Em tempos atuais, com diversas síndromes/patologias relacionadas ao nosso sistema imunológico é imprescindível praticar exercícios que sejam imunoestimulantes, levando em consideração a influência de diversos hormônios e citocinas. Dentre esses, destacam-se as catecolaminas, que além de atuarem no aumento dos leucócitos circulantes, pela maior liberação de células da medula óssea e de órgãos linfoides, também influenciam as funções das células imunológicas. Surpreendentemente, pouco se sabe do efeito da intensidade do exercício físico sobre a resposta de células imunológicas teciduais, apesar de sua extrema importância, tanto na mobilização como na possível comunicação com outros órgãos. Essas células sofrem influência da intensa inervação, além da produção autógena de catecolaminas, estabelecendo um processo de neuroimunomodulação local e alterando seu fenótipo de acordo com o microambiente. Assim, o presente trabalho objetivou investigar se a estimulação adrenérgica afeta o perfil inflamatório de macrófagos residentes no peritônio de ratos, por meio de diferentes intensidades de exercício físico agudo. Ratos Wistar foram submetidos a uma sessão aguda de natação com três intensidades de exercício (conforme sobrepeso atado à base da cauda, como porcentagem da massa no animal): repouso (20 min), 4 % (20 min) ou 8 % (até a exaustão). Trinta minutos antes das sessões de exercício, os animais receberam (i.p.) bloqueadores adrenérgicos [prazosina (a1), ioimbina (a2), metoprolol (b1), propranolol (b inespecífico) e duplo bloqueio (a1, a2 e b)], ou PBS como controle, sendo mortos imediatamente após o exercício ou depois de 6, 12 ou 24 h após as sessões de nado. Determinou-se uma curva intensidade de exercício-resposta em função do tempo sendo avaliada a função dos macrófagos por meio da capacidade fagocítica e de produção de óxido nítrico (NO, pela medida de nitritos em meio de incubação). Os dados mostraram que a maior influência do exercício sobre estas variáveis do macrófago dá-se 6 h após a sessão e que estas respostas são dependentes da carga e de estimulação a-adrenérgica. Entretanto, o aumento na produção de NO não foi devido nem a incrementos na quantidade de moléculas da enzima NO sintase induzível (iNOS) nem de seu RNA mensageiro e nem da arginase-1 (proteína e RNAm) que compete pela arginina com a iNOS. A redução na quantidade de moléculas de proteínas de choque térmico de 70 kDa (HSP70), que reprimem a expressão de iNOS, também não foi observada. Em conclusão, a modulação do perfil pró-inflamatório dos macrófagos peritoneais com o exercício é dependente da carga e da estimulação a-adrenérgica. / In current times, with the prevalence of several syndromes/pathologies related to our immune system, it is essential to practice exercises that are immunostimulants, taking into account the influences of various hormones and cytokines. Among these, catecholamines, which rise circulating leukocyte counts through increased release of bone marrow cells and lymphoid organs as well as influence the functions of immune cells. Surprisingly, there are a few studies about the effect of physical exercise load on the responses of tissue immune cells, which are extremely important, both in the mobilization as well as in the possible cross-talk with other organs. These cells are influenced by extensive innervation, besides their autogenic production of catecholamines, establishing a local neuroimmunomodulation and changing their phenotype according with microenvironment. Therefore, the present study aimed at investigating how adrenergic stimulation affects the inflammatory profile of rat peritoneal resident macrophages under different intensities of acute exercise. Wistar rats were submitted to a session of acute swimming with three exercise intensities (by an overweight attached to the base of the tail, as a percentage of animal body weight): rest (20 min), 4 % (20 min) or 8 % (to the point of exhaustion). Thirty minutes before the exercise sessions, the animals received (i.p.) adrenergic blockers [prazosin (a1), yohimbine (a2), metoprolol (b1), propranolol (b unspecific) and double blockade (a1 a2 and b)], or PBS as control, being killed immediately after exercise or after 6, 12 or 24 h after the sessions. It was prepared an exercise intensity-response curve as a function of time, being evaluated the function of macrophages through the phagocytic capacity and production of nitric oxide (NO, by the measurement of nitrite in the incubation media). The data showed that the highest influence of exercise on these variables occurred 6 h after the session and that these responses are dependent on exercise load and of a-adrenergic stimulation. However, the increase in the production of NO was not due nor to the increments in the number of molecules of the enzyme inducible NO synthase (iNOS), nor to its messenger RNA and neither to the arginase- 1 (protein and mRNA) that competes for arginine with NOS. A possible reduction in the amount of molecules of the 70 kDa heat shock proteins (Hsp70), which suppress iNOS expression was also not observed. In conclusion, the modulation of peritoneal macrophage pro-inflammatory profile with exercise is dependent on exercise load and a-adrenergic stimulation.

