Made available in DSpace on 2014-06-12T23:02:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo8576_1.pdf: 1176468 bytes, checksum: eba1dd425f80fea66dd1b6ebc6ac798a (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2006 / Estudo Eletrofisiológico: Ratos Wistar foram injetados durante o período de lactação com fluoxetina, um inibidor seletivo da recaptação de serotonina (5, 10, 20, ou 40 mg/kg/d por via subcutânea) e o fenômeno da depressão alastrante da atividade elétrica cerebral (DA) foi registrado na superfície cortical desses animais imediatamente após o desmame (25-30 dias de vida). Em um grupo adicional (10 mg/kg) a DA foi registrada aos 60-70 dias. Quando comparada às duas condições controle (injeção com solução salina ou sem injeção - ingênuos ), a fluoxetina reduziu (P<0,05) a velocidade da DA nos ratos jovens de forma dose-dependente em 4%, 6%, 16% e 15%, respectivamente, e nos adultos em 13%. Em um outro experimento com ratos adultos, a aplicação tópica cortical de fluoxetina (5 e 10 mg/ml) sobre a dura-máter intacta, durante 10 min, reduziu a velocidade da DA de modo diretamente proporcional à concentração aplicada (reduções máximas de 7,6% e 43,3%; P<0,05). A propagação da DA foi bloqueada em 4 dos 14 ratos tratados topicamente com a concentração mais alta de fluoxetina (10 mg/ml). Este efeito tópico da fluoxetina foi revertido após lavagem, da região tratada, com solução salina. Em ratos precocemente desnutridos, a fluoxetina aplicada durante o período de aleitamento (10 mg/kg/d, s.c.) e topicamente (10 mg/ml) também reduziu (P<0.05) as velocidades da DA em 18 e 22% para o tratamento sistêmico (nos animais jovens e adultos, respectivamente) e em 22,4% para o tratamento tópico. Estudo Morfológico: Em ratos Wistar tratados precocemente com fluoxetina (10 mg/kg/d, s.c.) não houve modificações apreciáveis no número, nem na área do corpo celular de neurônios nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato-diaforase (NADPH-d) positivos, independentemente do estado nutricional. Neurogênese Hipocampal: A fluoxetina não alterou o número de células hipocampais positivas à bromodeoxiuridina (marcador de proliferação celular) em ratos Sprague- Dawley jovens ou adultos, submetidos ou não a uma condição de estresse. Conclusões: 1) A presente ação da fluoxetina suporta a hipótese de uma influência serotoninérgica antagônica sobre a DA; 2) A desnutrição precoce não impede os efeitos da fluoxetina; 3) A neurogênese hipocampal, bem como as células NADPH-d-positivas (que são produtoras de óxido nítrico) parecem ser resistentes ao tratamento precoce com esse inibidor seletivo da recaptação de serotonina

O decanoato de nandrolona é um esteróide anabólico-androgênico (EAA), derivado da testosterona, utilizado de maneira abusiva por indivíduos procurando ganho de força física ou apenas efeitos estéticos. Doses suprafisiológicas desses compostos têm sido associadas a efeitos psiquiátricos adversos, especialmente episódios de impulsividade e aumento no comportamento agressivo. Considerando o desconhecimento dos mecanismos neurais envolvidos nessa desinibição comportamental, nós investigamos a integridade da transcrição de componentes do sistema serotoninérgico (intimamente relacionados à expressão de comportamentos emocionais) em diversas áreas cerebrais de camundongos sob a administração prolongada de nandrolona. Camundongos machos adultos da linhagem C57Bl/6J receberam uma injeção subcutânea diária de 15 mg/kg de decanoato de nandrolona durante 28 dias. Diferentes grupos de animais foram utilizados para a análise de comportamentos emocionais e para a quantificação da expressão de genes relacionados à serotonina (5-HT), utilizando a transcrição reversa do RNA associada à técnica de PCR em tempo-real. Os camundongos tratados apresentaram um aumento na massa corporal, hiperatividade motora e aumento de comportamentos relacionados à ansiedade em ambientes novos. A imobilidade avaliada no teste de nado forçado apresentou-se reduzida. Os animais que receberam a nandrolona se mostraram mais agressivos e impulsivos para iniciar o ataque aos camundongos oponentes, no modelo de residenteintruso. O EAA induziu uma redução significante na quantidade de transcritos da maioria dos receptores pós-sinápticos de 5-HT investigados na amígdala e no córtex pré-frontal. A expressão do gene do receptor 5-HT1B (reconhecidamente envolvido com as alterações comportamentais observadas) estava também reduzida no hipocampo e hipotálamo. No mesencéfalo, região onde se encontram os corpos neuronais dos neurônios serotoninérgicos que inervam o sistema límbico e demais áreas cerebrais, não se observou nenhuma alteração na expressão dos genes relacionados aos receptores serotoninérgicos pré-sinápticos. Os transcritos do transportador e da enzima de síntese de 5-HT, indicadores da integridade serotoninérgica pré-sináptica, também não se apresentaram alterados. Dessa maneira, concluímos que o efeito de altas doses do EAA decanoato de nandrolona em camundongos confirma os dados encontrados em literatura quanto à desinibição comportamental observada em usuários abusivos humanos. Nosso modelo também foi eficiente em mostrar pela primeira vez alterações moleculares induzidas por este EAA. A redução generalizada na expressão dos genes de receptores de 5-HT na amígdala e córtex pré-frontal sugere essas áreas, pós-sinápticas ao sistema serotoninérgico, como críticas nos efeitos induzidos pelo EAA. Nosso trabalho também sugere um papel importante para o receptor 5-HT1B na desinibição comportamental observada / Nandrolone decanoate is a highly abused anabolic-androgenic steroid (AAS) by individuals looking for gains in physical strength or body appearance. Supraphysiological doses of this testosterone synthetic derivative have been associated with many physical and psychiatric adverse effects, especially reported episodes of impulsiveness and overt aggressive behavior. Since the neural mechanisms underlying AAS-induced behavioral disinhibition are unknown, we investigated the integrity of serotonergic system transcription in several brain areas of mice under prolonged nandrolone administration. Male C57Bl/6J mice received 15 mg/kg of nandrolone decanoate subcutaneously once daily