Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

La tolérance immunitaire dépend de la distinction entre le soi et le non soi par le système immunitaire. Un bris dans la tolérance immunitaire mène à l'auto-immunité, qui peut provoquer la destruction des organes, des glandes, des articulations ou du système nerveux central. Le diabète auto-immun, également connu sous le nom diabète juvénile et diabète de type 1, résulte d'une attaque auto-immune sur les cellules β pancréatiques sécrétrices d’insuline, localisées au niveau des îlots de Langerhans du pancréas. Bien que le diabète auto-immun soit traitable par une combinaison d’injections quotidiennes d’insuline d’origine exogène, de régime et d'exercices, beaucoup de complications chroniques peuvent se manifester chez les patients, y compris, mais non limitées à, la cécité, les maladies cardiovasculaires, l’insuffisance rénale et l'amputation. En raison des nombreuses complications liées au diabète auto-immun à long terme, la recherche continue afin de mieux comprendre tous les facteurs impliqués dans la progression de la maladie dans le but de développer de nouvelles thérapies qui empêcheront, renverseront et/ou traiteront cette maladie. Un rôle primordial dans la génération et l'entretien de la tolérance immunitaire a été attribué au nombre et à la fonction des sous-populations de cellules régulatrices. Une de ces populations est constituée de cellules T CD4-CD8- (double négatives, DN), qui ont été étudiées chez la souris et l'humain pour leur contribution à la tolérance périphérique, à la prévention des maladies et pour leur potentiel associé à la thérapie cellulaire. En effet, les cellules de T DN sont d'intérêt thérapeutique parce qu'elles montrent un potentiel immunorégulateur antigène-spécifique dans divers cadres expérimentaux, y compris la prévention du diabète auto-immun. D’ailleurs, en utilisant un système transgénique, nous avons démontré que les souris prédisposées au diabète auto-immun présentent peu de cellules T DN, et que ce phénotype contribue à la susceptibilité au diabète auto-immun. En outre, un transfert des cellules T DN est suffisant pour empêcher la progression vers le diabète chez les souris prédisposées au diabète auto-immun. Ces résultats suggèrent que les cellules T DN puissent présenter un intérêt thérapeutique pour les patients diabétiques. Cependant, nous devons d'abord valider ces résultats en utilisant un modèle non-transgénique, qui est plus physiologiquement comparable à l'humain. L'objectif principal de cette thèse est de définir la fonction immunorégulatrice des cellules T DN, ainsi que le potentiel thérapeutique de celles-ci dans la prévention du diabète auto-immun chez un modèle non-transgénique. Dans cette thèse, on démontre que les souris résistantes au diabète auto-immun présentent une proportion et nombre absolu plus élevés de cellules T DN non-transgéniques, lorsque comparées aux souris susceptibles. Cela confirme une association entre le faible nombre de cellules T DN et la susceptibilité à la maladie. On observe que les cellules T DN éliminent les cellules B activées in vitro par une voie dépendante de la voie perforine et granzyme, où la fonction des cellules T DN est équivalente entre les souris résistantes et prédisposées au diabète auto-immun. Ces résultats confirment que l'association au diabète auto-immun est due à une insuffisance en terme du nombre de cellules T DN, plutôt qu’à une déficience fonctionnelle. On démontre que les cellules T DN non-transgéniques éliminent des cellules B chargées avec des antigènes d'îlots, mais pas des cellules B chargées avec un antigène non reconnu, in vitro. Par ailleurs, on établit que le transfert des cellules T DN activées peut empêcher le développement du diabète auto-immun dans un modèle de souris non-transgénique. De plus, nous observons que les cellules T DN migrent aux îlots pancréatiques, et subissent une activation et une prolifération préférentielles au niveau des ganglions pancréatiques. D'ailleurs, le transfert des cellules T DN entraîne une diminution d'auto-anticorps spécifiques de l'insuline et de cellules B de centres germinatifs directement dans les îlots, ce qui corrèle avec les résultats décrits ci-dessus. Les résultats présentés dans cette thèse permettent de démontrer la fonction des cellules T DN in vitro et in vivo, ainsi que leur potentiel lié à la thérapie cellulaire pour le diabète auto-immun. / Immune tolerance is dependent on the immune system discriminating between self and non-self. A break in immune tolerance results in autoimmunity, which can lead to the destruction of healthy organs, glands, joints or the central nervous system. Any disease that results from such an aberrant immune response is termed an autoimmune disease. Autoimmune diabetes, which is also referred to as juvenile diabetes and type 1 diabetes, results from an autoimmune attack on the insulin-producing β cells located within the islets of Langerhans of the pancreas. Although autoimmune diabetes is treatable through a combination of insulin therapy, diet and exercise, many chronic complications may arise in patients, including, but not limited to, blindness, cardiovascular disease, kidney failure and amputation. Due to the many