L’hypertension artérielle est le facteur de risque le plus important dans les maladies cardiovasculaires (MCV) et les accidents vasculaires cérébraux (AVC). L’hypertension artérielle essentielle est une maladie complexe, multifactorielle et polygénique. Même si on a identifié de nombreux facteurs de risque de l’hypertension artérielle, on ne comprend pas encore clairement les mécanismes qui la régissent. Les kinases hépatocytes produisant l’érythropoïétine (Eph) constituent la plus grande famille des récepteurs tyrosine kinase qui se lient à des ligands de surface cellulaire appelés éphrines sur les cellules avoisinantes. On sait que les interactions de Eph et des éphrines sont essentielles aussi bien dans les processus de développement que dans le fonctionnement des organes et des tissus adultes. Cependant on n’a pas encore étudié la relation entre Eph/éphrines et l’hypertension artérielle. Nous avons créé des modèles de souris knockout (K.O.) Ephb6-/-, Efnb1-/- et Efnb3-/- pour cette étude. Dans le modèle EphB6-/-, nous avons observé que les souris K.O. Ephb6 castrées, mais pas les femelles, ainsi que les souris mâles non castrées présentaient une tension artérielle élevée (TA) par rapport à leurs homologues de type sauvage (TS). Ceci suggère que Ephb6 doit agir de concert avec l’hormone sexuelle mâle pour réguler la TA. Les petites artères des mâles castrés Ephb6-/- présentaient une augmentation de la contractilité, une activation de RhoA et une phosphorylation constitutive de la chaîne légère de la myosine (CLM) lorsque comparées à celles de leurs homologues TS. Ces deux derniers résultats indiquent que la phosphorylation de CLM et de RhoA passe par la voie de signalisation de Ephb6 dans les cellules du muscle lisse de la paroi vasculaire (CMLV). Nous avons démontré que la réticulation de Efnbs mais non celle de Ephb6 aboutit à une réduction de la contractilité des CMLV. Ceci montre que l’effet de Ephb6 passe par la signalisation inversée à travers Efnb. Dans le modèle Efnb1-/- conditionnel spécifique au muscle lisse, nous n’avons observé aucune différence entre Efnb1-/- et les souris de TS concernant la mesure de la TA dans des conditions normales. Cependant, la TA des souris K.O. Efnb1 lors d’un stress d’immobilisation est supérieure à celle des souris de TS. Dans les petites artères des souris K.O. Efnb1, le rétrécissement et la phosphorylation de CLM étaient élevés. In vitro, la contractilité et l’activation RhoA de la CMLV des souris TS étaient augmentées quand leur Efnb1 était réticulé. Ces résultats corroborent ceux des souris KO Ephb6 et prouvent que l’effet de Ephb6 dans le contrôle de la TA se produit au moins par l’intermédiaire d’un de ses ligands Efnb1 dans les CMLV. Dans le modèle Efnb3-/-, on a observé une augmentation de la TA et du rétrécissement des vaisseaux chez les femelles Efnb3-/-, mais non chez les mâles; l’échographie a aussi révélé une résistance accrue au débit sanguin des souris K.O. femelles. Cependant la mutation de Efnb3 ne modifie pas la phosphorylation de la CLM ou l’activation de RhoA in vivo. Dans l’expérience in vitro, les CMLV des souris femelles Efnb3-/- ont présenté une augmentation de la contractilité mais pas celle des souris mâles Efnb3-/-. La réticulation des CMLV chez les mâles ou les femelles de TS avec solide anti-Efnb3 Ab peut réduire leur contractilité. Notre étude est la première à évaluer le rôle de Eph/éphrines dans la régulation de la TA. Elle montre que les signalisations Eph/éphrines sont impliquées dans le contrôle de la TA. La signalisation inverse est principalement responsable du phénotype