Partial or complete tears of the anterior cruciate ligament (ACL) can greatly afflict quality of life and often require surgical reconstruction with autograft or allograft tissue to restore native knee biomechanical function. However, limitations exist with these treatments that include donor site pain and weakness found with autografts, and longer "ligamentization" and integration times due to the devitalization of allograft tissue. Alternatively, a tissue engineering approach has been proposed for the fabrication of patient-specific grafts that can more rapidly and completely heal after ACL reconstruction. Electrospun micro-fiber networks have been widely utilized as biomaterial scaffolds to support the growth and differentiation of mesenchymal stem cells toward many tissue lineages including ligament. However, these micro-fiber networks do not possess suitable sizes and shapes for a ligament application and cannot support cell infiltration. The objective of this work was to develop techniques to 1) rapidly cellularize micro-fiber networks, 2) assemble micro-fiber networks into cylindrical composites, 3) provide cues to mesenchymal stem cells (MSCs) to guide their differentiation toward a ligament phenotype. The cellularization of micro-fiber networks was performed utilizing a co-electrospinning/electrospraying technique. Cells deposited within a cell culture medium solution remained where they were deposited and did not proliferate. The inclusion of space-filling hydrogel network such as collagen was necessary to reduce the density of the micro-fiber network to facilitate spreading. However, it became apparent that the incorporation of significant collagen phase was necessary for long-term MSC survival within the micro-fiber network. Next, two approaches were developed to fabricate large cylindrical, composites. The first approach utilized a co-electrospinning/electrospraying technique to generate micro-fiber/collagen composites that were subsequently rolled into cylinders. These cylindrical composites exhibited greater diameters and water weight percentages as collagen content increased. However, the high micro-fiber content of these composites was inhibitory to cell survival. In the second approach, thin layers (~5-10 fibers) of aligned electrospun PEUR fibers were encapsulated within a collagen gel and subsequently rolled the composites into cylinders. These sparse-fiber composites were nearly 98% by weight water and confocal imaging revealed the presence of sparse fiber layers (~5 fibers thick) separated by approximately 200 μm thick collagen layers. We hypothesize that the proliferation and migration of MSCs within these micro-fiber/collagen composites may not be restricted by the presence of a dense, non-manipulatable electrospun fiber network present in traditionally rolled fiber composites. Simple model platforms were then developed to study the influence of sparse micro-fibers on MSCs differentiation within a collagen hydrogel. MSCs in the presence of the softest (5.6 MPa) micro-fibers elongated and oriented to the underlying network and exhibited greater expression of scleraxis, and α-smooth muscle actin compared to the stiffest (31 MPa) fibers. Additionally, preliminary results revealed that the incorporation of fibroblast growth factor-2 and growth and differentiation factor-5 onto micro-fibers through chemical conjugation enhanced expression of the ligamentous markers collagen I, scleraxis, and tenomodulin. In conclusion, micro-fiber/collagen composite materials must possess sufficient space to support the infiltration and differentiation of MSCs. The strategies described in this document could be combined to fabricate large, micro-fiber/collagen composites that can support cell infiltration and provide relevant cues to guide the formation of an engineered ligament tissue. / Ph. D.

Ph.D. Thesis abstract: Diabetes mellitus is a chronic disease characterized by a metabolic disorder in which there is a low level or complete lack of the insulin. Diabetes mellitus type 1 (DM1) is caused by an autoimmune reaction leading to the destruction of the insulin producing beta cells in the pancreas. In consequence, low or non-existent insulin production leads to a complete dependence on exogenous insulin supplementation. DM1 causes serious long-term complications. Although strict control of blood sugar could prevent the onset and development of diabetic complications only 5% of diabetic patients are able to achieve such control. Hence it is evident that the current methods of treatment are neither sufficient to treat this disease, nor prevent late complications in most patients. The most promising therapeutic approach in the treatment of diabetes is the restoring of insulin production. One such method is the transplantation of insulin-producing tissue. However, a lack of available insulin- producing tissue limits such therapeutic approach. Therefore an alternative source of insulin producing cells have to be found to obtain a sufficient amount of safe and efficient insulin producing tissue. Pancreatic stem/progenitor cells could represent such an available alternative source. Despite the evidence...