complications associated with long-term autoimmune diabetes, research continues to better understand all the factors implicated in disease progression in order to develop new therapies that will prevent, reverse and/or cure this disease. A prominent role in the generation and maintenance of immune tolerance has been attributed to the number and function of regulatory cell subsets. One of these regulatory cell populations, namely CD4-CD8- (double negative, DN) T cells, have been studied in both mice and humans for their contribution to peripheral tolerance, disease prevention and their potential for use in cellular therapy. DN T cells are of particular therapeutic interest because they exhibit an antigen-specific immunoregulatory potential in various experimental settings, including the prevention of autoimmune diabetes. Indeed, using a transgenic system, we have shown that autoimmune diabetes-prone mice carry fewer DN T cells and that this phenotype contributes to autoimmune diabetes susceptibility, where a single transfer of DN T cells is sufficient to prevent diabetes progression in otherwise autoimmune diabetes-prone mice. These results suggest that DN T cells may be of therapeutic interest for diabetic patients. However, we must first validate these results using a non-transgenic setting, which is more physiologically relevant to humans. The main objective of this thesis is to determine the immunoregulatory function of the DN T cells as well as the therapeutic potential of these cells in the prevention of autoimmune diabetes in the non-transgenic setting. Here, we show that diabetes-resistant mice present with a higher proportion and cell number of DN T cells than diabetes-susceptible mice in the non-transgenic setting, which associates a deficiency in DN T cell number with disease susceptibility. We determine that DN T cells eliminate activated B cells in vitro via a perforin/granzyme-dependent pathway, where the function of DN T cells is equal between the diabetes-resistant and -susceptible mice, demonstrating that the association to autoimmune diabetes is due to a deficiency in DN T cell number rather than function. Interestingly, we show that non-transgenic DN T cells eliminate B cells loaded with islet antigen, but not B cells loaded with an irrelevant antigen, in vitro. Importantly, we establish that the transfer of activated DN T cells could prevent autoimmune diabetes development in the non-transgenic setting. Interestingly, we reveal that DN T cells migrate to the pancreatic islets and undergo preferential activation and proliferation within the pancreatic lymph nodes. Moreover, the transfer of DN T cells results in a decrease in both germinal center B cells directly within the pancreatic islets as well serum insulin autoantibody levels, which correlates with the aforementioned findings. Altogether, the results presented in this thesis have allowed us to enhance our understanding of the function of DN T cells both in vitro and in vivo as well as demonstrate the therapeutic potential for DN T cells as a novel cellular therapeutic for autoimmune diabetes.

Les maladies autoimmunes sont des affections chroniques, le plus souvent invalidantes, qui touchent plus de 5% de la population dans les pays développés. L’autoimmunité résulte de la rupture des mécanismes de tolérance du système immunitaire vis-à-vis des autoantigènes exprimés par les tissus de l’organisme, entraînant la destruction d’un ou de plusieurs organes-cibles par les lymphocytes T et/ou B. L’hépatite autoimmune et le diabète autoimmun se caractérisent par la destruction sélective des hépatocytes et des cellules beta pancréatiques, respectivement. De plus en plus d’arguments suggèrent une implication des lymphocytes T CD8+ dans le déclenchement, la progression et la régulation des réponses associées à plusieurs maladies autoimmunes. Dans ce projet, nous avons suivi l’évolution de clones de lymphocytes T CD8+ spécifiques à un antigène particulier dont le site d’expression différait. Pour ce faire, nous avons développé deux nouveaux modèles murins double transgéniques par croisement entre une lignée de souris exprimant un TCR transgénique spécifique à la nucléoprotéine (NP) du virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV), et une souris exprimant cette NP-LCMV : 1) uniquement dans les hépatocytes (modèle d’hépatite autoimmune), ou 2) simultanément dans le thymus et le pancréas (modèle de diabète autoimmun). L’avidité fonctionnelle des lymphocytes T CD8+ spécifiques à la NP chez les souris TCR transgéniques était inversement proportionnelle au niveau d’expression du TCR. Le répertoire lymphocytaire dans le thymus, la rate, les ganglions et le sang périphérique a été caractérisé pour chacune des lignées de souris double transgéniques, de même que la capacité fonctionnelle et le phénotype (marqueurs d’activation/mémoire) des lymphocytes T CD8+ autoréactifs. Chacun des deux nouveaux modèles présentés dans cette étude ont montré que les lymphocytes T CD8+ spécifiques à la NP sont aptes à briser la tolérance centrale et périphérique et à provoquer une réaction d’autoimmunité spontanée. Dans le modèle d’hépatite autoimmune, où l’expression de l’autoantigène était restreinte au foie, la