No description available.

No description available.

Small angle X-ray scattering (SAXS) has been widely used in polymer science to study the nano-scale morphology of various polymers. The data obtained from SAXS give information about sizes and shapes of macromolecules, characteristic distances of partially ordered materials, pore sizes, and so on. The understanding of these structural parameters is crucial in polymer science in that it will help to explain the origin of various properties of polymers, and guide design of future polymers with desired properties. We have been able to further develop the contrast variation method in SAXS to study the morphology of Nafion 117CS containing different alkali metal ions in solid state. Contrast variation allows one to manipulate scattering data to obtain desired morphological information. At room temperature, only the crystalline peak was found for Na⁺-form Nafion, while for Cs⁺-form Nafion only the ionic peak was observed. The utilization of one dimensional correlation function on different counterion forms of Nafion further demonstrates the necessity of contrast variation method in obtaining more detailed morphological information of Nafion. This separation of the ionic peak and the crystalline peak in Nafion provides a means to independently study the crystalline and ionic components without each other's effect, which could be further applied to other ionomer systems. We also designed time resolved SAXS experiments to study the morphological development during solution processing Nafion. As solvent was removed from Nafion dispersion through evaporation, solid-state morphological development occurred through a variety of processes including phase-inversion, aggregation of interacting species (e.g., ionic functionalities), and crystallization of backbone segments. To probe the real-time morphological development during membrane processing that accurately simulates industrial protocols, a unique sample cell has been constructed that allows for through-film synchrotron SAXS data acquisition during solvent evaporation and film formation. For the first time, this novel experiment allows for a complete analysis of structural evolution from solution/dispersion to solid-state film formation, and we were able to show that the crystallites within Nafion develop later than the formation of ionic domains, and they do not reside in the cylindrical particles, but are dispersed in solution/dispersion. Besides bulk morphology of Nafion, we have also performed Grazing Incident SAXS to study the surface morphology of Nafion. We were able to manipulate the surface morphology of Nafion via neutralizing H⁺-form Nafion with different large organic counterions, as well as annealing Nafion thin films under different temperatures. This not only allows to obtain more detailed information of the nano-structures in Nafion thin films, but also provides a means to achieve desired morphology for better fuel cell applications. We have also been able to study the polymer chain conformation in solution via measuring persistence length by utilizing solution SAXS. Different methods have been applied to study the SAXS profiles, and the measured persistence lengths for stilbene and styrenic alternating copolymers range from 2 to 6 nm, which characterizes these copolymers into a class of semi-rigid polymers. This study allows to elucidate the steric crowding effect on the chain stiffness of these polymers, which provides fundamental understanding of polymer chain behaviors in solution. Self-assembling in block copolymers has also been studied using SAXS. We established a morphological model for a multiblock copolymer used as a fuel cell material from General Motors®, and this morphological model could be used to explain the origins of the mechanical and transport properties of this material. Furthermore, several other block copolymers have been studied using SAXS, which showed interesting phase separated morphologies. These morphological data have been successfully applied to explain the origins of various properties of these block copolymers, which provide fundamental knowledge of structure-property relationship in block copolymers. / Ph. D.