A atividade física moderada regular apresenta uma série de efeitos benéficos para a fisiologia do organismo, particularmente no tocante à atividade do sistema imunológico. O exercício físico promove aumento da resistência a infecções por agentes virais e bacterianos, reduz a incidência de certos tipos de câncer, reduz enormemente os riscos de doenças cardiovasculares agudas e crônicas e melhora a qualidade de vida de uma maneira geral. Contudo, os mecanismos pelos quais o exercício físico regular melhora a performance do sistema imunológico não estão completamente elucidados. Particularmente em relação às alterações imunológicas observadas em sessões agudas de exercício moderado, pouco se sabe. Neste trabalho foi estudado o efeito de sessões agudas de exercício de natação em ratos (1 h, em água aquecida a 30ºC, com sobrepeso de 5% ligado à cauda) sobre a funcionalidade imunológica e inflamatória de macrófagos obtidos a partir de monócitos circulantes destes animais. Os resultados mostraram que o exercício induz uma intensa ativação na capacidade fagocitária (2,4 vezes maior que nos controles P = 0,0041), na produção basal de NO avaliada pelo acúmulo de NO3-, NO2- e NOx- total em macrófagos incubados por 1 h (até 95,5% de aumento P = 0,0220) e na produção de H2O2 estimulada pelo éster de forbol PMA (9,6 vezes maior que nos controles, P = 0,0022). O aumento na capacidade basal de produção parece estar associado à expressão da isoforma induzível da NO sintase (iNOS = NOS-2), já que o exercício provocou uma expressiva indução na expressão da enzima (P = 0,0319). Embora a indução da expressão da iNOS esteja relacionada à ativação da via do fator nuclear κB (NF-κB) o que, por sua vez, está normalmente associado ao estresse oxidativo, vários parâmetros sugerem que a ativação dos monócitos/macrófagos deva ter ocorrido localmente a despeito de qualquer alteração redox sistêmica, já que o exercício não levou a qualquer alteração na quantidade de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) plasmáticas ou no índice de estado redox eritrocitário, avaliado pela relação entre as concentrações intracelulares de dissulfeto de glutationa e glutationa. Também não houve alteração na expressão das proteínas de choque térmico da família das HSP70, o que sugere que o exercício não tenha provocado nenhuma sorte de estresse pronunciado sobre os macrófagos. Somados, os dados sugerem que o exercício agudo moderado possa desempenhar importante papel na ativação de certos mecanismos imunológicos e inflamatórios em monócitos/macrófagos e que algum fator neural ou humoral, que não o estresse oxidativo, possa mediar esta resposta.

Introdução: A Doença de Gaucher (DG) é causada pela atividade reduzida da enzima lisossomal glicocerebrosidase, o que leva ao acúmulo de glicocerebrosídeo em macrófagos. Embora o macrófago venha sendo a célula mais estudada, alguns achados sugerem que outras células do sistema imune possam ter papel importante na fisiopatologia da DG. Os pacientes com DG apresentam níveis elevados de imunoglobulinas e uma maior incidência de malignidades hematológicas, possivelmente devido ao desbalanço da regulação de citocinas inflamatórias. Objetivo: Caracterizar o envolvimento do sistema imune na DG ao analisar alterações clínicas e bioquímicas, variabilidade dos genes HLA e KIR e a expressão de citocinas em uma coorte de pacientes com DG do Estado do Rio Grande do Sul. Metodologia: Para o estudo relacionado aos genes HLA e KIR, 31 pacientes com DG tipo I foram analisados e comparados a 250 controles saudáveis. Para os estudos relacionados à variação de citocinas, foram obtidas amostras de 14 pacientes com DG tipo I fora de tratamento e após 6 meses de tratamento regular. Resultados/Discussão: O alelo HLA B37 foi mais frequente em pacientes com DG do que nos controles (p=0,01). A idade de início dos sintomas foi associada à combinação das variantes KIR2DL2 e KIR2DS2 com seu ligante HLA-C1 (p=0,038). Pacientes que apresentam a variante HLA-C2 parecem apresentar maior susceptibilidade a desenvolver bandas mono ou policlonais na eletroforese de proteínas (p=0,007, OR=21,3). Foi encontrada associação entre os alelos DR11 (p=0.008) e DR13 (p=0.011) e gravidade da doença. O BDNF está diminuído em pacientes com DG em relação a controles saudáveis e aumenta significativamente após a TRE, enquanto a osteopontina parece ser mais sensível que a quitotriosidase para avaliação de resposta ao tratamento. Ao avaliar a variação das citocinas, encontramos uma diminuição significativa de TNF-α, MIP-1α, MIP-1β e MDC e um aumento significativo de GRO, PAI-1 e leptina após tratamento. Conclusão: Nossos dados sugerem uma possível associação entre variantes dos genes KIR e HLA e a expressão fenotípica de pacientes com DG. Além disso, demonstramos a variabilidade de diferentes 12 citocinas após o tratamento, podendo algumas delas ser utilizadas para monitorização de resposta ao tratamento dos pacientes. / Background: Gaucher disease (GD) is caused by the reduced activity of the lysosomal enzyme glucocerebrosidase, which leads to the accumulation of glucocerebroside in the macrophages and a chronic stimulation of the immune system. Although the macrophage has been better studied, there are some findings regarding the role of other immunological cells in the pathophysiology of GD. GD patients have elevated levels of immunoglobulins and an increased incidence of hematological malignancies, possibly due to the imbalance of regulatory cytokines. Objectives: To characterize the involvement of the immune system in GD by analyzing clinical and biochemical features, variability of HLA and KIR genes and the cytokines expression in a cohort of patients from Rio Grande do Sul, Brazil. Methodology: Regarding the HLA and KIR genes study, DNA samples from 31 patients with GD type I were analyzed and compared to 250 healthy controls. For studies related to the variation of cytokines, samples from 14 patients with Gaucher type I off treatment and after 6 months of regular treatment were compared. Results/Discussion: The HLA B37 allele was more frequent in patients with GD than in controls (p = 0.01). The age of onset was associated with KIR2DL2 and KIR2DS2 combination with its ligand HLA-C1 (p = 0.038). Patients with the HLA-C2 appear to exhibit increased susceptibility to develop monoclonal or polyclonal bands on protein electrophoresis (p = 0.007, OR = 21.3). An association between the DR11 (p=0.008) and DR13 (p=0.011) alleles and disease severity was found. BDNF is decreased in patients with GD compared to healthy controls and increases after ERT while osteopontin seems to be more sensitive than chitotriosidase for assessing response to treatment. When evaluating the variation of cytokines, we found a significant decrease of TNF-α, MIP-1α, MIP-1β and MDC and significant increased GRO, PAI-1 and leptin after treatment. Conclusion: Our data suggest a possible association between variants of KIR and HLA genes and phenotypic expression presented by GD patients. Furthermore, we demonstrate the variability of different cytokines after treatment and some of them can be used for monitoring the response to treatment of patients.

