NSP2, NSP3 e VP6 contemplaram a open reading frame (ORF) completa do gene, enquanto que a ORF parcial foi determinada para os genes codificadores das proteínas VP1, VP2, VP3, VP4, VP7, NSP1, NSP4, NSP5 e NSP6. Os genotipos de rotavírus suíno provenientes das regiões amostradas concordam com os mais frequentemente descritos nesta espécie animal, apresentando, assim, uma matriz genética suína com a maioria dos segmentos pertencentes à constelação genotípica 1, com exceção dos genes codificadores das proteínas VP6 e NSP1, os quais foram os genotipos I5 e A8, respectivamente. Apesar de predominar o genotipo 1 (Wa-like) nas sequências deste estudo, a análise genômica sugere a existência de uma variação intragenotípica no genoma do rotavírus do grupo A atualmente circulante nas populações suína amostradas dos estados de São Paulo e Mato Grosso. Adicionalmente, buscou-se identificar os aminoácidos relacionados com a adaptação dos rotavírus no hospedeiro e assinaturas genéticas que distinguissem RVA suíno e humano. Para isso, as sequências obtidas neste estudo foram comparadas com outras cepas de RVA detectadas nestas duas espécies e pertencentes ao genotipo 1 (Wa-like) disponíveis no Genbank. Como resultados foram encontrados mais de 75 sítios de mudanças deaminoácidos que diferenciam RVA suíno e humano além de sítios de substituiçãopresentes em algumas proteínas virais que frequentemente covariaram entre elas. Estes resultados proporcionam um maior entendimento da diversidade viral circulante em unidades de produção suína e uma melhor compreensão dos animaiscomo reservatórios genéticos de cepas de rotavírus emergentes em humanos. / Group A rotaviruses (RVA) are leading causes of viral diarrhea in children and in the young of many animals species with impacts on public and animal health. To contribute to the understanding and prevention of rotaviruses as well as its possible zoonotic relationships, it was characterized the 11 segments of dsRNA rotavirus encoding the structural and nonstructural proteins present in positive fecal samples from pigs collected in the years 2012-2013 in 2 Brazilian states. Using RT-PCR, nucleotide sequencing, and phylogenetic analyses, all gene segments from 12 RVA samples detected in pigs were analyzed and compared with the other samples as described previously. The sequences obtained for the NSP2, NSP3, and VP6 coding genes covered the complete open reading frame (ORF), while the partial ORF was determined for the VP1, VP2, VP3, VP4, VP7, NSP1, NSP4, NSP5 and NSP6 coding genes. The genotypes of porcine rotavirus from the sampled regions agree with the most frequently reported in this species, presenting thus a porcine-RVA-like backbone with most segments being designated as constellation genotype 1, with the exception of the VP6 and NSP1 coding genes, which were genotypes I5 and A8, respectively. Although genotype 1 (Wa-like) sequences were predominant in this study, the genomic analysis suggests the existence of a intragenotypic variation in group A rotavirus genome currently circulating in swine populations sampled in the states of São Paulo and Mato Grosso. In addition, we sought to identify the amino acids related to the adaptation of rotavirus in the host and genetic signatures that distinguish RVA pig and human. For this, the sequences obtained in this study were compared with other strains of RVA detected in these two species, belonging to genotype 1 (Wa-like) available in Genbank. The following results were found more than 75 sites of amino acid changes that differentiate RVA pig and human as well as substitution sites present in some viral proteins that often covaried between them. These results provide a greater understanding of the current viral diversity in swine production units and a better understanding of animals as genetic reservoirs emerging rotavirus strains in humans.

A tuberculose (TB) embora passível de tratamento efetivo, ainda é um grave problema de saúde pública em diversos países, inclusive no Brasil. Nas últimas décadas houve progressos consistentes no controle da doença, porém o avanço da resistência bacilar ainda é um desafio a ser superado, já que os mecanismos da resistência são bastante complexos e não totalmente conhecidos, o que dificulta o desenvolvimento de testes de sensibilidade com elevada acurácia. O objetivo deste trabalho foi caracterizar as mutações gênicas de cepas de Mycobacterium tuberculosis de pacientes do Brasil e de Moçambique com doença resistente a drogas através do sequenciamento genômico total, além de descrever padrões de mutações obtidos por testes moleculares comerciais e comparar estes dados com resultados de testes fenotípicos. Estudo descritivo e transversal que incluiu 30 isolados (17 do Brasil e 13 de Moçambique), submetidos aos testes moleculares comerciais Genotype MTBDRplus®, Genotype MTBDRsl®, Xpert MTB/RIF® e teste fenotípico BACTEC MGIT 960 SIRE®. Todos os isolados também foram avaliados pelo sequenciamento genômico realizado pelo Illumina MiSeq Sequencing System® e submetidos a análise de mutações que conferem resistência às drogas contra TB utilizando o TB profiler online tool. A sensibilidade e especificidade do sequenciamento genômico para detecção de resistência a rifampicina foi de 87,5% e 92,3%, respectivamente. Além disso, o sequenciamento detectou a mutação (Val170Phe) no gene rpoB em dois isolados de M. tuberculosis de Moçambique. Esta mutação não é detectada pelos testes genotípicos comerciais. A sensibilidade do sequenciamento para a isoniazida foi de 95,6% e a especificidade de 100%. Para a estreptomicina, a sensibilidade foi de 85,7% e a especificidade de 93,3%. Para o etambutol, observamos sensibilidade de 100% e especificidade de 77,2%. As mutações mais frequentes associadas à resistência à rifampicina foram a Ser450Leu e a His445Tyr no gene rpoB. Em relação à isoniazida, predominou a mutação Ser315Thr no gene katG. O sequenciamento genômico, dado seu alto poder discriminatório, tem grande potencial de fornecer informações mais acuradas sobre mecanismo gênicos da resistência bacilar, possibilitando futuramente o aprimoramento de testes diagnósticos mais precisos. / Although there is an effective treatment for tuberculosis (TB), it is still a serious public health problem in several countries, including Brazil. In the last decades, there has been consistent progress in disease control, but the increasing number of disease caused by resistant strains is still a challenge to be overcome, since the mechanisms of resistance are quite complex and not fully known, which difficult the development of susceptibility tests with high accuracy. The aim of this work was to characterize gene mutations of Mycobacterium tuberculosis strains from Brazilian and Mozambican patients with drug-resistant disease through whole genome sequencing, as well as to describe patterns of mutations obtained by commercial molecular tests and to compare these data with results of phenotypic susceptibility tests. It was a cross-sectional study that included 30 isolates (17 from Brazil and 13 from Mozambique). Commercial molecular tests Genotype MTBDRplus(TM), Genotype MTBDRsl(TM), Xpert MTB / RIF(TM) and BACTEC MGIT 960 SIRE(TM) phenotypic test were performed for all isolates. All of them were also evaluated by whole genome sequencing performed by the Illumina MiSeq Sequencing System(TM) and submitted to analysis of mutations that confer drug resistance against TB using the TB profiler online tool. The sensitivity and specificity of whole genome sequencing for detection rifampicin resistance was 87.5% and 92.3%, respectively. Also, whole genome sequencing detected the mutation (Val170Phe) in the rpoB gene in two isolates of M. tuberculosis from Mozambique. This mutation is not detected by commercial genotypic tests. The sensitivity of the whole genome sequencing for isoniazid was 95.6%, and the specificity was 100%. For streptomycin, the sensitivity was 85.7%, and the specificity was 93.3%. For ethambutol, we observed a sensitivity of 100% and specificity of 77.2%. The most frequent mutations associated with rifampicin resistance were rpoB Ser450Leu and His445Tyr. About isoniazid, the katG Ser315Thr mutation was the most frequent. Whole genome sequencing, given its high discriminatory power, has great potential to provide more accurate information about the gene mechanisms of bacilli resistance, making possible the improvement of more accurate diagnostic tests in the future.

Submitted by KETERYNE RODRIGUES DA SILVA null (kethy-rs@hotmail.com) on 2016-04-18T13:44:34Z No. of bitstreams: 1 Dissertação PRONTA pdf.pdf: 2073917 bytes, checksum: a152ff76ebcbbec56c3a78a1d420c107 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-04-18T19:53:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 silva_kr_me_rcla.pdf: 2073917 bytes, checksum: a152ff76ebcbbec56c3a78a1d420c107 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-18T19:53:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 silva_kr_me_rcla.pdf: 2073917 bytes, checksum: a152ff76ebcbbec56c3a78a1d420c107 (MD5) Previous issue date: 2016-03-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O DNA pode estar organizado no genoma em sequências de cópias únicas e em sequências que se repetem várias vezes, denominadas sequências repetitivas. Estas sequências são constituídas basicamente por repetições em tandem (satélites, minissatélites e microssatélites) ou dispersas (transposons ou retrotransposons), e parecem estar envolvidas em