Le syndrome de Werner (SW) est une maladie génétique de transmission autosomique récessive qui cause le vieillissement prématuré. La maladie est causée par une mutation dans le gène Werner (WRN). Étant donné que le niveau d'espèces réactives d'oxygène (EROs) est élevé chez les personnes atteintes du SW et que c'est probablement un facteur causant une partie du phénotype, nous avons vérifié le phénomène au niveau cellulaire. Pour ce faire, nous avons analysé des fibroblastes de souris embryonnaires (FSEs) de type sauvage (TS) et des FSEs ayant une deletion dans une partie du domaine hélicase de la protéine homologue de WRN (Wrn[delta]hel/[delta]hel). Nous avons mesuré le niveau d'EROs dans ces cellules. Après avoir constaté que le niveau d'EROs est plus élevé dans les FSEs Wrn[delta]hel/[delta]hel que dans les FSEs TS, nous avons mesuré les effets directs et indirects de cette augmentation du niveau d'EROs au plan de la transcription globale dans ces cellules. Finalement, pour mieux comprendre l'impact des EROs dans le phénotype, nous avons étudié l'effet de l'addition d'EROs exogènes sur les cellules en culture. Nous avons donc traité des FSEs TS et Wm mutants avec du peroxyde d'hydrogène. À l'aide de biopuces à ADN, nous avons comparé le profil d'expression génique des FSEs traités au peroxyde d'hydrogène par rapport aux cellules non traitées. Nous avons par la suite validé les résultats des biopuces à ADN par transcriptase inverse suivi d'une réaction de polymerase en chaîne quantitative (TI-RPC) et analysé les données avec le programme PANTHER (Protein ANalysis THrough Evolutionary Relationships). Les EROs exogènes ont peu d'impact sur le profil d'expression des gènes chez les FSEs Wrn mutants en comparaison avec les FSEs TS car ces cellules démontrent déjà un niveau d'EROs plus élevé que la normale. Toutefois, plusieurs sentiers biologiques déjà affectés chez les FSEs Wrn mutants ont été affectés de la même façon dans les FSEs TS traités au peroxyde d'hydrogène. D'ailleurs, plusieurs de ces sentiers biologiques sont étroitement reliés au phénotype observé chez notre modèle de souris Wrn mutantes ainsi que chez les patients atteints du SW.

L'hypertension de grossesse (HG) se retrouve chez 5 à 10% des femmes enceintes. Son étiologie demeure inconnue à ce jour, mais sa physiopathologie impliquerait une perfusion sanguine abaissée de l'unité foeto-maternelle entraînant un stress oxydatif suivi d'une dysfonction de l'endothélium vasculaire maternel. Nos travaux de recherche visent l'identification des facteurs génétiques liés au stress oxydatif et pouvant prédisposer à l'HG chez la femme. Dans ce but, nous avons évalué certains polymorphismes de gènes impliqués dans la biotransformation des dérivés actifs de l'oxygène et des xénobiotiques : glutathion S-transférase pi (GSTP1), mu (GSTM1) et thêta (GSTT1) ; cytochrome p450 (CYP1A1), époxyde hydrolase (EPXH), NO-synthase endothéliale (eNOS), catalase (CAT) et superoxyde dismutase (MnSOD). Notre étude a permis de mettre en évidence quatre polymorphismes associés au risque d'HG et/ou de prééclampsie (PE) : GST[pi] A313 [313 en exposant]G (RC= 0.42 IC 95% [0.22-0.80]) ; GSTM1dél [dél en exposant] (RC= 0.26 [0.07-0.91]) ; eNOS G849 [849 en exposant]T (RC = 3.19 [1.33-7.67]) ainsi que CAT G-844 [-844 en exposant]A (RC= 0.24 [0.07-0.85]). Nos résultats montrent également plusieurs associations d'allèles indépendants combinés deux à deux prédictives d'un risque d'HG. En corollaire, certains marqueurs génétiques d'enzymes impliquées dans la biotransformation pourraient permettre d'identifier précocement les femmes à risque d'HG et pourraient avoir des implications sur le risque de maladies cardiovasculaires à long terme.

La maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) est principalement causée par le tabagisme chronique. Les sujets atteints présentent des altérations pulmonaires et systémiques les rendant intolérants à l'effort et réduisant leurs qualité et espérance de vie. Le poumon des sujets MPOC compte un plus grand nombre de cellules inflammatoires, notamment de macrophages, de neutrophiles et de lymphocytes T CD8+, que les sujets non-MPOC. On note également la présence d'un stress oxydant chronique ainsi qu'une augmentation du niveau d'apoptose alvéolaire. Les raisons pour lesquelles le niveau d'apoptose alvéolaire est augmenté chez ces sujets ne sont pas connues. L'accumulation des lymphocytes T CD8+, ou lymphocytes T cytotoxiques, dans le poumon MPOC pourrait expliquer cette augmentation de l'apoptose alvéolaire. Nous avons démontré que les lymphocytes T CD8+ circulants de sujets MPOC n'étaient pas plus activés que ceux de sujets contrôles, suggérant que l'activation des lymphocytes T CD8+ se ferait davantage au niveau pulmonaire. Le stress oxydant chronique, de pair avec les cellules inflammatoires, pourrait également influencer fortement la survie des cellules épithéliales alvéolaires pulmonaires. En effet, nous avons démontré que le tissu pulmonaire MPOC ainsi que les cellules épithéliales alvéolaires exposées in vitro au peroxyde d'hydrogène (stress oxydant) présentaient des niveaux plus élevés des molécules pro-apoptotiques p53, Bax et récepteurs de TRAIL 1 et 2. De plus, ces derniers étaient davantage sensibles à l'apoptose induite de manière extrinsèque par le ligand TRAIL, un ligand de mort relâché par les Natural killer, les lymphocytes T et les macrophages activés. Les résultats retrouvés dans cette thèse ont permis de souligner l'importance de l'activation locale des lymphocytes T CD8+ ainsi que le rôle du stress oxydant dans la sensibilisation du tissu pulmonaire MPOC à l'apoptose induite par TRAIL. Ensemble, ces données mettent l'emphase sur l'importance des cellules cytotoxiques et du stress oxydant dans l'augmentation de l'apoptose alvéolaire observée dans le poumon MPOC.

Le stress oxydatif peut provenir de sources exogènes comme les UVA ou de sources endogènes comme la chaîne respiratoire (OXPHOS). L'oxydation des composants cellulaires a été associée avec la dégénération, des phénotypes de vieillissement et des pertes de fonctionnalités des tissus. Les UVA sont les plus efficaces des rayons UV à induire de l’oxydation, tel que démontré par la formation de dommages oxydatifs à l'ADN et par l'apparition de délétions mitochondriales qui en résultent. La délétion mitochondriale de 4977 pb (ADNmtCD4977), la plus commune, et celle de 3895 pb (ADNmt3895) sont deux délétions reliées au photovieillissement cutané et à l'exposition au stress oxydant. Le phénomène de vieillissement dans la peau est bien documenté et se traduit par une dégradation de la matrice extracellulaire, une perte d'élasticité et la formation de rides. Toutefois, peu d'études portent sur la cornée humaine alors qu'elle est un tissu exposé directement aux rayonnements UV au même titre que la peau. Nous avons donc tenté mieux comprendre l'effet de l'oxydation exogène et endogène sur cette structure. L'analyse de la localisation des délétions ADNmtCD4977 et ADNmtCD4977 dans l'oeil humain a permis de révéler qu'elles se concentrent principalement dans le stroma cornéen et s'accumule avec l'âge. Le stroma cornéen est la couche cellulaire qui confère la transparence et la rigidité à la cornée humaine. Ces résultats nous ont suggéré une implication des UVA dans le photovieillissement de la cornée. Nous avons donc entrepris de vérifier les changements liés à l'exposition aux UVA dans le stroma cornéen puisque les UVA sont connus pour causer des altérations à la matrice extracellulaire (ECM) au niveau cutané. Nous avons donc créé un modèle de photovieillisement par une exposition chronique aux UVA sur des kératocytes avec lesquels nous avons fait sécréter une ECM. Nos résultats nous ont démontré qu'une exposition chronique aux UVA cause des altérations à l'ECM cornéen semblable à des phénotypes de photvieillissement. En effet, nous avons dénoté des changements transcriptomiques et protéomiques pour certains collagènes et protéoglycans. Une atteinte aux collagènes par le vieillissement cornéen se traduit entre autres par une rigidification, une opacification et un changement dans son pouvoir réfractif qui mène à une perte de la vision. Par ailleurs, notre avons également investigué l'implication du stress oxydatif dans la dystrophie cornéenne endothéliale de Fuchs (FECD), une maladie