Em tempos atuais, com diversas síndromes/patologias relacionadas ao nosso sistema imunológico é imprescindível praticar exercícios que sejam imunoestimulantes, levando em consideração a influência de diversos hormônios e citocinas. Dentre esses, destacam-se as catecolaminas, que além de atuarem no aumento dos leucócitos circulantes, pela maior liberação de células da medula óssea e de órgãos linfoides, também influenciam as funções das células imunológicas. Surpreendentemente, pouco se sabe do efeito da intensidade do exercício físico sobre a resposta de células imunológicas teciduais, apesar de sua extrema importância, tanto na mobilização como na possível comunicação com outros órgãos. Essas células sofrem influência da intensa inervação, além da produção autógena de catecolaminas, estabelecendo um processo de neuroimunomodulação local e alterando seu fenótipo de acordo com o microambiente. Assim, o presente trabalho objetivou investigar se a estimulação adrenérgica afeta o perfil inflamatório de macrófagos residentes no peritônio de ratos, por meio de diferentes intensidades de exercício físico agudo. Ratos Wistar foram submetidos a uma sessão aguda de natação com três intensidades de exercício (conforme sobrepeso atado à base da cauda, como porcentagem da massa no animal): repouso (20 min), 4 % (20 min) ou 8 % (até a exaustão). Trinta minutos antes das sessões de exercício, os animais receberam (i.p.) bloqueadores adrenérgicos [prazosina (a1), ioimbina (a2), metoprolol (b1), propranolol (b inespecífico) e duplo bloqueio (a1, a2 e b)], ou PBS como controle, sendo mortos imediatamente após o exercício ou depois de 6, 12 ou 24 h após as sessões de nado. Determinou-se uma curva intensidade de exercício-resposta em função do tempo sendo avaliada a função dos macrófagos por meio da capacidade fagocítica e de produção de óxido nítrico (NO, pela medida de nitritos em meio de incubação). Os dados mostraram que a maior influência do exercício sobre estas variáveis do macrófago dá-se 6 h após a sessão e que estas respostas são dependentes da carga e de estimulação a-adrenérgica. Entretanto, o aumento na produção de NO não foi devido nem a incrementos na quantidade de moléculas da enzima NO sintase induzível (iNOS) nem de seu RNA mensageiro e nem da arginase-1 (proteína e RNAm) que compete pela arginina com a iNOS. A redução na quantidade de moléculas de proteínas de choque térmico de 70 kDa (HSP70), que reprimem a expressão de iNOS, também não foi observada. Em conclusão, a modulação do perfil pró-inflamatório dos macrófagos peritoneais com o exercício é dependente da carga e da estimulação a-adrenérgica. / In current times, with the prevalence of several syndromes/pathologies related to our immune system, it is essential to practice exercises that are immunostimulants, taking into account the influences of various hormones and cytokines. Among these, catecholamines, which rise circulating leukocyte counts through increased release of bone marrow cells and lymphoid organs as well as influence the functions of immune cells. Surprisingly, there are a few studies about the effect of physical exercise load on the responses of tissue immune cells, which are extremely important, both in the mobilization as well as in the possible cross-talk with other organs. These cells are influenced by extensive innervation, besides their autogenic production of catecholamines, establishing a local neuroimmunomodulation and changing their phenotype according with microenvironment. Therefore, the present study aimed at investigating how adrenergic stimulation affects the inflammatory profile of rat peritoneal resident macrophages under different intensities of acute exercise. Wistar rats were submitted to a session of acute swimming with three exercise intensities (by an overweight attached to the base of the tail, as a percentage of animal body weight): rest (20 min), 4 % (20 min) or 8 % (to the point of exhaustion). Thirty minutes before the exercise sessions, the animals received (i.p.) adrenergic blockers [prazosin (a1), yohimbine (a2), metoprolol (b1), propranolol (b unspecific) and double blockade (a1 a2 and b)], or PBS as control, being killed immediately after exercise or after 6, 12 or 24 h after the sessions. It was prepared an exercise intensity-response curve as a function of time, being evaluated the function of macrophages through the phagocytic capacity and production of nitric oxide (NO, by the measurement of nitrite in the incubation media). The data showed that the highest influence of exercise on these variables occurred 6 h after the session and that these responses are dependent on exercise load and of a-adrenergic stimulation. However, the increase in the production of NO was not due nor to the increments in the number of molecules of the enzyme inducible NO synthase (iNOS), nor to its messenger RNA and neither to the arginase- 1 (protein and mRNA) that competes for arginine with NOS. A possible reduction in the amount of molecules of the 70 kDa heat shock proteins (Hsp70), which suppress iNOS expression was also not observed. In conclusion, the modulation of peritoneal macrophage pro-inflammatory profile with exercise is dependent on exercise load and a-adrenergic stimulation.