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Die progrediente, muskuloskelettale Erkrankung Ostheoarthrose wird aufgrund der immer älter werdenden Weltbevölkerung im Jahre 2020 einer der häufigsten Invaliditätsgründe sein. Koelling et al. beschrieb 2009 eine migrierende, chondrogene Progenitorzelllinie (CPC) im Reparaturgewebe der fortgeschrittenen Gonarthrose des Menschen, die Stammzelleigenschaften besitzt. Sie sind multipotent, klonal und besitzen ein osteochondrogenes Expressionsmuster, wodurch sie sich für neue Behandlungsmöglichkeiten bei der Ostheoarthrosetherapie eignen könnten. In dieser Arbeit wurden in vitro drei Klone einer humanen CPC-Population aus osteoarthrotisch verändertem Knorpel hinsichtlich ihrer multipotenten Eigenschaften, Proliferationsgeschwindigkeit und unterschiedlicher Phänotypen gegenübergestellt, da sich bei anderen Stammzelllinien Zusammenhänge zwischen diesen Eigenschaften zeigen, die mit fortgeschrittener Ausdifferenzierung der Stammzellen begründet wird. Die drei Klone IF-8, IIB-6 und IID-4 wurden 12 Tage unter Standardbedingungen in 2D-Flaschenkultur gehalten und anschließend ihr normaler Phänotyp ausgewertet. Dabei zeigte sich, dass IF-8 und IIB-6 eher einen fibroblastenartigen Phänotyp ausbildeten, während sich bei IID-4 erst kugelige Zellen bildeten, die später teils in eine längliche Form übergingen. Die fibroblastenartige Form entsprach der von CPCs aus heterogenen Kulturen, wohingegen der Phänotyp von IID-4 auf Dedifferenzierung oder fortgeschrittenere Differenzierung schließen ließ. Die Klone für die Differenzierungsversuche wurden mit zwei verschiedenen Zelldichten ausgesät, um auch eventuelle Einflüsse der Zelldichte mit in die Untersuchung einzubeziehen. Es wurde pro Well einmal die Anfangskonzentration von 1000 Zellen gewählt und einmal 3000 Zellen pro Well. Nach sechs Tagen wurden morphologische Veränderungen unter dem Mikroskop ausgewertet. Die Differenzierung in Adipozyten und Osteoblasten erfolgte insgesamt über zehn Tage mit anschließendem Differenzie- rungsnachweis mittels Oil-Red-Färbung von Adipozyten, bzw. der Alkalischen-Phosphatase-Reaktion der Osteoblasten. Es wurde zusätzlich mit der Immunfluoreszenzzytochemie kontrolliert, ob in den differenzierten Zellen auch spezifische Proteine exprimiert wurden und sich zwischen den Klonen ein quantitativer Unterschied ergibt, der auf einen veränderten Differenzierungsgrad der Klone schließen konnte. Für die Adipozyten wurden Antikörper gegen dieLipoproteinlipase und PPARγ gewählt, bei den Osteoblasten kamen Antikörper gegen Osteocalcin und den osteogenen Transkriptionsfaktor runx-2 zum Einsatz. Allen Differenzierungsversuchen wurden jeweils Kontrollgruppen gegenübergestellt. Die Ergebnisse zeigten morphologische Unterschiede zwischen den Klonen und den verschiedenen Zelldichten, die bei der osteogenen Differenzierung nicht so stark ausgeprägt waren wie bei der adipogenen. Der Klon-IID-4 zeigte auch hier die am Stärksten ausgeprägtesten morphologischen Unterschiede zwischen den Zellen selber und der verschiedenen Dichtegrade. Die quantitative Auswertung mittels Oil-Red und Alkalischer-Phosphatase, bzw. die Ergebnisse der Immunzytochemie ergaben hingegen keine Abweichungen zwischen den Klonen und keine Veränderung in Abhängigkeit zur Zelldichte. Dadurch konnte gezeigt werden, dass bei den CPCs ein veränderter Phänotyp kein Hinweis auf eine fortgeschrittene Zellalterung und verminderte Differenzierbarkeit ist. Auch die Zelldichte nimmt auf die Differenzierung in andere Zelllinien keinen positiven oder negativen Einfluss. Deutliche Unterschiede zwischen den Klonen zeigten sich hinsichtlich ihrer Proliferationsgeschwindigkeit und ihres osteochondrogenen Grundmusters. Für das Proliferationsassay wurden über den Zeitraum von sieben Tagen die Zellzahlen gemessen. Dabei wurde festgestellt, dass sich Klon-IF-8 am langsamsten teilte, danach folgte IID-4 und am Ende IIB-6. Im Zusammenhang mit dem Western-Blot, bei dem der osteogene Transkriptionsfaktor runx-2 und der chondrogene Transkrip-tionsfaktor sox-9 miteinander verglichen wurden, konnte eine Beziehung zwischen Proliferationsgeschwindigkeit und der Ausprägung der Transkriptionsfaktoren festgestellt werden. Mit Abnahme der Proliferationsgeschwindigkeit nimmt die Expression von runx-2 zu, während die Expression von sox-9 abnimmt. Dadurch konnte nachgewiesen werden, dass die CPCs mit abnehmender Zellteilung in einen vermehrt osteogenen Zustand übergehen und ihren osteochondrogenen Charakter verlieren. Dieser Übergang hat jedoch keinen Einfluss auf ihre multipotenten Eigenschaften. Mit den Ergebnissen konnte gezeigt werden, dass sich CPCs, ähnlich wie andere Progenitorzellen auch, in ihrer Entwicklung weiter ausdifferenzieren und sich dadurch innerhalb einer Population verschiedene Entwicklungszustände ergeben, die eine genauere Charakterisierung der CPCs weiter erschweren.

