Les flavonoïdes sont des composés naturels appartenant à la famille des polyphénols, qui sont étudiés depuis de nombreuses années pour leur caractère antioxydant ainsi que leurs propriétés thérapeutique. La mise en évidence, pour certaines d’entre eux, d’une activité vasorelaxante variant en fonction de leur structure, en fait un modèle d’étude de choix pour la prévention des maladies cardiovasculaires. Le 3’,4’-dihydroxyflavonol (DiOHF) est le dérivé le plus décrit pour son fort potentiel en terme de propriétés cardioprotectrices et antioxydantes et est considéré comme un composé d’intérêt dans le traitement anti-ischémique, bien que sa faible solubilité dans l’eau soit un facteur limitant pour son utilisation. Dans ce contexte, notre premier objectif a été de synthétiser une trentaine de dérivés du DiOHF, fonctionnalisés par un groupement hydrophile, tout en préservant ses propriétés antioxydantes et pour certaines des structures obtenues, ses propriétés vasorelaxantes. Pour cela, nous avons développé une méthode de synthèse rapide utilisant les irradiations micro-onde, qui nous a permis d’optimiser les rendements, de réduire les temps de réaction et qui ne conduit à aucune formation de sous-produits. Notre second objectif a été de déterminer l’activité antioxydante de ces dérivés flavonoïques par des tests mettant en œuvre des réactions de compétition avec des radicaux libres. Faisant suite à ce premier screening, des études biologiques chez le rat ont été réalisées sur les composés montrant les meilleures performances. A partir d’essais in vitro et in vivo nous avons démontré, l’innocuité de ces dérivés flavonols, et le fort impact des modifications de structure sur l’activité vasorelaxante et antioxydante, ainsi que sur la récupération fonctionnelle et métabolique consécutive à une ischémie/reperfusion myocardique. Un autre champ d’action de ces flavonols hydrosolubles pourrait être d’explorer leur utilisation dans le traitement du diabète de type 2. Pour cela nous avons greffé deux motifs antidiabétiques, correspondant à des molécules actives déjà utilisées dans le traitement de l’insulinorésistance, sur les dérivés flavonols les plus cardioprotecteurs et/ou vasorelaxants de notre série, ainsi que sur des dérivés de l’acide cinnamique. Ces composés ont été testés pour leur activité antioxydante, laissant supposer un potentiel significativement supérieur aux analogues antidiabétiques non fonctionnalisés, en termes de protection antioxydante et fonctionnelle. / Flavonoids are natural polyphenolic compounds, and epidemiological and pharmacological studies have shown that flavonoids intake is associated with many beneficial effects. An important example is the 3’,4’-dihydroxyflavonol (DiOHF) which showed interesting therapeutic properties in vitro so it could be considered as an important lead compound to the treatment of cardiovascular diseases. However is poor water solubility prevents it use as a drug. Starting from this model we have synthesized a series of new flavones functionalized by a hydrophilic group in order to increase water solubility. To obtain these derivatives we have set up a fast, simple and clean method without formation of by-products, using micro-waves irradiation to optimize yield and to decrease reaction time. Our second purpose was to investigate the antioxidant activity of the synthesized compounds by undergoing several assays. The most promising compounds were tested in biological studies, in vitro and in vivo. The results showed a significant enhancement of the post-ischemic mechanical function recovery in vivo and in vitro. Another purpose was to designed new flavonols linked to selected antidiabetic moieties already used in the treatment of insulinoresistance. It was shown that these new compounds retain the antioxidant properties of the parent flavonols, and can be of interest in the development of new diabete 2 treatments.