Made available in DSpace on 2016-04-04T12:35:25Z (GMT). No. of bitstreams: 2 bruno_nunes_ioc_mest_2014.pdf: 2295523 bytes, checksum: ae908a52d5c21a69d898434ee645c5cf (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Insetos são expostos a diversos microrganismos patogênicos durante seu ciclo de vida. Para sobreviverem a riscos de infecções, os insetos possuem várias barreiras e respostas imunes. O sistema imune de insetos é basicamente composto por vias de sinalização que controlam uma diversidade de mecanismos efetores, deste modo permitindo o controle da maior parte das infecções. Assim como em outros organismos, há três principais vias de sinalização relacionadas à imunidade em insetos: Toll, Imd e Jak/STAT. Nosso objetivo foi caracterizar estas vias imunes em L. longipalpis, o principal vetor da leishmaniose visceral no Brasil. Para isto, nós transfectamos células embrionárias LL5 de L. longipalpis com RNA dupla fita para os genes repressores cactus (Toll), caspar (Imd) e pias (Jak/STAT). Usando esta abordagem, foi possível correlacionar a expressão dos peptídeos anti-microbianos (AMPs) com as vias correspondentes. Nós vimos que cecropina e defensina 4 foram reguladas positivamente após transfecção com RNA dupla fita para cactus e caspar, mostrando regulação redundante pelas vias Toll e Imd. Nós também silenciamos o gene cactus em insetos adultos. Diferente do que foi observado em células LL5, atacina, cecropina e defensina 4 foram reguladas negativamente após o silenciamento. É possível que este resultado seja explicado pelo efeito de uma alça de regulação negativa da via Toll, de modo a preservar a microbiota na ausência de estímulo imune Além disso, nós avaliamos a resposta de genes de imunidade durante a infecção por Leishmania infantum chagasi em insetos adultos. Cactus foi regulado positivamente 48 horas após infecção, demonstrando o papel da via Toll em resposta à infecção por Leishmania. A expressão de SHP-1 foi modulada durante a infecção, com aumento significativo da expressão, em 48 horas. Este resultado sugere que, assim como em macrófagos, Gp63 ativa SHP-1, do hospedeiro invertebrado e, com isso, inibe a via Toll, possivelmente imunossuprimindo o flebotomíneo. Os AMPs atacina, cecropina e defensina 4 mostraram aumento significativo da expressão 72 horas após infecção, quando o parasita interage diretamente com o epitélio intestinal do flebotomíneo. A carga parasitária diminuiu significativamente nos terceiro e quarto dias, provavelmente devido ao aumento da expressão de AMPs nestes pontos. Estes resultados indicam que esses genes são regulados pelo flebotomíneo em resposta a presença de Leishmania, e que podem causar impactos na sobrevivência do parasita no intestino do inseto durante a infecção / nsects are exposed to a wide range of pathogenic microorganisms during their life cycle. In order to survive infection risks, insects developed several structural barriers and immune responses . The insect immune system is basically composed of signaling pathways that control a diversity of effector mechanisms, thus allowing control of most infections. As found in other organisms, there are three main signaling pathways related to immunity in insects: Toll, Imd and Jak/STAT. Our purpose was to characterize these immune pathways in L. longipalpis, the main vector of visceral leishmaniasis in Brazil. For this, we transfected L. longipalpis embryonic LL5 cells with dsRNA for the repressor genes cactus (Toll), caspar (Imd) and PIAS (Jak/STAT). Using this approach, it was possible to correlate the expression of AMPs to corresponding pathways. We found that cecropin and defensin 4 were upregulated after t ransfection by dsRNA for cactus and caspar, showing redundant regulation via the Toll and IMD pathways. We also silenced the cactus gene in adult insects by dsRNA. U nlike what was observed in LL5 cells , attacin, cecropin and defensin 4 genes were downregul ated after silencing. This result might be explained by the effect of a negative regulation loop via Toll, to preserve the microbiota in the absence of immune stimulation. Furthermore, we assessed the response of immunity genes upon Leishmania infantum cha gasi infection in adult insect. Cactus was upregulated at 48 hours after infection, demonstrating the role of the Toll pathway in response to Leishmania infection. The SHP - 1 expression was modulated during infection , with a significant increase in expressi on at 48 hours. This result suggests that, like in macrophages , Leishmania Gp63 activates SHP - 1 of the invertebrate host and thereby inhibits the Toll pathway , possibly immunosuppressing the sandfly . The AMPs attacin, cecropin and defensin 4 showed signifi cant increase in expression at 72 hours after infection, when the parasite is interacting closely with the sand fly intestinal epithelium . The parasite load decreased significantly on the third and fourth days after infection , probably due to increasead AM Ps expression at this point. These results indicate that these genes are regulated by the sand fly immune response upon the presence of Leishmania , which may have an impact on parasite survival in the insect gut during infection

A atividade física moderada regular apresenta uma série de efeitos benéficos para a fisiologia do organismo, particularmente no tocante à atividade do sistema imunológico. O exercício físico promove aumento da resistência a infecções por agentes virais e bacterianos, reduz a incidência de certos tipos de câncer, reduz enormemente os riscos de doenças cardiovasculares agudas e crônicas e melhora a qualidade de vida de uma maneira geral. Contudo, os mecanismos pelos quais o exercício físico regular melhora a performance do sistema imunológico não estão completamente elucidados. Particularmente em relação às alterações imunológicas observadas em sessões agudas de exercício moderado, pouco se sabe. Neste trabalho foi estudado o efeito de sessões agudas de exercício de natação em ratos (1 h, em água aquecida a 30ºC, com sobrepeso de 5% ligado à cauda) sobre a funcionalidade imunológica e inflamatória de macrófagos obtidos a partir de monócitos circulantes destes animais. Os