surexpression du TCR transgénique a entraîné une délétion thymique quasi-totale des lymphocytes T CD8+ spécifiques à la NP prévenant le développement d’une hépatite spontanée. alors qu’un niveau de TCR comparable à celui d’une souris de type sauvage a permis une sélection positive des lymphocytes autoréactifs qui se sont accumulés dans le foie où ils se sont activés pour provoquer une hépatite autoimmune spontanée. Dans le modèle de diabète autoimmun, où l’autoantigène était exprimé dans le pancréas et le thymus, les souris des deux lignées double transgéniques ont montré une délétion thymique partielle, peu importe le niveau d’expression du TCR. Seuls les mâles adultes développaient un diabète spontané et une partie de leurs lymphocytes T CD8+ exprimaient une combinaison particulière de marqueurs d’activation/mémoire (CD44, CD122, PD-1). Cette population lymphocytaire était absente chez les souris femelles et les mâles sains. L’étude de la tolérance des lymphocytes T CD8+ autoréactifs dans nos deux nouveaux modèles murins double transgéniques a permis d’identifier des mécanismes alternatifs possiblement impliqués dans la tolérance et l’activation, et de mieux comprendre le rôle des lymphocytes T CD8+ autoréactifs dans le processus autoimmun menant à l’hépatite autoimmune et au diabète autoimmun. Ces découvertes seront utiles pour développer de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les lymphocytes T CD8+ autoréactifs. / Autoimmune diseases are chronic and often invalidating disorders affecting more than 5% of the population in developed countries. Autoimmunity results from a breach in tolerance mechanisms towards autoantigens expressed in tissues and organs leading to the destruction of one or more target-organs by T and/or B lymphocytes. Autoimmune hepatitis and autoimmune diabetes are characterised by selective destruction of hepatocytes or pancreatic beta cells respectively. Accumulating evidences suggest a direct implication for CD8+ T cells in initiation, progression and regulation processes associated with many autoimmune diseases. To study the development of CD8+ T cell clones towards a particular antigen whose expression site was different, we developed two new double transgenic mice models. Each mice model was obtained after breeding of a mouse expressing a TCR specific for the nucleoprotein (NP) from lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) with a second mouse expressing this LCMV-NP either 1) exclusively in hepatocytes (autoimmune hepatitis model), or 2) broadly in the pancreas and thymus (autoimmune diabetes model). The functional avidity of the NP-specific CD8+ T cells clones in TCR transgenic mice lines was inversely correlated with their respective TCR expression level. The lymphocyte repertoire was characterized in each line of double transgenic mouse, and functional capacities and phenotype (activation/memory markers) of NP-reactive CD8+ T cells were assessed. Both new models of double transgenic mice showed that NP-reactive CD8+ T cells could break central and peripheral tolerance and provoke a spontaneous autoimmune response. In the autoimmune hepatitis model, where autoantigen was expressed only in the liver, overexpression of the transgenic TCR led to massive thymic deletion of the NP-specific CD8+ T cells and no hepatitis developed, whereas TCR expression matching wild-type level allowed positive selection of autoreactive CD8+ T cells which accumulated in the liver, became activated and led to hepatitis development. In the autoimmune diabetes model, where autoantigen was expressed both in the pancreas and thymus, both double transgenic mouse lines showed a partial thymic deletion of NP-specific CD8+ T cells, regardless of the TCR expression level. Only adult male mice developed spontaneous diabetes, and a population of their autoreactive CD8+ T cells expressed a singular combination of activation/memory markers (CD44, CD122, PD-1) which was not seen in female and healthy male mice. The study of the tolerance of autoreactive CD8 + T cells in our two new double transgenic mouse models led us to identify alternative mechanisms potentially involved in tolerance and activation, and to better understand the role of autoreactive CD8 + T cells in the autoimmune processes leading to autoimmune hepatitis and autoimmune diabetes. These findings will be useful in developing new therapeutic approaches targeting autoreactive CD8+ T cells

La maladie d'Alzheimer est la démence neurodégénérative la plus fréquente, en particulier chez les personnes âgées. A l'heure actuelle, aucun traitement ne permet d'arrêter efficacement le développement de la maladie. Le tetrahydro-N,N-dimethyl-2,2-diphenyl-3-furanmethanamine (ANAVEX2-73) est un composé mixte avec une affinité modérée, de l'ordre du µM pour les récepteurs muscariniques et les récepteurs sigma-1. Des données préliminaires ont montré que la molécule avait des propriétés anti-amnésiantes et neuroprotectrices dans un modèle non transgénique de la maladie d'Alzheimer. L'objectif de cette thèse est de poursuivre le développement préclinique de la molécule. Nous avons montré, d'abord dans un modèle non-transgénique de la maladie d'Alzheimer, le modèle d'injection de peptide AB(25-35) oligomérisé