Casos fatais de Febre Maculosa são registrados no estado do Rio de Janeiro. Avaliou-se o status epidemiológico de riquétsias Grupo Febre Maculosa em cães e ectoparasitas de seis municípios usando métodos imunológico (Reação de Imunofluorescência Indireta) e moleculares (Reação em Cadeia pela Polimerase convencional e em Tempo Real e Análise de Sequências). Avaliou-se a funcionalidade de iniciadores para a região VNTR (Número Variável de Repetições Sequenciais) de Rickettsia rickettsii, para genotipagem de amostras brasileiras. Registraram-se cães sorologicamente positivos em todos os municípios e gene riquetsial (gltA) foi detectado em seus soros, indicando sua importância na epidemiologia de riquétsias na região Metropolitana. R. rickettsii foi diagnosticada em Amblyomma cajennense sugerindo o envolvimento deste no surto com casos fatais do município de Petrópolis. Os iniciadores VNTRB mostraram-se limitados para genotipagem das cepas de R. rickettsii. O estudo evidenciou a necessidade de um sistema de vigilância ambiental contínuo para prevenção de casos fatais. / Spotted Fever fatal cases are reported in Rio de Janeiro state. We evaluated the epidemiological status of Spotted Fever Group Rickettsiae in dogs and ectoparasites of six municipalities using immunological methods (Indirect Immunofluorescence Assay) and molecular (Conventional and Real-Time Polymerase Chain Reaction and Sequence Analysis). We evaluated the functionality of primers for the VNTR region (Variable Number Tandem Repeat) of Rickettsia rickettsii, for brazilian samples genotyping. Dogs serologically positive were registered in all municipalities and riquetsial gene (gltA) was detected in their serum, indicating its importance in rickettsiae epidemiology in Metropolitan region. R. rickettsii was diagnosed in Amblyomma cajennense suggesting an involvement of this species in an outbreak with fatal cases in Petrópolis city. Primers VNTRB proved limited for genotyping R. rickettsii strains. This study highlighted the need for a continuous environmental monitoring system to prevent fatal cases.

O gênero Rickettsia compreende bactérias intracelulares obrigatórias patogênicas e não patogênicas. A principal espécie patogênica no novo mundo é Rickettsia rickettsii transmitida por carrapatos do gênero Amblyomma. Além de R. rickettsii, outra riquetsiose, causada por Rickettsia parkeri, apresenta sintomatologia branda e foi recentemente descrita causando doença na América do Sul. No Brasil casos clínicos ocasionados por R. parkeri foram notificados na Bahia e em São Paulo. O presente trabalho foi realizado em uma área endêmica para Febre Maculosa na Vila Itoupava, Município de Blumenau, Santa Catarina. Esta área apresenta características de área peri - urbanas inserida em fragmentos de Mata Atlântica. Amostras de sangue de humanos e de cães foram colhidas para pesquisa de anticorpos anti-riquétsias através da reação de imunofluorescência indireta (RIFI). Os carrapatos removidos dos cães foram identificados e submetidos às técnicas de hemolinfa e shell vial para o isolamento do agente e reação em cadeia pela polimerase (PCR) e sequenciamento de DNA dos isolados obtidos e amostras diretas para a identificação do agente circulante na região. Das 15 amostras de soro humano, 7 foram positivas (46,67%), apresentando sororeatividade de 26,67%, 26,67%, 20%, 40%, 13,34% e 6,67% para R. rickettsii, R. parkeri, R. rhipicephali, R. amblyommii, R. bellii e R. felis, respectivamente. Das 52 amostras de cães 35 foram positivas (67,31%), apresentando sororeatividade de 50%, 57,70%, 44,23%, 48,08%, 25% e 26,93% para R. rickettsii, R. parkeri, Rickettsia rhipicephali, Rickettsia amblyommii, Rickettsia bellii e Rickettsia felis, respectivamente. Dentre os 53 cães pesquisados 21 apresentavam carrapatos, resultando em uma frequência de infestação de 39,62%. Três espécies de carrapatos foram identificadas dentre os 153 coletados, sendo 95 da espécie Amblyomma ovale, 52 Amblyomma aureolatum e 6 Rhipicephalus sanguineus. Após a técnica de hemolinfa e Shell vial, foi realizado com sucesso o isolamento de R. parkeri cepa Mata Atlântica em A. ovale e A. aureolatum e foram caracterizadas pelos genes gltA, ompA, ompB e htrA. Nas amostras diretas de A. ovale e A. aureolatum observou-se, respectivamente, 7,79% e 10% de positividade para ambos os genes gltA e ompA. Os produtos amplificados dos isolados e amostras diretas foram seqüenciadas e apresentaram 100% de similaridade com R. parkeri cepa Mata Atlântica. Foram realizadas análise descritiva, teste de Qui-quadrado, teste exato de Fisher e regressão logística, pelo método forward selection, quando necessários. Os resultados mostraram que a única variável independente significativa foi tempo na mata, sendo que os cães que frequentavam a mata tinham 19,286 mais chances de apresentar sorologia positiva para riquétsias, quando confrontados com cães que não frequentavam a mata. Conclui-se neste trabalho que o agente R. parkeri cepa Mata Atlântica está presente no local estudado e pode ser o provável causador da Febre Maculosa na região. Apenas a variável independente tempo na mata apresentou significância estatística, e de acordo com os resultados desta pesquisa, a alteração exclusiva desta variável poderia reduzir em até 19,28 vezes as chances de um cão se infectar com R. parkeri cepa Mata Atlântica. / The genus Rickettsia comprises pathogenic and non pathogenic obligate intracellular bacteria. The main pathogenic species in the New World is Rickettsia rickettsii transmitted by ticks of Amblyomma genus. Apart of R. rickettsii, another riquetsiosis caused by Rickettsia parkeri, with mild symptoms, was recently described in South America. In Brazil clinical cases caused by R. parkeri were notified in Bahia and São Paulo. This study was conducted in a spotted fever endemic area in Vila Itoupava, Blumenau, State of Santa Catarina, Brazil. This area has a periurban characteristics inserted in fragments of Atlantic rainforest. Blood samples were collected from humans and dogs to be tested by immunofluorescence