Notre travail de thèse avait pour buts d’explorer les mécanismes de contrôle de la fonction respiratoire au cours de l’exercice incrémentiel maximal mais également de corréler les évènements biochimiques associés à l’exercice progressif aux modifications de l’électromyogramme des muscles participant à l’effort. Les résultats de nos trois études ont montré : 1) que la baisse de PO2, intervenant pendant les premiers paliers d’un exercice incrémentiel maximal, était bien dépendante d’une défaillance de la commande centrale de la réponse ventilatoire. 2) que le pattern ventilatoire durant la période située entre le seuil ventilatoire (VTh) et le 2ème seuil (RCP) lors d’un exercice incrémentiel, pouvait évoluer selon deux modalités différentes, l’une caractérisée essentiellement par une augmentation de VT (un tiers des sujets) et l’autre déterminée majoritairement par une augmentation de FR. L’hypothèse d’une différence interindividuelle du gain du réflexe de Hering-Breuer peut être évoquée pour expliquer ces différents modes ventilatoires pendant l’exercice ; 3) qu’il est mesuré une augmentation de la concentration plasmatique de l’IMA (marqueur du stress oxydatif), corrélée à la consommation de RAA (antioxydant endogène), durant la phase la plus intense de l’exercice incrémentiel. L’adaptation de la commande motrice via le mécanisme d’épargne musculaire (« muscle wisdom ») n’intervient que chez les sujets qui développent un stress oxydatif. Ainsi, la variabilité interindividuelle mesurée dans l’amplitude du stress oxydatif, à niveau d’exercice comparable, affecte la capacité des sujets à lutter contre la fatigue musculaire. / The aim of our PhD work was to explore, in healthy humans, the control mechanisms of the respiratory function during a maximal incremental exercise and also to correlate the changes in the motor control of working muscles to the changes in exercise-induced blood signals. The results of our three studies showed:1) The occurrence of a PO2 fall during the first steps of the incremental exercise, associated with a modest PCO2 increase, strongly suggests a non-adaptation of the central command to the oxygen demand and CO2 washout;2) Two opposite changes in the ventilatory pattern were observed between the ventilatory threshold (VTh) and the respiratory compensation point (RCP); one third of the subjects tends to recruit predominantly VT and the others the breathing frequency. The hypothesis of an inter-individual difference in the strength of the Hering-Breuer reflex seems to be the more consistent explanation. 3) The plasma concentration of IMA, a marker of the oxidative stress, increased at the highest levels of incremental exercise and was correlated to the consumption of endogenous antioxidant (RAA). Because we observed that the adaptive motor response to cycling (leftward shift of the EMG spectrum) closely depends on the importance of the oxidative stress response, we hypothesized that all the healthy subjects do not have the same chances to be protected against muscle fatigue.

Le PACAP38 est un polypeptide endogène secrété par le thalamus exerçant différents rôles physiologiques tels que vasodilatateur, immunomodulateur ou encore, analgésique. Selon certaines études, il aurait, également, un impact sur les processus cognitifs au niveau de l’hippocampe. Cependant, son mécanisme d’action est assez peu connu. Son analogue, récemment synthétisé, a, quant à lui, été très peu étudié. Il s'agit d'une version beaucoup plus stable et avec une meilleure affinité aux récepteurs au PACAP que le peptide natif.Le travail effectué et présenté dans ce mémoire a permis de comparer les effets du PACAP38 et de son analogue sur le processus de mémorisation chez des rats ayant subit des expériences de navigation spatiale hippocampo-dépendante.Lors du test de l'objet déplacé (OLT), nous avons montré qu'une dose de 30 µg/kg de PACAP38 injecté en intraveineuse améliore la consolidation de la mémoire chez des rats souffrant de troubles cognitifs induits par une injection en intrapéritonéale de lipopolysaccharides ou d'ifenprodil. L'analogue n'a, quant à lui, pas permis de réduire ces troubles.Lors du test de la piscine de Morris, le PACAP38 a exercé un effet promnésique mais pas l'analogue.Il s'est avéré que le PACAP38 contribue à l'amélioration des processus cognitifs par son activité antioxydante, en régulant les taux de cytokines pro et anti-inflammatoires et les taux de BDNF centraux d'une manière plus efficace que celle de l'analogue. / PACAP38 is an endogenous polypeptide secreted by the thalamus. It is exerting different physiological roles such as vasodilator, immunomodulator or analgesic. According to some studies, it would also have an impact on cognitive processes in the hippocampus. However, its action mechanism is relatively unknown. Its analog, recently synthesized, has, for its part, been studied very little. It is a much more stable version with better affinity to PACAP receptors than the native peptide.The work performed compares the effects of PACAP38 and its analog on memory process in rats that had undergone hippocampo-dependent spatial navigation experiments.In the object location test (OLT), we have shown that a 30 µg/kg dose of PACAP38 injected intravenously improves memory consolidation in rats with cognitive impairment induced by intraperitoneal injection of lipopolysaccharides or ifenprodil. The analog was not able to reduce these disorders.In the Morris water maze test, PACAP38 exerted a promnesic effect but not the analog.It has been found that PACAP38 contributes to the improvement of cognitive processes by its antioxidant activity, by regulating pro and anti-inflammatory cytokine levels and central BDNF levels in a more efficient manner than the analog. .