chez la souris, que la molécule prévient l'hyperphosphorylation de la protéine Tau ainsi que la production du peptide AB(1-42), deux éléments clés de la physiopathologie de la maladie. Nous avons utilisé ce même modèle pour montrer que l'ANAVEX2-73 prévient les déficits de la fonction mitochondriale, qui sont présents de manière constante et précoce chez les patients. Enfin, nous avons montré qu'un traitement chronique de deux mois avec le composé, dans un modèle de souris transgéniques de la maladie, permet de restaurer les capacités cognitives chez les souris, de diminuer le stress oxydant et d'augmenter les marqueurs synaptiques. Cependant le traitement n'a pas permis de réduire la charge amyloïde dans le cerveau des souris. L'ensemble de ces résultats est encourageant pour le développement futur de la molécule, puisque cette dernière, en plus d'être neuroprotectrice et anti-amnésiante semble être efficace sur les éléments clés de la physiopathologie de la maladie. / Alzheimer's disease is the most common form of dementia in the elderly. There is however no efficient treatment to stop the disease progression. Tetrahydro-N,N-dimethyl-2,2-diphenyl-3-furanmetanamine (ANAVEX2-73) is a mixed compound with moderate affinity for muscarinic and sigma-1 receptors. Preliminary data showed ANAVEX2-73 had anti-amnesic and neuroprotective poperties, in a non-transgenic model of Alzheimer's disease. The aim of this thesis is to improve knowledge about preclinical data of this molecule. We first showed that, in the non-transgenic AB(25-35) mouse model, ANAVEX2-73 prevented Tau protein hyperphosphorylation and AB(1-42) peptide seeding, two key parameters involved in Alzheimer's disease physiopathology. We also used this model tho show that ANAVEX2-73 prevented mitochondrial dysfunction, consistently reported as an early event of the disease in patients. The last part of this thesis showed that a two-month chronic treatment with ANAVEX2-73 in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease reversed cognitive dysfunction and prevented loss of synaptic markers and increased of oxidative stress. However, we could not show a decrease of amyloid load in mouse brain after chronic treatment. Altogether, these results suggest that ANAVEX2-73 treatment could be effective to treat Alzheimer's disease. In addition to its neuroprotective and anti-amnesic property, it also prevents key hallmarks involved in the physiopathology of Alzheimer's disease.

Le diabète auto-immun résulte de la destruction des cellules bêta pancréatiques sécrétrices d’insuline par les lymphocytes T du système immunitaire. Il s’ensuit une déficience hormonale qui peut être comblée par des injections quotidiennes d’insuline d’origine exogène, toutefois il demeure à ce jour impossible de guérir les patients atteints de la maladie. De façon générale, un système immunitaire sain reconnaît une multitude d’antigènes différents et assure ainsi notre défense à l’égard de différents pathogènes ou encore de cellules tumorales. Il arrive cependant que, pour des raisons génétiques et/ou environnementales, les lymphocytes T puissent s’activer de façon aberrante suite à la reconnaissance d’antigènes provenant du soi. C’est ce bris de tolérance qui mène au développement de pathologies auto-immunes telles que le diabète auto-immun. Afin de limiter l’auto-immunité, des mécanismes de sélection stricts permettent d’éliminer la majorité des lymphocytes T présentant une forte affinité envers des antigènes du soi lors de leur développement dans le thymus. Certains de ces lymphocytes réussissent toutefois à échapper à l’apoptose et migrent en périphérie afin d’y circuler en quête d’un antigène spécifiquement reconnu. Il est alors primordial que des mécanismes périphériques assurent le maintien de la tolérance immunitaire en faisant obstacle à l’activation et à la prolifération des lymphocytes T auto-réactifs. L’une des avenues afin d’inhiber le développement de réponses immunitaires aberrantes est la génération de lymphocytes T régulateurs. Ces cellules, d’origine thymique ou périphérique, peuvent arborer différents phénotypes et agissent via de multiples mécanismes afin d’inactiver et/ou éliminer les cellules impliquées dans l’apparition de pathologies auto-immunes. L’utilisation de modèles murins transgéniques a permis la mise en évidence d’une population peu caractérisée de lymphocytes T au potentiel régulateur. En effet, la proportion de ces cellules T n’exprimant pas les corécepteurs CD4 et CD8 (double négatives, DN) a été inversement corrélée à la prédisposition à l’auto-immunité chez ces ii souris. L’objectif principal de cette thèse est de démontrer la fonction immuno-régulatrice des lymphocytes T DN, tout en investiguant les facteurs génétiques responsables du maintien de cette population cellulaire. Nous avons observé que les lymphocytes T DN exercent une activité cytotoxique à l’égard des lymphocytes B de façon spécifique à l’antigène, via la libération de granules cytolytiques contenant du granzyme B et de la perforine. Par ailleurs, nous avons établi qu’un unique transfert adoptif de ces cellules est suffisant afin d’inhiber le développement du diabète auto-immun chez des hôtes transgéniques prédisposés à la