élevé de la TA. Bien que les Efnb1, Efnb3 appartiennent à la même famille, leur fonction et leur efficacité dans la régulation de la TA pourraient être différentes. La découverte de Eph/Efnb nous permet d’explorer plus avant les mécanismes qui gouvernent la TA. / Hypertension is the most important risk factor for the cardiovascular diseases (CVD) and strokes. The essential hypertension is a complex, multifactorial and polygenic disease. Although many hypertension risk factors have been identified, the comprehensive understanding of mechanisms remains elusive. Erythropoietin-producing hepatocyte kinases (Ephs) are the largest family of receptor tyrosine kinases, which bind to cell surface ligands called ephrins on neighboring cells. Eph and ephrin interactions are known to be essential in developmental processes, as well as in functions of adult organs and tissues. However the relationship between Ephs/ephrins and hypertension has not been studied. Ephb6-/-, Efnb1-/- and Efnb3-/-knockout mice models were established for this study. In the EphB6-/- model, we observed that the castrated Ephb6 KO mice but not female or uncastrated male mice presented heightened blood pressure (BP) compared to the wild type (WT) counterparts. This suggests that Ephb6 needs to act in concert with sex hormone to regulate blood pressure. Small arteries from castrated Ephb6-/- males showed increased contractility, RhoA activation and constitutive myosin light chain (MLC) phosphorylation compared to their WT counterparts. The latter two findings indicate that RhoA and MLC phosphorylation are in the signaling pathway of Ephb6 in vascular smooth muscle cell (VSMC). We demonstrated that, crosslinking of Efnbs but not Ephb6 resulted in reduced VSMC contractility. This indicates that the effect of Ephb6 is via reverse signaling through Efnbs. In smooth muscle-specific conditional Efnb1-/- model, no difference was observed between Efnb1-/- and WT mice in BP measurement under a normal condition. However, the BP of Efnb1 KO mice during immobilization stress were higher than that of WT mice. In the small arteries from Efnb1 KO mice, the constriction and MLC phosphorylation were elevated. In vitro, the contractility and RhoA activation of WT VSMC were augmented when their Efnb1 was crosslinked. These results corroborate the findings from Ephb6 KO mice, and prove that the effect of Ephb6 in BP control is at least via one of its ligand Efnb1 in VSMC. In the Efnb3-/- model the heightened BP and increased vessel constriction were observed in Efnb3-/-females but not males; the echography also revealed the increased blood flow resistance of female KO mice. However the mutation of Efnb3 doesn’t alter the MLC phosphorylation or RhoA activation in vivo. In in vitro experiment, VSMCs from Efnb3-/- female mice showed increased contractility but did not Efnb3-/- male mice. Crosslinking of VSMCs from WT males or females with solid anti-Efnb3 Ab can reduce their contractility. Our study is the first to assess the role of Eph/ephrins in BP regulation. Eph/ephrins signalings are involved in the regulation of BP. The reverse signaling is mainly responsible for the elevated BP phenotype. Although the Efnb1, Efnb3 belongs to the same family, their function and effectiveness in the regulation of BP might be different. The discovery of Eph/Efnbs allows us to further explore the mechanism in BP.

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Thesis (Ph. D.)--University of Virginia, 2007. / Title from title page. Includes bibliographical references. Also available online through Digital Dissertations.