for 28 days, and different sets of animals were used to investigate motor and emotion-related behaviors or 5-HT-related gene expression by qRT-PCR. AAS-injected mice had increased body weight, were hyperactive and displayed more anxious-like behaviors in novel environments. They exhibited reduced immobility in the forced swim test, higher probability of being aggressive and elevated impulsivity to attack the opponent. AAS induced substantial reduction in the transcription of most postsynaptic 5-HT receptors investigated in the amygdala and prefrontal cortex. Interestingly, 5-HT1B mRNA was further reduced in the hippocampus and hypothalamus. At the midbrain level, there was no alteration in 5- HT receptors, transporter or synthetic enzyme gene transcription. In conclusion, high doses of AAS nandrolone in male mice recapitulate the behavioral disinhibition observed in abusers. Furthermore, they are associated with overall decrease in 5-HT receptor gene expression in the amygdala and prefrontal cortex, implicating these areas as critical sites for AASinduced effects and indicating a role for the 5-HT1B receptor in this behavioral disinhibition

O decanoato de nandrolona é um esteróide anabólico-androgênico (EAA), derivado da testosterona, utilizado de maneira abusiva por indivíduos procurando ganho de força física ou apenas efeitos estéticos. Doses suprafisiológicas desses compostos têm sido associadas a efeitos psiquiátricos adversos, especialmente episódios de impulsividade e aumento no comportamento agressivo. Considerando o desconhecimento dos mecanismos neurais envolvidos nessa desinibição comportamental, nós investigamos a integridade da transcrição de componentes do sistema serotoninérgico (intimamente relacionados à expressão de comportamentos emocionais) em diversas áreas cerebrais de camundongos sob a administração prolongada de nandrolona. Camundongos machos adultos da linhagem C57Bl/6J receberam uma injeção subcutânea diária de 15 mg/kg de decanoato de nandrolona durante 28 dias. Diferentes grupos de animais foram utilizados para a análise de comportamentos emocionais e para a quantificação da expressão de genes relacionados à serotonina (5-HT), utilizando a transcrição reversa do RNA associada à técnica de PCR em tempo-real. Os camundongos tratados apresentaram um aumento na massa corporal, hiperatividade motora e aumento de comportamentos relacionados à ansiedade em ambientes novos. A imobilidade avaliada no teste de nado forçado apresentou-se reduzida. Os animais que receberam a nandrolona se mostraram mais agressivos e impulsivos para iniciar o ataque aos camundongos oponentes, no modelo de residenteintruso. O EAA induziu uma redução significante na quantidade de transcritos da maioria dos receptores pós-sinápticos de 5-HT investigados na amígdala e no córtex pré-frontal. A expressão do gene do receptor 5-HT1B (reconhecidamente envolvido com as alterações comportamentais observadas) estava também reduzida no hipocampo e hipotálamo. No mesencéfalo, região onde se encontram os corpos neuronais dos neurônios serotoninérgicos que inervam o sistema límbico e demais áreas cerebrais, não se observou nenhuma alteração na expressão dos genes relacionados aos receptores serotoninérgicos pré-sinápticos. Os transcritos do transportador e da enzima de síntese de 5-HT, indicadores da integridade serotoninérgica pré-sináptica, também não se apresentaram alterados. Dessa maneira, concluímos que o efeito de altas doses do EAA decanoato de nandrolona em camundongos confirma os dados encontrados em literatura quanto à desinibição comportamental observada em usuários abusivos humanos. Nosso modelo também foi eficiente em mostrar pela primeira vez alterações moleculares induzidas por este EAA. A redução generalizada na expressão dos genes de receptores de 5-HT na amígdala e córtex pré-frontal sugere essas áreas, pós-sinápticas ao sistema serotoninérgico, como críticas nos efeitos induzidos pelo EAA. Nosso trabalho também sugere um papel importante para o receptor 5-HT1B na desinibição comportamental observada / Nandrolone decanoate is a highly abused anabolic-androgenic steroid (AAS) by individuals looking for gains in physical strength or body appearance. Supraphysiological doses of this testosterone synthetic derivative have been associated with many physical and psychiatric adverse effects, especially reported episodes of impulsiveness and overt aggressive behavior. Since the neural mechanisms underlying AAS-induced behavioral disinhibition are unknown, we investigated the integrity of serotonergic system transcription in several brain areas of mice under prolonged nandrolone administration. Male C57Bl/6J mice received 15 mg/kg of nandrolone decanoate subcutaneously once daily for 28 days, and different sets of animals were used to investigate motor and emotion-related behaviors or 5-HT-related gene expression by qRT-PCR. AAS-injected mice had increased body weight, were hyperactive and displayed more anxious-like behaviors in novel environments. They exhibited reduced immobility in the forced swim test, higher probability of being aggressive and elevated impulsivity to attack the opponent. AAS induced substantial reduction in the transcription of most postsynaptic 5-HT receptors investigated in the amygdala and prefrontal cortex. Interestingly, 5-HT1B mRNA was further reduced in the hippocampus and hypothalamus. At the midbrain level, there was no alteration in 5- HT receptors, transporter or synthetic enzyme gene transcription. In conclusion, high doses of AAS nandrolone in male mice recapitulate the behavioral disinhibition observed in abusers. Furthermore, they are associated with overall decrease in 5-HT receptor gene expression in the amygdala and prefrontal cortex, implicating these areas as critical sites for AASinduced effects and indicating a role for the 5-HT1B receptor in this behavioral disinhibition

Pesticidas organofosforados são amplamente usados e seu uso constitui um grave problema de saúde pública. A ação clássica destes compostos é a inibição irreversível da acetilcolinesterase, promovendo acúmulo de acetilcolina nas sinapses e hiperestimulação colinérgica. No entanto, as consequências da exposição a baixas doses podem se estender a outros mecanismos de ação e sistemas neurotransmissores. Considerando que crianças constituem um grupo particularmente vulnerável aos efeitos de pesticidas, neste trabalho investigamos os efeitos da exposição aos organofosforados metamidofós (MET) e clorpirifós (CPF) durante o desenvolvimento sobre os sistemas colinérgico e serotoninérgico e sobre o comportamento de camundongos. Para isso, camundongos suíços foram expostos a injeções subcutâneas de MET, clorpirifós ou veículo do terceiro (PN3) ao nono (PN9) dias de vida pós-natal. As doses de exposição foram previamente escolhidas através da construção de uma curva dose-resposta que identificou como mais adequadas para este estudo as doses de 1mg/kg de MET e 3mg/kg de CPF, as quais promoveram em torno de 20% de inibição da acetilcolinesterase. Em PN10, parte dos animais foi sacrificada e foram avaliados os sistemas colinérgico e serotoninérgico no tronco encefálico e córtex cerebral. De PN60 a PN63, os animais foram submetidos a uma bateria de testes comportamentais. Em seguida, estes animais também foram sacrificados tendo sido avaliados os sistemas colinérgico e serotoninérgico. Em PN10, MET e CPF causaram alterações que sugerem aumento da atividade colinérgica respectivamente no tronco e córtex em fêmeas. No sistema serotoninérgico, apenas CPF promoveu alterações, aumentando a ligação ao receptor 5HT1A e transportador 5HT em fêmeas e diminuindo na ligação ao 5HT2. Em PN63, a atividade da acetilcolinesterase foi reestabelecida em todos os grupos. Ainda assim, MET diminuiu a atividade da colina acetiltransferase no córtex e a ligação ao transportador colinérgico no tronco. Quanto aos efeitos do CPF, no tronco, houve redução da atividade da colina acetiltransferase em fêmeas e aumento em machos. Sobre o sistema serotoninérgico, MET e CPF promoveram diminuições no 5HT1A respectivamente no tronco e córtex das fêmeas e CPF aumentou a ligação no córtex de machos. A ligação ao 5HT2 foi aumentada após o tratamento com MET e ao transportador 5HT foi diminuída em fêmeas após o tratamento com clorpirifós. Sobre o comportamento, identificamos comportamento associado à depressão em animais expostos a MET e aumento dos níveis de ansiedade, além de prejuízo de aprendizado/memória após exposição à CPF. Desta forma, nossos resultados indicam que a exposição à metamidofós e clorpirifós durante o desenvolvimento é capaz de alterar, de diferentes formas, a atividade colinérgica e serotoninérgica, mesmo que as doses de exposição sejam toxicologicamente equivalentes. Foram verificados efeitos nas vias neuroquímicas logo após a exposição e após um longo período de interrupção do tratamento, indicando efeitos tardios em sistemas importantes que podem estar associados às alterações comportamentais. Finalmente, o presente estudo reforça a associação epidemiológica entre pesticidas e alterações psiquiátricas e a capacidade da programação de alterações a longo-prazo quando a exposição se dá durante o desenvolvimento. / Organophosphate pesticides are widely used and its use consist on a severe public health problem. The classic effect of these compounds involve irreversible inhibition of the enzyme acetylcholinesterase, causing an accumulation of acetylcholine at cholinergic synapses and, consequently, cholinergic hyperstimulation. However, when the doses of exposure are low, other the mechanisms of action may play a role and other neurotransmitter systems may be affected. Considering that children are particularly vulnerable to effects of these compounds, in this study we investigated the effects of methamidophos and chlorpyrifos organophosphate exposure during development on cholinergic and serotonergic systems and behavior. For this purpose, Swiss mice received subcutaneous injections of methamidophos or chlorpyrifos, or vehicle from the third to the nineth postnatal day (PN3 - PN9). Initially, a dose-response study was performed and the doses of 1mg/kg methamidophos and 3mg/kg chlorphrifos, which promoted 20% inhibition of acetylcholinesterase activity in brain were chosen to be used in the next set of experiments. At PN10, one day after exposure, a group of animals was sacrificed and the brainstem and cortex collected and stored to further analysis of cholinergic and serotonergic systems. From PN60 to PN63 the animals were submitted to behavioral tests in order to evaluate: anxiety, locomotor activity, decision making, depressive-like behavior and learning/memory. After the last test, the animals were sacrificed and the brainstem and cortex collected and stored to further analysis of cholinergic and serotonergic systems. At PN10, methamidophos and chlorpyrifos promoted alterations that suggest an increase of cholinergic activity respectively on the brainstem and cortex of females. As for the serotonergic system: only chlorpyrifos elicited alterations: There were increases in 5HT1A receptor and 5HT transporter binding in females and a decrease in 5HT2 receptor binding. At PN63, the activity of acetylcholinesterase had returned to control levels. Despite that, methamidophos elicited a decrease in the activity of choline acetyltransferase in the cortex and in choline transporter binding in the brainstem. As for the serotonergic system, methamidophos and chlorpyrifos promoted decreased 5HT1A receptor binding respectively in the brainstem and cortex of females and chlorpyrifos increased its binding in males. Methamidophos exposure elicited increased 5HT2 binding whereas chlorpyrifos exposure decreased female 5HT transporter binding. Methamidophos elicited behavioral alterations suggestive of increased depressive-like behavior while chlorpyrifos exposure was associated to increased anxiety levels and memory/learning deficits. Our results indicate that metamidophos and chlorpyrifos exposure during development distinctively affect the cholinergic and serotonergic systems even at toxicologically equivalent doses. There were immediate and late-emergent neurochemical effects that may play a role on the behavioral outcomes. Finally, the present study reinforces the epidemiologic association between pesticides exposure and mood disorders and suggest that organophosphate exposure during early development programs for late effects.