resultados mostraram que o exercício induz uma intensa ativação na capacidade fagocitária (2,4 vezes maior que nos controles P = 0,0041), na produção basal de NO avaliada pelo acúmulo de NO3-, NO2- e NOx- total em macrófagos incubados por 1 h (até 95,5% de aumento P = 0,0220) e na produção de H2O2 estimulada pelo éster de forbol PMA (9,6 vezes maior que nos controles, P = 0,0022). O aumento na capacidade basal de produção parece estar associado à expressão da isoforma induzível da NO sintase (iNOS = NOS-2), já que o exercício provocou uma expressiva indução na expressão da enzima (P = 0,0319). Embora a indução da expressão da iNOS esteja relacionada à ativação da via do fator nuclear κB (NF-κB) o que, por sua vez, está normalmente associado ao estresse oxidativo, vários parâmetros sugerem que a ativação dos monócitos/macrófagos deva ter ocorrido localmente a despeito de qualquer alteração redox sistêmica, já que o exercício não levou a qualquer alteração na quantidade de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) plasmáticas ou no índice de estado redox eritrocitário, avaliado pela relação entre as concentrações intracelulares de dissulfeto de glutationa e glutationa. Também não houve alteração na expressão das proteínas de choque térmico da família das HSP70, o que sugere que o exercício não tenha provocado nenhuma sorte de estresse pronunciado sobre os macrófagos. Somados, os dados sugerem que o exercício agudo moderado possa desempenhar importante papel na ativação de certos mecanismos imunológicos e inflamatórios em monócitos/macrófagos e que algum fator neural ou humoral, que não o estresse oxidativo, possa mediar esta resposta.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-08-17T17:33:43Z No. of bitstreams: 1 2016_MarthadeOliveiraBravo.pdf: 17501557 bytes, checksum: 0f490dec5aa9501399b157cb3a253bcc (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-10-31T15:58:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_MarthadeOliveiraBravo.pdf: 17501557 bytes, checksum: 0f490dec5aa9501399b157cb3a253bcc (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-31T15:58:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_MarthadeOliveiraBravo.pdf: 17501557 bytes, checksum: 0f490dec5aa9501399b157cb3a253bcc (MD5) / As células-tronco mesenquimais (CTMs) desempenham importante função imunorregulatória, por escapar do reconhecimento imune e suprimir a resposta imunológica. A infusão de CTMs é útil para o tratamento de situações em que o sistema imunológico apresenta resposta exacerbada, como na doença do enxerto contra o hospedeiro (DECH). Entretanto, o elevado número de células necessário para a obtenção do efeito terapêutico desejado constitui um grande limitante para o uso clínico dessas células. Para realçar o potencial supressivo das CTMs, duas estratégias têm sido realizadas: o condicionamento (licenciamento) e a terapia combinada de CTMs com imunossupressores. A catelicidina (LL- 37) é um peptídeo antimicrobiano que exerce diversas funções modulatórias sobre a resposta imune, estimulando, em alguns contextos a produção de fatores anti-inflamatórios, como IL-10 e, em outros, estimulando mediadores pró-inflamatórios. Com base nesse contexto, avaliamos, in vitro, se o condicionamento de CTMs pelo peptídeo LL-37 realça o potencial supressivo dessas células e se esse peptídeo poderia ser utilizado como adjuvante das CTMs na supressão de linfócitos T. Além disso, investigamos se esse peptídeo exerce efeito sobre a proliferação e potencial migratório das dessas células. Por fim, investigamos a influência de LL-37 na expressão do receptor tipo toll-3 (RTT3) e no perfil de expressão gênica das CTMs. O condicionamento das CTMs com peptídeo LL-37 não influenciou o potencial supressivo dessas células, entretanto, quando usado como adjuvante, LL-37 aumenta o efeito supressor das CTMs. A catelicidina LL-37 não influenciou a capacidade proliferativa das CTMs, mas quando usada como adjuvante realçou o potencial migratório dessas células. Por fim, investigamos mecanismos moleculares que poderiam sustentar os efeitos funcionais observados. LL-37 induziu aumento da expressão do RTT3 nas CTMs e a hiperexpressão de genes anti-inflamatórios, o que, em parte, pode explicar os efeitos observados. De modo geral, os resultados obtidos nesse estudo, podem servir de base para o desenvolvimento de abordagens terapêuticas inovadoras que tenham por objetivo realçar propriedades fundamentais das CTMs, como o efeito imunossupressivo e o potencial migratório, garantindo, ao mesmo tempo, efeito contra microrganismos oportunistas. __________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Mesenchymal stem cells (MSCs) play an important immunoregulatory function, to escape immune recognition and suppress the immune response. Infusion of MSCs is useful for treatment of conditions where the immune system has exacerbated response, as in graftversus- host disease (GVHD). However, the large number of cells needed to achieve the desired therapeutic effect is a major limitation to the clinical use of these cells. To enhance the suppressive potential of MSCs, two strategies have been carried out: the conditioning (licensing) and combination MSCs therapy with immunosuppressants. The cathelicidin (LL- 37) is an antimicrobial peptide that exerts various modulatory functions on the immune response, stimulating, in some contexts the production of anti-inflammatory factors, such as IL-10, and others, stimulating proinflammatory mediators. Within this context, evaluated in vitro as MSCs conditioning the LL-37 peptide enhances the suppressive potential of these cells and this peptide could be used as adjuvant of MSCs in suppression of T lymphocytes. Furthermore, we investigated whether this peptide has an effect on the proliferation and migration potential of these cells. Finally, we investigated the influence of LL-37 in the toll-like receptor type 3 expression (TLR3) and gene expression profile of MSCs. The conditioning of MSCs with LL-37 peptide did not affect the suppressive potential of these cells, however, when used as adjuvant, LL-37 increases the suppressive effect of MSCs. The LL-37 cathelicidin did not affect the proliferative capacity of MSCs, but when used as an adjuvant enhanced the migration potential of these cells. Finally, we investigate molecular mechanisms that could sustain the observed functional effects. LL-37 induced increased expression in MSCs TLR3 and overexpression of anti-inflammatory genes, which in part may explain the observed effects. In general, the results obtained in this study could serve as the basis for the development of innovative therapeutic approaches which aim to enhance the fundamental properties of MSCs as immunosuppressive effect and migration potential, ensuring at the same time, effect against opportunistic microorganisms.