Le gène Notch3 code pour un récepteur transmembranaire hétérodimérique exprimé principalement dans les cellules musculaires lisses des petites artères. Les travaux de ces dernières années ont montré que le récepteur Notch3 joue un rôle clé dans la physiologie et la pathologie des petites artères. Chez la souris, Notch3 est requis pour l’intégrité structurale et fonctionnelle des artères de résistance en contrôlant l’identité artérielle, la maturation postnatale des cellules musculaires lisses et le tonus myogénique des artères de résistance. Chez l’Homme, les maladies des petites artères cérébrales (MPAC) regroupent un ensemble hétérogène de maladies parmi lesquelles un petit pourcentage, probablement encore sous-estimée, est héréditaire. A ce jour, très peu de gènes responsables de formes familiales de MPAC ont été identifiés. CADASIL est la forme familiale la plus fréquente de MPAC causée par des mutations du gène NOTCH3. Il s’agit de mutations extrêmement stéréotypées siégeant dans les répétitions EGF qui constituent le domaine extracellulaire de Notch3. Les résultats du laboratoire suggèrent fortement que l’effet pathogène de ces mutations résulte de l’acquisition par le récepteur muté d’une nouvelle fonction. Les deux objectifs de ce travail ont été : 1°) Tester l’hypothèse qu’il existe des maladies des petites artères cérébrales causées directement par une modification de l’activité du récepteur Notch3 2°) Identifier les effecteurs du récepteur Notch3 dans le contexte du développement et de la maturation des artères cérébrales Nous avons identifié chez une patiente présentant une MPAC distincte de CADASIL une nouvelle mutation siégeant dans le domaine d’hétérodimérisation du récepteur Notch3. In vitro, la mutation L1515P induit une activation ligand indépendante du récepteur Notch3. L’analyse biochimique suggère que cette activation est causée par une déstabilisation du domaine d’hétérodimérisation de Notch3.Nous avons réalisé une analyse du transcriptome des artères caudales de souris Notch3-/- et Notch3+/+. Cette analyse a permis d’identifier un groupe de 17 gènes régulés par Notch3 dans l’artère caudale ou les artères cérébrales. L’invalidation du facteur de transcription CSL/RBPJK dans les cellules musculaires lisses, pendant la période postnatale immédiate, phénocopie les altérations structurales et moléculaires observées chez les souris Notch3-/-. L’administration chez la souris d’un inhibiteur pharmacologique de la voie Notch a permis d’identifier 6 gènes (Grip2, Nrip2, Kv1.5, Pgam2, Susd5, Xirp1), en plus de Notch3, dont l’expression dans les artères cérébrales est rapidement diminuée par ce traitement. Nous avons ensuite concentré nos efforts sur le gène Grip2 dont l’expression était la plus fortement diminuée dans les différents modèles d’inactivation de la voie Notch. Grip2 était jusqu’alors connu pour son interaction avec les récepteurs au glutamate dans les neurones. Nous avons montré que Grip2 était également exprimé dans les cellules musculaires lisses vasculaires et identifié une isoforme vasculaire régulée spécifiquement par Notch3/CSL/RBPJK. L’analyse des souris Grip2neo/neo, exprimant une protéine Grip2 tronquée dans sa partie N-terminale, a révélé une atteinte sélective du tonus myogénique des artères cérébrales.En conclusion, nous avons démontré l’existence d’une mutation activatrice de NOTCH3 associée à une MPAC chez l’Homme. Nos résultats indiquent que dans le contexte de la maturation des artères cérébrales, la fonction de Notch3 est médiée par le facteur de transcription CSL/RBPJK dans les cellules musculaires lisses durant la période postnatale immédiate. Nous avons identifié plusieurs nouveaux effecteurs potentiels de Notch3 et validé l’un d’entre eux, Grip2, pour son implication dans les réponses myogéniques des artères cérébrales. Nous proposons que des mutations dans les gènes codant pour ces effecteurs puissent rendre compte de certaines formes monogéniques de MPAC. / Notch3 encodes a transmembrane receptor primarily expressed in arterial smooth muscle cells. Human and mouse genetics studies demonstrated that Notch3 is a key player in physiology and diseases of small vessels. Studies in mice revealed that Notch3 is required to generate functional arteries in regulating arterial differentiation, maturation of vascular smooth muscle cells and myogenic tone. Cerebral Autosomal Dominant Arteriopathy with Subcortical infarcts and Leukoencephalopathy (CADASIL) is the most frequent hereditary small vessels disease in human adults caused by NOTCH3 mutations. Pathogenic mutations lead to an odd number of cysteine residues within the NOTCH3 extracellular domain. Data from the laboratory suggest a model that invokes novel pathogenic roles from the mutant NOTCH3 protein. The main goals of this work are: 1°) To determine if there is small vessels disease caused by modification of Notch3 activity 2°) To identify Notch3 effectors involved in development and maturation of cerebral arteries We identified a novel heterozygous missense mutation (L1515P) in the heterodimerization domain of NOTCH3 in a patient with cerebral small vessel distinct from CADASIL. In vitro analysis showed that the L1515P mutant exhibits increased canonical NOTCH3 signaling in a ligand-independent manner. Biochemical analysis suggests that the mutation renders NOTCH3 hyperactive through destabilization of the heterodimer. Transcriptome analysis using tail arteries of Notch3-/- and Notch3+/+ mice identified a core set of 17 novel Notch3-regulated genes confirmed in tail or brain arteries. Postnatal deletion of RBP-Jκ in smooth muscle cells recapitulated the structural, functional, and molecular defects of brain arteries induced by Notch3 deficiency. Transient in vivo blockade of the Notch pathway with γ-secretase inhibitors uncovered, in addition to Notch3, 6 immediate responders, including the voltage-gated potassium channel Kv1.5, which opposes to myogenic constriction of brain arteries, and the glutamate receptor-interacting protein-2, with no previously established role in the cerebrovasculature. We identified a vascular smooth muscle cell isoform of Grip2. We showed that Notch3-RBP-Jκ specifically regulates this isoform. Finally, we found that cerebral arteries of glutamate receptor-interacting protein-2 mutant mice, which express an N-terminally truncated glutamate receptor-interacting protein-2, exhibited selective attenuation of pressure-induced contraction. In conclusion, we have demonstrated the existence of a NOTCH3 activating mutation associated with small vessels disease in human. Our results show that, in the context of cerebral arteries maturation, Notch3 functions are mediated by CSL/RBPJK transcription factor. We have identified several new Notch3 effectors and validated Grip2 as a novel regulator of myogenic tone in cerebral arteries. One can expect that mutations in these Notch3-regulated genes could be responsible of some monogenic form of small vessel diseases of the brain.

L'angiodermite nécrotique ou "Hypertensive Leg Ulcer" (HLU) est un ulcère de jambe inflammatoire de traitement difficile, associé à une hypertension artérielle chronique. La douleur est très importante et nécessite l'utilisation de la morphine pour soulager les patients. Notre objectif était d'analyser les caractéristiques de l'inflammation et d'étudier son implication dans la physiopathologie de la nécrose cutanée. La peau inflammatoire est le siège d'un infiltrat composé de macrophages et de lymphocytes. L'épiderme et les cellules vasculaires lisses des microvaisseaux présentent des troubles de la différenciation et une importante prolifération. Nous observé une forte augmentation des transcrits de l'interleukine 1β (IL-1β), de l'IL-6 et de l'Oncostatin M (OSM), qui sont exprimées par les macrophages.Les kératinocytes humains in vitro et in vivo chez la souris montrent un phénotype semblable lorsqu'ils sont exposés à ces cytokines.Comparée à la peau inflammatoire et à la peau saine, la peau en périphérie de l'inflammation est douloureuse et présente des altérations histologiques intermédiaires. On observe une légère augmentation de l'expression des cytokines inflammatoires IL-1β et OSM. D'autre part, la consommation de morphine est associée au niveau d'expression de l'OSM et l'inflammation systémique reflète la douleur ressentie par le patient. Ces éléments sont en faveur d'une implication des cytokines inflammatoires IL-1β et OSM dans la physiopathologie de la douleur et de la nécrose dans l'HLU. Le cercle vicieux pourrait être bloqué par l'utilisation des biothérapies anticytokines, ce qui met en avant de nouvelles cibles thérapeutiques. / Hypertensive Leg Ulcer (HLU) is an inflammatory skin lesion associated to chronic high blood pressure. The ulcer is painful requiring morphine to relieve patients. Our objective was to analyze the characteristics of the inflammation and to study it’s implication in pathogenesis of skin necrosis. Inflammatory skin is infiltrated by macrophages and lymphocytes. Keratinocytes and vascular smooth muscle cells of microvessels display an alteration of differentiation and an important proliferation. We studied the expression of cytokines associated to skin inflammation and we observed a strong augmentation of the transcripts for the interleukin 1β (IL-1β), the IL-6 and the Oncostatin M (OSM); which are expressed by the macrophages. The reconstructed human epidermis in vitro exposed to these cytokines showed a similar phenotype of the histological studies in human. At least, injection of these cytokines to the mouse produces an inflammation and an alteration of the epidermis comparable to HLU.Compared to the inflammatory skin and to the healthy skin, the skin in periphery of the inflammation is painful and presents intermediate histological alterations. We observed a slight augmentation of the inflammatory cytokines IL-1β and OSM. On the other hand, the consumption of morphine is associated with the level of expression of the OSM and systemic inflammation reflects the pain felt by the patient.The present evidence indicates an involvement of inflammatory cytokines IL-1β and OSM in the pathogenesis of pain and skin necrosis in the HLU. The vicious circle may be blocked by the use of biotherapies against inflammatory cytokines, which highlights new therapeutic targets.