Orientador: Marlus Chorilli / Coorientador: Giovana Maria Fioravanti Calixto / Banca: Anderson Orzari Ribeiro / Banca: Denise Madalena Palomarim Spolidorio / Resumo: A candidíase vulvovaginal (CVV) é uma doença causada por espécies do gênero Candida spp. no trato genital inferior feminino que afeta um grande número de mulheres em todo mundo. Porém o uso sistêmico de fármacos causa muitas reações adversas e as formulações tópicas possuem um baixo tempo de retenção na mucosa vaginal devido à diluição dos sistemas na cavidade vaginal. Esse estudo propõe uma terapia antifúngica alternativa empregando sistemas precursores de cristais líquidos mucoadesivos (SPCLM) para a liberação de hipericina (HIP), um potente fotossensibilizador isolado de plantas do gênero Hipericum com e sem o emprego da terapia fotodinâmica (TFD). O sistema visa aumentar o tempo de permanência da formulação, bem como reduzir o número de aplicações e a quantidade de fármaco empregada. O emprego da TFD, por sua vez, se faz como uma forma de diminuir a resistência pelos microrganismos. Observou-se a formação de sistemas isotrópicos no sistema constituído por 30% da fase oleosa constituída por ácido oleico e colesterol na razão de 7:1, 40% de Procetyl AWS como tensoativo e 30% de uma dispersão de poloxamer à 16% empregando as técnicas de microscopia de luz polarizada e espalhamento de raios-X a baixo ângulo. Após a introdução de três diferentes concentrações de fluido vaginal simulado FVS (30, 50 e 100%), as formulações resultantes passaram a apresentar anisotropia e picos característicos de fase lamelar. Análises das propriedades mecânicas, reológicas e mucoadesivas das form... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Vulvovaginal candidosis (VVC) is a disease induced by Candida strains in the female genital tract that affects a great number of women worldwide. However, systemic drugs cause many adverse reactions. Also, currently employed topical dosage forms present low retention times due to their dilution in vaginal fluids. This study proposes an alternative antifungal therapy through the development of liquid crystalline precursor systems (LCPS) for hypericin release, a potent photosensitizer isolated from Hipericum plants with and without photodynamic inactivation (PDI). The developed system aims to increase the residence time of the formulations, as well as decrease the number of applications and the amount of drug. Photodynamic therapy was used to reduce microorganism resistance. Polarized light microscopy and Small-Angle X-Ray Scattering confirmed the formation of an isotropic system composed of 30% of oil phase containing oleic acid and cholesterol in (ratio of 7:1). After addition of three different concentrations of simulated vaginal fluid -SVF (30, 50 and 100%), the resultant formulations presented anisotropy and characteristic peaks of lamellar phases. Mechanical, rheological and mucoadhesive assays indicated the formation of long-range ordering systems as the amount of SVF increased. Drug validation assays indicated that the method is aceptable for hypericin quantification according to regulatory agencies. In vitro drug release assays exhibited a sustained release profile pro... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Title: Self-assembly in mixture of surfactants and stimuli-responsive polymers with complex architecture Author: Anna Bogomolova Department: Physical and Macromolecular Chemistry Supervisor: PhD. Sergey K. Filippov, IMC AS CR, v.v.i. Supervisor's e-mail address: filippov@imc.cas.cz Abstract: The issue of construction of complex multi-block copolymers is currently one of the most researched areas. It became a logic consequence of the continuous development in polymer chemistry. Nowadays, a great interest is attracted to multi- responsive block copolymers. As a rule, they consist of hydrophilic, hydrophobic and responsive blocks. That responsive block can be either thermo-sensitive or pH-sensitive as well as sensitive to some other external stimuli. In the present work, we will try to cover topic of stimuli-responsive block copolymers and their interactions with different types of surfactants. Understanding of polymer/surfactant interactions can be a crucial step for future modeling of drug/polymer or protein(DNA)/surfactant interactions. There is a great interest in the investigation of polymer-surfactant interactions. However, while the homopolymer-surfactant interactions are characterized well enough, the same interactions for block copolymers are poorly described. The main development in the latter topic...