dégénérative de l'endothélium cornéen, qui mène à une perte de vision et est une cause principale de greffe cornéenne. L'étiologie de la maladie est encore inconnue, mais le stress oxydatif est soupçonné de jouer un rôle important dans la pathogenèse. Nos résultats ont amené de nouvelles évidences de l'implication de l'oxydation dans la maladie par l'augmentation de la quantité d'ADN mitochondrial et un raccourcissement des télomères dans des explants de cornées pathologiques. Nos résultats nous ont également démontré que la mise en culture de cellules FECD permettait la sélection de cellules fonctionnelles et comparables à des cellules saines en termes de quantité d'ADN mitochondrial et de son intégrité, de sensibilité à l'oxydation et de longueur télomérique. Les résultats obtenus soutiennent ainsi la possibilité d'employer les cellules FECD fonctionnelles sélectionnées pour utilisation en génie tissulaire afin de créer des cornées autologues pour pallier aux manques de greffes cornéennes. Enfin, nos résultats apportent de nouvelles évidences quant à l'implication du stress oxydatif dans le photovieillissement cornéen et dans l'étiologie de la FECD. / Oxidative stress can arise from exogenous sources like UVA or endogenous source like the respiratory chain (OXPHOS). Oxidation of cellular components is associated with degenerative disease, aging phenotypes and loss of tissue functions. UVA is the most efficient components of UV light to induce oxidation, like it have been shown by the formation of oxidative damage on DNA and the appearance of resulting mitochondrial deletions. The mitochondrial deletion of 4977 bp (mtDNACD4977), the most common, and the 3895 bp (mtDNA3895) are both connected to skin photoaging and exposition to oxidative stress. Skin photoaging is well documented and is portrayed by a degradation of the extracellular matrix, a loss of elasticity and formation of wrinkles. However, few studies have been done on the human cornea even if this structure is directly exposed to UV light like the skin. Thus, we have tried to understand the effect of exogenous and endogenous oxidative stress on this eye structure. Analysis of mtDNACD4977 and mtDNA3895 in the human eye has shown that these deletions are localized in the corneal stroma and accumulate with age. The corneal stroma is the cellular layer conferring transparency and rigidity to the human cornea. Our results have suggested that UVA is implicated in the photoaging of the cornea. Thus, we checked for changes linked to UVA exposure in the corneal stroma since UVA are known to cause alteration to the extracellular matrix (ECM). Thereby, we created a photoaging model by exposing keratocytes to chronic UVA doses and then making them secrete an ECM. Our results have shown that chronic UVA exposure causes changes similar to photoaging phenotypes. We noted changes in the transcriptomic and proteomic expression of collagen and proteoglycans. Alteration to collagens composition by aging leads to corneal rigidity, cloudening and a loss of refractive power of the cornea, which can result in a loss of vision. On the other hand, we also investigated the implication of oxidative stress in the Fuch’s Endothelial Corneal Dystrophy, a degenerative disease of the corneal endothelium, which leads to a vision loss and is the leading cause of corneal transplantation. The etiology of the disease is not well known, but oxidative stress is suspected of playing an important role in the pathogenesis. Our results have shown new evidences of oxidative stress in the pathology by displaying an increase in mitochondrial DNA and a telomeric shortening in cells from corneal explants. Our results have also shown that using cell culture on FECD cells can allow the selection of functional cells that can compare to healthy cells terms of mitochondrial amount and integrity, sensitivity to oxidation and telomere length. Our results support the fact that functional FECD cells could be used to create autologous cornea by tissue engineering to solve the lack of corneal graft. Thus, our findings bring new evidences to the implication of oxidative stress in corneal photoaging and in the etiology of FECD.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'œil est un organe complexe quotidiennement exposé au rayonnement électromagnétique ambiant. Les fonctions sensorielles uniques qu'il assure nécessitent l'acheminement spécifique d'une portion de ce rayonnement, la lumière, jusqu'à la rétine tapissant son fond. À cette fin, le chemin optique est constitué de différents tissus caractérisés par leur remarquable capacité à absorber ou transmettre des longueurs d'onde définies. L'absorption de longueurs fortement énergétiques s'accompagne néanmoins d'un risque de toxicité susceptible de compromettre l'intégrité et la santé des tissus absorbants. Tel est notamment le cas des rayons ultraviolets de type B ou UVB (rayons les plus énergétiques atteignant la surface oculaire en conditions normales). Les effets dommageables des UVB ont été documentés et découlent principalement de processus photochimiques directs. Il est de plus en plus reconnu que deux autres domaines du spectre électromagnétique ambiant, les UVA et la lumière bleue visible à haute énergie (HEV), disposent d'un potentiel significatif de toxicité pour les tissus oculaires. Toutefois, les fondements de cette nocivité sont mal compris. Les UVA, absorbés par la cornée et le cristallin, et la lumière HEV, absorbée au niveau de la rétine, se démarquent par une grande capacité à causer un stress oxydatif, à travers des processus indirects largement dépendants de la présence d'oxygène et de photosensibilisateurs adéquats dans les tissus absorbants. Plusieurs évidences lient leur toxicité à ce stress oxydatif, mais les événements moléculaires sous-tendant ce lien restent à définir. L'objectif global des travaux présentés dans cette thèse était donc d'identifier les déterminants de la toxicité tissulaire reliés à l'effet pro-oxydant de ces rayons. Bien que majoritairement absorbés par le cristallin, la cornée filtre une portion significative des rayons UVA parvenant à la surface oculaire et les conséquences de cette filtration sont très peu documentées. Le premier volet de nos travaux s'est donc penché sur les conséquences précoces d'une exposition de la cornée à ces rayons. L'exposition d'yeux de lapins aux UVA a permis de confirmer que ceux-ci induisent de nombreux phénomènes d'oxydation tout le long du tissu cornéen. Nous avons décrit les altérations moléculaires immédiates causées par ces phénomènes et leur profil de distribution à travers les trois couches cellulaires cornéennes (épithélium, stroma et endothélium). Nous avons ainsi déterminé que dans sa configuration native, la sensibilité aux dommages et la réponse de la cornée aux UVA ne sont pas uniformes d'une région à l'autre du tissu. Par exemple, alors que l'épithélium subit d'importantes altérations moléculaires en réponse à l'exposition, ses cellules limitent efficacement les manifestations immédiates de la toxicité des UVA par des mécanismes compensatoires. En contraste, l'endothélium à la surface postérieure de la cornée, présente une grande susceptibilité à une toxicité immédiate, et l'oxydation induite par une exposition prolongée aux UVA pose un risque particulier pour sa santé. Le second volet visait à déterminer les mécanismes cellulaires mis en œuvre dans l'action toxique de la lumière HEV. Les données disponibles sur la toxicité oculaire de ce rayonnement montrent que celle-ci touche principalement l'épithélium pigmenté de la rétine (EPR) et repose sur une accumulation de photosensibilisateurs endogènes dans ce tissu avec l'âge. Nous avons toutefois identifié un photosensibilisateur exogène de la lumière HEV susceptible de s'accumuler dans l'EPR, l'indénopyrène (IcdP), un hydrocarbure aromatique polycyclique abondant dans la fumée de tabac. Par l'exposition de cellules d'EPR humain à l'IcdP et/ou la lumière HEV, nous avons mis en évidence une synergie toxique émanant de leur interaction. L'IcdP devient au moins 3000 fois plus cytotoxique en présence de doses sous-létales de lumière HEV, causant un stress oxydatif, des altérations structurelles et une mort cellulaire rappelant les événements dégénératifs observés dans la dégénérescence maculaire liée à l'âge (première cause de cécité chez les personnes âgées). L'étude des mécanismes derrière cette synergie révèle que l'interaction IcdP-lumière HEV induit une perte du contrôle synchrone des phases assurant le métabolisme normal du xénobiotique dans l'EPR, ce qui semble précipiter le déclin cellulaire. Nos travaux ouvrent la perspective que la toxicité de la lumière HEV pour l'EPR soit significativement modulée, entre autres, par le style de vie des individus et la pollution environnementale. En évaluant leur toxicité sous des angles nouveaux, cette thèse démontre que le caractère nocif des rayons UVA et de la lumière HEV pour les tissus oculaires est largement sous-estimé. / The eye, a complex organ, faces the ambient electromagnetic spectrum on a daily basis. Its unique sensory functions require the specific delivery of light, a small portion of that spectrum, to the retina, the inside lining of eye fundus. To achieve such specificity, the optical path is made up of different tissues, each showing a remarkable ability to absorb or transmit precise wavelengths. However, high energy wavelengths absorption is associated with a risk of toxicity, which might threaten the integrity of absorbing tissues. This is particularly true for ultraviolet B or UVB (most energetic naturally occurring radiation that reach the ocular surface). UVB deleterious effects have been documented and mainly arise from direct photochemical processes. There is now a growing consensus that UVA and high energy visible blue light (HEV), the wavelengths adjacent to UVB in the spectrum, hold a significant potential for ocular toxicity. However, the basis for such toxicity is poorly understood. UVA rays are absorbed by the cornea and the lens, while HEV light is absorbed by the retina. Both spectral regions are characterized by a strong ability to promote oxidative stress in target tissues through indirect oxygen-dependent processes that rely on the presence of specific photosensitizers in tissues. Several data show that oxidative stress correlates with the toxic effects induced by eye exposure to UVA or HEV light, but the molecular events underlying such correlation remain to be clarified. The overall goal of the work presented in this thesis was therefore to identify key oxidation-related determinants of UVA and HEV light toxicity for ocular tissues. Even if the lens absorbs the majority of UVA rays reaching the ocular surface, the cornea also filters out a significant part of these wavelengths, and there is very little information on the repercussion for the cornea. In the first section of my thesis, we thus sought to determine the early consequences of cornea exposure to UVA. Using UVA-irradiated rabbit eyes as a model, we confirmed the induction of numerous oxidation reactions through corneal entire thickness. We reported oxidatively generated molecular changes occurring in the cornea very shortly after exposure and we described their distribution within the three corneal cellular layers (epithelium, stroma and endothelium). We provide evidence that in corneal native conformation, damage susceptibility and responsiveness to UVA-induced oxidation vary from one layer to another. For example, while corneal epithelial cells are subjected to important modifications in response to UVA exposure, they efficiently limit the early manifestations of UVA-induced toxicity by using compensatory mechanisms. On the other hand, the endothelium, the posterior portion of the cornea, is more susceptible to UVA-induced immediate toxicity. Oxidation resulting from extended exposure of the cornea to UVA is therefore expected to pose a hazard to corneal endothelium integrity. The second section of my thesis aimed to define cellular mechanisms involved in HEV light toxic action. Available data in the literature show that HEV light ocular toxicity primarily affects retinal pigment epithelium (RPE) and relies on the age-related accumulation of endogenous photosensitizers in RPE cells. However, we have identified an exogenous HEV light photosensitizer, indenopyrene (IcdP), an important tobacco smoke derived polycyclic aromatic hydrocarbon, which may accumulate in RPE. Using IcdP and/or HEV light-exposed human RPE cells as a model, we highlighted a toxic synergy between IcdP and HEV light. IcdP is at least 3000 times more toxic for RPE cells when irradiated with sub-lethal amounts of HEV light. It then promotes degenerative changes comparable to those observable in age-related macular degeneration (the leading cause of irreversible vision loss among elderly people). These changes include oxidative stress, structural defects and apoptotic cell death. A study of the molecular processes underlying this synergy reveals that IcdP HEV light interaction results in loss of the tight coupling required between the two metabolic phases ensuring IcdP efficient detoxification in RPE. Such loss seems to precipitate cell deterioration. Our work raises the prospect that HEV light toxicity for RPE is significantly modulated, among other things, by lifestyle and environmental pollution. This thesis, addressing UVA and HEV light ocular toxicity from a new perspective, proves that their harmful nature in ocular tissues is largely underestimated

Titre de l'écran-titre (visionné le 27 mars 2023) / Les lésions de la moelle épinière (LME) sont provoquées lorsque la moelle épinière est endommagée à la suite d'un impact ou d'une compression mécanique prolongée sur la colonne vertébrale, pouvant causer une paraplégie voire même une tétraplégie. Chaque année, entre 250 000 et 500 000 personnes dans le monde souffrent de LME selon l'organisation mondiale de la santé, dont 86 000 cas recensés au Canada. Les dommages causés aux neurones et aux cellules gliales à la suite d'une LME engendrent des dommages tissulaires irréversibles ainsi que l'activation de mécanismes inflammatoires principalement médiés par des cytokines. Initialement, la LME entraine la nécrose des microglies et la libération de leur contenu cellulaire qui inclut l'interleukine-1 alpha (IL-1α). Ce signal de danger hautement actif (alarmine) déclenche la neuroinflammation se traduisant à court terme par le recrutement des neutrophiles et des monocytes inflammatoires au site lésionnel et, à moyen terme, par la mort des oligodendrocytes (Ols) par apoptose. Des travaux de recherche récemment publiés par notre équipe ont montré que l'infiltration des cellules immunitaires du sang est significativement diminuée lorsque le gène Il1a ou Il1b est invalidé chez les souris. Cependant, seules les souris Il1a$^{-/-}$ ont montré des améliorations rapides et permanentes de la locomotion ainsi qu'un volume lésionnel réduit dès le premier jour suivant la lésion. L'objectif de cette thèse était d'investiguer le mécanisme d'action l'IL-1α au niveau du système nerveux central (SNC) afin de mieux comprendre comment cette cytokine médies es effets néfastes et ainsi permettre de les inhiber dans un contexte de LME. Nous avons ainsi mis en évidence que l'IL-1α entraîne principalement l'infiltration massive de neutrophiles ainsi que la diminution rapide des Ols. L'utilisation de différentes lignées murines transgéniques nous a permis d'induire une délétion ou une restauration spécifique du récepteur de l'IL-1, IL-1R1, dans les différents types cellulaires du SNC, afin de mieux comprendre le mécanisme d'action de l'IL-1α. Nous avons ainsi pu observer que l'infiltration des cellules immunitaires requiert la présence de l'IL-1R1 endothélial. Nous avons également montré que l'effet délétère de l'IL-1α sur les Ols est principalement médié par les astrocytes. De plus, nous avons montré que les astrocytes sont capables d'induire la mort des Ols via la production de dérivés oxygénés réactifs (Reactive Oxygen Species, ROS) dont l'effet peut être inhibé grâce à l'administration de l'antioxydant N-acétylcystéine. Ainsi, la meilleure compréhension du mécanisme d'action de l'IL-1α et de ses effets subséquents permet d'ouvrir la possibilité à de nouvelles cibles thérapeutiques dont les effets pourraient aider à réduire les dommages suite aux LME et, ainsi, favoriser la récupération des patients. / Over 4 million people suffer from SCI worldwide, and about 250 000 to 500 000 new injuries occur annually. At the site of trauma, SCI causes direct damage to cell bodies of neurons and glial cells. This is followed by a second wave of tissue degeneration characterized by damage to myelin and the death of oligodendrocytes (Ols) and neurons that survive the initial trauma, thus resulting in an amplification of the motor and sensory deficits. We recently demonstrated that dead and dying microglia at sites of SCI rapidly release the danger signal interleukin (IL)-1α, which in return triggers neuroinflammation. Accordingly, mice lacking the Il1a gene have an impaired inflammatory response and recover faster and to a greater extent than control mice after SCI. The main goal of this thesis was to investigate the mechanism of action and effects of IL-1α in the central nervous system (CNS) in order to prevent its detrimental consequences in the context of SCI. We uncovered that intra-cisterna magna (i.c.m.) delivery of recombinant IL-1α in mice leads to massive infiltration of neutrophils, the rapid death (within 24 hours) of mature Ols along the rostro-caudal spinal cord axis, damage to myelin sheaths, and strong activation of neurons. Using novel transgenic mouse lines in which we induced cell-specific deletion of the gene coding for the interleukin-1 receptor type I (IL-1R1), we found that Ol cell death was indirect and involved other types of CNS-resident cells such as astrocytes and endothelial cells (ECs), as well as blood-derived myeloid cells. Altogether, our data suggest that IL-1α released by damaged/dead microglia after SCI regulates Ol cell death and myelin damage through a mechanism that involves astrocytes, ECs and myeloid cells. Understanding the mechanism underlying Ol cell death and disruption of myelin integrity after SCI could allow the development of novel therapeutic strategies to protect and/or rescue this cell population and improve recovery after CNS injury and demyelinating diseases.

Introduction : Dans le cœur adulte, l'ischémie et la reperfusion entraînent des perturbations électriques, mécaniques, biochimiques et structurales qui peuvent causer des dommages réversibles ou irréversibles selon la sévérité de l'ischémie. Malgré les récents progrès en cardiologie et en chirurgie fœtales, la connaissance des mécanismes impliqués dans la réponse du myocarde embryonnaire à un stress hypoxique transitoire demeure lacunaire. Le but de ce travail a donc été de caractériser les effets chrono-, dromo- et inotropes de l'anoxie et de la réoxygénation sur un modèle de cœur embryonnaire isolé. D'autre part, les effets du monoxyde d'azote (NO) et de la modulation des canaux KATP mitochondriaux (mitoKATP) sur la récupération fonctionnelle postanoxique ont été étudiés. La production myocardique de radicaux d'oxygène (ROS) et l'activité de MAP Kinases (ERK et JNK) impliquées dans la signalisation cellulaire ont également été déterminées.<br />Méthodes : Des cœurs d'embryons de poulet âgés de 4 jours battant spontanément ont été placés dans une chambre de culture puis soumis à une anoxie de 30 min suivie d'une réoxygénation de 60 min. L'activité électrique (ECG), les contractions de l'oreillette, du ventricule et du conotroncus (détectées par photométrie), la production de ROS (mesure de la fluorescence du DCFH) et l'activité kinase de ERK et JNK dans le ventricule ont été déterminées au cours de l'anoxie et de la réoxygénation. Les cœurs ont été traités avec un bloqueur des NO synthases (L-NAME), un donneur de NO (DETA-NONOate), un activateur (diazoxide) ou un inhibiteur (5-HD) des canaux mitoKATP, un inhibiteur non-spécifique des PKC (chélérythrine) ou un piégeur de ROS (MPG).<br />Résultats : L'anoxie et la réoxygénation entraînaient des arythmies (essentiellement d'origine auriculaire) semblables à celles observées chez l'adulte, des troubles de la conduction (blocs auriculo-ventriculaires de 1er, 2ème et 3ème degré) et un ralentissement marqué du couplage excitation-contraction (E-C) ventriculaire. En plus de ces arythmies, la réoxygénation déclenchait le phénomène de Wenckebach, de rares échappements ventriculaires et une sidération myocardique. Aucune fibrillation, conduction rétrograde ou activité ectopique n'ont été observées. Le NO exogène améliorait la récupération postanoxique du couplage E-C ventriculaire alors que l'inhibition des NOS la ralentissait. L'activation des canaux mitoKATP augmentait la production mitochondriale de ROS à la réoxygénation et accélérait la récupération de la conduction (intervalle PR) et du couplage E-C ventriculaire. La protection de ce couplage était abolie par le MPG, la chélérythrine ou le L-NAME. Les fonctions électrique et contractile de tous les coeurs récupéraient après 30-40 min de réoxygénation. L'activité de ERK et de JNK n'était pas modifiée par l'anoxie, mais doublait et quadruplait, respectivement, après 30 min de réoxygénation. Seule l'activité de JNK était diminuée (-60%) par l'activation des canaux mitoKATP. Cet effet inhibiteur était partiellement abolit par le 5-HD.<br />Conclusion: Dans le cœur immature, le couplage E-C ventriculaire semble être un paramètre particulièrement sensible aux conditions d'oxygénation. Sa récupération postanoxique est améliorée par l'ouverture des canaux mitoKATP via une signalisation impliquant les ROS, les PKC et le NO. Une réduction de l'activité de JNK semble également participer à cette protection. Nos résultats suggèrent que les mitochondries jouent un rôle central dans la modulation des voies de signalisation cellulaire, en particulier lorsque les conditions métaboliques deviennent défavorables. Le cœur embryonnaire isolé représente donc un modèle expérimental utile pour mieux comprendre les mécanismes associés à une hypoxie in utero et pour améliorer les stratégies thérapeutiques en cardiologie et chirurgie fœtales.

Nous avons récemment démontré que les espèces réactives oxygénées induisent une augmentation de l’expression des protéines Giα dans les cellules du muscle lisse vasculaire (CMLV) provenant d’aortes de rats spontanément hypertendus (SHR, de l’anglais spontaneously hypertensive rats). La présente étude a pour but d’étudier les effets du peroxyde d’hydrogène (H2O2), un oxydant qui induit le stress oxydatif, sur l’expression de Giα et sur l’activité de l’adénylate cyclase, et d’explorer les voies de signalisation sous-jacentes responsables de cette réponse. Nos résultats montrent que H2O2 induit une augmentation de l’expression des protéines Giα-2 et Giα-3 de manière dose- et temps-dépendante avec une augmentation maximale de 40-50% à 100 µM après 1 heure, sans affecter l’expression de Gsα. L’expression des protéines Giα a été maintenue au niveau normal en presence de AG 1478, AG1295, PD98059 et la wortmannine, des inhibiteurs d’EGF-R (de l’anglais epidermal growth factor receptor), PDGFR-β (de l’anglais platelet-derived growth factor receptor β), de la voie de signalisation ras-ERK1/2 (de l’anglais extracellular regulated kinase1/2), et de la voie de la PI3Kinase-AKT (de l’anglais phosphatidyl inositol-3 kinase), respectivement. En outre, le traitement des CMLV avec H2O2 a induit une augmentation du degré de phosphorylation d’EGF-R, PDGF-R, ERK1/2 et AKT; et cette expression a été maintenue au niveau témoin par leurs inhibiteurs respectifs. Les inhibiteurs d’EGF-R et PDGF-R ont aussi induit une diminution du degré de phosphorylation de ERK1/2, et AKT/PKB. En outre, la transfection des cellules avec le siRNA (de l’anglais, small interfering ribonucleic acid) de EGF-R et PDGFR-β a atténué la surexpression des protéines Giα-2 et Giα-3 induite par le traitement au H2O2. La surexpression des protéines Giα induite par H2O2 a été corrélée avec une augmentation de la fonction de la protéine Giα. L’inhibition de l’activité de l’adénylate cyclase par de faibles concentrations de GTPγS après stimulation par la forskoline a augmenté de 20% dans les cellules traitées au H2O2. En outre, le traitement des CMLV au H2O2 a aussi accru l’inhibition de l’activité de l’adénylate cyclase par les hormones inhibitrices telles que l’angiotensine II, oxotrémorine et C-ANP4-23. D’autre part, la stimulation de l’adénylate cyclase induite par GTPγS, glucagon, isoprotérénol, forskoline, et le fluorure de sodium (NaF) a été atténuée de façon significative dans les cellules traitées au H2O2. Ces résultats suggèrent que H2O2 induit la surexpression des protéines Giα-2 and Giα-3 via la transactivation des récepteurs des facteurs de croissance EGF-R, PDGFR-β et l’activation des voies de signalisation ras-ERK1/2 et PI3K-AKT Mot-cles: Protéines Giα, peroxyde d’hydrogène, stress oxydant, récepteurs des facteurs de croissance, MAP kinases, adénylate cyclase, hypertension / We recently have shown that reactive oxygen species contribute to the enhanced expression of Giα proteins in vascular smooth muscle cells (VSMC) from spontaneously hypertensive rats (SHR). The present study was undertaken to examine if H2O2, an oxidant that induces oxidative stress could also enhance the expression of Giα proteins and associated adenylyl cyclase signalling in aortic VSMC and to further explore the underlying signaling pathways responsible for this response. Treatment of cells with H2O2 increased the expression of Giα-2 and Giα-3 proteins but not that of Gsα proteins in a concentration- and time-dependent manner. A maximal increase of 40-50% was observed at 100µM and 1h. The enhanced expression of Giα proteins was restored to control levels by AG 1478, AG1295, PD98059 and wortmannin, inhibitors of epidermal growth factor receptor (EGF-R), platelet-derived growth factor receptor (PDGFR-β), the mitogen-activated protein kinase (MEK1/2), and PI3 kinase respectively. In addition, treatment of VSMC with H2O2 also increased the phosphorylation of EGF-R, PDGF-R, ERK1/2 and AKT and this increased phosphorylation was attenuated to control levels by the respective inhibitors, whereas the inhibitors of EGF-R and PDGE-R also attenuated the enhanced phosphorylation of ERK1/2 and AKT to control levels. Transfection of cells with EGF-R and PDGFR-β siRNA followed by H2O2 treatment restored the H2O2-induced enhanced expression of Giα-2 and Giα-3 proteins to control levels. The increased expression of Giα proteins by H2O2 was reflected in the increased Gi functions. The inhibition of forskolin (FSK)-stimulated AC activity by low concentration of GTPγS (receptor- independent Gi functions) was increased by about 20% by H2O2 treatment. Moreover, treatment of cells with H2O2 also resulted in an increased Ang II-, C-ANP4-23, and oxotremorine-mediated inhibition of AC (receptor-dependent functions of Gi). On the other hand, Gsα-mediated stimulation of AC by GTPγS, glucagon, isoproterenol, FSK, and NaF was significantly decreased in H2O2-treated cells. These results suggest that H2O2 increases the expression of Giα-2 and Giα-3 proteins in VSMC through the transactivation of EGF-R, PDGFR-β and associated ERK1/2 and PI3K signalling pathways. Keywords: Giα proteins, hydrogen peroxide, adenylyl cyclase, oxidative stress, MAP kinase, growth factor receptors, hypertension.