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The mechanisms that regulate the differentiation of stem cells (SCs) into cardiomyocytes are still unclear and the role of endogenous molecules on this process remains unexplored. One such molecule is the bioactive phospholipid lysophosphatidic acid (LPA) which accumulates in the myocardium following acute infarction and exerts multiple biological functions, including the regulation of cell growth and differentiation as well as cell survival (Tigyi et al., 2003; Sengupta, et al., 2004). Experiments were therefore carried out in this thesis to reveal whether LPA can induce the differentiation of stem cells into cardiomyocytes and to identify the signalling mechanisms that mediate this effect. All experiments were carried out in the mouse P19 carcinoma stem cell line. Treatments with LPA in the absence and presence of various pharmacological compounds were conducted in embryoid bodies (EBs) formed from the P19 cells in sterile Petri dishes over 4 days. The EBs were subsequently transferred into 6-well cell culture plates and cultured for specific time points. Lysates were generated and subjected to western blotting for expression of cardiac- specific myosin light chain -1v (MLC-1v). To look at the expression of LPA receptors (LPAR1-LPAR5) experiments were carried out by RT-PCR using specific primers for each LPA receptor and the role of the latter in mediated responses to LPA were examined in the presence of the LPAR 1/3 antagonist, Ki16425, or the LPAR 4 receptor blocker suramin. In addition, experiments were carried out investigating the role of Gαi and specific signalling pathways that may be involved in the differentiation of P19 cells. These were carried out using potent inhibitors/antagonists of Gαi inhibitor (Pertussis toxin), PI3K inhibitor (LY294002), Akt inhibitor (Akt inhibitor XIII), PKC inhibitor (Bisindolylmaleimide I BIM-I), ROCK inhibitor (Y-27632), p38-MAPK inhibitor (SB203580) and ERK1/2 inhibitor (PD98059). Further experiments were carried out to establish whether the presence of LPA results in the phosphorylation of the targeted kinases. These studies were however limited to Akt, p38 MAPK and ERK1/2. Incubation of cells with LPA resulted in the differentiation of P19 cells into cardiomyocytes as reflected by the induction of MLC-1v. The latter increased significantly above basal in a time-dependent manner, reaching a maximum 10 days after plating EBs in 6-well plates. The induction of MLC-1v was more pronounced in cells incubated with 5 μM LPA at 6 days but showed little concentration differences at day 12. RT-PCR analysis confirmed the expression of LPA receptors 1 to 4 but not 5. Pre-incubating cells with suramin and Ki16425 concentration-dependently inhibited MLC-1v expression with 0.05 mg/ml and 10 μM respectively, virtually abolishing the expression of MLC-1v. Additionally, inhibitors of LPAR1/3 and LPAR4 receptors and all the signalling inhibitors except SB203580 abolished the phosphorylation of ERK1/2. Similarly, p38 MAPK activation was completely abolished by LPAR1/3 and LPAR4 receptor antagonists, Interestingly, only LY294002 (5 μM) and Y27632 (10 μM) abolished the LPA induced activation of p38 MAPK while SB203580, BIM-I, Akt inhibitor XIII and PD95080 caused no significant changes to the phosphorylation of p38 MAPK. In conclusion, the studies carried out in this thesis have shown that LPA can induce P19 stem cells to differentiate into cardiomyocytes and they are linked to the well characterised LPA receptors (LPAR1/3 and 4). These receptors are coupled to downstream signalling pathways of which those involving the ROCK, PI3K, PKC and/or Akt may be critical, and may converge on ERK1/2. Inhibition of any of these pathways has the potential to suppress differentiation. In contrast, signalling leading to p38 activation may potentially suppress differentiation but this needs further clarification.