Neste trabalho, utilizamos a técnica de espalhamento de raios-X a baixos Ângulos (SAXS) para estudar a influência de dois derivados fenotiazínicos na estrutura de sistemas micelares, assim como suas propriedades de auto-associação, além de investigar a influência da variação de pH e de concentração nas interações entre proteínas em solução. Para tanto, utilizamos dois fármacos fenotiazínicos, (Trifluoperazina, TFP e a Clorpromazina, CPZ), em presença de L--fosfatidilcolina (LPC), um surfactante zwiteriônico (30 mM), a pH 4.0 e 7.0. Os resultados de SAXS indicam que a micela de LPC, em ausência de fenotiazina, pode ser representada por uma micela com forma elipsoidal (com razão axial 1.6 0.1). No entanto, em presença de TFP e de CPZ a forma da micela se altera, passando para um cilindro (com razão axial 2.5 0.1). Este efeito é acompanhado por uma diminuição do raio parafínico da micela (22.5 0.3 Å), em ausência de fármaco, para 20.0 0.5 em presença de 10 mM de fármaco. Em paralelo, realizamos medidas de EPR (Ressonância Paramagnética eletrônica) destes sistemas. Combinando os resultados de SAXS e de EPR, propusemos um sítio para a localização destes compostos nas micelas de LPC, que seria na interface polar/apolar da mesma. Em um segundo momento, utilizamos as técnicas de SAXS e de EPR para investigar as características estruturais dos agregados formados por TFP e CPZ (a 20 e 60 mM, a pH 4.0 e 7.0). As curvas de SAXS são compatíveis com o espalhamento de agregados pequenos com diferentes geometrias: elipsoidal, cilíndrico e tipo-paralelepípedo. Devido à resolução da técnica, dentro do intervalo de vetores de espalhamento utilizada (até cerca de 0.3 Å-1), não é possível determinar, de forma absoluta, a correta geometria dos agregados, ou seja, todas as geometrias citadas acima ajustam de forma satisfatória as curvas de SAXS. As análises dessas curvas também não excluem a possibilidade de que estes fármacos mantenham-se como nano-cristais em solução (compostos por cerca de 10 celas unitárias, empilhadas na direção-z), seguindo sua estrutura cristalográfica. Medidas de EPR indicam que os auto-agregados a pH 4.0 possuem características semelhantes às micelas, mas a pH 6.5 este efeito não foi evidenciado, uma vez que ocorre uma forte interação entre a sonda e os agregados. Este fato indica que os agregados, a pH 6.5, têm um maior empacotamento, em comparação aos sistemas a pH 4.0. Por fim, utilizamos a Albumina de Soro Bovina (BSA, a 10 50 mg/ml), em diferentes pHs (2.0 9.0), para investigar os efeitos de concentração e de pH nos potenciais de interação das macromoléculas em solução. O fator de forma da proteína foi obtido através da estrutura cristalográfica da HSA (Human Serum Albumine, proteína humana homóloga a BSA), enquanto que as interações proteína-proteína foram calculadas através da relação de fechamento RPA (Random Phase Approximation). Nossos dados indicam que a BSA mantém sua estrutura terciária inalterada de pH 4.0 a 9.0, independente de sua concentração. No entanto, a pH 2.0 a proteína sofre um processo de desenovelamento, indicado pelo aumento da dimensão máxima da mesma. Nossos dados dão suporte para concluir que as interações entre as proteínas, a 10 mg/ml, são praticamente desprezíveis, exceto para os sistemas compostos a pH 2.0 (onde a proteína está desenovelada) e a pH 4.0 (onde evidenciamos a presença de interferência atrativa entre as proteínas). Entretanto, a medida em que aumentamos a concentração proteica, uma função de interferência do tipo repulsiva aparece na curvas de SAXS (para os sistemas de pH 4.0 a 9.0). Além disso, no sistema composto por BSA, pH 5.4 e 50 mg/ml, evidenciamos a existência de monômeros e dímeros em solução, provavelmente devido a proximidade do ponto isoelétrico da proteína (entre 4.8 5.6). Este efeito não foi evidenciado para os outros pHs, nesta mesma concentração. A pH 2.0 (25 e 50 mg/ml) evidenciamos uma compactação da proteína, sendo que sua forma é diferente da forma nativa da BSA. Nestas condições, é possível que a proteína tenha alcançado um estado molten globule, como evidenciado em outros trabalhos. Acreditamos que os efeitos de volume excluído são de grande importância para a estabilidade da proteína in vivo. / In this work we study, mainly by means of small angle X-ray scattering (SAXS), the influence of two phenothiazine derivatives on biomimetic systems as well as the self-assembly features. At the same time, the conformational stability of proteins in the presence of denaturant agents (pH and concentration) was evaluated. First of all, the phenothiazine compounds trifluoperazine (TFP) and chlorpromazine (CPZ) with micelles of the zwitterionic surfactant L--lysophosphatidylcholine (LPC), at pHs 4.0 and 7.0, are reported. The SAXS results demonstrate that, upon addition of both phenothiazines, the LPC micelle of prolate ellipsoidal shape changes into a cylindrically shaped micelle, increasing its axial ratio from 1.6 0.1 (in the absence of drug) to 2.5 0.1 (for 5 and 10 mM of phenothiazine). Such an effect is accompanied by a shrinking of the paraffinic shortest semiaxis from 22.5 0.3 to 20.0 0.5 Å. Besides, EPR (Electronic Paramagnetic Resonance) evidenced a bigger motion immobilization of the nitroxe probe, in the presence of phenothiazines. Our results provide evidence that the positively charged phenothiazine molecule must be accommodated near the hydrophobic/hydrophilic inner micellar interface. Furthermore, SAXS and EPR experiments were carried out to investigate the structure of the self-aggregates of CPZ and TFP, in aqueous