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Etude de gène et voie de signalisation impliqués dans les processus morphogénétiques chez Oscarella lobularis : implications potentielles sur la compréhension de l'origine du système nerveux / Genes and signaling pathways involved in morphogenetic processes in Oscarella lobularis (Porifera, Homoscleromorpha) : putative implications for the understanding of the nervous system originGazave, Eve 01 April 2010 (has links)
Le système neuro-sensoriel est considéré comme une synapomorphie des eumétazoaires, sur la base de la présence, chez ces organismes, du neurone. Les éponges, en tant que métazoaires non-bilatériens, sont d’un intérêt tout particulier pour comprendre l’origine et l’évolution de nombreux processus développementaux, tels que la mise en place du système neuro-sensoriel. Même si elles ne possèdent pas de neurones, ce ne sont pas des organismes passifs ; elles présentent des formes de communication chimiques et électriques. Cependant, rien n’est actuellement connu concernant les types cellulaires ni les mécanismes précis impliqués dans ces processus. Dans cette perspective de recherche, l’éponge homoscléromorphe Oscarella lobularis a été choisie comme modèle lors de cette thèse. Dans un premier temps, différents travaux pour la caractériser ont été réalisés. L’étude de ses relations phylogénétiques au sein des homoscléromorphes a notamment permis de restaurer une ancienne famille : les Oscarellidae. Je me suis attachée par la suite à identifier des gènes connus pour être impliqués dans la mise en place du système nerveux chez les eumétazoaires. Parmi les mécanismes moléculaires connus, la voie de signalisation Notch semble incontournable chez les bilatériens. Son origine et son évolution ont été étudiées à l’échelle des eucaryotes, révélant ainsi que cette voie est une synapomorphie des métazoaires bien que plusieurs de ses composants soient plus anciens. Mes résultats d’immunolocalisation de la protéine Notch révèlent un marquage dans les choanocytes. En parallèle, j'ai également montré l'expression dans ces cellules d'un facteur de transcription apparenté aux NK6-7, familles jouant un rôle dans la neurogenèse chez les bilatériens. Ces résultats semblent appuyer une hypothèse récente proposant que les choanocytes pourraient avoir des fonctions neuro-sensorielles. L'intégration d’autres données (moléculaires, physiologiques, biochimiques…) reste cependant indispensable à la validation de cette hypothèse et sont en cours de développement. Plus globalement, ces résultats vont dans le sens d'hypothèses récentes qui suggèrent que l'ancêtre commun des métazoaires présentait déjà une relative complexité moléculaire et fonctionnelle, même si ces fonctions devaient être assurées par des cellules multifonctionnelles. / The neuro-sensory system is considered to be a eumetazoan synapomorphy. Indeed, all these organisms share a specifialized cell: the neurone. Sponges, as non-bilateiran, are of special interest to investigate the origin and evolution of developmental processes, such as the emergence of neuro-sensory system. Although they are nerveless, sponges are not passive organisms; they harbour chemical and electric communication. Nevertheless, presently, nearly nothing is known concerning implicated cell types or conduction mechanisms. In the aim of understanding the nervous system origin, the homoscleromorph sponge Oscarella lobularis has been used as a sponge model in this thesis. First, diverse studies have been realised in order to characterise this species. The study of its phylogenetic position among homoscleromorph allowed us to restore an ancient family: the Oscarellidae. Then, I tried to identify genes that are known to be implicated in eumetazoan nervous system patterning. Among them, the Notch signalling pathway is crucial. Its origin and evolution have been investigated at the eukaryotic scale, revealing that this pathway is a metazoan synapomorphy, although several components emerged earlier. Notch protein immunolocalisation results in the staining of choanocytes. In parallel, I have also reported the expression pattern exclusively in this cell type, of a transcription factors related to NK6-7, those families being implicated in bilaterian neurogenesis. These results are in agreement with a recent hypothesis proposing that choanocytes may harbor neuro-sensory functions. The integration of other molecular, physiological and biochemical data is crucial to validate this hypothesis and is in progress. More globally, these results are in agreement with recent hypotheses suggesting a relative molecular and functional complexity of the metazoan common ancestor, although diverse functions may have been assumed by multifunctional cells.
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Interaction entre les voies de signalisation FGF et Notch lors de la migration de la parapineale dans le cerveau asymétrique du poisson zèbre / Crosstalk between FGF and Notch signaling pathways during the collective migration of parapineal cells in the left right asymmetric zebrafish brainWei, Lu 26 November 2018 (has links)
Lors du développement de l'asymétrie gauche droite dans le cerveau du poisson zèbre, un petit groupe de cellules, le parapinéale, migre collectivement depuis la ligne médiane vers la partie gauche de l'épithalamus. Cette migration est défectueuse dans des mutants pour le gène fgf8, indiquant que le facteur Fgf8 (Fibroblast Growth Factor 8), sécrété de part et d'autre de la ligne médiane, est requis pour la migration. Cependant, l'orientation gauche de la migration dépend de l'activation, plus précocement dans l'épithalamus gauche, de la voie de signalisation Nodal/TGFb (Transforming Growth Factor). Par conséquent, la parapinéale est un modèle de choix pour comprendre comment les cellules migrent collectivement en réponse aux Fgf et pour étudier comment d'autres voies de signalisation modulent ce processus. L'imagerie en temps réel d'un transgène rapporteur de la signalisation FGF a révélé que la voie FGF est activée préférentiellement dans quelques cellules de tête, c'est à dire localisées au front de migration. L'expression globale d'un récepteur aux Fgf activé de façon constitutive (CA-FgfR1) interfère avec la migration de la parapinéale en contexte sauvage mais est capable de restaurer à la fois la migration de la parapinéale et l'activation focale de la voie FGF au front de migration dans les mutants fgf8-/-. De plus, l'activation focale de la voie FGF dans seulement quelques cellules de parapinéale est suffisante pour restaurer la migration de tout le collectif dans les mutants fgf8-/-. Finalement, nos données montrent que la signalisation Nodal contribue à restreindre et à biaiser l'activation de la voie FGF afin d'orienter la migration de la parapinéale vers le côté gauche (Manuscript n°1). Par la suite, mes travaux de thèse ont visé à comprendre comment l'activation de la voie FGF est restreinte à quelques cellules, bien que toutes les cellules de parapinéale semblent compétentes pour activer la voie. Nos résultats montrent que la signalisation Notch est capable de restreindre l'activation de la voie FGF. La perte ou le gain de fonction de la voie Notch entrainent respectivement une augmentation ou une diminution de l'activité FGF, associés à des défauts de migration de la parapinéale dans les deux contextes. De plus, la diminution ou l'augmentation artificielle du niveau d'activation de la voie FGF peut respectivement restaurer la migration de la parapinéale ou aggraver les défauts de migration en absence d'activité Notch. Nos données indiquent que la signalisation Notch restreint l'activation de la voie FGF au sein des cellules de parapinéale pour permettre la migration du collectif (Manuscript n°2). La voie Notch est également requise pour la spécification d'un nombre correct de cellules de parapinéale, indépendamment de la voie FGF. En parallèle, nous avons analysé la fonction de MMP2 (Matrix Metalloprotease 2), une protéine exprimée mosaïquement dans la parapinéale et candidate pour moduler la signalisation FGF. Cependant, nous n'avons observé aucun défaut de spécification ou de migration de la parapinéale dans les embryons mutants pour le gène mmp2 -/- (Manuscript n°3). Mon travail de thèse révèle un rôle de la voie Notch pour restreindre l'activation de la signalisation FGF dans quelques cellules de parapinéale, un processus qui est biaisé par la voie Nodal afin d'orienter la migration du collectif vers la gauche. Ces données pourraient permettre de mieux comprendre les interactions entre les voies de signalisation FGF, Notch et Nodal dans d'autres modèles de migration cellulaire collective comme, par exemple, la migration des cellules cancéreuses. / During the establishment of left-right asymmetry in the zebrafish brain, a small group of cells, the parapineal, collectively migrates from the dorsal midline of the epithalamus to the left in most wild-type embryos. Parapineal migration requires Fibroblastic Growth Factor 8 (Fgf8), a secreted signal expressed bilaterally in epithalamic tissues surrounding the parapineal. The left bias in the orientation of parapineal migration depends on the activity of Cyclops, a secreted factor of the Nodal/TGFß family that is transiently expressed in the left epithalamus prior to parapineal migration. Therefore, the parapineal provides a powerful new model to understand FGF dependent collective cell migration and to study how other signaling pathways modulate this process. Live imaging of an FGF reporter transgene revealed that the FGF pathway is activated in only few parapineal cells that are usually located at the leading edge of migration. Global expression of a constitutively activated Fgf receptor (CA-FGFR) delays migration in wild-type, while it partially restores both parapineal migration and focal activation of the FGF reporter transgene in fgf8-/- mutant embryos. Importantly, focal activation of FGF signaling in few parapineal cells is sufficient to restore collective migration in fgf8-/- mutants. Finally, Nodal asymmetry contributes to restrict and left-bias the activation of the FGF pathway (Manuscript n°1). Following this work, my thesis project aimed at understanding how the activation of the FGF pathway is restricted to few cells, despite all parapineal cells apparently being competent to activate the pathway. We showed that Notch signaling is able to restrict FGF activity. Loss or gain of function of the Notch pathway respectively triggers an increase or decrease in FGF activity, which correlate with PP migration defects. Moreover, decreasing or increasing FGF activity levels respectively rescues or aggravates parapineal migration defects in Notch loss-of-function context. Our data indicate that Notch signaling restricts the activation of the FGF pathway within parapineal cells to promote their collective migration (Manuscript n°2). We also found that Notch pathway is required for the specification of a correct number of parapineal cells, independently of FGF pathway. In parallel, we analysed the function of MMP2 (Matrix Metalloprotease 2), a protein mosaïcally expressed in the parapineal and a candidate to modulate FGF signaling. However, we found no significant defects in the specification or migration of parapineal cells in mmp2-/- mutant embryos (Manuscript n°3). My PhD work reveals a role for Notch signaling in restricting the activation of FGF signaling within few parapineal cells, a process that is biased by Nodal pathway to the left and required for the migration of the entire parapineal. These data provide insights into the interaction of FGF, Notch and Nodal/TGFb signaling pathways that may be applicable to other models of collective cell migration, such as cancer cells migration for instance.
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Rôle de la voie de signalisation Insuline dans le couplage des informations nutritionnelles et développementales au cours de l'ovogenèse chez la drosophileJouandin, Patrick 06 December 2013 (has links) (PDF)
Au cours de l'ovogenèse, les stades vitellogéniques nécessitent une énergie considérable, et leur formation doit être ajustée en fonction d'autres besoins physiologiques. En utilisant la drosophile comme modèle, j'ai montré que la signalisation Insuline régule une transition du cycle cellulaire, mitose/ endocyle (M/E), une étape critique qui contrôle l'entrée des follicules en vitellogenèse. Mes travaux montrent que la transition M/E porte le rôle d'un point de contrôle nutritionnel. La carence protéique induit un blocage de cette transition au travers d'une interaction entre FoxO, Cut et Notch, empêchant une perte d'énergie. Ce blocage reste réversible, autorisant la reprise de l'ovogenèse sous retour à une alimentation normale. Ce travail montre qu'un point de contrôle nutritionnel au cours de l'ovogenèse permet de coupler des signaux métaboliques et développementaux pour protéger les tissus des dommages liés à la carence. D'autre part, j'ai montré que la signalisation Insuline contrôle la migration d'une cohorte de cellules d'origine épithéliale pour assurer la fertilité de l'ovocyte. L'insuline participe à la formation d'extensions cytoplasmiques riches en actine. Lors de ce processus, la signalisation Insuline contrôle notamment l'expression de chickadee, qui code pour la Profiline, une protéine nécessaire pour la polymérisation de l'actine qui permet la motilité des cellules. L'ensemble de ce travail montre que des tissus somatiques assurent l'homéostasie de l'ovogenèse malgré des conditions de nutritions fluctuantes. Ces travaux posent les bases de l'étude de nouveaux aspects de l'ovogenèse, potentiellement conservés chez les mammifères.
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Rôle de la voie de signalisation Insuline dans le couplage des informations nutritionnelles et développementales au cours de l'ovogenèse chez la drosophile / Role of the Insulin signalling pathway in coupling oogenesis rate with nutritional cues in DrosophilaJouandin, Patrick 06 December 2013 (has links)
Au cours de l’ovogenèse, les stades vitellogéniques nécessitent une énergie considérable, et leur formation doit être ajustée en fonction d’autres besoins physiologiques. En utilisant la drosophile comme modèle, j’ai montré que la signalisation Insuline régule une transition du cycle cellulaire, mitose/ endocyle (M/E), une étape critique qui contrôle l’entrée des follicules en vitellogenèse. Mes travaux montrent que la transition M/E porte le rôle d’un point de contrôle nutritionnel. La carence protéique induit un blocage de cette transition au travers d’une interaction entre FoxO, Cut et Notch, empêchant une perte d’énergie. Ce blocage reste réversible, autorisant la reprise de l’ovogenèse sous retour à une alimentation normale. Ce travail montre qu’un point de contrôle nutritionnel au cours de l’ovogenèse permet de coupler des signaux métaboliques et développementaux pour protéger les tissus des dommages liés à la carence. D’autre part, j’ai montré que la signalisation Insuline contrôle la migration d’une cohorte de cellules d’origine épithéliale pour assurer la fertilité de l’ovocyte. L’insuline participe à la formation d’extensions cytoplasmiques riches en actine. Lors de ce processus, la signalisation Insuline contrôle notamment l’expression de chickadee, qui code pour la Profiline, une protéine nécessaire pour la polymérisation de l’actine qui permet la motilité des cellules. L’ensemble de ce travail montre que des tissus somatiques assurent l’homéostasie de l’ovogenèse malgré des conditions de nutritions fluctuantes. Ces travaux posent les bases de l’étude de nouveaux aspects de l’ovogenèse, potentiellement conservés chez les mammifères. / How oogenesis is controlled upon nutrient challenge is a key biological question to understand the balance between reproduction and adult fitness. During Drosophila oogenesis, vitellogenic stages are highly energy consuming so their formation has to be balanced with other physiological needs. We reveal the role of the Insulin pathway and FoxO in regulating the transition from Mitotic-to-Endocycle, a critical step controlling the entry of egg chambers into vitellogenesis. We show that the M/E switch functions as a nutrient checkpoint, blocking the entry into vitellogenesis upon starvation and therefore protecting adults from energy loss. Pausing of the M/E switch involves a previously unknown crosstalk between FoxO, Cut and Notch, a fully reversible process ensuring rapid resuming of oogenesis upon re-feeding. This work reveals a FoxO-dependent nutrient checkpoint integrating metabolic cues with reproduction and protecting tissues from starvation-induced damages. In addition, we show that the Insulin pathway regulates the migration of a subset of epithelial cells to ensure oocyte fertilization. We demonstrate that Insulin signaling regulates the formation of actin-rich cellular extensions in invasive cells. During this process, FoxO represses chickadee expression, which encodes Profilin. Insulin signaling activity leads to the inhibition of FoxO and subsequent Profilin accumulation, which further allows actin polymerization, necessary for cell motility. Altogether, data reveal a crucial role for the conserved Insulin signaling pathway in regulating ovarian follicles through somatic tissues, a process which is likely to share much in common with oogenesis in mammals.
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L’inactivation de la cycline A2 contribue à la carcinogenèse colorectale en perturbant l'homéostasie colique et induisant une inflammation chez la souris / Loss of cyclin A2 contributes to colorectal carcinogenesis by disrupting colonic homeostasis and inducing inflammation in miceGuo, Yuchen 02 July 2018 (has links)
La cycline A2 est un régulateur essentiel du cycle cellulaire qui, en association avec des kinases dépendantes des cyclines (CDK) régule la réplication de l'ADN et l’entré des cellules en mitose. Dans de nombreux types de cancers humains, la cycline A2 a été considérée comme un facteur de prolifération contribuant à la cancérogenèse de par ses fonctions dans la régulation du cycle cellulaire. Récemment, la complexité des fonctions de cycline A2 a été révélée. Certaines études in vitro ont démontré que l'inactivation de la cycline A2 induit une augmentation de la motilité cellulaire et de l'invasion dans les fibroblastes consécutive à une activation défective de RhoA. De plus, il a été montré que l'inactivation de la cycline A2 induit la EMT par l’intermédiaire d’une augmentation de l'activité transcriptionnelle de la β-caténine, mais aussi via la voie TGFβ/Prefoldin. Ces études suggèrent que des niveaux réduits de cycline A2 sont liés à une invasion accrue et à l’apparition de métastases dans certains types de cancer. A l’aide d’un modèle de souris mutante pour la cycline A2, une étude récente a établi une fonction de cette dernière, indépendante des CDK, dans la réparation des cassures double brin de l'ADN et a montré que la perte de la cycline A2 favorise l’apparition de cancers de la peau et du poumon. L’ensemble de ces études met en évidence l’existence de multiples fonctions pour la cycline A2. Mon travail de thèse a consisté à explorer le rôle de la cycline A2 dans l'homéostasie du colon et le développement du Le cancer colorectal.Pour évaluer la valeur pronostique de la cycline A2 dans le CCR, nous avons analysé l'expression de la cycline A2 par IHC sur un grand nombre d'échantillons tumoraux dérivés de patients atteints de CCR de différents stades. Nous avons trouvé que les niveaux élevés de la cycline A2 sont corrélés avec un mauvais pronostic et une survie plus faible chez les patients atteints de CCR de stade I et II. Cependant, une diminution de l'expression de la cycline A2 a été détectée aux stades III et IV par comparaison aux biopsies de CCR de stade I et II. Il est tentant de proposer que le profil d'expression de la cycline A2 reflète ses rôles distincts au cours de la cancérogenèse du côlon, comme la prolifération cellulaire au stade précoce, lorsqu'elle est fortement exprimée, mais favorise l'invasion et l'agressivité à des stades plus avancés, lorsque ses niveaux d’expression sont réduits.En complément de cette étude clinique, nous avons généré des modèles murins porteurs d’une mutation constitutive ou inductible de la cycline A2 dans l’épithélium intestinal. Nous avons montré que la déplétion de la cycline A2 dans l'épithélium intestinal de la souris provoque une rupture de la crypte colique, une inflammation, une augmentation de la prolifération des cellules épithéliales et l’apparition de dysplasies de bas et haut grade, reconnues comme lésions précancéreuses dans le CCR. Ces observations suggèrent un rôle majeur pour la cycline A2 dans la régulation de l'homéostasie du côlon et l'initiation de la tumorigénèse. Une analyse plus poussée a révélé une proportion accrue de lésions au niveau de l'ADN et une activation aberrante de la β-caténine, anomalies couramment détectées chez les patients humains atteints de CCR et considérées comme les premières altérations de cette pathologie. En outre, nous avons détecté une expression élevée de NFkB et YAP1 chez les souris mutantes pour la cycline A2, voies qui jouent un rôle critique dans la régénération tissulaire et peuvent conduire la dédifférenciation des cellules épithéliales du côlon contribuant ainsi à la tumorigenèse. Finalement, les souris mutantes cycline A2 ont été soumises à un protocole de colite associé au cancer et ont développé une proportion accrue d'inflammation, mais aussi de dysplasies et d'adénocarcinomes, en taille et en nombre, suggérant que la perte de la cycline A2 participe à la carcinogenèse colorectale chez la souris. / Cyclin A2 is an essential cell cycle regulator required for accurate DNA replication and mitotic entry in association with cyclin-dependent kinases (CDKs). In multiple types of human cancers, cyclin A2 was considered as a proliferation driver contributing to carcinogenesis based on its function to promote cell cycle.Recently, the complexity of cyclin A2 functions has been revealed. Some in vitro studies demonstrated that cyclin A2 inactivation induces increased cell motility and invasiveness of mouse fibroblasts due to defective RhoA activation. Moreover, cyclin A2 inactivation has been shown to induce EMT through the upregulation of β-catenin transcriptional activity, but also via the TGFβ/Prefoldin pathway. These studies suggest that reduced levels of cyclin A2 are linked to increased invasiveness and metastasis in some cancer types. Using a cyclin A2 mutant mouse model, a recent study established the CDK-independent function of cyclin A2 in the repair of double-stranded DNA breaks and showed that loss of cyclin A2 promotes tumorigenesis in skin and lung due to deficient DSBs repair.Altogether, these studies highlight the multiple functions cyclin A2 can execute. The aim of my thesis was to explore the role of cyclin A2 in colon homeostasis and colorectal cancer development.To evaluate the prognostic value of cyclin A2 in CRC, we analyzed cyclin A2 expression by IHC on tumor samples derived from CRC patients of different stages. We found that high levels of cyclin A2 correlate with bad prognosis and lower survival in patients with stage I and II CRC. However, decreased cyclin A2 expression was detected in stage III and IV by comparison to stage I and II CRC biopsies. Complementary to the clinical study, we generated tissue-specific mutant mouse models bearing either a constitutive or inducible cyclin A2 deletion in the intestinal epithelium. We showed that depletion of cyclin A2 in mouse intestinal epithelium causes colonic crypt disruption, inflammation, increased proliferation of epithelial cells and occurrence of low- and high-grade dysplasia, recognized as precancerous lesions of CRC. These observations suggest a major role for cyclin A2 in the regulation of normal colon homeostasis and tumor initiation. Further analysis revealed an increased proportion of DNA damage and aberrant activation of β-catenin, commonly detected in human patients with CRC and which are considered as the first occurring alterations in this pathology. Furthermore, we detected elevated expression of NFkB and YAP1 in the colons of cyclin A2 mutant mice, pathways that have been previously shown to play critical roles for tissue regeneration after tissue damage and to drive dedifferentiation of colonic epithelial cells thus contributing to tumorigenesis. Finally, cyclin A2 mutant mice were subjected to a modified colitis-associated CRC model and developed increased proportion of inflammation, but also dysplasia and adenocarcinomas, in size and numbers, suggesting that loss of cyclin A2 contributes to inflammation-associated colorectal carcinogenesis in mice.
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Mécanismes moléculaires impliqués dans la plasticité neurovasculaire des cellules souches de glioblastome / Molecular mechanisms involved in glioblastoma stem cell neurovascular plasticityGuelfi, Sophie 05 December 2016 (has links)
Les Glioblastomes (GBM, grade IV selon l’OMS) sont les tumeurs cérébrales primaires les plus agressives et sont caractérisées par une néovascularisation importante associée à l’hypoxie et à la nécrose. L’origine cellulaire des GBM est controversée, mais des sous-populations de cellules multipotentes ont été identifiées au sein des tumeurs, et seraient responsables de la radio/chimiorésistance des GBM. Ces cellules souches de glioblastome (GSC) contrôlent activement la vascularisation tumorale par leur interaction étroite avec les cellules vasculaires composant les niches tumorales. La voie Notch est une signalisation canonique essentielle au développement et à l’homéostasie du système nerveux central et son réseau vasculaire associé. Dans le contexte des GBM, cette cascade serait nécessaire à la gliomagénèse, par le maintien du réservoir de GSC au sein de la niche périvasculaire. Cependant, le mode d’action moléculaire de Notch dans les GBM reste encore à démontrer, du fait de résultats divergents observés dans plusieurs études. Dans la première partie de mon travail de thèse, j’ai contribué à l’exploration de la signalisation Notch1 dans des cultures de GSC établies et caractérisées au sein du laboratoire. Le niveau basal d’activation de Notch1 étant faible dans nos GSC, l’approche a été d’activer constitutivement cet axe par transduction lentivirale. Suite à cette activation forcée, les GSC subissent un changement phénotypique majeur et se différencient en cellules périvasculaires ou cellules « pericyte-like ». Cette transition neurovasculaire des GSC promeut la vascularisation active des tumeurs par la normalisation du réseau vasculaire in vivo. Par la suite, j’ai posé la question des mécanismes moléculaires en aval de Notch1 ; par l’étude des facteurs de transcription TAL1 et SLUG, deux candidats potentiels au contrôle de cette plasticité neurovasculaire. Dans ce but, j’ai examiné leur contribution au phénotype vasculaire des GSC dans un modèle in vitro de la niche périvasculaire ; et in vivo par l’analyse d’échantillons humains de GBM. Enfin, j’ai également observé que l’activation de Notch1 module l’activité de la machinerie du protéasome, ce qui pourrait contribuer activement à la transition moléculaire observée dans les GSC. Ces travaux mettent en avant la plasticité phénotypique des GSC: une meilleure compréhension de ces processus pourrait mener à la conception de thérapies ciblant efficacement les GSC et leur vascularisation associée. / Glioblastomas (GBM, WHO grade IV) are highly aggressive brain tumors in which extensive vascularization is associated with hypoxia and necrosis. GBM cell of origin is controversial; however multipotent stem-like subpopulations have been identified within tumors, and could account for GBM radio/chemoresistance. These glioblastoma stem-like cells (GSC) actively promote tumoral vascularization processes by closely interacting with vascular cells composing tumoral niches. The Notch cascade is a canonical signaling pathway required during developmental stages and adult homeostasis of the central nervous system and the associated vascular network. In the context of GBM, this molecular axis could induce gliomagenesis by promoting GSC maintenance in the perivascular niche. However, Notch-induced molecular mechanisms controlling GBM progression still remain elusive, due to divergent results observed in numerous reports. During the first part of my thesis work, I contributed to the assessment of Notch1 functions in GSC cultures isolated and characterized in our lab. Given a low Notch1 basal activation status in our GSCs, our approach was to constitutively activate this axis via lentiviral transduction. Following this forced activation, GSCs undergo drastic phenotypic changes and differenciate into perivascular-like or “pericyte-like” cells. This neurovascular transition of GSCs induces active tumoral vascularization by promoting normalization of the vascular network in vivo. Consequently, I questioned the molecular mechanisms downstream of Notch1 by focusing on TAL1 and SLUG transcription factors, two potential candidates controlling this neurovascular plasticity. For this purpose, I examined their contribution to the GSC vascular-like phenotype in an in vitro model of the perivascular niche; and in vivo by analyzing human GBM samples. Finally, I also observed that Notch1 activation modulates the activity of the proteasomal machinery, which could actively contribute to the molecular transition occurring in GSCs. This work highlights GSC phenotypic plasticity: a better understanding of these processes could lead to the design of therapies efficiently targeting GSCs and their associated vasculature.
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The influence of Notch over-stimulation on muscle stem cell quiescence versus proliferation, and on muscle regeneration / L'influence de Notch sur-stimulation sur quiescence de cellules souches du muscle contre la prolifération et sur la régénération musculaireDing, Can 06 November 2015 (has links)
La transplantation de cellules souches de muscle possède un grand potentiel pour la réparation à long terme du muscle dystrophique. Cependant, la croissance ex vivo des cellules souches musculaires réduit de manière significative l'efficacité de leur greffe puisque le potentiel myogénique est considérablement réduit lors de la mise en culture. La voie de signalisation Notch a émergé comme un régulateur majeur des cellules souches musculaires (MuSCs) et il a également été décrit que la sur-activation de Notch est crucial pour le maintien du caractère souche des MuSC. Cette découverte pourrait être traduite comme un bénéfice thérapeutique potentiel. Des MuSCs murines ont été fraîchement isolées et ensemencées sur des boîtes de culture recouverte de Dll1-Fc, le domaine extracellulaire de Delta-like-1 est fusionné au fragment Fc humain, afin d'activer la voie de signalisation Notch et avec un IgG hu-main comme contrôle. Nous avons utilisé le rAAV afin d’exprimer le Dll1 spécifique-ment dans les muscles de souris. Les souris P3 ont été traitées avec de l’AAV pendant 3 semaines et 6 semaines afin d’étudier l'effet de Dll1 au cours du développement postnatal. Afin d’étudier le processus de régénération, l'AAV a également été injecté dans les muscles de souris mdx alors que les souris de type sauvage ont été utilisées comme contrôle. Un potentiel caractère souche supérieur (marquée avec le Pax7) est observé dans les cultures des MuSCs qui sont recouverte de Dll1-Fc par rapport à leurs homologues contrôles, par contre le taux de proliférer est réduit. Au cours du développement postnatal, la sur-activation de la voie de signalisation Notch par Dll1 sur les fibres musculaires a été en mesure d'élargir le pool des cellules Pax7+, cependant elle entraîne une diminution de la masse musculaire avec réduction de la taille des fibres et ceci sans affecter l'accumulation des myonuclei. Dans les MuSCs quiescentes (de type sauvage), la sur-activation de la voie de signalisation Notch ne présente pas de réel effet. La surexpression de Dll1 dans le muscle mdx a diminué la masse musculaire et agrandit le pool de cellules souches musculaires, ce-pendant le taux de régénération n'a pas été affecté. L’augmentation des MuSCs est attribuée à une différenciation entravée des cellules souches musculaires. En étudiant la stimulation de la voie de signalisation Notch dans les MuSCs à la fois in vitro et in vivo, nous démontrons que sur-activation de Notch préserve le caractère souche des cellules via l’inhibition de la prolifération et de la différenciation myogénique des MuSCs. / Muscle stem cell transplantation possesses great potential for long-term repair of dys-trophic muscle. However expansion of muscle stem cells ex vivo significantly reduces their engraftment efficiency since the myogenic potential is dramatically lost in culture. The Notch signaling pathway has emerged as a major regulator of muscle stem cells (MuSCs) and it has recently been discovered that high Notch activity is crucial for maintaining stemness in MuSCs. This feature might be exploited and developed into a novel therapeutic approach.Murine MuSCs were freshly isolated and seeded on culture vessels coated with Dll1-Fc, which fused Delta-like-1 extracellular domain with human Fc, to activate Notch sig-naling and with human IgG as a control. The rAAV gene delivery system was em-ployed to express Dll1 in murine muscles. P3 mice were treated with AAV for 3 weeks and 6 weeks to investigate the effect of Dll1 during postnatal development. To investi-gate the regeneration process, AAV were injected into mdx muscles whereas wild-type mice were used as control.Higher potential stemness (marked by Pax7 positivity) was observed in MuSCs grow-ing on a Dll1-Fc surface as compared to their counterparts on the control surface, while their proliferation rate was reduced. During postnatal development, overstimulation of Notch signaling by Dll1 on the mus-cle fibers was able to enlarge the Pax7+ cell pool, while also resulting in decreased muscle mass and smaller muscle fibers without affecting the accretion of myonuclei into the fiber. In quiescent (wild-type) MuSCs, overstimulation of Notch signaling did not have any discernible effect. Overexpression of Dll1 in mdx muscle decreased the muscle mass and enlarged the muscle stem cell pool, while muscle regeneration re-mained unaffected. By investigating Notch stimulation in MuSCs both in vitro and in vivo, we demonstrate that high Notch activity preserves stemness via inhibition of MuSCs proliferation and myogenic differentiation. Our findings point out that the Dll1 molecule, as a canonical Notch ligand, might have a therapeutic potential in cell-based therapies against muscu-lar dystrophies.
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Notch activation upon DNA damage : molecular characterisation and therapeutic applications in lung adenocarcinoma / Activation de la voie Notch en réponse aux dommages de l'ADN : caractérisation moléculaire et applications thérapeutiques dans l'adénocarcinome du poumonBernardo, Sara 15 November 2019 (has links)
Le cancer du poumon est la principale cause de décès par cancer chez les hommes et les femmes dans le monde. Malgré les avancées majeures dans les traitements, les thérapies à base de platine restent la thérapie standard pour les patients atteints du cancer du poumon induit par la mutation KRAS. Bien que les composés de platine aient un premier effet sur ces patients, l’apparition d’une rechute constitue le principal défi au niveau clinique.Dans ce contexte, notre projet actuel vise à caractériser l’activation de la voie Notch dans la réponse aux sels de platines d’adénocarcinomes mutés pour K-Ras ainsi que son rôle dans l’acquisition de la résistance à ce traitement. Nous avons mis en évidence que la voie Notch est activée en réponse à divers agents induisant des dommages à l’ADN dans des lignées de cancer du poumon. Nous avons montré que cette activation est dépendante de la voie de checkpoint de Réponse aux Dommages de l’ADN (DDR) via ATM, ATM qui est une des principales kinases de la réponse cellulaire aux lésions de l’ADN telles que les cassures double-brin, causé notamment par la chimiothérapie conventionnelle. Parmi les nombreux substrats d’ATM en réponse à ces dommages, nous montrons un effet direct de MDM2 dans l’activation de la voie Notch en réponse aux dommages à l’ADN causé par le carboplatine. Nos données montrent une nouvelle interaction entre ATM, MDM2 et Notch, lors du traitement au carboplatine, qui pourrait jouer un rôle dans la cascade de signalisation favorisant la survie des cellules tumorales pulmonaires.En utilisant des xénogreffes dérivées de patients atteints d’adénocarcinomes du poumon, ainsi qu’un modèle cellulaire de xénogreffe résistant à la carboplatine, nous avons montré que l’association d’inhibiteurs de Notch et de MDM2 associé au traitement au carboplatine ont un effet accru sur le ralentissement de la croissance de la tumeur et sur la survie, en comparaison avec le traitement actuel de référence que représente le carboplatine.Nos résultats offrent une nouvelle possibilité de thérapie pour les adénocarcinomes de poumons mutés pour KRAS, et pourrait donc répondre à un besoin clinique urgent notamment pour contrecarrer la résistance aux chimiothérapies conventionnelles à base de sels de platine. / Lung cancer is the leading cause of cancer death among men and women worldwide. Despite the major advances in the treatments, platinum-based therapy remains the standard of care for patients affected by KRAS-driven lung cancer. Even though the platinum-compounds display an initial effect on these patients, the onset of the relapse constitutes the main challenge for the clinic. The molecular mechanisms underlying lung adenocarcinoma (LUAD) relapse are not completely elucidated yet, thus it is fundamental to understand them in order to improve survival of patients. Our data show that upon carboplatin treatment, the Notch pathway is activated in vitro. Since this effect was common for several other DNA damage insults, our driving hypothesis connected the DNA Damage Response (DDR) to the activation of the Notch pathway. Our data demonstrates that protein kinase ataxia telangiectasia-mutated (ATM) is a key mediator in the activation of the Notch pathway during DNA damage signalling. ATM is well-known as the chief mobilizer of the cellular response to the most toxic lesions to the DNA, the double-strand breaks which are also the type of damage caused by the conventional chemotherapy. Among the several substrates of ATM in response to the damage, there is the mouse double minute 2 protein (MDM2) that it is known to interact with the Notch pathway. Our data uncovered a new pathway connecting ATM, MDM2 and NICD during carboplatin treatment in LUAD cells.Using LUAD Patient-Derived Xenografts and a new generated carboplatin resistant cellular model, we show in vivo that the combination of Notch and MDM2 inhibitors with carboplatin showed a therapeutic benefit in tumour growth and survival compared to the standard of care, i.e. carboplatin.Our results can offer a new therapeutic window for KRAS-driven LUAD that become resistant to platinum-based therapy, hence tackling an urgent and unmet clinical need.
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Evaluation de l'action régulatrice de la vitamine D sur le dialogue entre cellules immunitaires et musculaires : implication dans la capacité de régénération du muscle squelettique au cours de la sarcopénie.Domingues, Carla 15 December 2014 (has links)
La sarcopénie est définie comme la diminution de la masse et de la force musculaires squelettiques au cours du vieillissement.Dans ce contexte, l’objectif principal de cette thèse était d’évaluer l’action régulatrice de la vitamine D sur le dialogue entre cellules immunitaires et musculaires et son implication dans les capacités de régénération du muscle âgé.Dans un premier temps, nous avons étudié in vitro la différenciation des cellules musculaires de la lignée L6 co-cultivée ou non avec des cellules immunitaires (PBMC : cellules mononuclées du sang périphérique), et en présence ou non de LPS. Ce modèle a permis d’établir que les PBMC stimulaient bien la différenciation musculaire. La réponse pro-inflammatoire induite par le LPS inhibait l’expression des marqueurs de différenciation. Même en présence de LPS, la stimulation de l’expression ce des marqueurs dans les L6 co-cultivées était conservée. De plus, l’environnement pro-inflammatoire induit par le LPS dans les co-cultures inhibait l’expression musculaire des marqueurs de la voie de la régénération, comme Notch. Nous avons ensuite utilisé le même système de co-cultures afin de déterminer si la vitamine D, ici la 25(OH)D, pouvait moduler les sécrétions cytokiniques des PBMC et ainsi modifier l’expression des marqueurs de différenciation musculaires. Le traitement des co-cultures à la 25(OH)D n’a modifié ni le profil de sécrétion cytokinique des PBMC, ni l’expression des marqueurs de différenciation des L6.Dans un deuxième temps, nous avons étudié à l’aide d’un modèle de rats âgés déplétés en vitamine D les mécanismes pouvant contribuer à l’atrophie musculaire observée. Nous avons mis en évidence que l’activité de la voie de signalisation Notch, voie clé du processus de régénération, ainsi que la prolifération musculaire étaient diminuées chez ces rats, et ceci même en absence de lésion. Nous avons ensuite évalué l’effet du statut en vitamine D sur un processus aigu de régénération au cours de vieillissement chez le rat. L’analyse de cette expérimentation, actuellement en cours, a déjà permis de mettre en évidence qu’au cours du vieillissement, la prolifération musculaire suite à une lésion est diminuée, d’autant plus si le rat âgé est carencé en vitamine D. Le même résultat a été retrouvé pour l’expression d’une cible de la voie Notch (Hes1). En outre, l’expression des marqueurs de différenciation semblaient être altérée chez les animaux âgés résultant probablement en un retard et/ou une inefficacité du processus de différenciation, en particulier chez les rats âgés déplétés en vitamine D. En revanche, la supplémentation en vitamine D ne semblait pas avoir d’effet sur la régénération musculaire du rat âgé.En conclusion, in vitro, la 25(OH)D ne modifiait pas l’expression des marqueurs de différenciation des cellules musculaires co-cultivées avec des cellules immunitaires. En revanche in vivo, la déplétion en vitamine D semblerait aggraver l’effet de l’âge sur la régénération musculaire.La diminution de la capacité de régénération musculaire est un facteur contribuant au développement de la sarcopénie. Ce travail a permis de montrer que le maintien d’un statut optimal en vitamine D serait nécessaire à la conservation des capacités de régénération musculaire. Il semble donc important de maintenir des statuts optimaux en vitamine D afin de limiter l’atrophie musculaire au cours du vieillissement. / One of the most striking effects of ageing is an involuntary loss of skeletal muscle mass known as sarcopenia. The development of sarcopenia appears to be multifactorial and includes anabolic resistance to dietary amino acids and sedentary lifestyle. The diminished ability of aged muscle to self-repair is also a key factor of sarcopenia. During the regeneration process, immune and muscle cells work in a cross-talk leading to an optimal muscle cell proliferation and differentiation. However, with aging, the immune response is impaired, possibly contributing to the reduction in the capacity of regeneration.Muscle and immune cells are both targets of vitamin D action. This vitamin modulates muscle cell proliferation and differentiation and stimulates the anti-inflammatory response of immune cells. With age, vitamin D insufficiencies or deficiencies develop.In this context, the main objective of this thesis was to evaluate the regulatory action of vitamin D on the cross-talk between immune and muscle cells and its implication in the ability of skeletl muscle to regenerate during aging.Initially, we studied in vitro the differentiation of L6 muscle cells co-cultured with or without immune cells (PBMC: peripheral blood mononuclear cells), and in with or without of LPS. From this model, PBMC stimulated muscle cell differentiation. The pro-inflammatory response induced by LPS inhibited the expression of muscle differentiation markers in muscle cells. Of note, these markers were stimulated even in presence of LPS. In addition, the LPS-associated pro-inflammatory environment inhibited the Notch signaling pathway, the key pathway of muscle regeneration process, in L6 cells co-cultured with PBMC. We then used the same system of co-cultures to determine whether vitamin D, in its 25 (OH)D form, could modulate PBMC cytokine secretion and thereby could alter the expression of markers of muscle differentiation. Unfortunately, the treatment of co-culture with 25 (OH) D has changed neither the profile of PBMC cytokine secretion nor the expression of differentiation markers in L6 cells.Secondly, we investigated in a model of old rats the mechanisms that contribute to muscle atrophy following vitamin D depletion. We have demonstrated that the activity of the Notch signaling pathway, as well as muscle proliferation were reduced in old vitamin D-depleted rats, even in the absence of lesions. Then we evaluated the effect of the vitamin D status on an acute muscle regeneration process, i.e. muscle infusion of notexin in old rats. This ongoing experiment has already highlighted that during aging, muscle proliferation is reduced after injury, especially if age is associated with a vitamin D deficiency. In addition, during aging, the expression of differentiation markers was altered resulting in delayed and/or incomplete differentiation process, in particular in vitamin D-depleted old rats. However, vitamin D supplementation seemed to have no beneficial or deleterious effects on muscle regeneration in aged rats.In conclusion, in vitro 25 (OH) D was unable to modulate the differentiation of muscle cells co-cultured with immune cells. However, in vivo, vitamin D depletion appeared to worse the effect of ageing on muscle regeneration.The diminished ability of aged muscle to self-repair is a factor of sarcopenia. Our work has demonstrated the importance of maintening optimal vitamin D status to preserve muscle regeneration capacity and thus to limit muscle atrophy during aging.
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Rôle de la voie de signalisation Notch dans la réponse lymphocytaire T CD8 suite à une infection aiguë ou chroniqueDuval, Frédéric 12 1900 (has links)
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