Chez les plantes, les stress biotiques et abiotiques causent la surproduction d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les chloroplastes et les mitochondries. Ces ROS provoquent des dommages parfois irrémédiables pour la cellule ou déclenchent des voies de signalisation rétrogrades qui induisent la tolérance au stress. En parallèle, le génome nucléaire contrôle le développement et l’activité des organites grâce à la signalisation antérograde. Dans ce contexte, le complexe nucléaire Topoisomérase VI (Topo VI) a été étudié chez Arabidopsis thaliana. Topo VI est un régulateur des gènes de réponse à la signalisation rétrograde de la ROS oxygène singulet ; toutefois, les mécanismes qui régissent cette régulation sont inconnus. Afin de les déterminer, des interacteurs de la Topo VI ont été mis en évidence dont la sous-unité alpha du facteur général de transcription TFIIF (TFIIFα). Après caractérisation de l’expression du gène TFIIFα et des isoformes protéiques codées, des analyses transcriptomiques réalisées en condition standard de croissance et en condition de stress photo-oxydant ont montré que Topo VI et TFIIFα co-régulent la majorité des gènes de réponse à ce stress. De plus, ces interacteurs ont un rôle opposé dans la régulation de l’expression de gènes « PentatricoPeptide Repeat » (PPR). Les protéines PPR sont adressées aux chloroplastes et aux mitochondries dans lesquels elles participent à la régulation post-transcriptionnelle ; chez des mutants tfIIfα, des gènes PPR impliquées dans l’édition des ARN sont réprimés et l’édition de sites cibles associés est parfois altérée. Les conséquences de ces altérations sont discutées par l’analyse de fonctions chloroplastiques. / Under biotic and abiotic stress, plants overproduce reactive oxygen species (ROS) in plastids and mitochondria. ROS can cause damages sometimes definitive for cells or trigger retrograde signalling pathways to the nucleus that provide stress tolerance. Concurrently, the nuclear genome controls the development and the activity of organelles through anterograde signalling. In this context, the nuclear complex Topoisomerase VI (Topo VI) is studied in Arabidopsis thaliana. Topo VI is a regulator of stress responsive genes in the retrograde signalling triggered by the singlet oxygen ROS; nevertheless, the mechanisms controlling this regulation are still unknown. To determine them, Topo VI interactors were found out, including the alpha subunit of the general transcription factor TFIIF (TFIIFα). TFIIFα gene expression and the encoded protein isoforms were first characterized and then, transcriptomic analysis in standard growth conditions and under photo-oxidative stress showed that Topo VI and TFIIFα co-regulate most of stress responsive genes. Moreover, these interactors have an opposite role in the expression of "PentatricoPeptide Repeat" (PPR) genes. PPR proteins are targeted to plastids or mitochondria in which they contribute to post-transcriptional regulation mechanisms; in tfIIfα mutants, PPR genes involved in organellar RNA editing are down-regulated, and the editing of associated target sites was sometimes impaired. Possible consequences of this impairment were discussed through the analysis of plastidial functions.

La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est une maladie génétique caractérisée par une dégénérescence des muscles squelettiques accompagnée d’une myotonie. Cette maladie est due à une expansion instable de triplets CTG dans la région 3’ non traduite du gène DMPK. L’accumulation des ARNm DMPK mutés au sein de foci nucléaires conduit à la séquestration du facteur d’épissage MBNL1 et à des altérations de l’épissage alternatif de nombreux ARNm. En particulier, l’inclusion de l’exon 5 au sein du pré-ARNm de la troponine T cardiaque (hcTNT) est renforcée chez les patients DM1. Cette inclusion anormale participe aux anomalies cardiaques présentées par les patients. Les travaux de l’équipe, menés en collaboration avec l’équipe de Nicolas Sergeant à Lille, sur la régulation de l’épissage de l’ARNm hcTNT avaient établi l’existence de 8 sites MBNL1, dont 6 nouveaux, situés de part et d’autre de l’exon 5 et la présence de régions activatrices et inhibitrices de l’inclusion fixant des facteurs d’épissage dont l’identité n’était pas connue. L’un des objectifs de ma thèse était d’étudier l’importance fonctionnelle in cellulo de chacun des 8 sites MBNL1. J’ai ainsi pu montrer que chacun des 6 nouveaux sites participe à l’inhibition de l’inclusion de l’exon 5 par MBNL1. Les données obtenues nous ont amené à proposer un modèle dans lequel MBNL1 s’associe avec les triplets de sites MBNL1 situés de part et autre de l’exon 5 et entraine la formation d’une structure à longue distance via des interactions protéiques MBNL1-MBNL1. Cette structure isolerait l’exon 5 dans une boucle et limiterait la fixation du spliceosome. Par ailleurs, j’ai mis en œuvre une approche de purification de RNP formées en extrait nucléaire pour identifier d’autres facteurs régulant l’inclusion de l’exon 5. La protéine hnRNP H a ainsi pu être identifiée. Sa capacité à activer l’inclusion de l’exon 5 in cellulo et à entrer en compétition avec MBNL1 pour la régulation de l’inclusion de l’exon 5 via sa fixation sur des sites localisés dans l’exon 5 et en aval de cet exon a pu être confirmée. La seconde partie de ma thèse a porté sur l’étude de l’effet d’un stress oxydatif généré par 500 µM d’H2O2 sur le profil global d’épissage alternatif des pré-ARNm de cellules HeLa. Lors de ce travail, j’ai pu établir que la réponse des cellules HeLa au stress oxydatif implique deux phases de réponse : une phase précoce (1h-8h) caractérisée par un fort taux de mortalité associé à une forte augmentation du taux de d’entités oxygénées réactives (ROS) intracellulaire et une phase tardive (16h-24h) corrélée à une diminution du taux de ROS intracellulaires et une surexpression des ARN satellite III. Sur la base de ces données, une analyse globale du transcriptome par emploi de puces à exons (Affymetrix) a été réalisée à partir d’ARN totaux isolés 1h, 2h, 4h et 24h après le début du stress. Nous avons ainsi identifié des modulations d’expression et d’épissage spécifiques de chacune des deux phases. L’analyse des données par des outils bio-informatiques a permis de mettre en évidence des fonctions cellulaires bien définies qui sont plus particulièrement affectées lors d’un stress oxydant. Enfin, pour comprendre l’origine des variations d’épissage observées lors d’un stress oxydant, j’ai entrepris d’analyser les effets de ce stress sur le niveau d’expression et la localisation cellulaire des composants du spliceosome ou des facteurs qui s’associent pour réguler son activité / Myotonic distrophy of type 1 (DM1) is a genetic disease characterized by skeletal muscle degeneration associated to myotonia. DM1 results from the instable expansion of CTG repeats within the 3’ untranslated region of the DMPK gene. The accumulation of mutated DMPK mRNAs within nuclear foci leads to the sequestration of the MBNL1 splicing factor and causes splicing misregulation of numerous pre-mRNAs. Among altered events the increase of the inclusion of exon 5 in the human cardiac troponin T (hcTNT) mRNA is of particular importance, since it contributes to the cardiac symptoms presented by the patients. Through collaborative work with N. Sergeant’s team from Lille, the team has studied the molecular bases of hcTNT exon 5 inclusion regulation and mapped 8 MBNL1 binding sites, including 6 new ones, within intronic regions surrounding exon 5. They also identified positive and negative splicing regulatory elements of which protein partners remain unidentified. The first objective of my PhD thesis was to test the functional importance of each individual MBNL1 binding site. The obtained results established that the 6 newly identified MBNL1 binding sites are involved in splicing regulation by MBNL1 and lead us to propose a new regulation model in which MBNL1 binds on triplets of MBNL1 sites present on each side of exon 5 and form a long distance structure via MBNL1-MBNL1 protein interaction. The formation of this looping-structure is expected to isolate exon 5 and limit its recognition by the spliceosome. In addition I searched for protein partners of the identified regulatory elements by affinity chromatography. By this way, I identified hnRNP H as a positive regulator of exon 5 inclusion. Its capacity to compete with MBNL1 to regulate splicing in cellulo by binding on exonic and intronic binding sites was further confirmed. The second part of my PhD work corresponds to the study of the global impact of oxidative stress, generated by exposition of HeLa cells to 500 µM of H2O2, on alternative splicing. This allows us to establish that the response of HeLa cells to oxidative stress involve two distincts phases: an early one (1h-8h) characterized by poor survival rate and high intracellular ROS content and a late phase (16-24h), associated with a decrease of the intracellular ROS level and the overexpression of the long non coding sat III RNAs. Based on this observation, we performed a transcriptome global analysis by using exon arrays from Affymetrix on RNA samples isolated 1, 2, 4 or 24 hours after the induction of the oxidative stress. We identified changes of the gene expression level or mRNA splicing pattern specific of each of the response phases. Data computing by bio-informatic tools identified the most affected cellular processes and functions during the cell response to oxidative stress. In order to better understand the mechanisms underlying alternative splicing modulation during oxidative stress, I started to study the impact of oxidative stress on the expression level and the cellular localization of spliceosome components and most common splicing regulation factors

L'Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) est une technique d’imagerie très utilisée de nos jours, notamment pour le diagnostic médical. L’utilisation d’agents de contraste lors d’un examen IRM permet d’obtenir des images de bonne qualité. Cependant, le manque de sensibilité de cette technique d’imagerie a conduit à l’utilisation d’espèces hyperpolarisées (3He, 13C, 129Xe) en IRM. Le xénon (Xe) apparait aujourd’hui comme un composé très prometteur pour de telles applications mais son manque de sélectivité rend l’imagerie moléculaire impossible. Le développement et l’utilisation de molécules cages capable d’encapsuler le xénon et de l’amener vers la cible à imager est donc indispensable. Dans ce contexte, nous nous sommes intéressés au cours de cette thèse à l’élaboration de telles molécules, et plus précisément, à l’obtention de nouveaux cryptophanes qui présentent la plus forte affinité pour le xénon afin de pouvoir utiliser ces molécules en tant qu’outils pour l’IRM Xe. Une nouvelle voie de synthèse du cryptophane ayant la plus grande affinité pour le xénon a été mise au point ; ce composé a été fonctionnalisé pour la première fois au laboratoire et ceci dans le but d’obtenir les premières biosondes dérivées de composé. Le greffage d’antenne de reconnaissance sur ces biosondes permettrait alors de faire de l’imagerie ciblée. Une sonde pour la détection du peroxyde d’hydrogène (H2O2) a été synthétisée. Le peroxyde d’hydrogène est impliqué dans le développement de stress oxydant cellulaire et présent en ces de maladies neurodégénératives (Parkinson, Alzheimer). La sonde obtenue a permis d’imager H2O2 par IRM Xe pour la première fois. Un hybride composé de nanotube de carbone et de cryptophanes a aussi été synthétisé en vue de disposer d’outil présentant une forte concentration de cryptophanes et d’améliorer la sensibilité de la technique d’imagerie utilisant du xénon. / Magnetic Resonance Imaging (MRI) is widely used today for early medical diagnosis. During the MRI examination, the use of contrast agent allows the obtention of well resolved images. However the lack of sensibility of this technic lead to the utilization of hyperpolarized species (3He, 13C, 129Xe) in MRI. The xenon (Xe) is the more promising but due to its weak selectivity, it cannot be used in molecular imaging. So, the development and utilization of host molecules able to encapsulate the xenon and bring it to a targeted biological tissue or organ is necessary. In these conditions, during this thesis, we worked on the elaboration of such molecules, and particularly, in cryptophanes since these compounds have strong affinity for xenon and could be used as tools for MRI by hyperpolarized xenon (Hp Xe). A new route synthesis of cryptophane-111, that has the highest affinity for xenon, was developed; first functionalized derivatives of this compound have been also obtained in order to obtain the first biosensors based on cryptophane-111. The coating of specific ligand on these functionalized compounds could allow targeted MRI. A probe for hydrogen peroxide (H2O2) detection was synthesized. Hydrogen peroxide is implicated in cellular oxidative stress and present in case of neurodegeneratives diseases (Parkinson, Alzheimer). The probe obtained allowed the imaging of H2O2 by MRI Xe for the first time. Nanotubes functionalized with strong concentration of cryptophane have been synthesized in order to increase the sensitivity of the imaging technic that uses xenon.

Le génome est sans cesse menacé dans sa structure par des stress génotoxiques d’origine endogène (stress oxydant, blocage de la réplication…) ou exogène (irradiations, produits chimiques, métaux lourds…). La voie de réponse aux dommages de l’ADN coordonne un réseau d’événements en cascades qui incluent les points de surveillance du cycle cellulaire, la réplication/réparation/recombinaison de l’ADN et la mort cellulaire programmée. Ces voies collaborent pour assurer la transmission fidèle du génome et empêcher la prolifération des cellules qui aurait accumulé des altérations génétiques. En général, des défauts dans une de ces voies entraînent un changement de sensibilité aux agents génotoxiques, une instabilité génétique et une prédisposition au cancer. La recombinaison homologue (RH) est une voie essentielle pour la réparation de l’ADN ; elle joue un rôle fondamental dans le maintien de la stabilité du génome. Le stress oxydant, résultant d’une augmentation de la concentration intracellulaire de ERO, est une des causes majeures de dommages aux lipides, aux protéines et à l’ADN et pour cela, il représente un défi pour la survie cellulaire et pour la stabilité du génome. Les ERO apparaissent physiologiquement lors de la respiration cellulaire ou résultent d’un stress environnemental, comme l’exposition aux radiations UV ou agents chimiques oxydants. Elles contribuent à certains processus comme la croissance cellulaire, l’activité et au repliement des protéines, la sénescence et la mort cellulaire programmée. Il est important de souligner qu’un état redox altéré est souvent associé à un fonctionnement anormal des cellules, comme il est observé pour les cellules cancéreuses et les cellules sénescentes. L’objectif de ce projet a été d’analyser l’interface entre les voies DDR et SAPK (Stress activated protein kinase) évolutivement conservées et d’en étudier les conséquences sur la stabilité du génome en utilisant comme organisme modèle la levure à fission. Nos résultats montrent que la voie SAPK joue un rôle sur la RH en promouvant la phosphorylation de Rad52, une protéine impliquée dans différentes sous-voies de la RH. Nous avons aussi montré que Rad52 est phosphorylée sur différents acides aminés, parmi lesquels certains sont les cibles de kinases inconnues qui n’ont aucun lien avec la voie SAPK. Nous avons observé que Rad52 est phosphorylée soit après un stress oxydant, soit dans des cellules génétiquement sujettes à des perturbations de la RH. Nous avons identifié deux sites de phosphorylation de la protéine Rad52, dont un seul est dépendant de la voie SAPK. En étudiant la phosphorylation de Rad52 dans les cellules invalidées pour la voie SAPK ou mutées pour un des sites de phosphorylation de Rad52, nous avons pu montrer que la RH est modulée par la voie SAPK même en absence de insulte externe. Notre travail ouvre le chemin vers une nouvelle compréhension des mécanismes fondamentaux du maintien de l’intégrité du génome. / Genomes are routinely submitted to injuries from either endogenous stress (oxidative stress, DNA replication block…) or from exogenous sources (radiations, chemicals, heavy metals…). The DNA damage response (DDR) coordinates a network of pathways including cell cycle checkpoints, DNA replication/repair/recombination, and programmed cell death, ensuring faithful genome transmission and preventing from the proliferation of cells bearing genetic alterations. Defect in one of these pathways generally results in altered sensitivity to genotoxins, genetic instability and cancer predisposition. Homologous recombination (HR) is an essential DNA repair pathway playing pivotal role to maintain genome stability.Oxidative stress, resulting from increased intracellular concentration of ROS, is one of the major causes of lipid, protein and DNA damage, and therefore a challenge for cell survival and genome stability. ROS are generated physiologically as by-products of cellular respiration, or as result of environmental stresses, such as exposure to solar UV radiations or to oxidant chemicals, and they actively participate in processes such as cellular growth, protein activity and folding, senescence and programmed cell death. It is noteworthy that an altered redox homeostasis is often associated to abnormally functioning cells, such as cancer and senescent cells. The aim of this project was to study the interface between two major evolutionarily conserved pathways, DDR and SAPK (Stress activated protein kinase) and the consequences on genome stability using fission yeast as a model organism. We report data showing that SAPK pathway impinges on HR by promoting phosphorylation of Rad52, a key protein involved in all sub-pathways of HR. We also revealed that Rad52 is phosphorylated at multiple different sites some of which are substrate for unidentified kinases unrelated to the SAPK pathway. Rad52 phosphorylation occurs either after oxidative stress or in cells genetically prone to HR perturbation. We identified two sites of phosphorylation, one of which is dependent on functional SAPK pathway. By studying Rad52 phosphorylation in cells mutated in the SAPK pathway or mutated at the Rad52 site of phosphorylation, we showed that HR is modulated by SAPK even in the absence of external insults. Our work pave the way to a novel understanding of fundamental mechanisms required for genome integrity maintenance.