solution. SAXS studies (drug solutions of 20 and 60 mM, at pH 4.0 and 7.0) evidenced that several different particle form factors with a homogeneous electron density distribution, in respect to the water environment, could reproduce the scattering curves. Due to the limitation of scattering intensity in the q range above 0.15 Å-1, precise determination of the aggregate shape was not possible and all of the tested models for ellipsoids, cylinders, or parallelepipeds fitted the experimental data equally well. The SAXS data allows inferring, however, that CPZ molecules might self-assemble in a basis set of an orthorhombic cell, remaining as nanocrystallites in solution. Such nanocrystals are composed of a small number of unit cells (up to 10, in c-direction), with CPZ aggregation numbers of 60-80. EPR spectra of 5- and 16-doxyl stearic acids bound to the aggregates were also performed, indicating a micelle-like aggregate at pH 4.0, and a significant motional restriction of the nitroxide was observed at pH 6.5. This implies that the aggregate is densely packed at this pH and that the nitroxide is tightly bound to it producing a strongly immobilized EPR spectrum. Finally, the effect of concentration and pH on the protein-protein interactions of BSA (Bovine Serum Albumin, from 10 up to 50 mg/ml) was evaluated by SAXS. Our results give support to infer that BSA keeps its native shape (similar to the Human Serum Albumin, HSA, crystallographic structure) unaltered at middle-acid (pH 4.0) up to basic pHs (9.0). At pH 2.0, however, BSA undergoes an unfolding process, indicated by a non globular shape. The protein-protein interactions were analysed into the Random Phase Approximation. The results show that at smaller amounts of BSA (10 mg/ml) the interference effects are not significative over the SAXS curve for pH 5.4 up to 9.0. At pH 4.0 and 10 mg/ml, however, an attractive potential takes place over the SAXS curves, that becomes repulsive with increasing BSA concentration. Besides, at pH 5.4 and 50 mg/ml, we evidenced a dimer-monomer co-existence in the solution. At pH 2.0 and 25 and 50 mg/ml, BSA undergoes to a compact conformation. Probably, BSA is in a molten globule state. Our results give also support to infer that probably, the exclude volume effect plays an important role on the protein stability in vivo.

A capacidade de prever a estrutura nativa de uma proteína é um problema ainda sem solução. A predição da estrutura final ou nativa de uma proteína -, ou seja, partir da estrutura primária (sequência de aminoácidos linear) de um polipeptídeo tentar prever qual será a estrutura terciária (arranjo de hélices alfa, folhas beta e grampos) - tem sido um desafio para diversos pesquisadores desde o século passado. Atualmente existem diversos modelos que se propõem a executar essa tarefa, mas poucos que de fato partem de princípios físicos básicos para realizá-la. A grande maioria baseia-se em estruturas já conhecidas de proteínas com sequenciamento ou função similares para prever a estrutura terciária. Neste trabalho, no entanto, propõe-se o desenvolvimento de um campo de forças coarse-grained para aplicação em simulações de dinâmica molecular a fim de prever a estrutura de proteínas sem que seja necessária a comparação com estruturas já conhecidas. O fator de forma é um importante indicativo da estrutura de uma molécula em solução. Apesar de se tratar de uma grandeza que fornece informações de baixa resolução, ou seja, não fornece pormenores a respeito da posição dos átomos na estrutura da molécula, é uma estimativa inicial do espaço ocupado pela molécula e também da maneira com a qual ela interage com outras moléculas em solução. Isso é decorrente das operações matemáticas necessárias para que o fator de forma seja acessado a partir de dados de experimentos de espalhamento de raios X. Os resultados mostram que o método consegue prever uma estrutura condizente com os dados de espalhamento de raios X das estruturas cristalográficas e com os dados experimentais utilizados. / The prediction of the final structure of a protein (also called native structure) has been addressed by many research groups since the last century. This problem can be understood as how to predict the tertiary structure that a protein molecule assumes after the folding process from just the primary structure (the sequence of amino acids). Nowadays there are several models aiming at solving this problem, but very few of them are based on physical principles. Most of these models are template-based ones that search for similar amino acids sequences or analogous biological functions to predict the native structure. In the present work, however, we propose the development of a force field predict the form factor of proteins that does not entail the knowledge of any other model or template to do so. The form factor is an important aspect of the structure of a molecule in solution. Despite being a low-resolution method of analysis, in the sense that it does not provide details about the exact positions of the atoms inside the molecular structure (because of the mathematical operations needed to retrieve informations from the scattering data), it is an initial estimative of the volume occupied by this molecule and also a good initial path for uncovering how these molecules interact to each other in solution. The results show that the method presented here can predict a structure that agrees with the scattering data of the crystallographic structure and with available experimental data of x-ray scattering of proteins in solution.

Este trabalho consistiu em uma investigação sobre a utilização da sílica mesoporosa ordenada tipo SBA-15 como veículo para a incorporação, proteção, transporte e liberação de substâncias biológicas de interesse imunológico e/ou terapêutico. Estudos preliminares incluíram experimentos para estudar o recobrimento da sílica SBA -15 com o polímero Eudragit® e a estabilidade dessa sílica tanto em meios experimentais (água e solução PBS) quanto em meios corporais rnimetizados. Ambos esses estudos demonstraram que as propriedades da SBA-15 e do Eudragit possibilitariam o prosseguimento do trabalho. Os experimentos iniciais de liberação foram feitos principalmente com albumina bovina (BSA), e demonstraram a capacidade da sílica de incorporar, em sua estrutura, as diversas moléculas utilizadas, bem como a influência do Eudragit sobre a dinâmica de liberação, sobretudo em meio ácido. Também foi explorada a incorporação de compostos à SBA-15 sob pressão, tanto in-situ quanto ex-situ. As intensidades relativas dos picos de difração mostraram ser sensíveis à exerção de pressão sobre a amostra, especialmente no que se referiu à incorporação de insulina. Os experimentos in-si tu durante a incorporação e liberação de insulina ajudaram a elucidar a dinâmica desses fenômenos, através da adaptação do modelo teórico, originalmente utilizado em estudos sobre a síntese da SBA-15. Nesse modelo, parâmetros de ajuste foram monitorados durante o experimento e a partir da sua evolução conclusões puderam ser traçadas. A instrumentação necessária para os experimentos in-situ foi desenvolvida, e fica aqui documentada para referências futuras em experimentos envolvendo soluções expostas ao feixe de raios X, especialmente no equipamento Nanostar, onde o arranjo foi originalmente implementado. Os procedimentos de análise, incluindo o modelo teórico, também ficam à disposição para que estudos futuros possam ser executados. A introdução teórica (Cap. 2), complementada pelos apêndices C e B, fica como resumo da teoria e da técnica para os interessados, que podem ainda consultar a literatura para maiores detalhes. / This work consisted of an investigation on the use of SBA-15-type ordered mesoporous sílica as a vehicle for incorporation, protection, transport and release of biological substances for ímmunologic and/or terapeutic processes. Preliminary studies included experiments regarding the coating ofthe SBA-15 sílica with the Eudragit® polymer and the stability of SBA-15 in experimental media (water and PBS solution) and in simulated body fluids. Both studies demonstrated that the properties o f SBA -15 and Eudragit allowed for continuation o f the work. The initial experiments were performed mainly with bovine serum a1bumin (BSA), and showed the silica\'s capacity of incorporating, in its structure, the various molecules, as well as the influence of Eudragit on the release dynamics. Also, the íncorporation of molecules into SBA-15 under pressure, both in-situ and ex-situ, was explored. The relative intensities of the diffraction peaks were found to be susceptible to the pressure exerted on the sample, especially regarding insulin. In-situ experiments made during the incorporation and release o f insulin helped elucidate the dynamics of those phenomena, through the adaptation of the theoretical model, which was or~ginally desinged to study the synthesis process of the sílica. In this model, fit parameters were monitored during the experiment and from their behavior some conclusions were drawn. The necessary instrumentation for the in-situ experiments was developed, and is documented for future referene in experiments involving the exposure of solutions ro X-rays, especially in the Nanostar, where it was originally designed. The analysis procedures, including the theoretical model, are also available for future studies. The theoretical introduction (Chap. 2), together with appendices B and Ç, is left for those interested in the theory and technique, who are also referred to the literature for further details.

A proteína tirosina fosfatase eta de rato (rPTPeta), é uma RPTP transmembranar do tipo classe I. A rPTP eta e seu homólogo DEP-1 provenientes, respectivamente, de ratos e de humanos, estão inibidas em células neoplásicas. Este fenótipo maligno é revertido após reconstituição exógena, o que sugere que a capacidade restauradora da rPTP eta pode ser uma ferramenta importante na terapia de alguns tipos de câncer. Portanto, o objetivo deste projeto incluiu o estudo molecular, biofísico e estrutural do domínio catalítico da rPTPeta (rPTPetaDC). Para isso, sub-clonamos no vetor pET-28a(+) o inserto que codifica para a região C-terminal da rPTPeta . Em seguida, bactérias E. coli da linhagem BL21 (DE3) foram transformadas com o plasmídeo e a proteína recombinante expressada e purificada. A His6-rPTPetaDC purificada teve a cauda de histidina subseqüentemente removida por digestão com trombina. O ponto isoelétrico de 7,3 da proteína de 41kDa foi medido experimentalmente e a sua funcionalidade acessada pelo ensaio de hidrólise do pNPP. A enzima apresentou uma atividade específica de 9nmol/min/microg a qual é compatível com as atividades específicas descritas para as RPTPu, RPTPalfa, PTPB1 e SHP2. A estrutura secundária e a estabilidade da rPTPetaDC recombinante foi analisada por dicroísmo circular e espectroscopia de fluorescência. A rPTPetaDC mostrou-se estável a 18 graus Celsius e propriamente enovelada (Santos, et al., Prot. Expr. Purif., 2005. Anexo A). A proteína foi, em seguida, submetida a diferentes condições de cristalização e a estudos estruturais em solução. Nas condições de 0,1M de MES, pH 6,5 e 20% PEG 10000 cresceram cristais que difrataram na resolução de 1,87Å. Os cristais pertencem ao grupo espacial P2(1)2(1)2(1) com parâmetros de célula unitária: a=46,46; b=63,07; c=111,64 Å, e com uma única molécula por unidade assimétrica (Matozo, et al., Acta crystallogr. F, 2006. Anexo B). A estrutura da rPTPetaDC, em solução, foi analisada usando-se a técnica de SAXS e medidas de anisotropia de fluorescência. Os dados de SAXS mostraram que a proteína, forma dímeros alongados, com Rg de 2,65nm e Dmax de 8,5nm. A conformação da rPTPetaDC analisada por modelos de homologia sugere que seu dímero está mais próxima da estrutura cristalográfica dimérica da RPTPalfa-D1. Alem disso, a caracterização da rPTPetaDC por anisotropia de fluorescência demonstrou que o Kd do dímero da rPTPetaDC é de 21,6 + 2,0uM e a variação da energia livre de Gibbs dímero-monômero é de 7,2kcal/mol (Mtozo, et al., Biophys. J., 2007. Anexo C ). / The rat protein tyrosine phosphatase eta, rPTPeta, is a transmembrane RPTP, with an intracellular portion composed of a unique catalytic region. The rPTPeta and the human homolog DEP-1 are down-regulated in rat and human neoplastic cells, respectively. However, the malignant phenotype is reverted after exogenous reconstitution of rPTPeta, suggesting that its function restoration could be an important tool for gene therapy of several types of cancer. Therefore, the objective of our project aimed on the molecular, biophysical and structural study of the catalytic domain of rPTPeta, rPTPetaDC. We began our study cloning the rPTPetaDC into PET28a(+) vector, followed by its expression in Escherichia coli, and purification. The His6-tag from the rPTPetaDC purified was subsequently removed by thrombin digestion. PhastGel IEF electrophoresis demonstrated that the isoelectric point of the 41kDa was 7.3. To assess the functionality of the rPTPetaDC we used the pNPP hydrolysis assay and observed that the enzyme has a specific activity of 9nmol/min/ug. The experimentally determined rPTPetaDC specific activity showed to be in the same range as the previously reported activities for RPTPu, RPTPalfa, PTPB1 and SHP2. The secondary structure and stability of the recombinant protein was analyzed by circular dichroism and fluorescence spectroscopy. The results demonstrated that rPTPetaDC was stable at 18 Celsius and properly folded (Santos, et al., Prot. Expr. Purif., 2005. In attachment A). Then, the purified protein was submitted to different crystallization conditions and structural studies in solution. Crystals appeared at 0.1M MES, pH 6.5 and 20% PEG 10,000 and diffracted with resolution of 1.87Å. The crystals belong to spatial group P2(1)2(1)2(1) with unit cell parameters of a=46.46, b=63.07, c=111.64Å and contained one molecule for asymmetric unit (Matozo, et al., Acta crystallog. F, 2006. In attachment B). Also, the structural of rPTPetaDC, in solution, was analyzed by SAXS and fluorescence anisotropy. SAXS data showed that the protein forms elongated dimers in solution with an Rg of 2.65nm and a Dmax of 8.5nm. The rPTPetaDC conformation in solution, studied by homology models, suggested that the rPTPetaDC dimer architecture is more closely related to the crystal structure of RPTPalfa-D1. The characterization of rPTPetaDC by fluorescence anisotropy measurements demonstrated that the Kd of the dimer is 21.6 + 2.0uM and the energy Gibbs dimer-monomer is equal to 7.2kcal/mol (Matozo, et al., Bioph. J., 2007. In attachment C).

A parede das plantas é formada por uma matriz composta principalmente por celulose, hemicelulose e lignina. Celulose é o principal polissacarídeo das paredes das plantas, apresentando alta cristalinidade e recalcitrância. Xiloglucano (XyG) é um polissacarídeo complexo envolvido no controle da expansão celular e na biossíntese de componentes da parede celular vegetal. Uma complexa rede entre XyG e celulose é mediada por ligações de hidrogênio. A eficiente hidrólise de XyG e celulose é uma estratégia promissora na desconstrução da biomassa lignocelulósica pela ação orquestrada de CAZymes. Aqui são descritas as caracterizações funcional e estrutural de três novas enzimas das hidrolase de glicosídeos das famílias 9 (BlCel9), 48 (BlCel48) e 74 (XcGH74). XcGH74 é uma xiloglucanase de Xanthomonas campestris altamente específica para XyG. Durante a hidrólise do XyG por XcGH74 XX e XG são os produtos finais. A estrutura cristalográfica dessa enzima foi resolvida e as razões moleculares para sua alta permissibilidade no reconhecimento de XyG analisadas. Os resultados sugerem que XcGH74 cliva XyG preferencialmente entre motivos X–X; no entanto, não hidrolisa entre os motivos L–L, onde uma substituição da cadeia lateral é um pré-requisito para o reconhecimento do substrato. BlCel9 e BlCel48 são celulases de Bacillus licheniformis. BlCel48 é cataliticamente estável em uma ampla gama de temperaturas e pHs exibindo atividade em celulose inchada com ácido fosfórico (PASC) e celulose bacteriana (BC). BlCel48 libera predominantemente celobiose, e também pequenas quantidades de celotriose, celotetraose como produtos do PASC e tem processividade aparente 4,6 vezes maior em BC do que em PASC. Análises de espalhamento de raios X a baixo ângulo (SAXS) mostraram que essa enzima é globular e monomérica em solução. A estrutura cristalográfica de BlCel48 foi resolvida na presença de ligantes nas posições -5 a -2 e +1 a +2 no sítio catalítico. A especificidade no reconhecimento de celo-oligossacarídeo foi investigada por cromatografia de troca aniônica de alto desempenho (HPLC-PAD), cristalografia de proteínas e análise de acoplamento estatístico, mostrando que esta enzima possui endo iniciação durante a hidrólise de PASC. BlCel9 é uma endoglucanase que exibe eficiência catalítica máxima em pH 7,0 e 60 °C. Tem maior atividade em PASC, seguida por BC e, em menor grau, carboximetilcelulose (CMC). A análise por HPAEC-PAD dos produtos hidrolíticos demonstrou que o produto final da hidrólise é principalmente celobiose. Análises de dados cristalografia de raios X e SAXS mostraram que essa enzima é monomérica em solução, conforme estimado a partir dos dados do SAXS. Tem uma forma alongada composta por um módulo de ligação à carboidratos (CBM3c) N-terminal ligado ao domínio catalítico (GH9) C-terminal por um linker de 20 aminoácidos. Os domínios estão intimamente justapostos em uma conformação estendida e formam uma estrutura relativamente rígida em solução, indicando que as interações entre os domínios catalíticos e CBM3c desta enzima têm um papel cooperativo no reconhecimento da celulose. Juntos, esses resultados lançam alguma luz sobre a relação entre estrutura e função das hidrolases glicosídicas das famílias 9, 48 e 74. / Plant cell walls form a matrix composed mainly of cellulose, hemicellulose, and lignin. Cellulose is the main polysaccharide of the plant cell walls with high crystallinity and recalcitrance. Xyloglucan (XyG) is a complex polysaccharide involved in the control of cell expansion and biosynthesis of cell walls components. A complex crosslink between XyG and cellulose is mediated by H-bonds. An efficient hydrolysis of XyG and cellulose is a promising strategy to achieve an effective lignocellulosic biomass deconstruction by orchestrated action of CAZymes. Here are described the functional and structural characterization of three novel enzymes belonging to glycoside hydrolase families 9 (BlCel9), 48 (BlCel48) and 74 (XcGH74). XcGH74 is a highly specific xyloglucanase from Xanthomonas campestris . During the XyG hydrolysis, XX and XG are its end products. We also solved the structure of this enzyme and analyzed molecular reasons for its high permissibility in XyG recognition. These results suggest that the XcGH74 is able to cleave XyG preferentially between X-X motifs; however, it is unable to hydrolyze the polysaccharide between L-L motifs where a side-chain substitution is a prerequisite to improved substrate recognition. The BlCel9 and BlCel48 are cellulases from Bacillus licheniformis. BlCel48 is catalytically stable in a broad range of temperatures and pH conditions, exhibiting hydrolytic activity against phosphoric acid swollen cellulose (PASC) and bacterial cellulose (BC). BlCel48 releases predominantly cellobiose, and also small amounts of cellotriose and cello-tetraose as products from PASC with apparent processivity 4.6-times greater performance on BC than on PASC. Small-angle X-ray scattering (SAXS) data analysis revealed a globular molecular shape and monomeric state in solution. The crystal structure of BlCel48 was solved and used in presence of ligands spanning -5 to -2 and +1 to +2 subsites into the catalytic site. The specificity of the recognition of the cello-oligosaccharide was investigated by high-performance anion exchange chromatography (HPLC-PAD), protein crystallography, and statistical coupling analysis, which showed that this enzyme has an endo-like initiation on PASC. BlCel9 is a processive endoglucanase exhibiting maximum catalytic efficiency at pH 7.0 and 60 °C, exhibiting highest hydrolytic activity against PASC, followed by BC, and to a lesser extent carboxymethyl-cellulose (CMC). The HPAEC-PAD analysis of the hydrolytic products demonstrated that the end product of the enzymatic hydrolysis is primarily cellobiose. SAXS and X-ray crystallographic data analyses revealed that this enzyme adopts a monomeric state in solution, as estimated from SAXS data; has an elongated shape composed of an N-terminal family 3 carbohydrate-binding module (CBM3c) and a C-terminal GH9 catalytic domain joined together by 20 amino acid residue long linker peptides. The domains are closely juxtaposed in an extended conformation and form a relatively rigid structure in solution, indicating that the interactions between the CBM3c and GH9 catalytic domains might play a key role in cooperative cellulose recognition. Together, these results shed some light on the structure-function relationship of glycoside hydrolases from families 9, 48 and 74.