Pesticidas organofosforados são amplamente usados e seu uso constitui um grave problema de saúde pública. A ação clássica destes compostos é a inibição irreversível da acetilcolinesterase, promovendo acúmulo de acetilcolina nas sinapses e hiperestimulação colinérgica. No entanto, as consequências da exposição a baixas doses podem se estender a outros mecanismos de ação e sistemas neurotransmissores. Considerando que crianças constituem um grupo particularmente vulnerável aos efeitos de pesticidas, neste trabalho investigamos os efeitos da exposição aos organofosforados metamidofós (MET) e clorpirifós (CPF) durante o desenvolvimento sobre os sistemas colinérgico e serotoninérgico e sobre o comportamento de camundongos. Para isso, camundongos suíços foram expostos a injeções subcutâneas de MET, clorpirifós ou veículo do terceiro (PN3) ao nono (PN9) dias de vida pós-natal. As doses de exposição foram previamente escolhidas através da construção de uma curva dose-resposta que identificou como mais adequadas para este estudo as doses de 1mg/kg de MET e 3mg/kg de CPF, as quais promoveram em torno de 20% de inibição da acetilcolinesterase. Em PN10, parte dos animais foi sacrificada e foram avaliados os sistemas colinérgico e serotoninérgico no tronco encefálico e córtex cerebral. De PN60 a PN63, os animais foram submetidos a uma bateria de testes comportamentais. Em seguida, estes animais também foram sacrificados tendo sido avaliados os sistemas colinérgico e serotoninérgico. Em PN10, MET e CPF causaram alterações que sugerem aumento da atividade colinérgica respectivamente no tronco e córtex em fêmeas. No sistema serotoninérgico, apenas CPF promoveu alterações, aumentando a ligação ao receptor 5HT1A e transportador 5HT em fêmeas e diminuindo na ligação ao 5HT2. Em PN63, a atividade da acetilcolinesterase foi reestabelecida em todos os grupos. Ainda assim, MET diminuiu a atividade da colina acetiltransferase no córtex e a ligação ao transportador colinérgico no tronco. Quanto aos efeitos do CPF, no tronco, houve redução da atividade da colina acetiltransferase em fêmeas e aumento em machos. Sobre o sistema serotoninérgico, MET e CPF promoveram diminuições no 5HT1A respectivamente no tronco e córtex das fêmeas e CPF aumentou a ligação no córtex de machos. A ligação ao 5HT2 foi aumentada após o tratamento com MET e ao transportador 5HT foi diminuída em fêmeas após o tratamento com clorpirifós. Sobre o comportamento, identificamos comportamento associado à depressão em animais expostos a MET e aumento dos níveis de ansiedade, além de prejuízo de aprendizado/memória após exposição à CPF. Desta forma, nossos resultados indicam que a exposição à metamidofós e clorpirifós durante o desenvolvimento é capaz de alterar, de diferentes formas, a atividade colinérgica e serotoninérgica, mesmo que as doses de exposição sejam toxicologicamente equivalentes. Foram verificados efeitos nas vias neuroquímicas logo após a exposição e após um longo período de interrupção do tratamento, indicando efeitos tardios em sistemas importantes que podem estar associados às alterações comportamentais. Finalmente, o presente estudo reforça a associação epidemiológica entre pesticidas e alterações psiquiátricas e a capacidade da programação de alterações a longo-prazo quando a exposição se dá durante o desenvolvimento. / Organophosphate pesticides are widely used and its use consist on a severe public health problem. The classic effect of these compounds involve irreversible inhibition of the enzyme acetylcholinesterase, causing an accumulation of acetylcholine at cholinergic synapses and, consequently, cholinergic hyperstimulation. However, when the doses of exposure are low, other the mechanisms of action may play a role and other neurotransmitter systems may be affected. Considering that children are particularly vulnerable to effects of these compounds, in this study we investigated the effects of methamidophos and chlorpyrifos organophosphate exposure during development on cholinergic and serotonergic systems and behavior. For this purpose, Swiss mice received subcutaneous injections of methamidophos or chlorpyrifos, or vehicle from the third to the nineth postnatal day (PN3 - PN9). Initially, a dose-response study was performed and the doses of 1mg/kg methamidophos and 3mg/kg chlorphrifos, which promoted 20% inhibition of acetylcholinesterase activity in brain were chosen to be used in the next set of experiments. At PN10, one day after exposure, a group of animals was sacrificed and the brainstem and cortex collected and stored to further analysis of cholinergic and serotonergic systems. From PN60 to PN63 the animals were submitted to behavioral tests in order to evaluate: anxiety, locomotor activity, decision making, depressive-like behavior and learning/memory. After the last test, the animals were sacrificed and the brainstem and cortex collected and stored to further analysis of cholinergic and serotonergic systems. At PN10, methamidophos and chlorpyrifos promoted alterations that suggest an increase of cholinergic activity respectively on the brainstem and cortex of females. As for the serotonergic system: only chlorpyrifos elicited alterations: There were increases in 5HT1A receptor and 5HT transporter binding in females and a decrease in 5HT2 receptor binding. At PN63, the activity of acetylcholinesterase had returned to control levels. Despite that, methamidophos elicited a decrease in the activity of choline acetyltransferase in the cortex and in choline transporter binding in the brainstem. As for the serotonergic system, methamidophos and chlorpyrifos promoted decreased 5HT1A receptor binding respectively in the brainstem and cortex of females and chlorpyrifos increased its binding in males. Methamidophos exposure elicited increased 5HT2 binding whereas chlorpyrifos exposure decreased female 5HT transporter binding. Methamidophos elicited behavioral alterations suggestive of increased depressive-like behavior while chlorpyrifos exposure was associated to increased anxiety levels and memory/learning deficits. Our results indicate that metamidophos and chlorpyrifos exposure during development distinctively affect the cholinergic and serotonergic systems even at toxicologically equivalent doses. There were immediate and late-emergent neurochemical effects that may play a role on the behavioral outcomes. Finally, the present study reinforces the epidemiologic association between pesticides exposure and mood disorders and suggest that organophosphate exposure during early development programs for late effects.

O Transtorno Depressivo Maior (TDM) é uma condição neuropsiquiátrica que resulta em um substancial sofrimento pessoal, incapacidade e custos sociais. Devido à inacessibilidade ao encéfalo humano por questões práticas, éticas e às limitações encontradas pelo uso de modelos animais, o desenvolvimento de modelos in vitro acurados torna-se fundamental para o estudo desta doença. Neste aspecto, o surgimento da tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) apresenta-se como uma importante ferramenta, uma vez que permite a recapitulação da diversidade genética dos pacientes e possibilita a produção de tipos celulares de interesse para o estudo da doença, como neurônios e glia. Entretanto, até o momento, não há registros da produção de modelos in vitro a partir de hiPSCs de pacientes com TDM. Visando preencher esta lacuna, o presente estudo teve por objetivo a produção e caracterização de dois tipos de modelos in vitro a partir de hiPSCs de pacientes com TDM: neurônios serotoninérgicos, uma cultura celular em monocamada, e organóides cerebrais, uma cultura celular em suspensão. 5 linhagens de hiPSCs de pacientes foram diferenciadas em neurônios com sucesso e no ensaio de imunocitoquímica, expressaram os marcadores 5-HT (serotonina), T5-HT (transportador de serotonina), nestina (presente em diferentes tipos de células neuronais) e Tuj1 (proteína do citoesqueleto, neurônio-específica), confirmando o fenótipo de neurônios serotoninérgicos. As céluas diferenciadas obtiveram também resultados positivos nos testes de imageamento de cálcio e de medidas da alteração no potencial de membrana, indicando que os neurônios diferenciados eram fisiologicamente funcionais. De 5 linhagens de hiPSCs (sendo uma controle e as outras 4 de pacientes com TDM), somente 1 linhagem sobreviveu ao processo de diferenciação, originando organóides cerebrais e apresentou expressão dos marcadores Sox2 (progenitoras neurais) e Tuj1 (neurônios maduros), indicando ainda uma estruturação correta da citoarquitetura, com as progenitoras localizadas mais internamente, na zona ventricular, ao redor dos lúmens preenchidos com líquido e com os neurônios maduros localizados na placa cortical, região mais externa dos agregados celulares. Apesar de o processo de produção dos organóides cerebrais necessitar de aperfeiçoamento e melhor padronização, a produção destes dois tipos de modelos in vitro, feitos a partir de hiPSCs de pacientes com TDM configura-se como um importante passo para a futura redução do uso de modelos animais em pesquisa, elucidação de mecanismos subjacentes à doença, identificação de biomarcadores diagnósticos e triagem de fármacos de maneira personalizada, visando permitir tratamentos mais baratos, adequados e eficientes para o TDM / Major Depressive Disorder (MDD) is a neuropsychiatric condition that results in substantial personal distress, disability, and social costs. The inaccessibility to the human brain due to practical and ethical issues and the limitations encountered by the use of animal models turn the development of accurate in vitro models into an essential factor to study this disease. In this regard, the emergence of human induced pluripotent stem cell technology (hiPSCs) is an important tool, since it allows the recapitulation of patient\'s genetic diversity and allows the production of cell types of interest for studying the disease, such as neurons and glia. However, to date, there are no records of the production of in vitro models from hiPSCs of patients with MDD. In order to fill this gap, the present study aimed at the production and characterization of two types of in vitro models from hiPSCs of patients with MDD: serotonergic neurons, a monolayer cell culture, and cerebral organoids, a suspension cell culture. 5 patients\' hiPSCs lines were successfully differentiated into neurons and, in the immunocytochemistry assay, they expressed the 5-HT (serotonin), T5-HT (serotonin transporter), nestin (present in several neuronal cell types) and Tuj1 (cytoskeleton protein, neuron-specific), confirming the phenotype of serotonergic neurons. Differentiated cells also obtained positive results in calcium imaging tests and measurements of membrane potential changes, indicating that differentiated neurons were physiologically functional. Of 5 hiPSCs lines (one control and the other 4 of patients with MDD), only 1 survived to the differentiation process, originating cerebral organoids which presented expression of Sox2 (neural progenitor) and Tuj1 (mature neurons) markers and a correct structuring of the cytoarchitecture, with the progenitors located more internally in the ventricular zone, around the lumens filled with liquid and with the mature neurons located in the cortical plate, the outermost region of the cellular aggregates. Although the cerebral organoids production process needs improvement and better standardization, the production of these two types of in vitro models, made from hiPSCs of patients with MDD, is an important step for the future reduction of animal models use, elucidation of disease underlying mechanisms, identification of diagnostic biomarkers and drug screening in a personalized manner, in order to allow cheaper, more adequate and more efficient treatments for MDD