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2014. / Submitted by Camila Duarte (camiladias@bce.unb.br) on 2017-01-10T13:50:26Z No. of bitstreams: 1 2014_MaryaniAndressaGomesBezerra.pdf: 4392987 bytes, checksum: 2d620e2e34486b05d19113128ecd6494 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2017-01-17T13:50:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_MaryaniAndressaGomesBezerra.pdf: 4392987 bytes, checksum: 2d620e2e34486b05d19113128ecd6494 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-17T13:50:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_MaryaniAndressaGomesBezerra.pdf: 4392987 bytes, checksum: 2d620e2e34486b05d19113128ecd6494 (MD5) / O anticorpo anti-CD3 humano OKT3 foi utilizado por décadas na prevenção da rejeição aguda em transplantes, mas por acarretar o desenvolvimento de uma resposta imunogênica severa, seu uso foi descontinuado. A humanização desse anticorpo e a engenharia molecular de sua porção Fc têm sido instrumentos valiosos para desenvolvimento de uma nova geração de anticorpos anti-CD3 humano, os quais também vêm sendo considerados para o tratamento de doenças autoimunes. Os melhores candidatos deverão induzir a inativação de células T através de mecanismos não-líticos, promovendo apoptose, anergia e/ou expansão de células T regulatórias. Em nosso grupo, estamos trabalhando com anticorpos recombinantes anti-CD3 humanizados com potencial imunoregulatório. Nesse trabalho, buscamos aprofundar a caracterização das atividades ligante e efetora de versões humanizadas e quimera do anticorpo anti-CD3 humano na forma de FvFc e IgG. Todos os anticorpos recombinantes foram capazes de se ligar à superfície das células T CD4+ e CD8+. Somente os FvFcs recombinantes foram capazes de competir pela ligação à molécula CD3 com o anticorpo parental OKT3. As versões FvFc humanizadas apresentaram uma menor mitogenicidade em células T CD4+ e CD8+ comparadas à versão FvFc quimérica. Os FvFcs recombinantes induziram uma menor produção de citocinas inflamatórias comparada as do anticorpo OKT3. As versões FvFc R e FvFc M induziram o aumento da expressão de Fas nas populações CD4+ e CD8+ de forma dose-dependente, sendo a versão humanizada FvFc R a que revelou o maior aumento. Isso sugere que a humanização pode ter tornado o anticorpo anti-CD3 humano mais pró-apoptótico. A presença dos FvFcs recombinantes também aumentou o número de células positivas para alguns marcadores de células T regulatórias (CD25, GARP e CTLA-4) dentro das populações CD4+ e CD8+. A versão humanizada FvFc R foi a que revelou o maior aumento de células CD25+ GARP+, sugerindo a indução de um fenótipo imunoregulatório. Esses resultados mostram que anticorpos na forma de FvFc e a versão humanizada FvFc R do anticorpo anti-CD3 humano são promissoras em procedimentos onde um ambiente imunoregulatório é requerido. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The anti-human CD3 antibody OKT3 had been used for decades on acute transplant rejection prevention, but due to its severe immunogenic reaction, its use was discontinued. Antibody humanization and molecular engineering of the Fc portion have been valuable tools in the development of a new generation of anti-human CD3 antibodies, that have also been considered for the treatment of autoimmune diseases. Best candidates may induce T-cell inactivation through non-lytic mechanisms, promoting apoptosis, anergy and/or regulatory T cell expansion. Our group is working with humanized recombinant anti-CD3 antibodies with immunoregulatory potential. In this work, we pursued the binding and effector activities characterization of humanized and chimeric versions of the anti-human CD3 antibody, in FvFc and IgG formats. All recombinant antibodies were capable of bind to CD4+ and CD8+ T cells surface. Only recombinant FvFcs were able to compete to CD3 molecule with the parental antibody OKT3. The humanized FvFc versions showed low mitogenicity on CD4+ and CD8+ T compared to chimeric FvFc version. Recombinants FvFcs induced lower production of inflammatory cytokines compared to OKT3 antibody one. FvFc R and FvFc M versions induced the increase of Fas expression on CD4+ and CD8+ populations in a dose-dependent manner, being the humanized FvFc R version the one with the highest increase. This suggests that the humanization may have turned the anti-human CD3 FvFc R more pro-apoptotic. Recombinant FvFcs presence also increased the number of positive cells to some regulatory T cell markers (CD25, GARP e CTLA-4) inside CD4+ and CD8+ populations. The humanized FvFc R version was the one with the highest increase of CD25+ GARP+ cells, suggesting an immunoregulatory phenotype induction. These data shows that the FvFc molecules and the humanized FvFc R version are promising in procedures where an immunomodulatory environment is required.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-graduação em Medicina Tropical, 2015. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-03-03T17:43:05Z No. of bitstreams: 1 2015_ShirleyClaudinoPereiraCouto.pdf: 2005336 bytes, checksum: 109e6489df275decec29166652ec4123 (MD5) / Approved for entry into archive by Ruthléa Nascimento(ruthleanascimento@bce.unb.br) on 2017-03-31T16:30:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_ShirleyClaudinoPereiraCouto.pdf: 2005336 bytes, checksum: 109e6489df275decec29166652ec4123 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-31T16:30:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_ShirleyClaudinoPereiraCouto.pdf: 2005336 bytes, checksum: 109e6489df275decec29166652ec4123 (MD5) / A malária continua sendo um importante problema de saúde pública mundial acometendo milhões de pessoas principalmente nas regiões tropicais, e resulta em aproximadamente em 600 mil mortes por ano. As drogas antimaláricas influenciam indiretamente as respostas do sistema imunitário pela capacidade de diminuir a carga parasitária, diminuindo a quantidade de antígenos capazes de ativar o sistema imunitário. Entretanto, ainda está pouco esclarecida a ação das drogas antiplasmodiais sobre os mecanismos de defesa contra o plasmódio. A fagocitose encontra-se entre os principais mecanismos de eliminação do parasito, principalmente pela produção de radicais de oxigênio e nitrogênio pelos monócitos. A biogênese dos corpos lipídicos encontra-se aumentada na malária e pode estar envolvida na defesa e na fisiopatogenia da malária grave. O objetivo desse trabalho foi avaliar a influência do efeito imunomodulador do artemeter, lumefantrina e mefloquina na malária, pela avaliação da influência dessas drogas na fagocitose das formas eritrocitárias do plasmódio, na produção de óxido nítrico e peróxido de hidrogênio e na biogênese de corpos lipídicos. A influência do artemeter, da lumefantrina ou da mefloquina sobre a fagocitose por monócitos de indivíduos normais foia valiada in vitro utilizando 106 eritrócitos parasitados pelo Plasmodium falciparum, pelos receptores para padrões moleculares de patógenos (rPMP) e pelos receptores para opsoninas (rOps). Os monócitos e/ou os eritrócitos foram tratados previamente com as drogas por 60 min. O índice fagocitário foi determinado pela média de eritrócitos parasitados ingeridos por monócito multiplicado pela proporção de monócitos envolvidos na fagocitose. A produção de óxido nítrico foi avaliada pela reação de Griess e a produção de peróxido de hidrogênio foi avaliada pela oxidação do vermelho fenol na presença de peroxidase, sendo os monócitos estimulados pelos eritrócitos parasitados. Os corpúsculos lipídicos foram avaliados pela coloração com Oil Red O. As drogas foram utilizadas in vitro considerando os picos séricos observados quando do tratamento in vivo, sendo 360 ng/mL para o artemeter, 4,9g/mL para a lumefantrina e 687ng/mL para a mefloquina. Quando foi feito o tratamento dos monócitos e dos eritrócitos com o artemeter, observamos diminuição no IF quando avaliado pelos rOps (7,6x 5,2) (p= 0,02). A diminuição da fagocitose foi semelhante quando quantificada para hemozoína (p=0,036). Para a lumefantrina, houve diminuição do IF de 8,4 para 4,6 (p=0,02), quando apenas os monócitos foram tratados e a fagocitose avaliada pelos rPMP. Também houve diminuição do IF para esquizontes pelos rPMP, quando apenas os monócitos foram tratados (p=0,006). Quando os monócitos foram estimulados com os eritrócitos parasitados pelos rPMP, as três drogas diminuíram a expressão de corpúsculos lipídicos (p<0,05). Entretanto, quando os monócitos foram estimulados com os eritrócitos infectados sensibilizados, pelos receptores para opsoninas, houve aumento da expressão dos corpúsculos lipídicos pelo tratamento com a lumefantrina e a mefloquina (p<0,05). O estímulo dos monócitos com os eritrócitos parasitados aumentou a produção de peróxido de hidrogênio (p=0,009). E a mefloquina diminuiu a produção basal de H2O2 pelos monócitos (p<0,05). A diminuição da expressão de corpúsculos lipídicos nos monócitos estimulados com eritrócitos parasitados pelo P. falciparum pelos rPMP e seu aumento pelos rOps indica que a expressão dos corpúsculos lipídicos foi dependente da via pelo qual o monócito foi estimulado pelo eritrócito parasitado. A lumefantrina deprimiu a fagocitose dos eritrócitos parasitados pelos rPMP, enquanto a depressão da fagocitose ocasionada pelo artemeter foi dependente da ingestão do parasito pelos receptores para complemento. Nossos dados mostraram que o artemeter, a lumefantrina e a mefloquina modulam as respostas dos monócitos aos eritrócitos parasitados pelo P. falciparum em aspectos fundamentais relacionados com a defesa inata, nas interações iniciais do parasito com as células de defesa do hospedeiro. Mostrando, portanto, que a ação desses fármacos não depende exclusivamente de sua atividade antiparasitária, mas que o resultado final da ação desses medicamentos depende também da modulação de diversos mecanismos de defesa inato contra o parasito. / Malaria remains a worldwide public health issue, affecting millions of people, especially those living in tropical regions. Statistics confirm the magnitude of this disease, with, approximately, 600 thousand deaths each year. Antimalarial drugs indirectly influence immune response through its capacity to reduce parasite load, reducing the quantity of antigens that are capable of activating immune system. However, the role played by antiplasmodial drugs on defense against Plasmodium is still not well established. Phagocytosis remains one of the main mechanisms of eliminating parasites, especially through production of radical oxygen and nitrogen molecules by monocytes. The lipid body biogenesis is also enhanced in malaria e may be involved in defense and pathophysiology of severe disease. Therefore, the objective of the current study was to evaluate the immunomodulatory effect of arthemeter, lumefantrine and mefloquine drugs in malaria, based on the role of these drugs on phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes, on the production of nitric oxide and hydrogen peroxide and on the biogenesis of lipid bodies. The influence of arthemeter, lumefantrine and mefloquine on phagocytosis by monocytes in healthy individuals was evaluated in vitro using 106 Plasmodium falciparum-infected erythrocytes, through pathogen-associated molecular pattern receptors (PAMPr) or opsonin receptors. Monocytes and/or erythrocytes were previously treated with the drugs for 60 minutes. The phagocitic index was determined by the product of the mean number of parasitized erythrocytes ingested by monocyte and the proportion of monocytes involved in phagocytosis. The production of nitric oxide was evaluated through the Griess