Le premier objectif de cette thèse était d’améliorer l’utilisation et la compréhension des outils de mesure de la déformabilité du globule rouge (GR) dans la drépanocytose (Etudes 1 et 2). L’étude 1 a montré l’importance de la standardisation des mesures de déformabilité par ektacytométrie chez les enfants drépanocytaires. Au cours de l’étude 2, les propriétés des GR ont été modifiées et la variation des courbes de déformabilité érythrocytaire « classique » (index d’élongation en fonction de la contrainte de cisaillement en milieu isotonique) a été comparée aux résultats d’osmoscan (mesure de la déformabilité érythrocytaire en gradient osmolaire à contrainte de cisaillement fixe), méthode de référence pour étudier les anomalies de la membrane du GR. Ainsi, les variations de déformabilité érythrocytaire au-delà de 3 Pa sont affectées à la fois par la viscosité interne du GR et par des modifications de la surface cellulaire (rapport surface/volume) alors que les modifications de l’élasticité membranaire affectent la déformabilité érythrocytaire quelles que soient les forces de cisaillements utilisées (faibles, modérées ou hautes). Le deuxième objectif de cette thèse était d’apporter des éléments supplémentaires sur l’implication des facteurs génétiques, des paramètres hémorhéologiques et du niveau de stress oxydant sur la survenue des complications vaso-occlusives chez les patients atteints de syndrome drépanocytaire majeur (Etudes 3 à 6). La mise en commun des résultats d’hémorhéologie obtenus sur 165 patients de notre cohorte lyonnaise et 240 patients de la cohorte guadeloupéenne a permis de montrer que la rhéologie du GR chez les patients drépanocytaires était dépendante de l’âge. Ainsi, la viscosité sanguine augmente avec l’âge pour atteindre un plateau vers 30 ans alors que la déformabilité érythrocytaire diminue avec l’âge (Etude 3). Ces modifications participent vraisemblablement à l’apparition de complications chroniques chez l'adulte drépanocytaire. Les études 4 et 5 ont été réalisées sur la cohorte pédiatrique lyonnaise. Au cours de ces 2 études, nous avons étudié l’influence sur la rhéologie du sang et la survenue de crises vaso-occlusives (CVO) des facteurs génétiques (alpha-thalassémie, déficit en Glucose-6-Phosphate Déshydrogénase (G6PD) et haplotypes S) d’une part (Etude 4) et du niveau de stress oxydant et nitrosatif d’autre part (Etude 5). L’alpha-thalassémie augmente la déformabilité des GR et l’agrégation érythrocytaire. Ces 2 phénomènes pourraient participer à augmenter le risque de CVO. De plus, l’alpha-thalassémie, en diminuant l’hémolyse, diminuerait le niveau de stress oxydant, élément majeur impliqué dans la physiopathologie de la drépanocytose. Enfin, l’étude 6 a montré que la rhéologie sanguine des patients Sbêta+ était quasi-identique à celle des sujets sains AA mais que les patients les plus sévères pourraient avoir un déficit en monoxyde d’azote circulant. En conclusion, mon travail de thèse contribue à une meilleure compréhension de la physiopathologie de la drépanocytose / The first goal of this thesis (Study 1 and 2) was to improve the use and the comprehension of tools for red blood cell (RBC) deformability measurements in sickle cell disease (SCD). The first study showed the importance of standardization of RBC deformability measurements by ektacytometry in SCD children. In the study 2, the RBC proprieties was modified and the variation of « classic » RBC deformability curve (elongation index as a function of the shear stress in isotonic medium) was compared to osmoscan results (elongation index in hyperosmolar gradient and constant shear stress), the gold standard for RBC membrane defect studies. Thus, the modifications of RBC deformability curve above 3 Pa were affected by RBC internal viscosity and cellular surface modification (and thus surface/volume ratio) while membran elasticity modifications affected RBC deformability whatever the shear stress (low, moderate or high). The second goal of this thesis was to study the effects of genetic modifiers, hemorheological parameters and oxidative stress level on vaso-occlusive complications (VOC) in SCD (Study 3 to 6). Hemorheological parameters were measured on 165 patients from Lyon and 240 patients from Gwada and the results showed that blood viscosity increased until the age of 30 and RBC deformability decreased with age (Study 3). This modifications probably play role in the chronic complications of SCD adult patients. The studies 4 and 5 were conducted on SCD children. We studied the effects of genetic modifiers (alpha-thalassemia, glucose-6-phospho-deshydrogenase deficiency and S haplotypes ; study 3) and nitro-oxidative stress level (study 5). Alpha-thalassemia increase RBC deformability and RBC aggregation. This phenomenon could contribute to increase VOC. Moreover, alpha-thalassemia decreased hemolysis and thus oxidative stress, a major component of SCD physiopathology. Then the study 6 showed that Sbeta+ patient hemorheology was quite the same of AA ubjects but the more severe patients could have a defect in circulating nitric oxide. To conclude, my thesis contribute to a better understanding of SCD physiopathology