maladie. Le recours à des souris déficientes pour l’expression du gène CD47 a permis de constater que la voie de signalisation CD47-Sirp est essentielle dans le maintien de la proportion des lymphocytes T DN. De plus, le locus murin de prédisposition au diabète auto-immun Idd13, qui contient le gène Sirp, a été identifié pour son rôle dans la régulation de la proportion de ces cellules. Finalement, une analyse génétique a révélé que d’autres intervalles génétiques sont impliqués dans le contrôle de la population des lymphocytes T DN. Parmi ceux-ci, un locus situé en région proximale du chromosome 12 a été validé grâce à la création de souris congéniques. Grâce aux résultats présentés dans cette thèse, notre compréhension de la biologie ainsi que de la régulation des lymphocytes T DN est approfondie. Ces connaissances constituent un pas important vers la création de thérapies cellulaires novatrices permettant de prévenir et de guérir diverses pathologies auto-immunes. / Autoimmune diabetes results from the destruction of the insulin-secreting pancreatic beta cells by the T lymphocytes of the immune system. This leads to a hormonal deficiency that can be regulated with daily injections of exogenous insulin. However, to date, there is no cure for autoimmune diabetes. A healthy immune system generally recognizes a multitude of antigens in order to ensure our defence against different pathogens and tumor cells. Yet, depending on genetic and/or environmental factors, individuals may develop T cells that are aberrantly activated following the recognition of self-antigens. This break in tolerance leads to the development of autoimmune pathologies, such as autoimmune diabetes. In order to limit autoimmunity, rigorous selection mechanisms eliminate the vast majority of the T lymphocytes that present a high affinity for self-antigens during their thymic development. However, some of these auto-reactive lymphocytes escape from the elimination processes and migrate to the periphery where they might encounter a self-antigen. It is then essential that peripheral mechanisms maintain the immune tolerance by abrogating the activation and the proliferation of these self-specific T lymphocytes. One of the means to inhibit aberrant immune responses is the generation of regulatory T lymphocytes. These cells, which can be of thymus or peripheral origin, display various phenotypes and can mediate their action through several mechanisms in order to inactivate and/or eliminate the cells that are implicated in the development of autoimmune diseases. The use of transgenic mouse models made it possible to identify a poorly characterized population of T lymphocytes that exhibit a regulatory potential, namely CD4-CD8- (double negative, DN T cells). Indeed, the proportion of DN T cells in lymphoid organs is inversely correlated to autoimmune predisposition. The main objective of this thesis is to determine the immunoregulatory function of the DN T cells, as well as to reveal the genetic factors underlying the regulation of the proportion of DN T cells. iv We observed that through the release of cytolytic granules containing granzyme B and perforin, DN T lymphocytes exert a cytotoxic activity towards B cells in an antigen-specific manner. In addition, we have established that a single injection of those DN T cells is sufficient to inhibit the development of autoimmune diabetes in highly susceptible transgenic mice. The use of CD47 deficient mice also demonstrated that the CD47-Sirp pathway is essential to maintain DN T cell proportion. Also, we identified that the autoimmune diabetes susceptibility locus Idd13, which contains Sirp participates in defining the proportion of DN T cells. Finally, a genetic analysis revealed that other loci are implicated in the control of the DN T cell population. Among those, the role of a locus situated in the proximal region of chromosome 12 has been validated through to the generation of congenic mice. The results presented in this thesis have allowed us to enhance our understanding of the biology and genetic regulation of DN T lymphocytes. This knowledge constitutes an important step towards the creation of innovative cellular therapies that may prevent and cure a diversity of autoimmune pathologies.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

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La tolérance immunitaire dépend de la distinction entre le soi et le non soi par le système immunitaire. Un bris dans la tolérance immunitaire mène à l'auto-immunité, qui peut provoquer la destruction des organes, des glandes, des articulations ou du système nerveux central. Le diabète auto-immun, également connu sous le nom diabète juvénile et diabète de type 1, résulte d'une attaque auto-immune sur les cellules β pancréatiques sécrétrices d’insuline, localisées au niveau des îlots de Langerhans du pancréas. Bien que le diabète auto-immun soit traitable par une combinaison d’injections quotidiennes d’insuline d’origine exogène, de régime et d'exercices, beaucoup de complications chroniques peuvent se manifester chez les patients, y compris, mais non limitées à, la cécité, les maladies cardiovasculaires, l’insuffisance rénale et l'amputation. En raison des