assay (IFA) against rickettsial antigens. Ticks removed from dogs were identified and submitted to hemolymph test and shell vial attempting to isolate rickettsiae. Polymerase chain reaction (PCR) and DNA sequencing of rickettsial gene fragments were performed on the rickettsial isolates and also directly on tick samples. Of the 15 human sera 7 were IFA positive (46.68%), with seroreactivity of 26.67%, 26.67%, 20%, 40%, 13.34% and 6.67% for R. rickettsii, R. parkeri, Rickettsia rhipicephali, Rickettsia amblyommii, Rickettsia bellii and Rickettsia felis, respectively. Of the 52 samples collected from dogs 35 were IFA positive (67.31%), with seroreactivity of 50%, 57.70%, 44.23%, 48.08%, 25% and 26.93% for R. rickettsii, R. parkeri, R. rhipicephali, R. amblyommii, R. bellii and R. felis, respectively. Ticks were collected from 21 (39.62%). Three tick species were identified among 153 specimens collected: 95 Amblyomma ovale, 52 Amblyomma aureolatum and 6 Rhipicephalus sanguineus. After hemolymph and shell vial techniques, R. parkeri strain Atlantic rainforest was successful isolated from A. ovale and A. aureolatum ticks, and further characterized by DNA sequencing of fragments of the rickettsial genes gltA, ompA, ompB and htrA. Overall, 7.79% of A. ovaleand 10% of A. aureolatum ticks were PCR-positive for both gltA and ompA genes. DNA sequences generated from the PCR products of these ticks presented 100% of similarity with R. parkeri strain Atlantic rainforest. Descriptive analysis, Chi-square, Fishers exact test and logistic regression (forward selection method) were used when necessary. The unique significant independent variable was time spent in the forest, being that dogs visiting the forest had up to 19.286 higher chances of being IFA positive for riquettsia than dogs that did not visit the forest. In conclusion, the agent R. parkeri strain Atlantic rainforest is present in the study area and may be the cause of spotted fever in the area. The independent variable \"time spent in the forest\" had statistical significance and, according to the results of this research, changing this variable only could reduce up to 19.28 times the chances of a dog being infected with R. parkeri strain Atlantic rainforest.

Rickettsia rickettsii é uma bactéria intracelular obrigatória e agente etiológico da febre maculosa brasileira, uma grave enfermidade para humanos. Na América do Sul, o principal vetor para o agente é o carrapato Amblyomma cajennense. Alguns animais exercem um papel importante na manutenção da bactéria na natureza, uma vez que a mantêm em níveis altos na corrente sanguínea por alguns dias ou semanas, garantindo que novos carrapatos se infectem. Os equinos são um dos principais hospedeiros para A. cajennense, porém sua importância como hospedeiro amplificador de R. rickettsii ainda não havia sido estudada. Objetivou-se no presente trabalho detectar, em equinos experimentalmente infectados com R. rickettsii, possíveis alterações clínicas, ocorrência e duração de riquetsemia e ocorrência de transmissão da bactéria dos equinos para carrapatos A. cajennense, além de observar a curva de anticorpos IgG anti-R. rickettsii nestes animais. Para tanto, quatro equinos foram infectados com a amostra Taiaçu de R. rickettsii, sendo dois por meio de infestação com carrapatos A. cajennense infectados e dois por meio de inoculação intraperitoneal. Durante 30 dias, os animais foram examinados diariamente e amostras de sangue foram coletadas a cada dois dias para realização de hemograma, PCR em tempo real do sangue para detecção de Rickettsia e inoculação do sangue em cobaias. Adicionalmente, exames bioquímicos foram realizados a cada seis dias e RIFI para detecção de anticorpos IgG foi realizada até os animais se tornarem soronegativos. Para verificar a capacidade de transmissão para carrapatos, os equinos foram infestados com larvas, ninfas e adultos de A. cajennense não infectados. Após serem retirados dos equinos, estes carrapatos foram alimentados em coelhos e/ou testados pela PCR em tempo real e PCR convencional para detecção de Rickettsia. Os equinos não apresentaram sinais clínicos nem alterações significativas no hemograma e testes bioquímicos. Todas as amostras de sangue foram negativas na PCR em tempo real e nenhuma cobaia inoculada com sangue dos equinos apresentou sinais clínicos compatíveis com infecção por R. rickettsii, nem soroconversão. Os equinos apresentaram anticorpos detectáveis a partir de 10 ou 12 dias pós-inoculação ou infestação e permaneceram soropositivos por no mínimo 177 dias. Nenhum coelho infestado com carrapatos previamente alimentados nos equinos apresentou sinais clínicos ou soroconversão após 21 dias da infestação. Apenas um carrapato, originário de um equino infectado via carrapatos infectados, foi positivo concomitantemente na PCR em tempo real e PCR convencional. Conclui-se que equinos experimentalmente infectados com uma amostra brasileira de R. rickettsii não apresentam alterações clínicas nem bacteremia detectável e transmitem a bactéria para uma quantidade ínfima de carrapatos, porém desenvolvem boa resposta humoral. Pode-se inferir que, em condições naturais, equinos não são importantes como hospedeiros amplificadores para R. rickettsii. / Rickettsia rickettsii is an obligate intracellular bacterium and the etiological agent of Brazilian spotted fever, a severe illness of humans. In South America, the main vector for the agent is the tick Amblyomma cajennense. Some animals play an important role in maintenance of the bacterium in nature, since they develop high levels of bacteremia for a few days or weeks, ensuring that new ticks become infected. Horses are one of the major hosts for A. cajennense, but its importance as an amplifier host for R. rickettsii had not yet been studied. This study aimed to evaluate possible clinical changes, the occurrence and duration of rickettsemia, and the occurrence of transmission of the bacterium from horses to A. cajennense ticks in horses experimentally infected with R. rickettsii, in addition to observe the kinetics of anti-R. rickettsii IgG antibodies. Therefore, four horses were infected with R. rickettsii strain Taiaçu, two by infestation with infected A. cajennense ticks and two by intraperitoneal injection. For 30 days, the animals were examined daily and blood samples were collected every two days for hemogram, real-time PCR of whole blood for the detection of Rickettsia, and inoculation of guinea pigs with blood. Additionally, biochemical tests were performed every six days and IFA test for detection of IgG antibodies was performed until the animals become seronegative. In order to verify the ability of the horses to transmit the infection to ticks, horses were infested with uninfected A. cajennense larvae, nymphs and adults. After being removed from horses, these ticks were fed on rabbits and/or tested by real-time PCR and conventional PCR. The horses showed no clinical signs or significant changes in the blood count and biochemical tests. All blood samples were negative in the real-time PCR and no guinea pig inoculated with the horse blood showed clinical signs consistent with infection by R. rickettsii, neither seroconversion. Horses had detectable antibodies from 10 or 12 days post-inoculation or infestation and remained seropositive for at least 177 days. None of the rabbits infested with ticks previously fed on the horses showed clinical signs or seroconversion after 21 days of infestation. Only one tick fed on a horse infected by infected ticks was positive in the real-time PCR and conventional PCR. The results allows to conclude that horses, experimentally infected with a Brazilian strain of R. rickettsii, do not exhibit clinical changes or detectable bacteremia, and transmit the bacterium to a very small amount of ticks, but develop good humoral response. We can infer that horses are not important as amplifiers hosts for R. rickettsii under natural conditions.

Estudos recentes demonstraram a existência de Rickettsia felis, riquétsia do Grupo da Febre Maculosa, em sangue de pacientes com quadro clínico compatível com a doença e em pulgas infectadas. Este projeto visa determinar a prevalência de R. felis em vetores (pulgas e carrapatos) e em potenciais reservatórios (gambás, cães, gatos, eqüinos e humanos), procedentes de áreas endêmicas (Mogi das Cruzes, Pedreira, Piracicaba e São Paulo), e não endêmicas (Pirassununga) para FM no Estado de São Paulo. Foram utilizados métodos moleculares (reação em cadeia pela polimerase e sequenciamento de DNA), diagnóstico sorológico e cultivo celular. Em gambás capturados (Didelphis aurita e Didelphis albiventris) foram colhidas 312 pulgas, pertencentes às Famílias Pulicidae (141), Rhopalopsyllidae (170) e Ctenophthalmidae (1) e 709 carrapatos (Amblyomma spp e Ixodes loricatus). Nos cães foram colhidos 212 pulgas (Ctenocephalides felis felis) e 115 carrapatos (Amblyomma cajennense, Amblyomma aureolatum e Rhipicephalus sanguineus). Nos gatos foram colhidos 66 pulgas (59 C. felis felis e 7 Rhopalopsyllus lutzi lutzi) e 10 carrapatos (R. sanguineus e Amblyomma spp). A colheita de sangue foi realizada em 94 gambás, 55 cães, 25 gatos, 85 eqüinos e 238 humanos. Rickettsia felis foi detectada em 42-45,8% das pulgas C. felis felis de gambás, cães e gatos; em 4% das pulgas Polygenis (N) atopus de gambás e em 1,8% e 0,7% de carrapatos I. loricatus e Amblyomma spp, respectivamente, colhidos de gambás. Rickettsia bellii foi detectada em carrapatos I. loricatus (59,1%), A. dubitatum (8,7%) e Amblyomma spp (0,9%) e em uma pulga P. (N.) atopus (1%). Não foi possível a detecção de infecção por Rickettsia spp em sangue dos animais e humanos. Contudo, constatou-se presença anticorpos frente aos antígenos de Rickettsia rickettsii, Rickttesia parkeri, R. felis e R. bellii nas áreas estudadas. A titulação obtida sugere infecção por R. rickettsii em gambás, cães, eqüinos e humanos e por R. parkeri em gambás, cães e eqüinos. R. felis e R. bellii foram isoladas e cultivadas com a utilização de células C6/36 e VERO, respectivamente. / Recent studies have showed the presence of Rickettsia felis, a spotted fever group Rickettsiae, in human blood with clinical signs compatible with spotted fever and in infected fleas. This work aims to determine the prevalence of R. felis in potential vectors (fleas and ticks) and reservoirs (opossums, dogs, cats, equines and humans) from endemic (Mogi das Cruzes, Pedreira, Piracicaba e São Paulo), and non-endemic (Pirassununga) areas for spotted fever in the State of São Paulo. Molecular probes (polimerase chain reaction and DNA sequencing), serologic diagnoses and cell culture were used. From trapped opossums (Didelphis aurita and Didelphis albiventris) a total of 312 fleas, belonging to Family Pulicidae (141), Rhopalopsyllidae (170) and Ctenophthalmidae (1) and 709 ticks (Amblyomma spp and Ixodes loricatus) were collected. On dogs a total of 212 fleas (Ctenocephalides felis felis) and 115 ticks (Amblyomma cajennense, Amblyomma aureolatum and Rhipicephalus sanguineus) were collected. On cats, 66 fleas (59 C. felis felis and 7 Rhopalopsyllus lutzi lutzi) and 10 ticks (R. sanguineus and Amblyomma spp) were collected. Blood samples were collected from 94 opossums, 55 dogs, 25 cats, 85 equines and 238 humans. Rickettsia felis was detected in 42-45,8% of the C. felis felis collected on opossums, dogs and cats. This same Rickettsia species was detected in 4% of Polygenis (N.) atopus fleas, and 1,8% and 0,7% of I. loricatus and Amblyomma spp ticks, respectively, collected from opossums. Rickettsia bellii was found in ticks I. loricatus (59,1%), A. dubitatum (8,7%) and Amblyomma spp (0,9%) and in a flea P. (N.) atopus (1%). No Rickettsia DNA was detected in animal or human blood samples. However antibodies against Rickettsia rickettsii, Rickettsia parkeri, R. felis and R. bellii were detected in all locations. The titers suggest infection by R. rickettsii in opossums, dogs, equines and humans and by R. parkeri in opossums, dogs and equines. R. felis and R. bellii were isolated and cultivated with the C6/36 and VERO cells, respectively.

Rickettsia rickettsii é uma bactéria Gram-negativa, intra-celular obrigatória, causadora de uma grave riquetsiose em humanos, chamada no Brasil de Febre Maculosa Brasileira (FMB). Os carrapatos vetores de R. rickettsii para humanos, conhecidos até o momento no Brasil são Amblyomma cajennense e Amblyomma aureolatum. O presente estudo avaliou o tempo mínimo de parasitismo de A. aureolatum (ninfas não-alimentadas, machos adultos em jejum e pré-alimentados), infectadas por R. rickettsii, para que ocorra a transmissão da bactéria para o hospedeiro vertebrado. Para a produção de ninfas infectadas, foi mantida uma colônia de carrapatos em laboratório, infectados por R. rickettsii através de infestação em cobaias (Cavia porcellus) inoculadas por essa bactéria (Cepa Taiaçu). Para os experimentos com as ninfas de A. aureolatum, dividiram-se as cobaias em dez grupos de duas, sendo essas infestadas com dez ninfas cada uma. Após 2 horas da infestação (fixação da primeira ninfa), o primeiro grupo (G1) teve todas suas ninfas removidas. Após 4 horas de infestação, um segundo grupo (G2) de cobaias teve todas suas ninfas removidas de forma semelhante. Este procedimento foi repetido com os demais grupos, cada um em um determinado número de horas após a infestação: após 6 (G3), 8 (G4), 12 (G5), 18 (G6), 24 (G7), 36 (G8) e 48 (G9) horas. Para um último grupo (G10), as ninfas foram deixadas em parasitismo até seu desprendimento natural (cerca de 10 dias). Os experimentos realizados com carrapatos machos adultos em jejum seguiram os mesmos períodos utilizados para as ninfas, para fixação e retirada de carrapatos, assim como o número de cobaias. Nos experimentos com carrapatos machos adultos previamente alimentados - 48 horas em coelhos (Oryctolagus cuniculus), utilizaram-se os períodos de fixação e retirada de carrapatos idênticos aos experimentos anteriores, e além desses foi necessária a utilização de períodos menores de fixação de A. aureolatum, variando entre um minuto e uma hora. As cobaias foram avaliadas clinicamente todos os dias, e sacrificadas 21 dias após a infestação. Amostras de sangue foram colhidas e testadas para presença de anticorpos anti-R. rickettsii. Carrapatos retirados das cobaias de todos os grupos foram testados por PCR, a fim de se certificar que estavam infectados por R. rickettsii. De acordo com os resultados obtidos, ninfas não alimentadas de carrapatos A. aureolatum, infectados por R. rickettsii, necessitam realizar o repasto sanguíneo por um período mínimo de 12 horas, para que ocorra a transmissão da bactéria ao hospedeiro vertebrado; carrapatos adultos não alimentados, infectados por R. rickettsii, necessitam realizar o repasto sanguíneo por um período mínimo de 10 horas, para que ocorra a transmissão da bactéria ao hospedeiro vertebrado; e carrapatos adultos infectados por R. rickettsii e pré-alimentados em coelhos por 48 horas, necessitam realizar o repasto sanguíneo por um período mínimo de 10 minutos, para que ocorra a transmissão da bactéria ao hospedeiro vertebrado, utilizando-se cobaias como modelo experimental. / Rickettsia rickettsii is the causative agent of the most severe rickettsiosis, known in Brazil as Brazilian Spotted Fever (BSF). Tick vectors of R. rickettsii to humans in Brazil are Amblyomma cajennense and Amblyomma aureolatum. The present study determined the minimum feeding period required for A. aureolatum-infected unfed nymphs, unfed adults, and fed adults to transmit infective forms of R. rickettsii to naïve guinea pigs. For this purpose, we used nymphs and adults of a laboratory colony of A. aureolatum, previously shown to be 100% infected by R. rickettsii strain Taiaçu. Infected nymphs were allowed to infest 10 groups of hosts, each containing 2 guinea pigs, with each individual guinea pig receiving 10 infected. After two hours of parasitism (counting from the moment when the first infected nymph attached to the skin), this group had all infected nymphs manually removed and saved for further molecular analysis. After 4 hours of infection, guinea pigs of a second group had all their nymphs similarly removed. This procedure was repeated with the other groups, each at a given number of hours after infestation: 6, 8, 12, 18, 24, 36, and 48h. For an additional group, nymphs were allowed to complete feeding period (96-120h). In another experiment, this whole procedure was performed with adult ticks, being one infected male tick per naïve guinea pig. In a third experiment, adult male ticks were pre-fed on rabbits for 48h before allowing to feed on naive guinea pigs for 1, 3, 5, 10, 20, 40 or 60 minutes, and then for 2 to >48h. Clinical signs and rectal temperature were evaluated daily in each guinea. Blood samples were collected at 21 days after infestation, and tested for presence of anti-R. rickettsii antibodies. All removed ticks in all groups showed to contain rickettsial DNA by PCR. According to the results, unfed nymphs of R. rickettsii-infected A. aureolatum ticks must feed for a minimum of 12 hours to transmit the bacterium to the vertebrate host; unfed R. rickettsii-infected adult ticks must feed for a minimum of 10 hours for transmission to occur, while previously fed adult ticks must feed for a minimum of 10 minutes to transmit R. rickettsii to vertebrate hosts, using guinea pigs as experimental model.

Em trabalho recente, foi encontrada a infecção de 9,7% da população de Amblyomma triste por Rickettsia parkeri, agente etiológico de riquetsiose humana, na várzea do Rio Paraná, no município de Paulicéia. Desta forma o presente trabalho busco a soroprevelência de anticorpos anti-R. parkeri em humanos, cavalos, cães e gambás; e a prevalência de infecção por R. parkeri em ectoparasitas e diferentes áreas do local. Os carrapatos adultos e ninfas coletados foram identificados com chaves específicas e as larvas por técnicas moleculares (PCR para gene 16S rRNA mitocondrial, seguido de sequenciamento). Também foi feito o teste de presença de DNA de Rickettsia. Amostras de soro sanguineo de cães, cavalos e humanos foram analisadas pela técnica de reação de imunoflurescência indireta, para a pesquisa de anticorpos anti-R. rickettsii, R. parkeri, R. bellii, R. amblyommii, R. riphicephalii e R. felis. De 1699 carrapatos coletados, a maioria (1511) foi Amblyomma. Cajennense. Os demais pertenciam às espécies A. coelebs (6), A. triste (2), A. dubitatum (114), Rhipicephalus (Boophilus) microplus (55), Dermacentor nitens (10) e Amblyomma rotundatum (1). Somente 2 ninfas da espécie A. coelebs estavam infectadas com Rickettsia, com sequências 99% de identidade para o gene ompA R. amblyommii. Dos soros de humanos coletados 25 foram negativos e somente um apresentou títulos ≤64 para R. parkeri e R. rickettsii. De 140 soros dos equinos, 24% apresentou anticorpos anti-Rickettsia, com títulos variando de 64 a 1024, sendo que nove amostras tinham títulos anti-R. parkeri pelo menos quatro vezes maior que os para demais espécies de Rickettsia, indicando a R. parkeri como provável antígeno homólogo. Em 55 amostras de cães 7,7% apresentaram anticorpos anti-Rickettsia, com títulos variando de 64 a 256. Para duas amostras a R. parkeri foi o provável antígeno homólogo. Analisando os questionários epidemiológicos dos eqüinos, juntamente com os resultados sorológicos, a regressão logística indicou associação estatisticamente significante entre a presença de anticorpos anti-Rickettsia com as varáveis independentes (i) acesso à várzea (ii) e tempo de residência na região, os quais podem ser considerados fatores de risco para rickettsiose na região estudada. Foram capturados quatro gambás (Didelphis albiventris) e todos tinham anticorpos para R. parkeri, R. rickettsii, R. amblyommii e R. rhipicephalii, porém sem variação de pelo menos quatro vezes entre os títulos. Os gambás estavam infestados com ninfas A. cajennense e A. coelebs, todas negativas para o PCR para Rickettsia. Em vista destes resultados pode-se dizer que os animais domésticos e os gambás estiveram em contato com bactérias do gênero Rickettsia na região estudada, onde a várzea parece ser a principal foco de carrapatos infectados. / In recent work, 9.7% of the Amblyomma triste of the marsh by the Paraná River in Paulicéia, State of São Paulo, was found infected with Rickettsia parkeri, the etiological agent of spotted fever rickettsiosis in humans. Based on this report, the present study aimed to determine soroprevelence of anti-R. parkeri antibodies in humans, horses, dogs and opossuns, and the prevalence of rickettsial infection in ectoparasites, in different areas of Paulicéia. While ticks were identified by using current morphological Keys for adults and nymphs, larva were identified to species by molecular methods (PCR targeting the mitochondrial 16S rRNA gene followed by DNA sequencing). Ticks were tested by PCR for the presence of Rickettsia DNA. Animal and human sera samples were tested by immunofluorescence assay (IFA) for the presence of antibodies reactive to R. rickettsii, R. parkeri, R. belli, R. amblyommii, R. riphicephalii and R. felis. From 1699 collected ticks, a vast marjority (1511) was Amblyomma. cajennense. The remaining were the especies A. coelebs (6), A. triste (2), A. dubitatum (114), Rhipicephalus (Boophilus) microplus (55), Dermacentor nitens (10) and Amblyomma rotundatum (1). Only two nymphs of A. coelebs were found infected by Rickettsia, yielding DNA sequences 99% identical to the gene ompA of R. amblyommii. 25 of human sera collected were negative, except for one for one that showed endpoint titer ≤64 to both R. parkeriand R. rickettsii. Among horses, 24% sera contained anti Rickettsia antibodies, with titles ranging from 64 to 1024, nine samples showed anti-R. parkeri titles at least four times higher than the remaining Rickettsia species, indicating that these animals had been infected by R. parkeri. For 55 dogs, 7.7% anti Rickettsia antibodies, with endpoint titles ranging from 64 to 256. For two canine serum R. parkeri was considered the possible agent responsible for the infection. Through statistical analyses of the serological results with independent variables, the presence of seropositive horses was significantly associated with (i) grazing in the marsh (ii) and being for more than 8.5 years in the region; these two independent variables were considered to be risk factors for rickettsiosis in the study region. A total of four opossums (Didelphis albiventris) were captured. All four had antibodies reactive to R. parkeri, R. rickettsia, R. amblyommii and R. rhipicephalii, however, with less than 4-fold differences between endpont titers to different Rickettsia species. Opossums were found infested by nymphs of A. cajennense and A. coelebs, all negative to Rickettsia by PCR. Based in these results, it is concluded that domestic animals and opossums had been in contact with Rickettsia of the spotted fever group in the study region, where the marsh area seems to be the main focus of Rickettsia-infected ticks

A febre maculosa é uma zoonose emergente causada por bactérias do gênero Rickettsia do Grupo da Febre Maculosa (GFM). Este estudo foi delineado para comprovar indiretamente a infecção por riquétsias em humanos e animais e, diretamente em carrapatos Amblyomma cajennense. As amostras foram colhidas no município de Pedreira, região endêmica do estado de São Paulo. A reação de imunofluorescência indireta foi positiva em 31,2% e 77,3% dos soros de cães e eqüinos, respectivamente. Nenhum humano se apresentou positivo para esse teste. Para confirmar a infecção natural dos carrapatos adultos, utilizou-se o teste de hemolinfa, que se revelou insatisfatório. Larvas, ninfas e adultos de A. cajennense foram submetidos à técnica de reação em cadeia pela polimerase (PCR). As reações resultaram na amplificação de um fragmento (230pb) do gene codificador da proteína 17 kDa, somente em adultos (4,7%) e em larvas (1,1%). Não foi possível a amplificação de nenhum fragmento de outros genes testados (citrato sintase, OmpA e OmpB). Os produtos amplificados pela PCR de dois carrapatos adultos e de quatro larvas foram seqüenciados, apresentando 100% de similaridade com Rickettsia felis; e de 99,4% a 100% de similaridade com Rickettsia rickettsii, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri e Rickettsia peacockii, respectivamente. A detecção de positividade em larvas não alimentadas confirma a ocorrência da transmissão transovariana de riquétsias na espécie A. cajennense. A alta identidade observadas entre as riquétsias estudadas e as espécies acima mencionadas sugere a existência dessas bactérias na região. Contudo, maiores estudos deverão ser realizados, uma vez que as sequências de bases do fragmento de DNA estudado não permite a distinção entre as diferentes riquétsias do GFM. / Spotted fever is an emergent zoonosis caused by Rickettsia from the Spotted Fever Group. This study was designed to indirectly detect the human and animals infection by rickettsiae, and to directly detect the Amblyomma cajennense tick infection. The samples were collected at the Pedreira County, an endemic region of the State of São Paulo. The indirect imunofluorescence assay was positive for 31.2 % of canine and for 77.3% of equine examined sera. No human serum was positive by the use of this serological tests. In order to confirm the adult tick natural infection, it was used the hemolymph test, which showed to be unsatisfactory. The larvae, nymph and adult tick rickettsiae detection was performed by the use of the polymerase chain reaction (PCR). The PCR resulted on the amplification of a 230 bp fragment of the gene encoding the17 kDa protein, in adults (4.7%) and larvae (1.1%) only. It was not possible to amplify any other tested gene fragment (citrate synthase, OmpA and OmpB). The PCR amplified products from two adult ticks and from four larvae were sequenced, and presented 100% of similarity with Rickettsia felis and from 99,4% to 100% of similarity to Rickettsia rickettsii, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri and Rickettsia peacockii, respectively. The rickettsia detection in non-fed larvae confirms the occurrence of the rickettsiae transovarian transmission in A. cajennense specie. The high identity observed among the present studied rickettsiae and the above cited rickettsia species suggests the presence of these bacteria in Pedreira County. However, once the sequences of bases of the studied amplified DNA fragment did not allow the differentiation among the SFG rickettsiae, further studies are necessary.

There are a huge number of pathogens with multi-component transmission cycles, involving ampli_er hosts, vectors, complex pathogen life cycles and particular environmental conditions. These complex systems present challenges in terms of modeling and policy development. The deadliest tick-borne infectious disease in the world, the Brazilian Spotted Fever (BSF), is a relevant example of that. The current increase of human cases of BSF has been associated with the presence and expansion of capybaras Hydrochoerus hydrochaeris, amplifer host for the agent Rickettsia rickettsii and primary host for the tick vector Amblyomma sculptum. The objective of this thesis was to analyze the dynamics of the FMB with the purpose of providing bases for the planning of strategies focused on the prevention of human cases. We proposed diferent approaches to evaluating: i) the contribution of hosts and vectors in the transmission of BSF, ii) potential risk areas and anthropogenic parameters associated with the occurrence of human cases, iii) the pattern and the spatial propagation velocity of BSF, and iv) climatic and landscape factors that could be related to the distribution of the vector. The proposed approaches elucidated how BSF control and prevention strategies can be focused on the management of amplifier hosts populations. We found that geographical barriers generated, for example, by areas of riparian reforestation, could prevent the spatial spread of BSF, since a positive association between the occurrence of human cases and the increment of sugarcane crop was determined, as well as a higher propagation velocity of BSF in places with higher carrying capacity. This thesis was interdisciplinary and required, on one hand, expertise in biology, computational epidemiology, mathematics and statistics and on the other hand, a datarich environment such as the Laboratory of Parasitology of the VPS/FMVZ/USP. The results of this thesis can be usefulness in the planning of public health policies related to the prevention of BSF. Furthermore, this work will open the path to further mathematical and computational studies focused on the dynamics and prevention of other vector-borne infectious diseases. / Existe um grande número de agentes patogênicos com ciclos de transmissão complexos, envolvendo hospedeiros amplificadores, vetores e condições ambientais particulares. Esses sistemas complexos apresentam desafios quanto a modelagem e desenvolvimento de políticas públicas. A Febre Maculosa Brasileira (FMB) é a doença transmitida por carrapatos mais letal do mundo e é um claro exemplo de um sistema complexo. O aumento atual de casos humanos de BSF tem sido associado à presença e expansão de capivaras Hydrochoerus hydrochaeris, hospedeiros amplificadores do agente Rickettsia rickettsii e hospedeiros primários do carrapato vetor Amblyomma sculptum. O objetivo desta tese foi analisar a dinâmica da FMB com o propósito de fornecer bases para o delineamento de estratégias de prevenção de casos em humanos. Diferentes abordagens foram propostas para avaliar: i) a contribuição específica de hospedeiros e vetores na transmissão da FMB, ii) os parâmetros antropogênicos associados com a ocorrência dos casos e potenciais áreas de risco, iii) o padrão e a velocidade de propagação espacial e da doença, e iv) os fatores climáticos e paisagísticos que poderiam estar relacionados à distribuição do vetor. Os modelos propostos elucidaram que as estratégias de controle e prevenção da FMB podem estar focadas em práticas de manejo das populações de hospedeiros amplificadores. Uma vez que uma associação positiva entre ocorrência de casos humanos e o incremento de cultura de cana-de-açúcar foi determinada, assim como uma maior velocidade de propagação da FMB em locais com alta quantidade desta cultura, barreiras geográficas geradas, por exemplo, por zonas de reflorestamento ciliar, poderiam impedir a disseminação da FMB. Esta tese foi interdisciplinar e exigiu, por um lado, conhecimentos em biologia, epidemiologia computacional, matemática e estatística e, em contrapartida, um ambiente rico em dados biológicos como o Laboratório de Parasitologia do VPS/USP. Os resultados desta tese poderão ser utilizados na planificação de políticas de saúde pública enfocadas à prevenção da FMB. Complementarmente, este trabalho abrirá o caminho para futuros estudos matemáticos e computacionais orientados no estudo da dinâmica e prevenção de outras doenças infecciosas transmitidas por vetores.

O carrapato Amblyomma cajennense é o principal vetor da bactéria Rickettsia rickettsii, agente etiológico da febre maculosa brasileira (FMB). Os estágios imaturos destes artrópodes apresentam uma baixa especificidade para os hospedeiros, o que aumentam as chances de parasitismo em humanos. Nos anos de 2011 e 2012, a vigilância epidemiológica da FMB registrou 140 casos confirmados e letalidade de 50 por cento , a maior incidência desde a regulamentação da notificação compulsória no Estado de São Paulo, em 2001. Além disso, estudos indicam uma tendência de aumento de expansão geográfica e de número de casos da doença. A fim de aplicar medidas de controle para a FMB, a determinação de quais são os animais hospedeiros para as fases imaturas do carrapato é importante para identificar as fontes de infecção de bactérias. Entre a literatura científica não havia estudos sobre esse escopo para carrapatos da América do Sul. Neste estudo, uma abordagem para a detecção de hábito alimentar de A. cajennense foi padronizada. Resumidamente, as amostras de sangue foram coletadas a partir das seguintes espécies animais: frango, capivara, codorna, cavalo, cobaia, coelho, cachorro e um camundongo silvestre. Em seguida, o DNA foi extraído a partir destas amostras e, depois, testado para a amplificação por PCR utilizando-se três pares de diferentes oligonucleotídeos iniciadores para mamíferos, três para aves e cinco para os dois grupos de animais, além de oligonucleotídeos iniciadores específicos desenhados para roedores cricetídeos. Os genes alvos 12S rDNA, cyt b e COI resultou em positivo para a detecção de fragmentos de DNA. Por PCR foi testado posteriormente em laboratório repastos de carrapatos. Carrapatos adultos de A. cajennense que foram alimentados em coelhos quando larvas e ninfas tiveram o intestino extraído e processado para o isolamento de DNA que foi submetido à amplificação por PCR. Foi possível identificar a espécie hospedeira em 66,7 por cento dos carrapatos testados. O sequenciamento de DNA e a comparação das sequências consenso com todas as sequências do banco de dados (GenBank) permitiu a identificação em nível de espécie (coelho), com base em 98 por cento de similaridade. / The tick Amblyomma cajennense is the main vector of the bacterium Rickettsia rickettsii, the etiological agent of brazilian spotted fever (BSF). The subadult stages of this arthropod present a low specificity for hosts, which increases the chances of parasitism in humans. In the years of 2011 and 2012, the BSF epidemiological surveillance recorded 140 confirmed cases and 50 per cent case-letality rate, the highest incidence since the regulation of the compulsory notification in the State of São Paulo, in 2001. Furthermore, studies indicate an increase trend for geographical expansion and number of cases of the disease. In order to apply control measures for BSF, the determination of which is the vertebrate hosts for the immature stages of the tick is important to identify the sources of infection of bacteria. Among the scientific literature there was no studies on this scope for ticks of South America. In this study, it was standardized a approach for detection of feeding habits of A. cajennense. Briefly, blood samples were collected from the following animal species: chicken, capybara, quail, horse, guinea pig, rabbit, dog and a wild mouse. Then, DNA was extracted from these samples and afterwards tested for PCR amplification using three different pairs of primers for mammals, three for birds, and five for both groups of animals in addition to a specific designed primers for cricetidae rodents. The target gene 12S rDNA, cyt b and COI resulted in positive for detection of DNA fragments. PCR was tested thereafter on laboratory fed ticks. Adult A. cajennense ticks that were fed on rabbits as larvae and nymphs had the midguts extracted and processed for DNA isolation and underwent PCR amplification. It was possible to identify the host species on 66,7 per cent of tested ticks. The DNA sequencing and comparison of the consensus sequences of all the database sequences (GenBank) allowed the identification at the species level (rabbit), based on 98 per cent similarity.

This study aimed to evaluate the ability of nymphs of Amblyomma ovale naturally infected with Rickettsia parkeri (Atlantic Forrest strain) in transmitting it to Cavia porcellus (guinea pigs), and analyze the infection in these animals. A total of 26 guinea pigs divided into three groups were used: G1 - 10 guinea pigs infested with nymphs of uninfected A. ovale; G2 - 10 guinea pigs infested with nymphs of A. ovale naturally infected with R. parkeri (Atlantic Forrest strain) and G3 - 6 uninfected guinea pigs. A tick infestation chamber was fixated on the animals, where 25 nymphs of A. ovale, either infected or not, were placed. In the first study, the vector competence of A. ovale nymphs in the transmission of R. parkeri (Atlantic Forrest strain) for C. porcellus (animals of G1 and G2) was evaluated. After the period of parasitism, engorged nymphs were collected and stored in a B.O.D incubator. To assess the anti-Rickettsia spp antibodies, blood was collected at 7, 14, 21 and 28 days post infestation (DPI) being evaluated by indirect immunofluorescence assay (IFA). To identify the multiplication of Rickettsia in the tissue from guinea pigs a polymerase chain reaction was carried out at 7, 10, 14 and 28 DPI. To verify the vector competence of nymphs, parasite periods, the percentage of molting, transstadial survival and IFA were analyzed. The average period of parasitism in G1 was 6.6 days and 6 days in G2. The average percentage of molting (nymph to adult) was 95%. In G2, the survival of transstadial Rickettsia was confirmed in 100% (PCR) and 80% (hemolymph test) of adults. In serological analysis, 100% of G1 animals were seronegative and 80% were seropositive in G2. No riquetsial DNA was detected in the tissues of animals. In the second study, the profile of experimental infection caused by rickettsia in guinea pigs (animals from G1, G2 and G3) were analyzed, seeking to identify the clinical, histopathological and hematological profile. Blood samples for hematological analyzes were performed in the same periods of the previous study and the collection of tissue for histopathological analyzes, occurred at 10 and 28 DPI. In serology, animals from G1 and G3 were negative and 80% of the G2 positive. The observed hematological results were: G1 - leukopenia at 7 DPI, increased total plasma proteins (TPP) and decreased platelets at 7, 14 and 21 DPI, G2: leukocytosis, neutrophilia and monocytosis at 7 DPI, increased platelets at 14 DPI and decreased PPT at 21 DPI. Histopathology observed: G1 - diffuse splenic hemosiderosis at 28 DPI (20%), G2 - diffuse splenic hemosiderosis at 10 DPI (10%), diffuse pulmonary congestion at 10 and 28 DPI (30%) and multifocal splenic follicular hyperplasia at 28 DPI (20%); G3 - diffuse pulmonary congestion at 10 DPI (33%). It was concluded that nymphs of A. ovale presented vector competence in the transmission of R. parkeri (Atlantic Forrest strain) to guinea pigs, being possible to determine an acute infection of subclinical character in these hosts. / Este estudo teve como objetivos avaliar a capacidade de ninfas de Amblyomma ovale naturalmente infectadas com Rickettsia parkeri (cepa Mata Atlântica) em transmiti-la para Cavia porcellus (cobaios) e, analisar a infecção nestes animais. Utilizou-se 26 cobaios divididos em três grupos: G1 - 10 cobaios infestados com ninfas de A. ovale não infectadas, G2 - 10 cobaios infestados com ninfas de A. ovale naturalmente infectadas com R. parkeri (cepa Mata Atlântica) e G3 - 6 cobaios não infestados. Foi fixada uma câmara de infestação de carrapatos nos animais onde foram colocadas 25 ninfas de A. ovale infectadas ou não, de acordo com o grupo. No primeiro estudo foi avaliado a competência vetorial de ninfas de A. ovale na transmissão de R. parkeri (cepa Mata Atlântica) para C. porcellus (animais do G1 e G2). Após o período do parasitismo, as ninfas ingurgitadas foram coletadas e armazenadas em estufa B.O.D. Para a pesquisa de anticorpos anti-Rickettsia spp., coletou-se soros sanguíneos aos 7, 14, 21 e 28 dias pós infestação (DPI) sendo avaliados por meio de reação de imunofluorescência indireta (RIFI). Para a identificação da multiplicação desta riquétsia nos tecidos dos cobaios foi realizada a reação em cadeia da polimerase aos 7, 10, 14 e 28 DPI. Para verificar a competência vetorial das ninfas, analisaram-se os períodos parasitários, o percentual de ecdise, a sobrevivência transestadial e a RIFI. O período médio de parasitismo no G1 foi de 6,6 dias e, de 6 dias no G2. O percentual médio de ecdise (ninfa para adulto) foi de 95%. No G2, a sobrevivência desta riquétsia de forma transestadial foi confirmada em 100% (PCR) e 80% (teste de hemolinfa) dos adultos. Na análise sorológica, 100% dos animais do G1 foram soronegativos e 80% do G2 soropositivos. Não foi detectado o DNA riquetsial nos tecidos dos animais. No segundo estudo, avaliou-se o perfil da infecção experimental causada por esta riquétsia nos cobaios (animais do G1, G2 e G3), buscando identificar as alterações clínicas, perfil hematológico e histopatológico. As coletas sanguíneas para análises hematológicas foram realizadas nos mesmos períodos do estudo anterior e, as coletas de tecidos para análises histopatológicas, ocorreram aos 10 e 28 DPI. Na sorologia, os animais do G1 e G3 fora negativos e, 80% dos animais do G2 positivos. Os resultados hematológicos observados foram: G1 - leucopenia aos 7 DPI, aumento de proteínas plasmáticas totais (PPT) e diminuição de plaquetas aos 7, 14 e 21 DPI; G2: leucocitose, neutrofilia e monocitose aos 7 DPI, aumento de plaquetas aos 14 DPI e diminuição de PPT aos 21 DPI. Na análise histopatológica observou-se: G1 - hemossiderose difusa esplênica aos 28 DPI (20%); G2 - hemossiderose difusa esplênica aos 10 DPI (10%), congestão difusa pulmonar aos 10 e 28 DPI (30%) e hiperplasia folicular multifocal esplênica aos 28 DPI (20%); G3 - congestão difusa pulmonar aos 10 DPI (33%). Concluiu-se que ninfas de A. ovale apresentaram competência vetorial na transmissão de R. parkeri (cepa Mata Atlântica) para cobaios, sendo possível determinar uma infecção aguda de caráter subclínico nestes hospedeiros.