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RNA-bindende Proteine sind zentrale Regulatoren der Genexpression, aber ihre Funktionen bei der Koordinierung von Zellschicksalsentscheidungen sind unzureichend verstanden. In dieser Studie haben wir RNA interactome capture angewandt, um die globalen Dynamiken des RNA-gebundenen Proteoms während der Auflösung der Pluripotenz und neuronaler Differenzierung zu bestimmen. Wir haben entdeckt, dass 30-40% der RNA-bindenden Proteine sehr dynamisch während der Zellschicksalentscheidungen sind, die Abundanzdynamiken dieser Proteine aber nicht hauptursächlich dafür zu sein scheinen. Basierend auf unseren Daten haben wir ZAP (ZC3HAV1) als einen Faktor identifiziert, der mit Pluripotenz assoziiert ist. Um die Rolle von ZAP in der Stammzellbiologie zu analysieren, haben wir PAR-CLIP, SLAMseq und einen Differenzierungsassay angewandt. Unsere Daten haben gezeigt, dass ZAP mehr als 2,000 mRNA-Transkripte innerhalb des murinen Stammzelltranskriptoms in Abhängigkeit von CG-Dinukleotiden bindet. Zieltranskripte sind angereichert mit Genfunktionen in Zell-Zell-Interaktionen, Gewebemorphogenese und Pluripotenzregulation und werden in Abwesenheit von ZAP stabilisiert. Auβerdem haben wir herausgefunden, dass Depletion von ZAP zu flacherer und breiterer Koloniemorphologie von Stammzellen bei gleichzeitiger Fehlexpression von hunderten von Genen inklusive Lineage-Faktoren führt. Desweiteren führt Abwesenheit von ZAP zu erhöhter Geschwindigkeit bei der Auflösung der Pluripotenz. Zusammengefasst stellen wir die These auf, dass ZAP ein multi-modaler Regulator der Pluripotenz ist. ZAP agiert als positiver Regulator während Aufrechterhaltung der Pluripotenz, während es am Anfang der Pluripotenzauflösung pluripotenz-fördernde Faktoren herunterreguliert. Schlussendlich demonstriert diese Studie, wie die Erforschung von Dynamiken des RNA-gebundenen Proteoms während Zellschicksalsentscheidungen neue Wege öffnet, um die Funktion von RNA-bindenden Proteinen im entwicklungsbiologischen Kontext zu analysieren. / RNA-binding proteins are key regulators of gene expression, but their functions in coordinating cell fate transitions are poorly understood. In this study, we applied RNA interactome capture to determine the global dynamics of the RNA-bound proteome during dissolution of pluripotency and neuronal differentiation. We discovered that 30-40% of RNA-binding proteins are highly dynamic during cell fate transitions and that these dynamics do not appear to be predominantly governed by alterations in their abundance. Based on our data, we identified ZAP (ZC3HAV1) as a factor highly associated with pluripotency. In order to dissect the role of ZAP in mESC biology, we applied a variety of approaches including PAR-CLIP, SLAMseq and pluripotency exit reporter assays. We found that ZAP binds more than 2,000 mRNAs in the mESC transcriptome in a CG dinucleotide-dependent manner. Targets are enriched for transcripts encoding cell-cell adhesion, tissue morphogenesis and pro-pluripotency regulators and stabilized in absence of ZAP. Furthermore, we found that ZAP depletion leads to flattened and spreading stem cell colony morphology, concomitant misexpression of hundreds of transcripts including lineage factors and accelerated early dissolution of pluripotency. In conclusion, we propose that ZAP is a multi-modal stem cell RNA-binding protein acting as a positive regulator in maintenance of pluripotency while aiding downregulation of pro-pluripotent factors at the onset of differentiation. Ultimately, this study demonstrates how exploration of RNA-bound proteome dynamics during cell fate transitions can open paths to dissecting functions of RNA-binding proteins in a developmental context.

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