nombreuses complications liées au diabète auto-immun à long terme, la recherche continue afin de mieux comprendre tous les facteurs impliqués dans la progression de la maladie dans le but de développer de nouvelles thérapies qui empêcheront, renverseront et/ou traiteront cette maladie. Un rôle primordial dans la génération et l'entretien de la tolérance immunitaire a été attribué au nombre et à la fonction des sous-populations de cellules régulatrices. Une de ces populations est constituée de cellules T CD4-CD8- (double négatives, DN), qui ont été étudiées chez la souris et l'humain pour leur contribution à la tolérance périphérique, à la prévention des maladies et pour leur potentiel associé à la thérapie cellulaire. En effet, les cellules de T DN sont d'intérêt thérapeutique parce qu'elles montrent un potentiel immunorégulateur antigène-spécifique dans divers cadres expérimentaux, y compris la prévention du diabète auto-immun. D’ailleurs, en utilisant un système transgénique, nous avons démontré que les souris prédisposées au diabète auto-immun présentent peu de cellules T DN, et que ce phénotype contribue à la susceptibilité au diabète auto-immun. En outre, un transfert des cellules T DN est suffisant pour empêcher la progression vers le diabète chez les souris prédisposées au diabète auto-immun. Ces résultats suggèrent que les cellules T DN puissent présenter un intérêt thérapeutique pour les patients diabétiques. Cependant, nous devons d'abord valider ces résultats en utilisant un modèle non-transgénique, qui est plus physiologiquement comparable à l'humain. L'objectif principal de cette thèse est de définir la fonction immunorégulatrice des cellules T DN, ainsi que le potentiel thérapeutique de celles-ci dans la prévention du diabète auto-immun chez un modèle non-transgénique. Dans cette thèse, on démontre que les souris résistantes au diabète auto-immun présentent une proportion et nombre absolu plus élevés de cellules T DN non-transgéniques, lorsque comparées aux souris susceptibles. Cela confirme une association entre le faible nombre de cellules T DN et la susceptibilité à la maladie. On observe que les cellules T DN éliminent les cellules B activées in vitro par une voie dépendante de la voie perforine et granzyme, où la fonction des cellules T DN est équivalente entre les souris résistantes et prédisposées au diabète auto-immun. Ces résultats confirment que l'association au diabète auto-immun est due à une insuffisance en terme du nombre de cellules T DN, plutôt qu’à une déficience fonctionnelle. On démontre que les cellules T DN non-transgéniques éliminent des cellules B chargées avec des antigènes d'îlots, mais pas des cellules B chargées avec un antigène non reconnu, in vitro. Par ailleurs, on établit que le transfert des cellules T DN activées peut empêcher le développement du diabète auto-immun dans un modèle de souris non-transgénique. De plus, nous observons que les cellules T DN migrent aux îlots pancréatiques, et subissent une activation et une prolifération préférentielles au niveau des ganglions pancréatiques. D'ailleurs, le transfert des cellules T DN entraîne une diminution d'auto-anticorps spécifiques de l'insuline et de cellules B de centres germinatifs directement dans les îlots, ce qui corrèle avec les résultats décrits ci-dessus. Les résultats présentés dans cette thèse permettent de démontrer la fonction des cellules T DN in vitro et in vivo, ainsi que leur potentiel lié à la thérapie cellulaire pour le diabète auto-immun. / Immune tolerance is dependent on the immune system discriminating between self and non-self. A break in immune tolerance results in autoimmunity, which can lead to the destruction of healthy organs, glands, joints or the central nervous system. Any disease that results from such an aberrant immune response is termed an autoimmune disease. Autoimmune diabetes, which is also referred to as juvenile diabetes and type 1 diabetes, results from an autoimmune attack on the insulin-producing β cells located within the islets of Langerhans of the pancreas. Although autoimmune diabetes is treatable through a combination of insulin therapy, diet and exercise, many chronic complications may arise in patients, including, but not limited to, blindness, cardiovascular disease, kidney failure and amputation. Due to the many complications associated with long-term autoimmune diabetes, research continues to better understand all the factors implicated in disease progression in order to develop new therapies that will prevent, reverse and/or cure this disease. A prominent role in the generation and maintenance of immune tolerance has been attributed to the number and function of regulatory cell subsets. One of these regulatory cell populations, namely CD4-CD8- (double negative, DN) T cells, have been studied in both mice and humans for their contribution to peripheral tolerance, disease prevention and their potential for use in cellular therapy. DN T cells are of particular therapeutic interest because they exhibit an antigen-specific immunoregulatory potential in various experimental settings, including the prevention of autoimmune diabetes. Indeed, using a transgenic system, we have shown that autoimmune diabetes-prone mice carry