diversos eventos celulares importantes, como por exemplo nos processos de replicação do DNA, de recombinação, de expressão gênica e de evolução dos cromossomos, auxiliando na manutenção e propagação do material genético celular. Em nível cromossômico parecem ser responsáveis por proporções significativas das variações cariotípicas observadas em diversos grupos. O gênero Ancistrus (Siluriformes, Loricariidae) apresenta atualmente 68 espécies nominais, e uma enorme quantidade de espécies ainda não identificadas. Alguns trabalhos vêm utilizando sequências repetitivas também em análises citogenéticas e moleculares para identificação de cromossomos homólogos e marcadores cariotípicos interessantes que podem auxiliar os trabalhos de identificação de espécies. Apesar de serem amplamente estudadas em diversos organismos, há ainda muito a ser entendido sobre essas sequências e sua organização no genoma. Este trabalho teve como objetivo isolar sequências repetitivas no genoma de espécies de Ancistrus, afim de encontrar possíveis marcadores para o gênero, que pudessem contribuir para o entendimento da taxonomia deste grupo, bem como auxiliar no entendimento do processo de evolução dos cromossomos sexuais dessas espécies. Dentre as sequências isoladas está um transposon da família TC1/mariner que se mostrou presente em todos os cromossomos das espécies analisadas e dois DNAs satélites que se apresentam acumulados em regiões centroméricas de alguns cromossomos. Sendo assim, este estudo resultou em dados que poderão contribuir com o entendimento da evolução cariotípica do gênero Ancistrus bem como fornecer mais informações sobre características e evolução dos cromossomos sexuais em peixes. / DNA may be organized in the genome as single copy sequences and as sequences that are repeated several times, called repetitive sequences. These sequences are basically constituted by tandem repeats (satellites, minisatellites and microsatellites) or scattered (transposons and retrotransposons), and seem to be involved in important cellular events such as, DNA replication process, recombination, gene expression and chromosome evolution, assisting in maintenance and spread the genetic material of cells. At chromosome level, seems to be significant proportions of karyotypic variations observed in several groups. The genus Ancistrus (Siluriformes, Loricariidae) has, actually, 68 nominal species and several species not identified yet. Repetitive sequences have been used in molecular cytogenetic analysis for identification of homologous chromosomes and interesting karyotypic markers that can assist in species identification works. Despite being widely studied in several organisms, there is still much to be understood about these sequences and their organization in the genome. This study aimed to isolate repetitive sequences in the genome of Ancistrusspecies in order to find possible markers for the genus, which could contribute to the understanding of the taxonomy of this group and to the understanding of the process of evolution of sex chromosomes of these species. Among the isolated sequences, there is a family of TC1/mariner transposon that showed to be present in all the chromosomes of the analyzed species, and two satellites DNAs that have accumulated in centromeric regions. Thus, this study resulted in data that could be contribute to understanding the karyotype evolution of Ancistrus genus as well as providing more information on the characteristics and evolution of sex chromosomes in fish.

A tuberculose (TB) embora passível de tratamento efetivo, ainda é um grave problema de saúde pública em diversos países, inclusive no Brasil. Nas últimas décadas houve progressos consistentes no controle da doença, porém o avanço da resistência bacilar ainda é um desafio a ser superado, já que os mecanismos da resistência são bastante complexos e não totalmente conhecidos, o que dificulta o desenvolvimento de testes de sensibilidade com elevada acurácia. O objetivo deste trabalho foi caracterizar as mutações gênicas de cepas de Mycobacterium tuberculosis de pacientes do Brasil e de Moçambique com doença resistente a drogas através do sequenciamento genômico total, além de descrever padrões de mutações obtidos por testes moleculares comerciais e comparar estes dados com resultados de testes fenotípicos. Estudo descritivo e transversal que incluiu 30 isolados (17 do Brasil e 13 de Moçambique), submetidos aos testes moleculares comerciais Genotype MTBDRplus®, Genotype MTBDRsl®, Xpert MTB/RIF® e teste fenotípico BACTEC MGIT 960 SIRE®. Todos os isolados também foram avaliados pelo sequenciamento genômico realizado pelo Illumina MiSeq Sequencing System® e submetidos a análise de mutações que conferem resistência às drogas contra TB utilizando o TB profiler online tool. A sensibilidade e especificidade do sequenciamento genômico para detecção de resistência a rifampicina foi de 87,5% e 92,3%, respectivamente. Além disso, o sequenciamento detectou a mutação (Val170Phe) no gene rpoB em dois isolados de M. tuberculosis de Moçambique. Esta mutação não é detectada pelos testes genotípicos comerciais. A sensibilidade do sequenciamento para a isoniazida foi de 95,6% e a especificidade de 100%. Para a estreptomicina, a sensibilidade foi de 85,7% e a especificidade de 93,3%. Para o etambutol, observamos sensibilidade de 100% e especificidade de 77,2%. As mutações mais frequentes associadas à resistência à rifampicina foram a Ser450Leu e a His445Tyr no gene rpoB. Em relação à isoniazida, predominou a mutação Ser315Thr no gene katG. O sequenciamento genômico, dado seu alto poder discriminatório, tem grande