Le syndrome néphrotique (SN) est causé par une altération glomérulaire, responsable d’une excrétion urinaire anormale de protéines plasmatiques, compliquée d’hypoalbuminémie. Le SN est toujours associé à une rétention rénale de Na + qui conduit à la génération d'ascite et / ou d'œdèmes. La pathogénie de la rétention de Na + et de la constitution d’œdèmes n’est pas entièrement élucidée. Dans notre étude, nous avons évalué le rôle possible des espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans cette pathogénie. Notre étude dans le modèle de rat aminonucléoside puromycine (PAN) de SN fournit des éléments de preuve d'un rôle critique des ROS dans les troubles hydro-électrolytiques associés au SN. Dans le rein, l'endocytose de l'albumine anormalement filtrée dans le néphron distal induit un stress oxydatif qui est responsable de l’augmentation de la Na, K-ATPase. Dans le péritoine, le SN est associé à une augmentation marquée de la perméabilité à l'eau et à une diminution du coefficient de réflexion des protéines de la barrière péritonéale. Ces modifications, déclenchées par le stress oxydatif et l'activation subséquente de NF-kB, comptent pour environ deux tiers du volume de l'ascite. Enfin, nous avons confirmé que le stress oxydatif participe à la sécrétion de l'angiotensine-aldostérone et est nécessaire à l’apparition de l'hyperaldostéronémie observée chez les rats PAN-néphrotiques. / Nephrotic Syndrome (NS) is a nonspecific kidney disorder defined by abnormal urinary excretion of plasma proteins and hypoalbuminemia. NS is always associated with a renal retention of Na+ leading to the generation of ascites and/or edema. The pathogenesis of Na+ retention and edema is not fully elucidated. In our studies we evaluated the possible role of reactive oxygen species (ROS) in this pathogenesis. Our studies in the puromycin aminonucleoside (PAN) rat model of NS provided pieces of evidence for a critical role of ROS in the hydro-electrolytic disorders associated with NS. In the kidney, endocytosis of abnormally filtered albumin in the distal nephron induces an oxidative stress which is responsible for the up-regulation of Na,K-ATPase. In the peritoneum, NS is associated with a marked increase in water permeability and a decrease in the reflection coefficient to proteins of the peritoneal barrier. These changes, which are triggered by oxidative stress and subsequent activation of NF-kB, account for approximately two-third of the volume of ascites. Finally, we confirmed that oxidative stress participates in the angiotensin-stimulated secretion of aldosterone and is required for the hyperaldosteronemia observed in PAN-nephrotic rats.

Fusarium graminearum est un champignon phytopathogène responsable de la fusariose de l’épi, maladie affectant les céréales telles que le blé ou le maïs. Le champignon peut également produire des métabolites secondaires toxiques ou mycotoxines, tels que les trichothécènes de type B qui sont stables d’un point de vue chimique et thermique. Ces mycotoxines peuvent contaminer les grains avant récolte. Aucun procédé à l’heure actuelle ne permet de les éliminer ou de limiter leur toxicité. Un moyen de lutte efficace est donc de limiter la biosynthèse de ces toxines. Cette voie implique les gènes Tri qui sont regroupés dans un cluster dont la régulation est complexe. Lors de l’infection de la plante hôte, le champignon se retrouve potentiellement en contact avec des molécules pro ou antioxydantes intervenant dans les mécanismes de défense de la plante. In vitro, ces molécules prooxydantesactivent la production de trichothécènes via la surexpression des gènes Tri alors que les composés antioxydants la répriment, via la répression des gènes Tri.Le facteur de transcription Fgap1, homologue au facteur Yap1 de levure impliqué dans la réponse austress oxydant, a été identifié chez F. graminearum et son rôle potentiel dans la régulation de labiosynthèse des trichothecenes a été étudié. Des souches recombinantes ont été construites et ontpermis de montrer l’implication de ce facteur non seulement dans l’activation de l’expression des gènes de détoxification, mais aussi dans la modulation de la production de trichothécènes en réponseau stress oxydant. Ce facteur n’intervient cependant pas dans la réponse aux composés antioxydants.Une analyse RNA-seq a été entreprise pour identifier plus globalement les réseaux de régulation impliqués en réponse aux variations redox. / Fusarium graminearum is a pathogenic fungus responsible for “Fusarium Head Blight”, a diseaseaffecting cereals, including wheat or maize. The fungus can produce toxic secondary metabolitesbelonging to the type B trichothecene family. These metabolites are heat and chemically stablemolecules. These toxins can be found in grains before harvest and no available decontaminationprocess can eliminate or detoxify trichothecenes. The best way to restrict their occurrence is to limittheir biosynthesis. The Tri genes involved in the biosynthetic pathway are clustered and theirregulation is complex. During plant/pathogen interaction, the fungus must cope with pro orantioxidants, involved in plant defense mechanisms. In vitro, prooxidant molecules stimulatetrichothecenes biosynthesis via Tri genes overexpression, whereas antioxidants compounds repress Trigenes expression and toxin accumulation.The transcription factor Fgap1, homologous to Yap1 in yeast and involved in response to oxidativestress, was identified in F. graminearum and its potential role in the regulation of trichothecenesbiosynthesis was investigated. Using recombinant strains, we demonstrated that, in response tooxidative stress, Fgap1 is not only involved in expression of detoxifying activities, but also in themodulation of trichothecene accumulation. Nonetheless, Fgap1 is not involved in response toantioxidant compounds. RNA-seq analysis has been initiated to identify regulatory network involvedin response to redox variations.