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Depression is a psychiatric disorder associated with a negative impact on quality of life. Monoaminergic system has been involved in this disease and in the action of antidepressants. This study aimed to investigate the potential antidepressant-like of 7-fluoro-1,3-diphenylisoquinoline-1-amine (FDPI) and the possible involvement of monoaminergic system. Results showed that FDPI (1, 10 and 20 mg/kg, intragastric (i.g.)) reduced the immobility time, increased swimming time, but did not alter climbing time of mice in the modified forced swimming test (FST). These effects were similar to those of paroxetine (8 mg/kg, intraperitoneally (i.p.)), a selective serotonin reuptake inhibitor, which was used as positive control. Pretreatments with p-chlorophenylalanine (pCPA, an inhibitor of serotonin (5-HT) synthesis, 100 mg/kg, i.p., once a day for 4 consecutive days), N-[1]-N-(2-pyridinyl) cyclohexanecarboxamide (WAY 100635, a 5-HT1A receptor antagonist, 0.1 mg/kg, subcutaneous injection (s.c.)) and ondansetron (a 5-HT3 receptor antagonist, 1 mg/kg, i.p.) reversed the antidepressant-like effect of FDPI at the dose 1 mg/kg in FST, this did not occurs with ritanserin (a 5-HT2A/2C receptor antagonist, 1 mg/kg, i.p.). Antagonist related with dopaminergic system, as haloperidol (a D2 receptor antagonist, 0.2 mg/kg, i.p.) and SCH23390 (a D1 receptor antagonist, 0.05 mg/kg, s.c.) were able to reverse the antidepressant-like effect of FDPI at the dose 1 mg/kg in FST, this did not occurs with sulpiride (a D2 and D3 receptors antagonist, 50 mg/kg, i.p.). FDPI, at doses of 10 and 20 mg/kg, inhibited monoamine oxidase-B activity in prefrontal cortex of mice. These results suggest that FDPI produced an antidepressant-like action in the FST in mice, possibly by an involvement of the monoaminergic system. Additional studies are necessary in order to propose FDPI as a drug for depression treatment. / A depressão é uma doença psiquiátrica associada com um impacto negativo na qualidade de vida. O sistema monoaminérgico parece estar envolvido nessa doença e na ação dos antidepressivos. Esse estudo teve como objetivo investigar o potencial do tipo antidepressivo do 7-flúor- 1,3 difenilisoquinolina-1-amino (FDPI) e o possível envolvimento do sistema monoaminérgico. Os resultados mostraram que o FDPI (1, 10 e 20 mg/kg, intragástrico (i.g.)) reduziu o tempo de imobilidade, aumentou o tempo de nado, mas não alterou o tempo de escalada dos camundongos durante o teste do nado forçado (TNF) modificado. Esses efeitos foram similares aos da paroxetina (8 mg/kg, intraperitoneal (i.p.)), um inibidor seletivo da recaptação de serotonina, o qual foi usado como controle positivo. Os pré-tratamentos com p-clorofenilalanina (pCPA, um inibidor da síntese de serotonina (5-HT), 100 mg/kg, i.p., uma vez por dia, por 4 dias consecutivos), N-{2-[4-(2-metoxifenil)-1-piperazinil]etil}-N-(2-piridinil) ciclohexanocarboxamida (WAY 100635, um antagonista dos receptores 5-HT1A, 0,1 mg/kg, subcutâneo (s.c.)) e ondansetrona (um antagonista dos receptores 5-HT3, 1 mg/kg, i.p.) conseguiram reverter o efeito do tipo antidepressivo do FDPI na dose de 1 mg/kg no TNF, o que não aconteceu com a ritanserina (um antagonista do receptores 5-HT2A/2C, 1 mg/kg, i.p.). Antagonistas relacionados com o sistema dopaminérgico, como haloperidol (um antagonista do receptor D2, 0,2 mg/kg, i.p.), e SCH23390 (um antagonista do receptor D1, 0,05 mg/kg, s.c.) foram capazes de reverter o efeito do tipo antidepressivo do FDPI na dose de 1 mg/kg no TNF, o que não aconteceu com o sulpiride (um antagonista dos receptores D2 e D3, 50mg/kg, i.p.). O composto FDPI nas doses de 10 e 20 mg/kg inibiu a atividade da monoamino oxidase B em córtex pré-frontal de camundongos. Estes resultados sugerem que o FDPI apresentou uma ação do tipo antidepressiva no TNF em camundongos, possivelmente por um envolvimento do sistema monoaminérgico. Mais estudos se fazem necessários antes que se possa propor o FDPI como uma droga para o tratamento da depressão.

Há estudos que mostraram que o ácido N-metil-D-aspártico (NMDA), microinjetado nas estruturas do teto mesencefálico (corpos quadrigêmeos) de ratos evoca comportamentos defensivos do tipo pânico que podem ser seguidos por uma resposta antinociceptiva. Tem sido sugerido que respostas defensivas relacionadas ao medo organizadas por neurônios do tronco cerebral podem ser moduladas por projeções ascendentes mediadas pelo neurotransmissor 5-hidroxitriptamina (5-HT) do núcleo dorsal da rafe (NDR), e fenômenos antinociceptivos induzidos pelo medo inato podem ser organizados por vias serotoninérgicas descendentes também originadas no NDR. Os neurônios do NDR que originam tais conexões, por sua vez, podem ser moduladas por monoaminas que recrutam receptores 5-HT2A localizados no NDR. Não obstante, háuma escassez de estudos mostrando o papel dos receptores 5-HT2A do NDR na modulação do comportamento do tipo pânico e da antinocicepção induzida pelo medo inato organizados nos colículos superiores e inferiores. O objetivo deste estudo foi investigar a participação dos receptores 5-HT2A do NDR na modulação do comportamento de defesa organizado pelos corpos quadrigêmeos e da antinocicepção induzida pelo medo evocados por microinjeções de NMDA nos corpos quadrigêmeos. No experimento I, os animais receberam microinjeção de veículo (NaCl 0,9% / 0,2?L) ou 6, 9 e 12 nmol NMDA no CI. No experimento II, foi realizado o pré-tratamento do NDR com microinjeções de veículo ou o antagonista seletivo do receptor 5HT2A (R-96544) nas concentrações de 5, 10 e 15 nM. Dez minutos depois, o NMDA na dose mais efetiva (12 nmol) foi injetado no CI. Em ambos os experimentos, as respostas defensivas foram analisadas quantitativamente durante 10 min e, em seguida, as latências de retirada de cauda foram medidas a intervalos de 10 min durante 70 min. No experimento III, os animais receberam microinjeção de salina fisiológica ou NMDA (6, 9 e 12 nmol) nas cpSC. No experimento IV, a dose mais efetiva de NMDA (12 nmol) ou veículo foi precedida por microinjeções de veículo ou antagonista seletivo do receptor 5HT2A (R- 96544) em diferentes concentrações, 0.5, 5 e 10 nM. Ambos os efeitos pró-eversivos e antinociceptivos provocados pelas injecções intra-cpCS de NMDA foram atenuados pelo pré-tratamento do NDR com R-96544. No experimento V, a análise morfológica mostrou que os receptores 5-HT2A estão presentes nos interneurônios GABAérgicos do NDR. Em conjunto, esses achados sugerem que o bloqueio dos receptores 5-HT2A no NDR é capaz de atenuar tanto o comportamento defensivo do tipo pânico quanto a antinocicepção induzida pelo medo organizada pelos corpos quadrigêmeos. / There are studies that suggest that N-methyl-D-aspartic acid (NMDA) microinjected into the midbrain tectum structures, such corpora quadrigemina, of rats evokes panic-like defensive behaviours that can be followed by an antinociceptive response. It has been suggested that fear-related defensive responses organised by brainstem neurons can be modulated by ascending projections mediated by the neurotransmitter 5-hydroxytryptamine (5-HT) of the dorsal raphe nucleus (DRN), and phenomena of innate fear-induced antinociception can be organised by descending serotonergic pathways also originating from the DRN. The DRN neurons that give rise to such connections, in turn, can be moduled by monoamines that recruit 5-HT2A receptors located in the DRN. Nevertheless, there is a shortage of studies showing the role of DRN 5-HT2A receptors in the modulation of panic-like behaviour and innate fearinduced antinociception organised by superior and inferior colliculi. The purpose of this study was to investigate the participation of DRN 5-HT2A receptors in the modulation of panic-like behaviour and antinociception evoked by corpora quadrigemina injections of NMDA. In experiment I, the animals received microinjection of vehicle (0.9%NaCl/0.2?L) or 6, 9 and 12 nmol NMDA into the IC. In experiment II, it was performed the pretreatment of DRN with microinjections of vehicle or the 5HT2A receptor selective antagonist (R-96544) in a concentration of 5, 10 and 15 nM. Ten minutes later, NMDA at the most effective dose (12nmol) was injected in the IC. In both experiments, the defensive responses were quantitatively analysed for 10 min and then the tail-flick withdrawal latencies were measured at 10 min-intervals for 70 min. In experiment III, the animals received microinjection of physiological saline or NMDA (6, 9 and 12 nmol) into the deep layers of SC (dlSC). In experiment IV, the most effective dose of NMDA (12 nmol) or vehicle was preceded by microinjections of vehicle or 5HT2A receptor selective antagonist (R-96544) at different concentrations (0.5, 5, and 10 nM). Both proaversive and antinociceptive effects elicited by intra-dlSC injections of NMDA were attenuated by the pretreatment of the DRN with R-96544. In experiment V, the morphological analysis showed that 5-HT2A receptors are present in GABAergic interneurons in the DRN. Taken together, these findings suggest that the blockade of DRN 5-HT2A receptors decreased both panic attack-like defensive behaviour and fear- induced antinociception organised by the corpora quadrigemina neurons.

Bases: A antinocicepção induzida por substâncias doces tem sido largamente estudada. Contudo, a investigação dos neurotransmissores envolvidos nesse processo antinociceptivo ainda carece de mais estudos, pois é de extrema importância entender o envolvimento desses neurotransmissores no sistema neural que controla este tipo de antinocicepção. Objetivo: O objetivo deste estudo é clarificar o envolvimento dos sistemas opióide e serotoninérgico na antinocicepção induzida por substância doce. Método: O presente trabalho foi realizado em modelo animal (Rattus norvegicus, Rodentia, Muridae), objetivando investigar se a ingestão crônica de solução de sacarose é seguida de antinocicepção. A latência de retirada de cauda após a aplicação de estímulo nocivo térmico foi medida antes e após esse tratamento no teste de retirada de cauda (provavelmente um reflexo espinal). Não houve diferenças estatisticamente significantes entre os valores de linha basal dos diferentes grupos e foi calculado um índice de analgesia da latência de retirada de cauda antes e depois do tratamento. O envolvimento de opióides endógenos e de serotonina neste processo antinociceptivo foi pesquisado com fármacos antagonistas específicos e não-específicos dos receptores opióides e serotoninérgicos. Resultados: O efeito analgésico da ingestão de sacarose depende da concentração da solução de sacarose e do tempo de duração do consumo da mesma. Naltrexona e metisergida diminuíram a antinocicepção induzida por substâncias doce (após 14 dias de ingestão da sacarose). Estes efeitos foram corroborados pela administração periférica de naloxonazina e cetanserina. Conclusões: Os resultados sugerem o envolvimento de opióides endógenos e serotonina no processo antinociceptivo atualmente estudado. Tudo apontando para a participação de receptores opióides µ1 e serotoninérgicos 5-HT2 na regulação central da antinocicepção induzida por substâncias doces. / Rationale: Sweet substance-induced antinociception has been widely studied, and the investigation of the neurotransmitters involved in the antinociceptive process is an important way for understanding the involvement of neural system controlling this kind of antinociception. Objective: The aim of this study is to investigate the involvement of opioid and serotonergic system in the sweet substance-induces antinociception. Methods: the present work was made in animal model (Rattus norvegicus, Rodentia, Muridae); with the aim of investigating if the chronic intake of sweet substance, such as sucrose, is followed by antinociception. Their tail withdrawal latencies in the tail-flick test (probably a spinal reflex) were measured before and immediately after this treatment. As there was not statistic significant differences between baseline values of different groups, an analgesia index was calculated from the withdrawal latencies before and after treatment. The involvement of endogenous opioid and serotonin in the antinociceptive process was investigated with specific and non-specific pharmacological antagonism on opioid and serotonergic receptors. Results: The analgesic effect of sucrose intake depends on the concentration of sucrose solution and on the time during which the solution is consumed. Naltrexone and methysergide decreased the sweet substance-induced antinociception (post 14 days of sucrose intake). These effects were corroborated by peripheral administration of naloxonazina and ketanserin. Conclusions: The present results suggest the involvement of endogenous opioids and serotonin in the antinociceptive process presently studied. µ1-opioid and 5-HT2 serotonergic receptors may be involved in the central regulation of the sweet substance-produced antinociception.

Bases: A antinocicepção induzida por substâncias doces tem sido largamente estudada. Contudo, a investigação dos neurotransmissores envolvidos nesse processo antinociceptivo ainda carece de mais estudos, pois é de extrema importância entender o envolvimento desses neurotransmissores no sistema neural que controla este tipo de antinocicepção. Objetivo: O objetivo deste estudo é clarificar o envolvimento dos sistemas opióide e serotoninérgico na antinocicepção induzida por substância doce. Método: O presente trabalho foi realizado em modelo animal (Rattus norvegicus, Rodentia, Muridae), objetivando investigar se a ingestão crônica de solução de sacarose é seguida de antinocicepção. A latência de retirada de cauda após a aplicação de estímulo nocivo térmico foi medida antes e após esse tratamento no teste de retirada de cauda (provavelmente um reflexo espinal). Não houve diferenças estatisticamente significantes entre os valores de linha basal dos diferentes grupos e foi calculado um índice de analgesia da latência de retirada de cauda antes e depois do tratamento. O envolvimento de opióides endógenos e de serotonina neste processo antinociceptivo foi pesquisado com fármacos antagonistas específicos e não-específicos dos receptores opióides e serotoninérgicos. Resultados: O efeito analgésico da ingestão de sacarose depende da concentração da solução de sacarose e do tempo de duração do consumo da mesma. Naltrexona e metisergida diminuíram a antinocicepção induzida por substâncias doce (após 14 dias de ingestão da sacarose). Estes efeitos foram corroborados pela administração periférica de naloxonazina e cetanserina. Conclusões: Os resultados sugerem o envolvimento de opióides endógenos e serotonina no processo antinociceptivo atualmente estudado. Tudo apontando para a participação de receptores opióides µ1 e serotoninérgicos 5-HT2 na regulação central da antinocicepção induzida por substâncias doces. / Rationale: Sweet substance-induced antinociception has been widely studied, and the investigation of the neurotransmitters involved in the antinociceptive process is an important way for understanding the involvement of neural system controlling this kind of antinociception. Objective: The aim of this study is to investigate the involvement of opioid and serotonergic system in the sweet substance-induces antinociception. Methods: the present work was made in animal model (Rattus norvegicus, Rodentia, Muridae); with the aim of investigating if the chronic intake of sweet substance, such as sucrose, is followed by antinociception. Their tail withdrawal latencies in the tail-flick test (probably a spinal reflex) were measured before and immediately after this treatment. As there was not statistic significant differences between baseline values of different groups, an analgesia index was calculated from the withdrawal latencies before and after treatment. The involvement of endogenous opioid and serotonin in the antinociceptive process was investigated with specific and non-specific pharmacological antagonism on opioid and serotonergic receptors. Results: The analgesic effect of sucrose intake depends on the concentration of sucrose solution and on the time during which the solution is consumed. Naltrexone and methysergide decreased the sweet substance-induced antinociception (post 14 days of sucrose intake). These effects were corroborated by peripheral administration of naloxonazina and ketanserin. Conclusions: The present results suggest the involvement of endogenous opioids and serotonin in the antinociceptive process presently studied. µ1-opioid and 5-HT2 serotonergic receptors may be involved in the central regulation of the sweet substance-produced antinociception.