fewer DN T cells and that this phenotype contributes to autoimmune diabetes susceptibility, where a single transfer of DN T cells is sufficient to prevent diabetes progression in otherwise autoimmune diabetes-prone mice. These results suggest that DN T cells may be of therapeutic interest for diabetic patients. However, we must first validate these results using a non-transgenic setting, which is more physiologically relevant to humans. The main objective of this thesis is to determine the immunoregulatory function of the DN T cells as well as the therapeutic potential of these cells in the prevention of autoimmune diabetes in the non-transgenic setting. Here, we show that diabetes-resistant mice present with a higher proportion and cell number of DN T cells than diabetes-susceptible mice in the non-transgenic setting, which associates a deficiency in DN T cell number with disease susceptibility. We determine that DN T cells eliminate activated B cells in vitro via a perforin/granzyme-dependent pathway, where the function of DN T cells is equal between the diabetes-resistant and -susceptible mice, demonstrating that the association to autoimmune diabetes is due to a deficiency in DN T cell number rather than function. Interestingly, we show that non-transgenic DN T cells eliminate B cells loaded with islet antigen, but not B cells loaded with an irrelevant antigen, in vitro. Importantly, we establish that the transfer of activated DN T cells could prevent autoimmune diabetes development in the non-transgenic setting. Interestingly, we reveal that DN T cells migrate to the pancreatic islets and undergo preferential activation and proliferation within the pancreatic lymph nodes. Moreover, the transfer of DN T cells results in a decrease in both germinal center B cells directly within the pancreatic islets as well serum insulin autoantibody levels, which correlates with the aforementioned findings. Altogether, the results presented in this thesis have allowed us to enhance our understanding of the function of DN T cells both in vitro and in vivo as well as demonstrate the therapeutic potential for DN T cells as a novel cellular therapeutic for autoimmune diabetes.

Les membres de la famille des 5-phosphatases d’inositols polyphosphates et de phosphoinositides sont des enzymes caractérisées par la présence de deux domaines catalytiques conservés qui hydrolysent un phosphate en position 5 sur un noyau inositol. SKIP (Skeletal Muscle and Kidney enriched Inositol Phosphatase), également appelée Pps (Putative PI 5-phosphatase) est un des derniers membres de la famille des 5-phosphatases à avoir été découvert à ce jour. Cette enzyme hydrolyse majoritairement le phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2) et le phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate (PtdIns(3,4,5)P3). Les phosphoinositides (PtdIns) représentent environ 10% des lipides membranaires et sont impliqués dans de nombreuses cascades de signalisation cellulaire conduisant, entre autres, à la prolifération, l’apoptose, la différenciation, la sécrétion, le trafic vésiculaire et la mobilité cellulaire.<p>Des études de surexpression de SKIP en cellules tendent à montrer que cette protéine pourrait jouer un rôle de régulateur négatif dans la formation du cytosquelette d’actine et/ou dans la voie de signalisation de l’insuline. <p><p>Afin d’étudier in vivo la fonction de la protéine SKIP chez la souris, nous avons décidé de générer des souris transgéniques surexprimant cette protéine de manière conditionnelle. Dans ce but, nous avons infecté des embryons murins par des lentivirus porteurs d’un transgène SKIP et avons obtenu, après réimplantation des embryons infectés dans des femelles pseudogestantes, deux lignées de souris transgéniques. Celles-ci ont ensuite été croisées avec des souris exprimant la recombinase Cre de manière ubiquitaire afin de pouvoir activer la transcription de SKIP dans l’ensemble des organes. Des expériences de Western blot, de dosage d’activité 5-phosphatase ainsi que des PCR en temps réel sont venus confirmer la présence de la protéine transgénique et de son activité catalytique.<p>L’ensemble des expériences qui ont été menées du point de vue phénotypique tend à montrer que dans notre modèle, la surexpression de SKIP ne provoque aucune anomalie évidente du point de vue anatomique, glycémique ou immunologique. Toutefois, des expériences concernant la physiologie rénale ont été réalisées sur base des résultats d’immunohistochimie et nous ont permis de détecter une anomalie dans les mécanismes de réabsorption d’eau ainsi que dans l’expression et la phosphorylation des canaux hydriques AQP2.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Superviseur : Dr. Piet Van Vliet Collaborateurs: Dr. Alexandre Dubrac, Dr. Martin Smith / Résumé INTRODUCTION : Les maladies valvulaires du cœur surviennent dans 2% de la population, impliquant souvent un reflux sanguin dû au rétrécissement de la valve. Nous avons récemment identifié deux familles non apparentées étant atteintes par une sténose aortique. Le séquençage exomique des familles a révélé une mutation entrainant une perte de fonction homozygote pour le gène ADAMTS19. La relation entre la perturbation du gène ADAMTS19 et la sténose a été reproduite et donc confirmée grâce à une souris ADAMTS19-LACZ KO/KO. Cette souris montre également que ADAMTS19 est spécifiquement exprimé dans les cellules valvulaires interstitielles (VICs) dans les valves. Le rôle d’ADAMTS19 durant le développement des valves reste inconnu. Pour analyser le patron d’expression d’ADAMTS19 pendant le développement du cœur, nous avons obtenu un modèle de souris transgénique contenant une CRE-tamoxifen inductible (Cre-ERT2) qui est exprimé sous l’influence du promoteur humain ADAMTS19. HYPOTHESE/OBJECTIF : Nous émettons l’hypothèse que le promoteur humain d’ADAMTS19 inséré dans la souris ADAMTS19-Cre-ERT2 contient toutes les séquences régulatrices permettant d’exprimer le gène ADAMTS19 et que ADAMTS19 est principalement exprimé au niveau des cellules valvulaires interstitielles dans les valves. L’objectif est de caractériser le patron d’expression d’ADAMTS19 en analysant sa distribution durant le développement grâce à une souris reportrice tdTomato. Comme ADAMTS19 est spécifiquement exprimé dans les VICs, cet outil transgénique permettrait d’étudier ces cellules durant le développement. METHODE/RESULTAT : Suite à une étude in silico le promoteur ADAMTS19 est apparu comme extrêmement conservé. Par conséquent, pour analyser l’expression d’ADAMTS19 nous avons obtenu une souris BAC ADAMTS19-Cre-ERT2 contenant la séquence conservée que nous avons croisé avec une souris reportrice tdTomato. Le Tamoxifen est administré aux femelles gestantes par gavage aux jours embryonnaires E9,5, E11,5 ainsi que E13,5, et les cœurs sont extrait a E16,5. Des coupes de cœurs embryonnaires vont permettre d’identifier la localisation et la morphologie des cellules marquées. L’expression d’ADMATS19 dans les cellules valvulaires interstitielles est consistant avec le fait qu’ADAMTS19 est connu pour affecter les valves durant le développent et dans le cas de maladie valvulaire. Cependant, le patron des valves n’est pas reproductible au travers des générations. De plus, nous observons qu’ADAMTS19 est marqué dans des cellules des oreillettes et ventricule dans une lignée et dans une sous population de cellules de l’artère pulmonaire dans une autre. CONCLUSION : L’analyse des séquences de chaque lignée par séquençage permettre d’investiguer la raison de ses différents patrons et de mettre en évidence des régulateurs spécifiques. / BACKGROUND: Valvular heart disease (VHD) occurs in ~2% of the general population, often resulting in reduced or disturbed blood flow. We recently identified two unrelated families with recessive inheritance patterns of progressive polyvalvular heart disease in absence of any clear syndromic phenotype. Exome sequencing revealed homozygous, rare, loss of function (LOF) alleles in both families for the gene ADAMTS19. The relation between ADAMTS19 mutation and aortic stenosis were confirm via an ADAMTS19-LacZ KO/KO mouse model. This model also shows that ADAMTS19 is specific of VICs during valve development. The ADAMTS protein family includes 19 proteases that are involved in matrix remodeling, and tissue homeostasis in development and disease. However, the role of ADAMTS19 specifically during valve development remains unknown. We aim to characterize ADAMTS19 expression using a BAC transgenic ADMTS19-CRERT2 mouse. HYPOTHESE/OBJECTIVE We hypothesize that the BAC used to make the ADMTS19-CRERT2 mouse contains all the regulatory elements to express it and also that its expression will be specific to the VICs. The objective is to establish the ADAMTS19- CREERT2 and therefore to create a new tool to study VICs in vivo. METHODS/RESULTS: In silico analysis of the human and mouse ADAMTS19 genomic regions showed a high level of conservation. Thus, to analyze ADAMTS19 expression patterns during mouse development, we obtained a BAC transgenic mouse model containing a tamoxifen inducible Cre (CreERT2) that is expressed under the influence of the human ADAMTS19 promoter and surrounding genomic region. We crossed males from several lines created in parallel with Rosa-tdTomato reporter females to generate offspring in which expression of the fluorescent tdTomato reporter is activated in ADAMTS19-expressing cells upon tamoxifen administration. Surprisingly, whole mount imaging of embryos induced at E13.5 and isolated at E16.5 revealed strong, but distinct labelling patterns in offspring from different ADAMTS19CreERT2 sublines. Whereas one line exclusively labelled VICs, consistent with ADAMTS19 in situ RNA expression data from the Eurexpress database, another line specifically labelled cells in atrial and ventricular, but not VICs. A third line seems to label only a subset of cells in the pulmonary artery. Labeling of ADAMTS19-positive VICs is consistent with ADAMTS19 affecting valve development and VHD. In addition, we observed exclusive ADAMTS19-dependent labelling in atrial and ventricular cells or in a subset of pulmonary artery cells in two different sublines. CONCLUSION: The distinct expression patterns in offspring from different ADAMTS19-Cre-ERT2 lines indicates that although regulation of ADAMTS19 is conserved between human and mouse, expression in VICs versus other cells may be dependent on mutually exclusive regulatory mechanisms.