L’AMPc est un second messager exerçant un rôle vasculoprotecteur majeur, par ses effets relaxants et inhibiteurs de la prolifération et de la migration cellulaires. Les concentrations intracellulaires d’AMPc sont finement régulées par leur synthèse via les adénylates cyclases et leur dégradation par les phosphodiestérases (PDEs). Nous avons évalué l’impact de l’environnement cellulaire sur la voie de signalisation couplée au récepteur β-adrénergique (β-AR/AMPc/PDE) dans les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLVs), ainsi que les altérations potentielles de celle-ci en situation pathologique d’insuffisance cardiaque (IC).Notre première étude montre que dans les CMLs d’aorte de rat en culture, adoptant un phénotype synthétique, la voie de signalisation β-AR/AMPc/PDE est hautement modulée par la densité cellulaire Ainsi, une faible densité cellulaire est associée à une régulation négative de l’expression fonctionnelle du récepteur β1-AR, à une activité hydrolytique des PDEs-AMPc plus faible et à des concentrations d’AMPc intracellulaire plus élevées que celles observées dans des cellules confluentes.Notre deuxième étude montre que dans l’aorte de rat, l’IC est associée à une dysfonction endothéliale (DE), une hyperréactivité aux agents contractants et une altération de la fonction et de l’expression des PDEs-AMPc. Nos résultats suggèrent que l’altération de la voie du NO/GMPc suite à la DE conduit à une hyper-activation de la PDE3, qui masque la fonction de la PDE4 et altère la relaxation β-AR.L’ensemble de ce travail met en évidence le rôle critique de l'environnement cellulaire dans le contrôle de la voie β-AR/AMPc/PDE des CMLVsMots clés : Muscle lisse vasculaire, récepteur β-adrénergique, AMPc, phosphodiestérases, densité cellulaire, insuffisance cardiaque / CAMP is second messenger which plays a prominent vasculoprotective role by its relaxing effects and inhibition of cell proliferation and migration. Intracellular cAMP level is regulated by its synthesis by adenylate cyclase and its degradation by phosphodiesterases (PDEs). We evaluated the influence of cellular environment on signaling pathway coupled to β-adrenoceptors (β-AR/cAMP/PDE) on vascular smooth muscle cells (VSMCs), as well as potential alterations in heart failure (HF).The first study showed that in cultured rat aortic SMCs exhibiting synthetic phenotype, the β-AR/cAMP/PDE signaling pathway is highly modulated by the cellular density.Thus, the low density state being associated to a downregulation of the β1-AR, a lower cAMP-PDE activity and a higher basal [cAMP]i compared to confluent cells.Our second study showed that in rat aorta, HF is associated with endothelial dysfunction, hyper-reactivity to contractile agents and an alteration of function and expression of cAMP-PDEs. Our results suggest that NO/cGMP pathway alteration following the ED in HF leads to hyper-activation of PDE3 which masks PDE4 function and alters β-adrenoceptor relaxationThus, our works highlights the critical role of the cellular environment in controlling the vascular β-AR signaling.Keywords: Vascular smooth muscle, β-adrenoceptor, cAMP, phosphodiesterases, cellular density, heart failure.

The master’s thesis deals with the computational modelling of the mechanical testing of isolated smooth muscle cells. The main aims are to create computational model of a cell, to simulate single-axis tensile test and to modify the model so that the model reflects real mechanical response. The model of the cell includes cytoplasm, nucleus, cell membrane and cytoskeleton which is modelled as a tensegrite structure. On this model the tensile test was simulated in case of the cell with cytoskeleton and the cell with distributed the cytoskeleton. Force-elongation curves, which were obtained from this simulation, were compared with experimental data which were taken from literature. Tensile properties were measured on freshly isolated cells from rat thoracic aorta, cultured cells, and cells treated with cytochalasin D to disrupt their actin filaments. It was found that the cytoskeleton influence on the cell load in computational model was smaller than in the real cell. Therefore the model was modified by changing material propreties and geometry so that the model of the cell corresponded with the different types of experimentally measured cells.

Dans le contexte pathologique de l’athérosclérose, les cellules du muscle lisse vasculaire (CMLV) sont caractérisées par une prolifération et une migration accrue. La stimulation à l’Angiotensine II (Ang II) ou au facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) a tendance à promouvoir cette migration anormale. Cependant, ce phénomène seul n’est pas suffisant pour que les CMLV puissent migrer à travers le tissu environnant et envahir l’intima des vaisseaux sanguins. Les CMLV doivent alors dégrader la matrice extracellulaire et développer des structures nécessaires à l’invasion. Ce mouvement cellulaire est à l’origine d’une augmentation de la plaque athéromateuse responsable de nombreuses complications. Des données préliminaires ont montré que des facteurs de croissance ou hormones pouvaient induire l’invasion des CMLV. Dans notre laboratoire, il a été montré que les facteurs d’ADP-ribosylation (ARF) permettent la régulation du remodelage phénotypique des CMLV, et jouent un rôle dans la prolifération et la migration cellulaire. Au cours de cette étude, nous allons donc examiner le rôle de ARF6 dans la formation de structures importantes pour l’invasion et l’activation de métalloprotéinases de la matrice dans les CMLV humaines. En premier lieu, nous avons défini que la stimulation avec du PDGF ou de l’Ang II permet l’activation de la GTPase ARF6. En second lieu, nous avons mis en avant l’impact de la déplétion de ARF6 sur l’invasion cellulaire induite à la suite d’une stimulation avec le PDGF ou l’Ang II. Pour y parvenir, nous avons utilisé deux méthodes d’analyse de l’invasion, tout d’abord de la microscopie sur support gélatineux qui permet d’observer la dégradation de la matrice, ensuite des essais d’invasion sur du Matrigel dans des chambres de Boyden. Pour finir, nous avons voulu définir le mécanisme impliqué dans ce phénomène d’invasion cellulaire chez les CMLV humaines. En somme nous avons montré, l’importance d’ARF6 dans l’invasion induite par des facteurs de croissance ou hormone. Et nous avons soumis l’hypothèse que ce mécanisme passe par l’activation de la voie des MAPK ou PI3K. L’élucidation de ces mécanismes cellulaires pourrait avoir un intérêt quant à l’élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de l’athérosclérose. / In the pathological setting of atherosclerosis, vascular smooth muscle cells are characterized by an increased proliferation and migration. Stimulation of these cells with Angiotensin II (Ang II) or platelet-derived growth factor (PDGF) usually promotes this abnormal migration. However, this phenotype alone is not sufficient for VSMCs to migrate through surrounding tissues and infiltrate the blood vessels’ intima. VSMCs must also be able to degrade extracellular matrix components and acquire the cellular structures necessary for invasion. The migration of VSMCs to the intima is responsible for the growth of the atherosclerotic plaque which leads to numerous complications. Preliminary data has shown that growth factors and hormones can cause the invasive phenotype of VSMCs. Our group has demonstrated that the ADP-ribosylation factor (ARF) could regulate the phenotypic remodeling of VSMCs and, by extension, their proliferative and migrative capacities. During this study, we will examine the importance of ARF6 in the formation of important invasive cellular structures as well as matrix metalloproteinases activation in human VSMCs. First, we have discovered and defined the connection between agonist stimulation and the activation of the small GTPase ARF6. We have also studied the impact of ARF6 depletion on cellular invasion following PDGF or Ang II stimulation. We have accomplished this using two methods commonly employed to analyze cellular invasion: Gelatine-based matrix degradation assays analyzed by microscopy and invasion assays on Matrigel in Boyden chambers. Lastly, we have tried to uncover the mechanistic behind this invasive phenotype observed in human VSMCs. To summarize, we have demonstrated the importance of ARF6 in growth factors and hormone-induced cellular invasion and we have hypothesized that this activity is mediated by the activation of the MAPK or PI3K signaling pathways. The further characterization of these cellular mechanisms could lead to the discovery of novel therapeutic strategies in atherosclerosis.

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