potencial de fornecer informações mais acuradas sobre mecanismo gênicos da resistência bacilar, possibilitando futuramente o aprimoramento de testes diagnósticos mais precisos. / Although there is an effective treatment for tuberculosis (TB), it is still a serious public health problem in several countries, including Brazil. In the last decades, there has been consistent progress in disease control, but the increasing number of disease caused by resistant strains is still a challenge to be overcome, since the mechanisms of resistance are quite complex and not fully known, which difficult the development of susceptibility tests with high accuracy. The aim of this work was to characterize gene mutations of Mycobacterium tuberculosis strains from Brazilian and Mozambican patients with drug-resistant disease through whole genome sequencing, as well as to describe patterns of mutations obtained by commercial molecular tests and to compare these data with results of phenotypic susceptibility tests. It was a cross-sectional study that included 30 isolates (17 from Brazil and 13 from Mozambique). Commercial molecular tests Genotype MTBDRplus(TM), Genotype MTBDRsl(TM), Xpert MTB / RIF(TM) and BACTEC MGIT 960 SIRE(TM) phenotypic test were performed for all isolates. All of them were also evaluated by whole genome sequencing performed by the Illumina MiSeq Sequencing System(TM) and submitted to analysis of mutations that confer drug resistance against TB using the TB profiler online tool. The sensitivity and specificity of whole genome sequencing for detection rifampicin resistance was 87.5% and 92.3%, respectively. Also, whole genome sequencing detected the mutation (Val170Phe) in the rpoB gene in two isolates of M. tuberculosis from Mozambique. This mutation is not detected by commercial genotypic tests. The sensitivity of the whole genome sequencing for isoniazid was 95.6%, and the specificity was 100%. For streptomycin, the sensitivity was 85.7%, and the specificity was 93.3%. For ethambutol, we observed a sensitivity of 100% and specificity of 77.2%. The most frequent mutations associated with rifampicin resistance were rpoB Ser450Leu and His445Tyr. About isoniazid, the katG Ser315Thr mutation was the most frequent. Whole genome sequencing, given its high discriminatory power, has great potential to provide more accurate information about the gene mechanisms of bacilli resistance, making possible the improvement of more accurate diagnostic tests in the future.

Orientador: João Pessoa Araujo Junior / Resumo: O Vírus da Anemia Infecciosa Equina (VAIE) é um lentivírus que infecta equídeos causando a Anemia Infecciosa Equina. A doença possui distribuição mundial e o principal método de controle empregado é a eutanásia dos animais positivos, uma vez que não existe cura ou vacina disponível. No Brasil, a região do Pantanal é endêmica para a doença e, somente nessas áreas, a eutanásia não é obrigatória. A alta variação genética de lentivírus durante uma infecção prolongada é bem conhecida em várias espécies e também descrita em sequências de VAIE de outros países. Não há sequência genômica brasileira completa descrita ou mesmo um estudo da variação genética do vírus em um ambiente endêmico como o Pantanal Brasileiro. Com isso, este trabalho teve como objetivos a caracterização molecular do VAIE em equinos da região do Pantanal Brasileiro, e a padronização da PCR quantitativa (qPCR) para detecção do DNA proviral de VAIE. Duas amostras de plasma equino positivas para VAIE foram submetidas ao sequenciamento do genoma completo utilizando uma combinação de técnicas tradicionais e de nova geração. O genoma a partir do RNA viral foi obtido, anotado e comparado com sequências virais obtidas de animais naturalmente infectados em outros países. As sequências provenientes do Pantanal apresentaram identidade entre 75 e 77 % com sequências de outros países e 88,54 % entre si, classificando-as em um clado individual na árvore filogenética dos vírus já descritos, exibindo a maior variação genética de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Equine infectious anemia virus (EIAV) is a lentivirus that infects equids and causes equine infectious anemia (EIA). This disease presents worldwide distribution and the main control method is the euthanasia of positive animals, since there is no cure or vaccine available. The Pantanal region in Brazil is endemic for the disease, and euthanasia is not mandatory in this area. The high lentivirus genetic variation during a prolonged infection is well known in several species and also described in EIAV sequences in other countries. There are no Brazilian viral genomic sequences available or even a study of genetic variation in an environment such as Brazilian Pantanal. This work aimed to characterize the EIAV complete genome in equines from Brazilian Pantanal and to standardize a quantitative real time PCR (qPCR) for detection of EIAV proviral DNA. Two plasma samples of EIAV positive horses were submitted to massive sequencing by combination of Sanger and NGS sequencing. The complete genome from viral RNA was obtained, annotated and compared with viral sequences of naturally infected animals from other countries. Sequences from Pantanal showed identity between 75% and 77% with other countries sequences and 88.54% with each other, classifying them into an individual cluster in EIAV cladogram and exhibiting the greatest genetic variation between sequences from the same country. With viral envelope gene analysis, both Brazilian sequences were classified as two quasispecies. A qPCR ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor