Escherichia coli enteroinvasora (EIEC) e Shigella spp. causam disenteria bacilar, caracterizada pela destruição das células epiteliais da mucosa do cólon do hospedeiro. Ambos os microrganismos apresentam características bioquímicas, genéticas e patogênicas semelhantes, porém a doença causada por EIEC se apresenta numa forma mais branda e auto limitante. Dois genes plasmidiais, icsA e icsB estão envolvidos na disseminação intra e intercelular da bactéria, fator importante na produção e resolução da doença. Trabalhos anteriores mostraram que S. flexneri M90T possui uma capacidade maior de disseminação do que o sorotipo de EIEC O124:H-. Devido a esses resultados surgiu a seguinte pergunta: Será que essas diferenças moleculares e fenotípicas estariam restritas ao sorotipo O124:H- ou é comum ao patotipo EIEC? Assim, neste trabalho avaliamos as características fenotípicas e moleculares de onze diferentes sorotipos de EIEC e as comparamos com as amostras de S. flexneri. Pelo ensaio de placas de lise em células Caco-2 mostramos que a capacidade de disseminação de todos os sorotipos de EIEC é menor quando comparada à Shigella M90T. Ao avaliar as sequências gênicas vimos polimorfismos dos genes icsA e icsB dentro do grupo EIEC, assim como em relação aos sorotipos S. flexneri 2a e S. flexneri 5a. A menor disseminação, apresentado pelo patotipo de E. coli, pode estar associada com o processo de ligação e/ou recrutamento de N-WASP, como também na interação com outras proteínas do hospedeiro. / Enteroinvasive Escherichia coli (EIEC) and Shigella spp cause bacillary dysentery in humans by invading and multiplying within epithelial cells of the colonic mucosa. Although EIEC and Shigella spp share many genetic and biochemical similarities, the illness caused by EIEC is less severe. The effector proteins IcsA and IcsB are important in the physiopathology of the disease triggered by EIEC and Shigella spp. IcsA is required for intracellular actin-based motility, and the role of IcsB is to camouflage IcsA from the autophagic host defense system. Previous studies showed that EIEC O124:H- showed a significantly less efficient cell-to-cell Caco-2 dissemination when compared with S. flexneri. Due to these results the following question arose: Are molecular and phenotypic differences restricted to serotype O124:H- or is it common to EIEC pathotype? Thus, this study evaluated the phenotypic and molecular characteristics of eleven different serotypes of EIEC and compares them to samples of S. flexneri. All EIEC serotypes presented lower cell-to-cell Caco-2 dissemination compared to Shigella M90T, and the differences between this two species expanded to the icsA and icsB gene sequences, in which it was possible to observe a polymorphism of the genes. The smallest spread presented by EIEC E. coli pathotype could be associated with the connection process and/or recruitment of N-WASP, as well as to other important host proteins.

As infecções causadas por patógenos intestinais gram-negativos são importantes fontes de prejuízos na criação de animais domésticos como bovinos, ovinos, suínos e aves. Em muitos casos, opta-se pela administração de antibióticos de amplo espectro para prevenção destas infecções e atenuação das perdas. No entanto, esta prática apresenta risco para a saúde humana, bem como contribui para seleção de cepas resistentes. Nos últimos anos, muito tem se discutido a respeito de novas alternativas para atenuar os prejuízos mencionados sem apresentar o mesmo risco. Uma destas alternativas é a utilização de micro-organismos que apresentam propriedades probióticas que sintetizam substâncias inibitórias sobre espécies de patógenos intestinais. Esta abordagem praticamente elimina o risco de desenvolvimento de resistência aos antibióticos de uso clínico, além de evitar a presença de resíduos nos produtos de origem animal. O termo \"probiótico\" é utilizado atualmente para definir micro-organismos que, administrados em doses e frequências adequadas, conferem benefícios à saúde do hospedeiro. Nos últimos anos, diversos estudos têm sido desenvolvidos envolvendo quatro cepas de Lactobacillus (L. acidophilus ATCC 4356, L. casei ATCC 7469, L. fermentum ATCC 9338 e L. plantarum ATCC 8014) com resultados promissores no tocante às suas características probióticas. Desta forma, a proposta deste estudo foi avaliar a capacidade destas cepas em relação à produção de substâncias que apresentam atividade inibitória sobre espécies patogênicas, intestinais gram-negativas, especificamente Escherichia coli 0112, Escherichia coli 0124, Escherichia coli 0127, Shigella sonnei ATCC 25931, Shigella dysenteriae ATCC 13313, Salmonella enteritidis ATCC 13076. Para tanto, foi avaliada a atividade inibitória de substâncias presentes no sobrenadante livre de células de cada cepa. Adicionalmente, foi realizada a caracterização presuntiva das substâncias responsáveis pela inibição do crescimento microbiano quando os respectivos sobrenadantes foram submetidos a diferentes tratamentos (catalase, enzimas proteolíticas, tratamento térmico e neutralização do pH). A estratégia adotada consistiu na avaliação do crescimento, determinado por turbidimetria, das cepas patogênicas na presença do sobrenadante in natura e tratado. Os valores de absorbância foram analisados estatisticamente pelos testes de ANOVA e Tukey e os resultados mostraram que os sobrenadantes in natura de L. acidophilus ATCC 4356 L. casei ATCC 7469 e L. plantarum ATCC 8014 foram capazes de inibir 5 das 6 cepas dos patógenos intestinais estudadas em níveis de inibição variando de 23% a 53%, sendo que a cepa S. dysenteriae ATCC 13313 não teve seu crescimento inibido pelas cepas de Lactobacillus avaliadas. Demonstrou-se também que apenas o sobrenadante in natura de L. fermentumATCC 9338 apresentou atividade inibitória sobre esta cepa, cujo percentual de inibição variou entre 20% e 35% e entre 36% e 65% para as demais cepas patogênicas. A avaliação dos resultados relativos ao crescimento das cepas patogênicas na presença dos sobrenadantes in natura e tratados revelou que o efeito de inibição observado foi devido a presença de ácidos orgânicos que provocou o abaixamento do pH. Demonstrou-se ainda a ausência de substâncias peptídicas e termolábeis ativas contra as cepas patogênicas avaliadas, bem como peróxido de hidrogênio nos respectivos sobrenadantes. / Infectious diseases caused by gram-negative pathogens are important sources of losses in livestock, especially bovine, ovine and poultry. In many cases, subclinical administration of broad-spectrum antibiotics is chosen as an approach for the prevention of these infections, consequently decreasing these losses. However, this practice presents an important risk to human health, as well as it contributes to the selection of bacterial strains which are resistant to antibiotics usually employed in clinical practice. Therefore, special attention has been given to finding alternative procedures to decrease those losses while eliminating that risk. One of these alternatives consists of using microorganism species which present probiotic properties such as synthesis of inhibitory compounds that act on intestinal pathogen species. This alternative virtually eliminates the risk of developing resistance to broad-spectrum antibiotics, as well as avoids the presence of antibiotic residues in animal products. The term \"probiotic\" is currently used to define microorganism species which promote several benefits to the host, once they are administered frequently and in adequate amounts. In the last few years, several works have been carried out using four Lactobacillus strains (L.acidophilus ATCC 4356, L.casei ATCC 7469, L. fermentum ATCC 9338 and L. plantarum ATCC 8014), and the results have been satisfactory regarding to their probiotic characteristics. Therefore, the aim of this study was to evaluate the ability of these strains to produce inhibitory compounds which are active on gram-negative intestinal pathogen species, specifically Escherichia coli 0112, Escherichia coli 0124, Escherichia coli 0127, Shigella sonnei ATCC 25931, Shigella dysenteriae ATCC 13313 and Salmonella enteritidis ATCC 13076. So, antimicrobial activity of the cell-free supernatant of each strain was evaluated. Additionally, presumptive characterization of these compounds was undertaken by submitting the supernatants to different treatments (catalase, proteolytic enzymes, thermic treatments, pH neutralizing). The strategy consisted of evaluating the growth, estimated by turbidimetry, of the mentioned pathogenic strains in the presence of the original supernatants, as well as in the presence of treated supernatants. Aborbance values were statistically analyzed by means of ANOVA and Tukey\'s test. The results showed that the original supernatants of L. acidophilus ATCC 4356 L. casei ATCC 7469 and L. plantarum ATCC 8014 were capable of inhibiting five of six strains of enteric pathogens at levels varying from 23% to 53%. S. dysenteriae ATCC 13313 was not inhibited by the Lactobacillus strains evaluated. It was also demonstrated that only the original supernatant of L. fermentum ATCC 9338 showed inhibitory activity upon this strain varing from 15% to 32%, and between 36% and 65% regarding to the other strains. Growth evaluation of the pathogenic strains in the presence of the treated and original supernatants revealed that the inhibition effect observed occurred due to the presence of organic acids, which lowered the pH of the supernatants. It was also demonstrated the absence of hydrogen peroxide, peptidic and thermolabile compounds in the supernatants.

Made available in DSpace on 2015-04-11T13:38:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maria Scheffer.pdf: 2086782 bytes, checksum: 928db75671ab568b474a01a176b2665e (MD5) Previous issue date: 2012-12-12 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Shigellosis is a disease manifested from mild diarrhea to severe ysentery. The ability to invade cells, cause injury and imbalance in the homeostasis to the intestinal mucosa and modulate the inflammatory response has been attributed to several factors of pathogenicity of Shigella spp. In this study, thirty-six isolates of Shigella were identified from an etiologic study of childhood diarrhea in 1,500 children aged 0-10 years who were admitted to hospitals in Manaus (East-South-and-West Zones) between August 2007 and July 2009. Shigella flexneri was the most common (65%), followed by Shigella sonnei (20%), Shigella boydii (12.5%) and Shigella dysenteriae (2.5%). Among the isolates, one isolate (intermediate) resistant to ciprofloxacin and 1 (intermediate) to ceftriaxone, which are antibiotics recommended by WHO. Molecular typing of the pathogenicity factors showed evidence of the pathogenic potential of shet- 1B subunit of Shigella and can lead to complications related to dehydration. Frequencies of the IpaBCD (the most prevalent factors among isolates) followed by IpaH suspect associations to fever and bowel injury. The IpaH was clearly associated to bloody diarrhea. And finally, differences in the frequencies of Shet-2 positives between febrile-based groups reinforce its role in the inflammatory response. This study has contributed to the few data in the literature on the pathogenicity of wild Shigella isolates associated to shigellosis and consolidate the importance of finding ways to block the toxicity of these major pathogenicity factors / A shigelose é uma doença manifestada desde uma diarreia leve até uma severa disenteria. A habilidade de invadir células e provocar lesão na mucosa intestinal, bem como levar ao desequilíbrio na homeostase e modular a resposta inflamatória em nível intestinal tem sido atribuídos a diversos fatores de patogenicidade das Shigella spp. Neste trabalho, trinta e seis isolados de Shigella foram identificados a partir de um estudo etiológico de diarreia infantil em 1.500 crianças com idade entre zero a dez anos que deram entrada nos hospitais de Manaus (Zona Leste, Zona Sul e Zona Oeste) com quadro diarreico, no período entre agosto de 2007 a julho de 2009. Shigella flexneri foi à espécie mais frequente (65%), seguida por S. sonnei (20%), S. boydii (12,5%) e S. dysenteriae (2,5%). Entre os isolados, merece destaque o aparecimento de um isolado resistente (intermediária) à ciprofloxacina e 1 resistente (intermediária) à ceftriaxona, que são os antibióticos recomendados pela OMS. A tipagem molecular dos fatores de patogenicidade mostrou evidências sobre o potencial patogênico da subunidade shet-1B das Shigellas, podendo levar a complicações relacionadas à desidratação, de IpaH na febre e na lesão do intestino evidenciado pelo diarreia sanguinolenta. IpaBCD foram os fatores de virulência mais predominantes seguido de IpaH. E uma frequência maior de Shet-2+ em crianças febris em relação a não febris foi verificada. Este estudo vem contribuir com a pouca literatura que existe em relação aos fatores de patogenicidade de isolados de Shigella selvagens com quadro diarreico com ou sem shigelose e consolidar a importância de encontrar caminhos para bloquear a toxicidade destes principais fatores de patogenicidade

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Submitted by Maryse Santos (maryseeu4@gmail.com) on 2016-09-02T15:23:02Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Final Paula Taquita Serra.pdf: 5828635 bytes, checksum: 30c415dfffb3ecb7f7e2e64439a68ae5 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-09-16T12:20:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Final Paula Taquita Serra.pdf: 5828635 bytes, checksum: 30c415dfffb3ecb7f7e2e64439a68ae5 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-09-16T12:24:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Final Paula Taquita Serra.pdf: 5828635 bytes, checksum: 30c415dfffb3ecb7f7e2e64439a68ae5 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-16T12:24:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Final Paula Taquita Serra.pdf: 5828635 bytes, checksum: 30c415dfffb3ecb7f7e2e64439a68ae5 (MD5) Previous issue date: 2013-09-04 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Introduction: Shigellosis is a bacillary dysentery caused by Shigella, a gramnegative intracellular human pathogen. One of most common animal models to evaluate Shigella’s immune response is mice pulmonary infection due easy manipulation and similar gut responses. At this study, we have hypothesized how clinical strains isolated from Shigellosis patients had differential immune response expression when compared to standards strains (M90T). Our main proposition was analyze four clinical Shigella strains with distinct virulence genes and M90T immune responses at murine invasion after 24 and 48h infection. Methods: Shigella Clinical Strains were selected through presence of specific virulence genes by PCR. Primers related to immune system were designed. Clinical strains and M90T Shigella were submitted to expression at Fluidigm (Bioamark Platform). Results were analyzed in statistical software R. Results: We grouped analyzed mRNA in five gene sets: Pro Inflammatory (CXCL15, IL-1β, IL-6, IFN-β, TNF-α), Anti Inflammatory (TGF-β1, TGF- β2 e TGF-β3), Innate Response (NOD 1, NOD 2, TLR4 e TLR9), Adaptive Response (Th1-like, IFN-γ, IL-17A e IL-17B) and Macrophage (NOS, H2 -Aβ1, H2-Eβ, H2-K1, MHC-like 2). As main results, all clinical strains displayed a moderate mRNA expression in 24h infection which gets higher in 48h, while M90T standard had opposite regulation with lower mRNA rates in 48h infection, suggesting major differences between well characterized standards and clinical strains. Clinical strain #5 did not alter mRNA expression in 24 and 48h at adaptive immune response genes, suggesting low invasion rates and host control at initial steps of infection. Clinical strain #11 demonstrates high macrophage activity by superior expression levels of IFN-γ and NOS. Strains #14 and #27 suggest potential of Th1 protection through high MHC-like II and Th1 mRNA expression when compared to all other strains and standard control. Presence of IL-17 high expression in strain #27 demonstrates a possible relation with Th17 cells. The immunological potential of strain #27 may have relationship with Shigella enterotoxins (shET1A, shET1B, and shET2). Enterotoxins presence was confirmed by PCR and results shows this complete set is absent in all other strains studied. Conclusion: The differences between clinical strains and standards were evident at this study. Clinical strain 27 appears as a great candidate to future studies and may provide new perspectives about differences among invasion and immune response seen in the clinical practice. / Shigelose é uma disenteria bacilar causada pela Shigella, um patógeno Gram negativo e intracelular. Um dos modelos animais mais comuns para avaliar a resposta imune da Shigella é a infecção pulmonar em camundongos devido a fácil manipulação e similaridade com as respostas intestinais. Neste estudo, nós levantamos a hipótese de como cepas clínicas isoladas de pacientes com shigelose possuem expressão de resposta imune diferencial quando comparados com cepas padrões (M90T). Nossa principal proposta foi analisar quatro cepas de Shigella clínicas com diferentes genes de virulência e a cepa padrão M90T quanto as respostas imunes após invasão murina em 24 e 48h. Métodos: Cepas clínicas de Shigella foram selecionadas pela presença de genes de virulência específicos por PCR. Primers relacionados ao sistema imune foram desenvolvidos. As cepas clínicas e a padrão foram submetidas à análise de expressão gênica pelo Fluidigm (Bioamark Platform). Os resultados foram analisados em programa estatístico R. Resultados: Nós agrupamos os mRNA em cinco grupos: Pró Inflamatórios (CXCL15, IL-1β, IL-6, IFN-β, TNF-α), Anti Inflamatórios (TGF-β1, TGF-β2 e TGF-β3), Resposta Inata (NOD 1, NOD 2, TLR4 e TLR9), Resposta adaptativa (Th1-like, IFN- γ, IL-17A e IL-17B) e Macrófago (NOS, H2 -Aβ1, H2-Eβ, H2-K1, MHC-like 2). Como principais resultados, todas as amostras clínicas demonstraram uma expressão mRNA em 24h de infecção que foi gradativamente aumentado após 48h, enquanto a cepa padrão M90T teve a regulação oposta com taxas de mRNA em 48h, sugerindo grandes diferenças entre as respostas a cepas clínicas e a padrões bem caracterizados. A cepa clínica #5 não alterou a expressão de mRNA em 24 e 48h nos genes da resposta adaptativa, sugerindo baixas taxas de invasão e controle do hospedeiro nas etapas iniciais da infecção. A cepa clínica #11 demonstrou alta atividade macrofágica devido a maior expressão de IFN-γ e NOS. A cepa #14 e #27 demonstraram um possível potencial de proteção Th1 devido a alta expressão mRNA para MHC-like II e Th1 quando comparado a outras cepas e o controle positivo. A presença de alta expressão de IL-17 na cepa #27 relação com células Th17. O potencial imunológico da cepa #27 pode ter relação com as enterotoxinas (shET1A, shET1B e shET2). A presença do conjunto completos destas enterotoxinas foi confirmado na cepa #27 por PCR. Conclusão: As diferenças entre cepas clínicas e padrões foram evidentes neste estudo. Cepa clínica 27 parece ser uma ótima candidata para estudos futuros e pode prover novas perspectivas para as diferenças de invasão e resposta imune vista nos hospitais.

Escherichia coli enteroinvasora (EIEC) e Shigella spp. causam disenteria bacilar, caracterizada pela destruição das células epiteliais da mucosa do cólon do hospedeiro. Ambos os microrganismos apresentam características bioquímicas, genéticas e patogênicas semelhantes, porém a doença causada por EIEC se apresenta numa forma mais branda e auto limitante. Dois genes plasmidiais, icsA e icsB estão envolvidos na disseminação intra e intercelular da bactéria, fator importante na produção e resolução da doença. Trabalhos anteriores mostraram que S. flexneri M90T possui uma capacidade maior de disseminação do que o sorotipo de EIEC O124:H-. Devido a esses resultados surgiu a seguinte pergunta: Será que essas diferenças moleculares e fenotípicas estariam restritas ao sorotipo O124:H- ou é comum ao patotipo EIEC? Assim, neste trabalho avaliamos as características fenotípicas e moleculares de onze diferentes sorotipos de EIEC e as comparamos com as amostras de S. flexneri. Pelo ensaio de placas de lise em células Caco-2 mostramos que a capacidade de disseminação de todos os sorotipos de EIEC é menor quando comparada à Shigella M90T. Ao avaliar as sequências gênicas vimos polimorfismos dos genes icsA e icsB dentro do grupo EIEC, assim como em relação aos sorotipos S. flexneri 2a e S. flexneri 5a. A menor disseminação, apresentado pelo patotipo de E. coli, pode estar associada com o processo de ligação e/ou recrutamento de N-WASP, como também na interação com outras proteínas do hospedeiro. / Enteroinvasive Escherichia coli (EIEC) and Shigella spp cause bacillary dysentery in humans by invading and multiplying within epithelial cells of the colonic mucosa. Although EIEC and Shigella spp share many genetic and biochemical similarities, the illness caused by EIEC is less severe. The effector proteins IcsA and IcsB are important in the physiopathology of the disease triggered by EIEC and Shigella spp. IcsA is required for intracellular actin-based motility, and the role of IcsB is to camouflage IcsA from the autophagic host defense system. Previous studies showed that EIEC O124:H- showed a significantly less efficient cell-to-cell Caco-2 dissemination when compared with S. flexneri. Due to these results the following question arose: Are molecular and phenotypic differences restricted to serotype O124:H- or is it common to EIEC pathotype? Thus, this study evaluated the phenotypic and molecular characteristics of eleven different serotypes of EIEC and compares them to samples of S. flexneri. All EIEC serotypes presented lower cell-to-cell Caco-2 dissemination compared to Shigella M90T, and the differences between this two species expanded to the icsA and icsB gene sequences, in which it was possible to observe a polymorphism of the genes. The smallest spread presented by EIEC E. coli pathotype could be associated with the connection process and/or recruitment of N-WASP, as well as to other important host proteins.

Orientador: Marcelo Brocchi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T03:47:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gregoracci_GustavoBueno_D.pdf: 6197096 bytes, checksum: 05eb5e18d8084e5c5f742c6ec5afd63d (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Bacteriófagos são vírus que infectam bactérias e arqueias, representando as entidades biológicas mais abundantes do mundo e influenciando de maneira marcante populações naturais de seus hospedeiros. A terapia com bacteriófagos, que representa uma das primeiras formas modernas de combate a infecções bacterianas, foi recentemente redescoberta e vem sendo reavaliada seguindo metodologias atuais quanto à sua viabilidade terapêutica. Para completar a caracterização dos fagos de nossa coleção, sequenciamos completamente o genoma da maior parte destes, através da metodologia multiplex pair-ended utilizando a plataforma Illumina. Visando contribuir para verificação da viabilidade terapêutica de bacteriófagos testamos os efeitos protetor e terapêutico dos fagos Shfl1, Saen1v2 e Saen1v4, pertencentes à coleção de nosso laboratório, em modelos biológicos relevantes. O fago Shfl1, lítico contra Shigella flexneri, foi testado em ensaio de invasão em células HeLa. A redução de bactérias intracelulares foi mensurada independentemente através de plaqueamento e citometria de fluxo, além da observação direta por microscopia de fluorescência. O fago Saen1v2, lítico contra Salmonella Typhimurium, foi estudado quanto à biodistribuição e meia-vida em modelo murino, e uma variante viral com maior persistência in vivo foi selecionada. Essa variante, denominada Saen1v2p5, e o fago Saen1v4, lítico contra Salmonella Typhi, foram testados em modelo murino de infecção tifoide, contra seus respectivos hospedeiros. Encontramos similaridade genômica a fagos conhecidos, como T4, T7, T1 entre outros, em maior ou menor grau. Obtivemos um efeito protetor e terapêutico contra Shigella flexneri utilizando o fago Shfl1 em ensaio de invasão em cultura de células HeLa, verificado por todas as metodologias empregadas. Não verificamos efeito antimicrobiano in vivo do fago Saen1v2p5 em modelo murino de infecção por Salmonella Typhimurium. Por outro lado, observamos efeito terapêutico e protetor dose dependente utilizando o fago Saen1v4 em modelo murino de infecção por Salmonella Typhi. O sucesso obtido com baixas multiplicidades de infecção sugere um possível efeito indireto ou estimulação imune inespecífica / Abstract: Bacteriophages are viruses that infect Bacteria and Achaea, representing the most abundant biological entities in the world and markedly influencing natural host populations. Phage therapy, which represents one of the first modern ways to fight bacterial infections, was recently rediscovered and is being re-evaluated according to current methodologies regarding its therapeutic viability. In order to complete phage characterization in our collection, we sequenced completely the genomes of most of these, through the multiplex pair-ended methodology using the Illumina platform. Aiming to contribute to the therapeutic viability verification of bacteriophages we tested phage protective and therapeutic effects of Shfl1, Saen1v2 and Saen1v4, which belong to our collection, in biologically relevant models. Phage Shfl1, lytic against Shigella flexneri, was tested in a HeLa invasion assay. Intracellular bacteria reduction was measured independently through plating and flow cytometry, besides direct observation through fluorescent microscopy. Phage Saen1v2, lytic against Salmonella Typhimurium, was studied about its bio-distribution and half-life in murine model, and a viral variant with longer in vivo persistence was selected. This variant, denominated Saen1v2p5, and phage Saen1v4, lytic against Salmonella Typhi, were tested in murine typhoid model, against their respective hosts. Genomic similarity to known phages such as T4, T7, T1 among others, was found, in various degrees. We obtained both protective and therapeutic effect against Shigella flexneri using phage Shfl1 in the HeLa invasion assay, through all methodologies utilized. We could not verify in vivo antimicrobial effect of phage Saen1v2p5 in the murine model of Salmonella Typhimurium infection. On the other hand, we observed both therapeutic and protective dose dependent effect using phage Saen1v4 in Salmonella Typhi murine infection model. The success obtained with low multiplicities of infection may suggest a possible indirect effect or unspecific immune stimulation / Doutorado / Microbiologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Wanderley Dias da Silveira, Eliana Guedes Stehling / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T01:02:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mobilon_Cristiane_D.pdf: 11609484 bytes, checksum: 06504829a16dd9fe15e1e7aff6ed5392 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A shigelose, uma infecção intestinal grave, causada por bactérias Gram-negativas pertencentes ao gênero Shigella, é uma patologia com incidência significativa, principalmente em países em desenvolvimento, onde ocorrem 99% dos casos relatados, sendo que, 69% deles acometem crianças menores de 5 anos de idade. A alta incidência de Shigella em países em desenvolvimento é, geralmente, atribuída à falta de saneamento básico, condições de higiene inadequadas, subnutrição e alto custo dos antimicrobianos. O modo predominante de transmissão ocorre por via fecal-oral. Os mecanismos de patogenicidade descritos para as diferentes espécies de Shigella incluem numerosos genes de virulência, sendo a maioria encontrada em um plasmídio (pINV) de 220 kb. O plasmídio pINV de S. flexneri codifica 2 operons cruciais para seu fenótipo invasivo: o operon ipa e o operon mxi-spa. O operon ipa codifica os antígenos plasmidiais de invasão denominados IpaA, IpaB, IpaC e IpaD, os quais são efetores para o processo de invasão bacteriana. O operon mxi-spa juntamente com as proteínas IpaB, IpaC e IpaD são essenciais para a invasão in vitro de células epiteliais. Sabe-se, também, que essas proteínas, ou antígenos plasmidiais de invasão, podem ser altamente imunogênicos. Neste trabalho, clonou-se o gene ipaC no vetor pET28a para expressão em Escherichia coli e em vetores constitutivos para bactérias lácticas com a finalidade de se verificar a capacidade imunogênica da proteína expressa por este gene. Além disso, verificou-se que os anticorpos produzidos pela resposta à proteína IpaC foram capazes de inibir a adesão e invasão de Shigella flexneri em culturas celulares cultivadas in vitro confirmando, assim, a importância dessa proteína no processo invasivo da bactéria e seu possível uso no desenvolvimento de futuras vacinas a serem usadas contra a shigelose / Abstract: Shigellosis is a severe intestinal infection caused by Gram-negative bacteria which belongs to the genus Shigella. It is a pathology with high incidence and it is known that 99% of cases occur in underdevelopment countries. Among these cases, 69% of them affect children under 5 years old. The high incidence of Shigella in underdevelopment countries, is mainly atribbuted to substandard hygiene, unsafe water supplies, subnutrition and antibiotic high cost. The predominant mode of transmission is by fecal-oral contact. The pathogenicity mechanisms described for Shigella species include several virulence genes, most of them been encoded in a plasmid (pINV) with 220 kb. This plasmid encodes 2 important operons which are essential for the invasive phenotype: the operon ipa and the operon mxi-spa. The ipa operon encodes the invasion plasmid antigens called IpaA, IpaB, IpaC and IpaD, which are effector proteins required for the bacteria invasion process. The mxi-spa operon together with IpaB, IpaC and IpaD are essential to epithelial in vitro cell invasion. It is also known that these proteins or invasion plasmid antigens may be highly immunogenic. During the development of this work, ipaC gene was cloned in the plasmidial vector pET28a for expression in Escherichia coli and in constitutive vectors for lactic acid bacteria to prove its immunogenic importance. Furthermore it was verified that the antibodies produced in response to IpaC protein were able to inhibit Shigella flexneri adhesion and invasion in in vitro cultured cells, confirming its important hole in bacteria invasion process and its possible usage in vaccine development against shigellosis / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Escherichia coli enteroinvasora (EIEC) possuem características bioquímicas e genéticas semelhantes às de Shigella, porém para que ocorra um processo infeccioso são necessárias 102 células de Shigella em relação a 106 células de EIEC. A patogenicidade de Shigella e EIEC se dá pela presença de um plasmídio de virulência denominado pInv, que contêm os genes necessários para a invasão e disseminação bacteriana nas células do hospedeiro. Estudos anteriores relataram que os genes ipaA, ipaB, ipaC e ipaD de EIEC e Shigella não possuem diferenças genéticas que possam explicar sua diferença de patogenicidade. No presente trabalho, foram avaliados os níveis transcricionais dos genes envolvidos na invasão e disseminação dessas bactérias. Pela técnica de RT-PCR semi-quantitativo, pode-se observar diferenças nos níveis de transcrição para a maioria dos genes de virulência selecionados, quando as bactérias estavam em contato com os macrófagos. Porém, sem o contato com estas células, o nível de transcrição dos genes foi o mesmo entre as espécies, com exceção do gene ipaD. Foi verificada que a transcrição deste gene em contato com macrófago é praticamente a mesma entre as bactérias, enquanto que na ausência de macrófagos, o nível de transcrição é bem menor em EIEC, quando comparado no mesmo intervalo de tempo. Após estes resultados foram selecionados os principais genes para estudo por PCR em tempo real. Foi possível observar que o nível de transcrição de EIEC é menor, em relação a Shigella. Mais ainda, a análise dos genes dentro do mesmo operon mostrou uma cinética de transcrição distinta do icsB em relação a outros genes do operon das ipas. Os resultados obtidos sugerem que esta diferença de transcrição possa estar relacionada com a virulência mais branda em EIEC. Ainda mais, Os genes pertencentes ao operon icsB-ipaCB parecem ser regulados de forma distinta. Além disso, a transcrição de ipaD em EIEC, provavelmente, depende de uma via de sinalização distinta de Shigella flexneri. Diante desses resultados, novos estudos estão sendo propostos em nosso laboratório para melhor compreensão do mecanismo de virulência desse enteropatógeno. / Enteroinvasive Escherichia coli (EIEC) serotypes described so far share antigenic, biochemical, genetic and pathogenetic properties with Shigella sp. However, in order for an infectious process to occur, an inoculum of 102 Shigella cells is needed in contrast to as much as 106 EIEC cells. The characteristic ability of S. flexneri and EIEC to enter epithelial cells, multiply intracellularly and spread from cell to cell is uniquely encoded by their 220-kb virulence plasmid. Previous studies realized in our laboratory showed that the genes ipaA, ipaB, ipaC and ipaD do not possess molecular alterations in the nucleotides sequences that can explain the difference in the pathogenicity between EIEC and Shigella spp. In the present work, the transcription levels of the bacterial genes involved in the invasion and escape from host cells were evaluated. Through reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis, differences in the transcription levels for the majority selected virulence genes could be observed when bacteria were in contact with the macrophages. However, without the contact with those cells, the transcription levels of the genes were the same between both bacteria species, with the exception of ipaD. When the bacteria is in contact with macrophages, the transcription of ipaD is the same in both species whereas in the absence of macrophages, the transcription level is lower in EIEC than Shigella, when compared in the same period of time. Those results provided the selection of the genes for the real time PCR analysis. In general, the EIEC transcription levels genes are lower than Shigella. More still, the icsB showed a distinct kinetic of transcription from the others genes in the same operon. All results suggest that the lower pathogenicity due to EIEC can partially have to the differences of the virulence genes transcription. Still more, the genes-encoded by operon icsB-ipaCB seem to be regulated of a distinct form. Therefore, transcription of the ipaD in EIEC probably depends on distinct signaling way of S. flexneri. New studies shows to be necessary for the better understanding of the pathogenic mechanism of EIEC.

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