reaction, while de hydrogen peroxide production through the red phenol oxidation in presence of peroxidase. Lipid body formation was evaluated by oil red O staining. The drug concentrations used in vitro were obtained by the higher serum levels observed in vivo after ingestion of the drugs, which was 360 ng/mL for arthemeter 4,9 μg/mL for lumefantrine and 687ng/mL for mefloquine. When monocytes and erythrocytes were treated with arthemeter, it was observed a decrease in the phagocitic index when analyzed through opsonin receptors (7,5x5,2) (p=0,02). The reduction in phagocytosis was similar when quantified by hemozoine ingestion (p=0,02). Regarding the lumefantrine treatment, a reduction from 8,4 to 4,6 was observed in the phagocytic index when only monocytes were treated and phagocytosis was assessed through pathogen-associated molecular pattern receptors. An additional reduction was also observed in phagocytic index for esquizonts, through PAMPr when only monocytes were treated (p=0,006). When monocytes were stimulated with parasitized erythrocytes by PAMPr, all three drugs diminished the lipid body formation. However, when monocytes were stimulated with sensitized infected erythrocytes by the opsonin receptors, an increase in lipid body formation was observed when lumefantrine or mefloquine treatment were done (p>0,05). When monocytes were stimulated with Plasmodium falciparum-infected erythrocytes there was an increase in hydrogen peroxide production (p=0,009), whereas mefloquine treatment reduced the basal production of H2O2 by monocytes (p<0,05). Reduction observed in lipid body production after monocyte stimulation with Plasmodium falciparum-infected erythrocytes by PAMPr and its increase when monocyte stimulation occurred by opsonin receptors show that lipid body formation depended on the intracellular pathway by which monocytes were stimulated. Lumefantrine reduced phagocytosis of infected erithrocytes through PAMPr, while reduction caused by arthemeter was observed when phagocytosis occurred by complement receptors. Our dada show that arthemeter, lumefantrine and mefloquine modulate monocyte functions in defense against P. falciparum. Therefore, we conclude that beside the antiparasitic action of these drugs they also modulate the innate defense against parasite.

Orientador: Paulo Câmara Marques Pereira / Banca: Silvia Justina Papini / Banca: Dalmo Correia Filho / Resumo: A doença de Chagas, causada pelo Trypanosoma cruzi, é uma doença infecciosa crônica negligenciada. Apresenta grande incidência no Brasil e, nos últimos anos, passou a ser uma endemia de centros urbanos. É acompanhada por alterações no sistema imune com variações nos níveis séricos das citocinas pró-inflamatórias. O tratamento disponível no Brasil é o benzonidazol, com baixa eficácia na fase crônica e efeitos colaterais importantes. Não há estudos que relacionem o tratamento, a resposta imune e a desnutrição na doença de Chagas. Sabe-se que a desnutrição é um fator de imunossupressão e que poderia interferir na evolução das doenças infecciosas e parasitárias. Portanto, o objetivo foi avaliar a desnutrição associada com o tratamento anti-parasitário e com as citocinas pró-inflamatórias, em camundongos Balb/c infectados. Foram utilizados 90 animais, divididos em seis grupos: G1-controle, G2-infectado com dieta normal, G3-infectado com dieta normal e tratado, G4-controle desnutrido, G5-desnutrido e infectado e G6 desnutrido, infectado e tratado. Foram avaliados em cinco momentos: M1-1°dia, M2-3°dia, M3-5°dia, M4-7°dia e M5-9°dia. Para infecção foi utilizada a cepa aguda Y, com pico de parasitemia no sétimo dia (M4). Realizou-se a eutanásia de três animais de cada grupo, em cada momento. Para determinação das citocinas foi utilizado o ELISA e, para análise histopatológica, amostras do coração, intestino e fígado. O medicamento foi dado na dosagem de 100 mg/kg/dia. A análise estatística foi realizada pelo Grupo de Apoio à Pesquisa da Faculdade de Medicina de Botucatu. Observou-se que nos animais desnutridos houve redução significativa do peso no M4, mostrando que a desnutrição agravou a infecção. O coração foi o órgão que apresentou maior diminuição do seu peso, tanto nos animais com dieta... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Chagas disease, caused by Trypanosoma cruzi, is a neglected infectious chronic disease. It is highly incident in Brazil and, in the last few years, it has become endemic in certain urban centers. It is accompanied by alterations in the immune system with variations in the serum levels of pro-inflammatory cytokines. The treatment available in Brazil is benznidazole with low efficacy in the chronic phase and important side effects. No studies have related treatment, immune response and malnutrition in Chagas disease. It is known that malnutrition is an immunodepression factor and that it could interfere with the development of infectious and parasitic diseases. Therefore, this study aimed at evaluating malnutrition associated with anti-parasitical treatment and pro-inflammatory cytokines in infected Balb/c mice. Ninety animals were used, and they were divided into six groups: G1-control, G2-infected mice with a normal diet, G3-infected mice with a normal diet and treated, G4-malnourished control, G5-malnourished and infected and G6-Malnourished, infected and treated. The animals were evaluated at five moments: M1-1st day, M2-3rd day, M3-5th day, M4-7th day and M5-9th day. The acute Y strain, with a parasitemia peak on the seventh day (M4), was used for infection. Three animals from each group were euthanized at each moment. ELISA was used for cytokine determination, and heart and liver samples were used for histological analysis. The drug was used at a dosage of 100 mg/kg/day. Statistical analysis was performed by the Research Support Group of the Botucatu School of Medicine. Significant weight loss at M4 was observed in malnourished animals, thus showing that malnutrition aggravated infection. The heart was the organ that showed the largest weight reduction, both in animals under a normal diet and in malnourished... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre