Introduction: L’activation des cellules stellaires hépatiques (CSHs) est un point clé du processus de fibrose hépatique. Les lymphocytes T CD4+ intra-hépatiques sont une source majeure de cytokines anti-inflammatoires comme l’IL-10 et pro-inflammatoire (IL-17A), hépatoprotectrice (IL-22) produites par les Th17. Les Th17 sont impliqués dans de nombreuses pathologies inflammatoires mais l’effet de ces cellules sur les CSHs n’est pas encore élucidé. Objectif: Comprendre le rôle des cytokines de type Th17 dans le processus d’activation des CSHs. Méthodes: La lignée de CSHs humaine LX2 a été stimulée par l’IL-17A ou l’IL-22 puis comparée à des cellules traitées par le TGF-b et le tampon phosphate salin (PBS). L’activation des CSHs a été évaluée en examinant les molécules profibrotique alpha-smooth muscle actin (a-SMA), collagène de type I (COL1A1) et inhibiteur produits par les tissus des métalloprotéases matricielles I (TIMP-I) par q-PCR. L’expression protéique a été validée par immunobuvardage ou coloration au rouge de picro Sirius. L’expression membranaire de l’IL-10Rb, du TGF-b-RII et de l’IL-17RA a été mesurée par cytométrie en flux. Résultats: L’IL-17A et l’IL-22 n’activent pas les cellules LX2, car aucune induction d’a-SMA, de COL1A1 et de TIMP-I n’a été observée. Cependant, l’IL-17A et l’IL-22 sensibilisent les CSHs à l’action du TGF-b, tel que démontré par une forte expression et production d’a-SMA, collagène type I et TIMP-I. L’IL-17A, mais pas l’IL-22, induit la surexpression à la surface cellulaire du TGF-b-RII et inhibe partiellement la baisse d’expression du TGF--RII après stimulation au TGF-b. Conclusion: Nos résultats démontrent une fonction pro-fibrotique de l’IL-17A et de l’IL-22, car les deux cytokines sensibilisent les CSHs à l’action du TGF-b. L’IL-17A agit via la surexpression et la stabilisation du TGF-b-RII tandis que l’IL-22 agit probablement par des mécanismes intracellulaires. / Background: Activated hepatic stellate cells (HSCs) are key initiators of the fibrogenic process. Intrahepatic CD4+ T cells are major producers of hepatoprotective cytokines such as IL-10 produced by regulatory T cells (Tregs) or inflammatory and regulatory cytokines like IL-17 and IL-22 produced by Th17 cells. Th17 cells have been implicated in various conditions or liver damage but the mechanism of action of Th17 cytokines on HSC is still poorly understood. Aims: To understand the role of the different Th17 cytokines (IL17-A and IL-22) in modulating HSC activation. Methods: The HSC line LX2 was stimulated with increasing doses of IL-17A or IL-22, and compared to TGF-b and PBS-treated cells. Activation of HSCs was evaluated by examining the expression of the pro-fibrotic molecules alpha-smooth muscle actin (a-SMA), collagen type I (COL1A1) and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase I (TIMP-I) by q-PCR. Protein expression was validated by either western blot or picro Sirius red stain. Cell surface expression of the cytokine receptors IL-10Rb, TGF-b-RII and IL-17RA was evaluated by flow cytometry. Results: IL-17A and IL-22 alone did not induce LX2 activation, as no induction of a-SMA, COL1A1 and TIMP-I was observed. However, both IL-17A and IL-22 sensitized HSCs to the action of suboptimal doses of TGF-b, confirmed by strong a-SMA, collagen type I and TIMP-I gene expression and protein production. IL-17A but not IL-22 upregulated TGF-b-RII cell surface expression and partially inhibited TGF-b-RII downmodulation upon TGF-b stimulation. Conclusion: Our results demonstrated a pro-fibrotic function for IL-17A and IL-22, as both cytokines sensitize HSC to the action of TGF-b. IL-17A acts through upregulation and stabilization of the TGF-b-RII while IL-22 probably acts through an intracellular mechanism.

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Les interneurones de la couche moléculaire du cervelet (ICM: cellules en panier et cellules étoilées) sont connectés par des synapses électriques fréquentes et puissantes chez les jeunes rats et souris autour de la fin de la deuxième semaine postnatale. Les courants capacitifs des ICM montrent une composante lente qui reflète la charge des interneurones couplés électriquement. Leur analyse permet de quantifier le nombre de cellules directement couplées à une cellule et le nombre équivalent de cellules couplées (Alcami et Marty, soumis), et d'établir une difference de couplage entre les cellules en panier et les cellules étoilées pendant le développement postnatal. Elle a mené à proposer une topologie de réseau des cellules en panier. La force du couplage peut être modulée par les courants intrinsèques, dont Ih dans le domaine hyperpolarisant. Les synapses électriques modifient la propagation et les patrons d'activité dans le réseau des ICM en réponse à une excitation du réseau.L'étude de la connectivité des ICM par des synapses chimiques GABAergiques nous a mené à réexaminer les sources d'erreur des mesures d'activité électrique en configuration cellule attachée (Alcami et coll., 2012). Les mesures en cellule attachée peuvent modifier l'activité électrique des ICM en introduisant un couplage conductif entre la pipette d'enregistrement et l'intérieur cellulaire, résultant d'une combinaison de mécanismes de couplage passifs et actifs. / Molecular layer interneurons of the cerebellum (MLIs: basket cells and stellate cells) are connected by frequent and strong electrical synapses in young rats and mice around the end of the second postnatal week. Capacitive currents of MLIs show a slow component that reflects the charge of electrically-coupled MLIs. The analysis of capacitive currents makes it possible to quantify the number of directly connected cells and the equivalent number of coupled cells (Alcami and Marty, submitted). They were used to show a difference in coupling between basket and stellate cells and propose a model of the basket cell coupled network. Electrical coupling strength can be modulated by intrinsic currents, like the h current in the hyperpolarizing range. Electrical synapses modify the propagation and the patterns of activity in the MLI network, when the network is excited.The study of connectivity of MLIs by chemical GABAergic synapses led us to reevaluate the sources of error of cell-attached recordings (Alcami et al., 2012). Cell-attached measurements can modify cellular electrical activity of MLIs, by introducing a conductif coupling between the recording pipette and the cell interior, resulting from a combination of passive and active coupling.

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La réponse immunitaire est régulée spatialement et temporellement. Les cellules immunitaires font partie d’une plus grande communauté de populations cellulaires interconnectées qui coordonnent leurs actions par la signalisation intercellulaire. Suivant une blessure hépatique, la distribution et la composition du compartiment immunitaire évoluent rapidement au fil du temps. Par conséquent, l’information sur la position des cellules immunitaires dans le tissu hépatique est essentielle à la bonne compréhension de leurs fonctions dans la santé et la maladie. Cependant, l’organisation spatiale des cellules immunitaires en réponse à une atteinte hépatique aiguë, ainsi que les conséquences fonctionnelles de leur distribution topographique spécifique, restent mal comprises. Les macrophages hépatiques sont des cellules effectrices clés pendant l’homéostasie et en réponse à des blessures, et sont impliqués dans la pathogenèse de plusieurs maladies du foie. L’hétérogénéité et plasticité des macrophages dans le foie a été exposée avec l’émergence du séquençage de l’ARN, la cytométrie en flux et la cytométrie de masse. Ces techniques ont sensiblement contribué à la compréhension de l’origine, et fonctions des macrophages dans le foie. Cependant, ces technologies impliquent la destruction du tissu pour la préparation de suspension cellulaires ce qui entraîne une perte d’information spatiale et de contexte tissulaire. Par conséquent, la caractérisation spatiale et temporelle des macrophages dans le tissu hépatique pendant l’homéostasie tissulaire, et en réponse à une blessure, fournit une nouvelle information sur la façon dont les macrophages se rapportent aux cellules voisines et leur comportement pendant les réponses immunitaires. Dans la première partie de cette étude, nous avons conçu une stratégie pour le phénotypage spatial des cellules immunitaires hépatiques dans des échantillons de tissus. Cette stratégie combine techniques d'imagerie et l’alignement numérique des images pour surmonter les limitations actuelles du nombre de marqueurs pouvant être visualisés simultanément. En outre, nous avons généré des protocoles pour la quantification automatisée des cellules d’intérêt dans des sections de tissus pour réduire la subjectivité associée à la quantification par inspection visuelle, et pour augmenter la surface et la vitesse de l’analyse. Par conséquent, un plus grand nombre de populations de cellules immunitaires ont été visualisées, quantifiées et cartographiées, et leurs relations spatiales ont été déterminées. Dans la deuxième partie de l’étude, nous avons déterminé la cinétique et la dynamique spatiale des cellules de Kupffer (KCs) et des macrophages dérivés de monocytes (MoMFs) en réponse à une atteinte hépatique aiguë au CCl4, afin de mieux comprendre leurs rôles fonctionnels, et la répartition du travail entre eux. Nous avons constaté que les KC et les MoMFs présentent des différences au niveau de la distribution tissulaire, la morphologie, et la cinétique. En plus, seulement les KCs ont proliféré pour repeupler la population de macrophages résidents pendant la réparation tissulaire. Finalement, nous avons montré que le degré de colocalization de KCs et des MoMFs avec les cellules stellaires est différent. En plus, cette colocalisation varie avec la progression de la réponse immunitaire. Dans l’ensemble, nous avons montré que les KCs et les MoMFs ont des profils spatiaux et temporels différents en réponse à une atteinte hépatique aiguë. Dans l’ensemble, les observations faites dans cette étude suggèrent que le comportement spatial et temporel d’une sous-population donnée de cellules immunitaires est distinct et sous-tend sa capacité à remplir ses fonctions spécifiques pendant la réponse immunitaire. / The immune response is spatially and temporally regulated. Immune cells are part of a larger community of interconnected immune and non-immune cell populations that coordinate their actions mostly through cell-cell intercellular signaling. In the liver, the distribution pattern, and the composition of the immune compartment evolve during an immune response to injury influencing disease pathology, progression, and response to treatment. Hence, information on the location and interacting partners of immune cells in the hepatic tissue is critical for the proper understanding of their functions in health and disease. However, the spatial organization of hepatic resident and infiltrating immune cells in response to acute injury, and the functional consequences of their specific topographical distribution, remain poorly defined. Hepatic macrophages are key effector cells during homeostasis and in response to injury and are involved in the pathogenesis of several liver diseases. The heterogeneity and plasticity of the macrophage compartment in the liver have only recently started to be appreciated with the emergence of RNA sequencing, flow cytometry, and mass cytometry. Detailed transcriptomic and phenotypic profiling have deeply expanded our understanding of macrophage biology. However, these technologies involve tissue disruption with loss of spatial information and tissue context. Therefore, the spatial and temporal profiling of liver macrophages in tissue samples during the steady state, and in response to injury, provide novel information on how the macrophages relate to neighboring cells and their behavior during immune responses. In the first part of this study, we designed a strategy for the spatial phenotyping of hepatic immune cells in tissue samples. This strategy combined serial and sequential labeling, and digital tissue alignment to overcome current limitations in the number of markers that can be simultaneously visualized. In addition, we generated protocols for automated quantification of cells of interest in whole tissue sections which removed the subjectivity associated with quantification by visual inspection and greatly increased the area and the speed of the analysis. As a result, a larger number of immune cell populations were visualized, quantified, and mapped, and their spatial relations were determined in an unbiased manner. In the second part of this study, we monitored the kinetics, and spatial dynamics of resident Kupffer cells (KCs) and infiltrating monocyte-derived macrophages (MoMFs) in response to acute liver injury with CCl4, to gain insight into their functional roles, and the distribution of labor between them. KCs and MoMFs exhibited different tissue distribution patterns and cell morphology, different kinetics, and occupied neighboring but unique microanatomical tissue locations. KCs and MoMFs displayed a different capacity to replenish the macrophage pool upon acute injury, and were differentially related to hepatic stellate cells. Different kinetics and spatial profiles revealed that KCs and MoMFs have distinct spatial signatures and suggest that they perform distinct functions during the wound-healing response to acute liver injury. In summary, we optimized techniques and put together a strategy for the spatial profiling of hepatic immune cells. Then, we used this methodology to profile resident and infiltrating macrophage subpopulations to gain insight into their biology and distinct contribution to healing in response to acute liver injury. Overall, the observations made in this study suggest that the spatial and temporal behavior of a given subpopulation of immune cells underlie its ability to perform its specific functions during the immune response.