La mucoviscidose est une maladie génétique, autosomale et récessive. Elle est caractérisée par une inflammation précoce des voies aériennes observée en absence de toute infection bactérienne, virale ou fongique. Aujourd’hui, l’origine de cette inflammation précoce reste très discutée. Plusieurs études mettent en avant la participation du stress oxydatif, une composante pathologique majeure de la mucoviscidose. Cependant, le lien entre le stress oxydatif et l’inflammation dans un contexte mucoviscidosique reste à démontrer.Mon projet de thèse a porté sur la caractérisation du rôle du stress oxydatif dans le déclenchement de l'inflammation dans la mucoviscidose. Pour cela j’ai utilisé des cellules épithéliales bronchiques humaines saines (HBE) et mucoviscidosiques(CFBE). J'ai également utilisé deux modèles de cellules dérivées de la cellule CFBE; les cellules CFBE corrigées par la protéinenormale et celles surexprimant la protéine CFTR mutée ; CFTR-delF508 (CFBE-delF508). La caractérisation du profil inflammatoire dans les trois modèles cellulaires a confirmé la présence d'une inflammation intrinsèque dans les cellules CFBE. Cependant, ce profil serait indépendant de l'expression de la protéine CFTR, car il n’est pas modifié suite à l’utilisation de traitements avec des correcteurs de l’expression de la protéine CFTR mutée. Ces résultats suggèrent que le statut inflammatoire dans les cellules mucoviscidosiques serait dû à des protagonistes autres que CFTR. Des études récentes de notre groupe ont montré que les cellules de patients atteints de mucoviscidose présentent une diminution de la concentration en cuivre (Cu), une augmentation de la production de radicaux libres (ROS) et une diminution des activités enzymatiques anti-oxydantes, notamment celle de la Cu/Zn-SOD. La caractérisation du statut du métal cuivre dans nos modèles, nous a permis d'établir un lien entre les niveaux de Cu, le stress oxydatif et l'inflammation dans la mucoviscidose. La comparaison des niveaux d'expression de gènes codants pour des protéines impliquées dans l'homéostasie du Cu dans les cellules HBE et CFBE, nous a permis d’identifier la protéine prion cellulaire (PrPC) comme protéine surexprimée dans les cellules CFBE. PrPC est une glycoprotéine ancrée à la surface des cellules grâce à son ancre Glycosyl-Phosphatidyl-Inositol(GPI). Plusieurs études menées in vitro et in vivo ont montré la capacité du PrPC à interagir avec différentes protéines, à lier le Cu avec une forte affinité, et à protéger les cellules contre le stress oxydatif. Néanmoins, ses fonctions restent à caractériserdans des tissus extra-neuronaux comme l'épithélium bronchique. Nous avons étudié le rôle de la protéine PrPC dans le contrôle de l'homéostasie du Cu et du stress oxydatif dans les cellules épithéliales bronchiques. Nous avons aussi étudié son implication dans le contrôle des jonctions cellulaires des cellules pulmonaires. Afin de mieux comprendre la fonction PrPC dans les processus inflammatoires associés à la mucoviscidose, nous avons développé une nouvelle lignée cellulaire invalidée pour la protéine PrPC, en utilisant la stratégie CRISPR / Cas9. Dans l'ensemble, notre projet a avancé nos connaissances sur la compréhension de l'implication de la protéine CFTR dans l’inflammation et le stress oxydatif associé aux cellules bronchiques mucoviscidosiques. Nous avons aussi mis en évidence l’implication du cuivre dans le stress et l’inflammation dans les cellules mucoviscidosiques. Finalement, nous avons montré que dans les cellules bronchiques humaine, la protéine PrPC est exprimée et localisée dans les jonctions cellulaires où elle participe à la protection contre le stress d’origine cuprique. / In cystic fibrosis (CF), inflammation is detected early on in the airways, even before the onset of bacterial infection, suggesting that mechanisms other than infection are at the origin of the initial inflammatory processes. Among these processes, there is the oxidative stress. The latter is widely accepted as a critical component of several diseases. My PhD project was focused on the characterization of the role of the oxidative stress in triggering inflammation in the CF disease. I used normal (HBE) and cystic fibrosis (CFBE) human bronchial epithelial cells. I also used two cell models derived from CFBE upon either, a stable expression of the wild-type protein (CFBE-wt), or its mutant form; delF508 (CFBEdeltaF508). The characterization of the inflammatory profile in our cellular models confirmed the presence of an intrinsic inflammation inCFBE cells. This profile was independent of the expression of the CFTR protein and was not modified upon the treatments with different molecules known to correct the trafficking of the mutant CFTR (delF508) protein. This suggest that other parameters might be the cause of the CF intrinsic inflammation. Recent studies from our group showed that cells from bronchial CF patients displayed a decrease in copper (Cu) concentrations, and increase in the production of free radicals, and a decrease in antioxidant enzyme activities, such as Cu/Zn-SOD. These results allowed us to establish a link between Cu levels, oxidative stress and inflammation. While investigating the levels of expression of a number of genes encoding proteins that control Cu homeostasis in HBE and CFBE cells, we found that the expression of the cellular prion protein (PrPC) was altered in CFBE cells. PrPC is a glycosyl phosphatidyl inositol (GPI)-anchored glycoprotein involved in prion infection, propagation and aggregation in the central nervous system that leads to transmissible spongiforme encephalopathies (TSE) diseases. Despite several in vitro and in vivo studies demonstrating the capacity of PrPC to interact with other proteins, to bind copper (Cu) with high affinity and to protect cells against oxidative stress, its physiological functions were still under investigations, particularly in extra-neuronal tissues, such as the bronchial epithelium. We have addressed the role of PrPC in the lung cellular architecture, by determining its impact on the integrity of the lung epithelial junctions. This was performed in relation to Cu homeostasis and oxidative stress in bronchial epithelial cells. To further understand PrPC function, we developed a new HBE PrPC knock-out cell line using the CRISPR/Cas9 strategy. Overall, my project brought new insights into the understanding copper involvement in inflammation, oxidative stress and jonctionnal barriers, and how PrPC protein protect bronchial epithelial cells form copper-associated oxidative stress.

Les composants cellulaires sont constamment exposés à un stress oxydatif, lié à l’environnement et au métabolisme cellulaire. Les espèces réactives de l’oxygène produites par ce stress induisent de nombreuses lésions dans l’ADN, telles que l’oxydation des bases, la formation de sites abasiques ou la cassure de brins d’ADN. Ces dommages sont corrigés par un panel de systèmes de réparation, qui jouent un rôle critique dans la survie cellulaire et dans la prévention de pathologies telles que les maladies neurodégénératives ou le cancer. La modification de bases est le type de dommage le plus abondant, généré spontanément ou par des agents exogènes. Notre laboratoire s’intéresse ainsi au système de réparation par excision de base (BER), qui élimine les bases nucléotidiques altérées. Des études antérieures ont montré la formation « d’usines de réparation du BER » suite à des traitements induisant l’oxydation des bases dont la forme la plus courante est la 8-oxoguanine (8-oxoG). Dans le cas de cette lésion mutagène, l’assemblage du complexe BER dépend du recrutement d’OGG1 à la chromatine, l’enzyme qui reconnaît et excise la 8-oxoG. Cependant, ce recrutement ne nécessite pas la reconnaissance de la 8-oxoG, indiquant que d’autres signaux interviennent pour initier la réparation de la 8-oxoG par OGG1. Un crible à haut débit a été réalisé dans des cellules humaines pour rechercher des protéines impliquées dans le recrutement d’OGG1. Deux complexes ont été identifiés, les cohésines et le médiateur de la transcription.Dans ce projet de recherche, nous avons exploré le rôle de ces protéines dans la relocalisation d’OGG1 suite à un stress oxydatif. Nos études ont tout d’abord permis d’identifier des protéines essentielles au recrutement d’OGG1 : les protéines formant l’anneau de cohésines (SMC1, SMC3 et RAD21), plusieurs sous-unités du médiateur dont MED14, ainsi que le module CDK (MED12, MED13, Cycline C et CDK8). De plus, ces protéines sont nécessaires pour le recrutement d’OGG1 tout au long du cycle cellulaire. Nos résultats montrent que la relocalisation d’OGG1 sur la chromatine est liée à sa fonction de réparation de la 8-oxoG. Nous avons d’autre part montré que deux sous-unités du médiateur (MED12 et CDK8) sont relocalisées dans l’euchromatine, comme OGG1, de façon dépendante du corps du médiateur et des cohésines. Enfin, l’association d’OGG1 avec ses partenaires a été validée par microscopie FLIM-FRET et co-immunoprécipitation dans des conditions de stress oxydatif.En conclusion, ces résultats montrent pour la première fois un lien entre la réparation des bases oxydées et les complexes du médiateur et des cohésines, tous deux connus pour leur participation à d’autres voies de réparation de l’ADN. L’identification des mécanismes moléculaires et de nouveaux facteurs impliqués dans la réparation des bases oxydées pourrait fournir à terme des éléments essentiels pour la prise en charge de maladies telles que le cancer ou les maladies neurodégénératives. / Our laboratory focuses on the base excision repair (BER) mechanism that is responsible for the removal of damaged bases in DNA. Oxidative DNA damage is generated spontaneously by the endogenous metabolism of the cells or induced exogenously by chemical or physical agents. Our aim is to understand how BER complexes are assembled in the context of the cell nucleus in response to genotoxic stress. We previously found that after treatments generating oxidized bases into cellular DNA BER complexes are assembled on the chromatin. In the case of the 8-oxoguanine (8-oxoG) mutagenic lesion, assembly of the BER complex depends on the recruitment to the chromatin of OGG1, the DNA glycosylase that recognizes and excises the lesion. Surprisingly, characterization of OGG1 mutants that are not able to recognize 8-oxoG showed that the recruitment of this initiator protein does not require the recognition of the damaged base. This suggests that there are other mechanisms that allow recruitment of the enzyme to chromatin and thus initiation of the repair of the 8-oxoG by the BER. We performed a high-throughput siRNA screen in human cells to identify proteins required for the recruitment of OGG1 to chromatin. Among the candidates issued from the screen, two groups of proteins were selected for further study: members of the mediator and cohesin complexes.In this project, we explored the role of these proteins in OGG1 relocalization after an oxidative stress. Our studies confirmed the requirement of essential proteins for OGG1 recruitment: cohesins subunits (SMC1, SMC3 and RAD21), mediator subunits including the central protein MED14, and CDK subunits (MED12, MED13, Cyclin C and CDK8). Requirement of all these proteins is independent of the cell cycle. Furthermore we show that recrutement of OGG1 is essential for its 8-oxoG repair function. Microscopy studies revealed recruitment and colocalization of two mediator subunits (MED12 and CDK8) with OGG1 on euchromatin domains after an oxidative stress. Finally, the association between OGG1 and its partners, specifically after an oxidative stress, was validated by FLIM-FRET microscopy and co-immunoprecipitation.To conclude, these results show for the first time a link between repair of oxidized bases and mediator and cohesin complexes, both of them being already involved in other DNA repair pathways. The identification of molecular mechanisms and new factors involved in the repair of oxidized bases may ultimately provide new elements for the management of diseases such as cancer and neurodegenerative diseases.

La régénération in vitro est un processus complexe largement utilisé pour la multiplication végétative ainsi qu'en recherche fondamentale pour étudier l'organogenèse. Malgré les diverses applications de la caulogenèse in vitro, les mécanismes de régulation impliqués restent mal caractérisés. Avant le début de mon doctorat, nous avons identifié un mutant d'Arabidopsis thaliana chez lequel un défaut du complexe I de la chaîne de transport d'électrons mitochondriale (CTEm) entraîne une augmentation du taux de régénération comparé au sauvage, mesurée sur des cals issus de protoplastes. Au début de mon projet doctoral, j'ai confirmé le lien entre le dysfonctionnement respiratoire et l'augmentation des taux de régénération en utilisant un inhibiteur spécifique du complexe I appelé roténone. Pour comprendre ce phénomène, j'ai étudié les mécanismes moléculaires et biochimiques liant la respiration mitochondriale et l'organogenèse in vitro. J'ai analysé différents mutants affectés dans l'activité du complexe I et conclu que le retard de croissance qui en découle est positivement corrélé avec le taux de régénération. Pour comprendre comment les perturbations de la CTEm affectent la formation des bourgeons, j'ai comparé les profils d'expression des gènes dans des tissus mutants du complexe I et dans des cals traités avec la roténone. Les résultats obtenus montrent, d’une part, que le profil d’expression des gènes est différent chez le sauvage et chez les mutants du complexe I et, d’autre part, que la roténone induit un stress oxydatif, inhibe la prolifération cellulaire et module les régulations hormonales. J'ai confirmé que la réponse oxydative induite par la roténone est rapidement relayée dans le cytosol en utilisant un bio-senseur de l’état redox cellulaire. Nos résultats suggèrent un lien de causalité entre un stress oxydatif induit par des perturbations respiratoires et la hausse du taux de régénération. Nos travaux pointent vers des méthodes alternatives pour améliorer l'efficacité de l'organogenèse in vitro par inhibition transitoire d'activités mitochondriales. / In vitro shoot regeneration is a complex process routinely used for vegetative propagation and to study plant organogenesis. Despite multiple applications of in vitro shoot initiation, the regulatory mechanisms involved remain poorly understood. Prior to the beginning of my PhD thesis, we identified an Arabidopsis thaliana mutant in which a defect in the complex I of the mitochondrial electron transport chain (mETC) results in a higher shoot regeneration rate compared to wild type, measured on protoplast-derived calli. At the beginning of my PhD project, I confirmed the link between the respiratory defect and the shoot regeneration boost with a specific complex I inhibitor called rotenone. To understand this phenomenon, I investigated the molecular and biochemical mechanisms linking mitochondrial respiration and shoot organogenesis. For this purpose, I analyzed different mutants affected in the complex I activity and concluded that the resulting growth retardation is positively correlated with the regeneration rate. To understand how mETC perturbations promote shoot regeneration, I compared gene expression profiles in complex I mutant tissues and in calli treated with rotenone. Our data show, on the one hand, that gene expression profiles are different in complex I mutants and, on the other hand, that rotenone induces an oxidative stress, inhibits cell proliferation, and modulate hormonal regulations. I confirmed that the oxidative response induced by rotenone is rapidly relayed in the cytosol with a redox- sensitive biosensor. Altogether, our results suggest a causal link between an oxidative stress caused by respiratory impairments and shoot regeneration enhancement. Our findings point to alternative methods to promote in vitro organogenesis via transient inhibition of mitochondrial activities.

La bactérie Salmonella enterica sérovar Typhi est l’agent responsable de la fièvre typhoïde qui cause 20 millions de cas et plus de 200 000 morts annuellement. Elle possède plusieurs facteurs de virulence y compris 14 fimbriae, des structures protéiques que l’on retrouve à la surface de certaines bactéries. Plusieurs facteurs impliqués dans la chaîne de transport d'électrons (CTE) influencent l’expression du fimbriae fim, tel que Ndh, une NADH déshydrogénase (NADH-2), qui accepte et transmet les électrons du complexe I au pool de quinones entre le complexe II et III, et est un facteur majeur de la respiration aérobie chez les bactéries qui régit l'équilibre entrele NADH et NAD, et YqiC, une protéine multifactorielle et un facteur accessoire des ubiquinones, ont été identifiés comme activateur du fimbriae Fim. Notre hypothèse est que la CTE est impliquée dans la régulation du fimbriae fim. Nous voulions déterminer si la CTE régule l’expression du fimbriae fim de façon directe ou indirecte. Pour ce faire, nous avons déterminé le rôle du complexe I ; l’effet du stress oxydatif; et le rôle de l’accepteur final d’électron. Plusieurs mutants ont été créés par échange allélique et l’expression de fim chez ces mutants est quantifiée à l’aide d’un gène rapporteur, soit une fusion du promoteur fim avec le gène rapporteur lacZ. Pour déterminer le rôle du complexe I de la CTE, nous avons testé le mutant NDH-1 et NDH-2, qui s’avère à jouer un rôle important essentiel pour la régulation de fim. Pour évaluer l’effet du stress oxydatif, nous avons testé les mutants OxyR, SodB, la catalase KatG et les 3 peroxydases (Tpx, AhpC et TsaA) qui détoxifient les espèces réactives d’oxygènes (ROS) produites lors de la respiration. L’absence combinée de la catalase KatG et de la peroxydase AhpC empêche totalement l’expression de fim. Le rôle de l’accepteur final d’électron a été évalué par la présence ou absence d’oxygène, avec ou sans ajout de nitrate, nous suggérant un rôle important de YqiC pour la synthèse des transporteurs d’électrons, la génération d’ATP et le maintien du métabolisme bactérien en cas de stress oxydatif. Cette étude a permis d’identifier Ndh (NDH-2) comme une cible thérapeutique potentielle puisqu’elle ne se retrouve pas dans la chaîne d’électron de la mitochondrie chez les mammifères, donc chez les humains. Aussi, cette étude a permis de cibler les gènes détoxifiant essentiels à la régulation de fim, devenant eux aussi des cibles thérapeutiques potentielles. / The bacterium Salmonella enterica serovar Typhi is the causative agent of typhoid fever, which causes 20 million cases and more than 200,000 deaths annually. It has several virulence factors including 14 fimbriae, protein structures found on the bacterial surface. Several factors involved in the electron transport chain (ETC) influence expression of the fim fimbriae, such as Ndh, an NADH dehydrogenase (NDH-2), which accepts and transports electrons from complex I to the quinone pool between the complex II and III, and is a major factor in aerobic respiration in bacteria that governs the balance between NADH and NAD, and YqiC, a multifactorial protein and an ubiquinone biosynthesis accessory factor, have been identified as an activator of Fim fimbriae . Our hypothesis is that ETC is involved in the regulation of the fim fimbriae. Our aim was to determine whether ETC regulates the expression of the fim fimbriae directly or indirectly. To do this, we determined the role of complex I; the effect of oxidative stress; and the role of the final electron acceptor. Several mutants were created by allelic exchange and fim expression in these mutants was quantified using a reporter gene, i.e. a fusion of the fim promoter with the lacZ reporter gene. To determine the role of ETC complex I, we tested the NDH-1 and NDH-2 mutants, which appears to play an important role essential for fim regulation. To assess the effect of oxidative stress, we tested mutants of OxyR, SodB, catalase KatG and the 3 peroxidases (Tpx, AhpC and TsaA) which detoxify reactive oxygen species (ROS) produced during respiration. When both the catalase KatG and the peroxidase AhpC were mutated, the fim expression was totally turned off. The role of the final electron acceptor was evaluated by the presence or absence of oxygen, with or without addition of nitrate, suggesting an important role of YqiC for electron carrier synthesis, the generation of ATP and the maintain bacterial metabolism in the event of oxidative stress. This study made it possible to identify Ndh (NDH-2) as a potential therapeutic target since it is not found in the electron chain of the mitochondria in mammals, therefore in humans. Also, this study made it possible to target the detoxifying genes essential to fim regulation, also becoming potential therapeutics targets.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'œil est un organe complexe quotidiennement exposé au rayonnement électromagnétique ambiant. Les fonctions sensorielles uniques qu'il assure nécessitent l'acheminement spécifique d'une portion de ce rayonnement, la lumière, jusqu'à la rétine tapissant son fond. À cette fin, le chemin optique est constitué de différents tissus caractérisés par leur remarquable capacité à absorber ou transmettre des longueurs d'onde définies. L'absorption de longueurs fortement énergétiques s'accompagne néanmoins d'un risque de toxicité susceptible de compromettre l'intégrité et la santé des tissus absorbants. Tel est notamment le cas des rayons ultraviolets de type B ou UVB (rayons les plus énergétiques atteignant la surface oculaire en conditions normales). Les effets dommageables des UVB ont été documentés et découlent principalement de processus photochimiques directs. Il est de plus en plus reconnu que deux autres domaines du spectre électromagnétique ambiant, les UVA et la lumière bleue visible à haute énergie (HEV), disposent d'un potentiel significatif de toxicité pour les tissus oculaires. Toutefois, les fondements de cette nocivité sont mal compris. Les UVA, absorbés par la cornée et le cristallin, et la lumière HEV, absorbée au niveau de la rétine, se démarquent par une grande capacité à causer un stress oxydatif, à travers des processus indirects largement dépendants de la présence d'oxygène et de photosensibilisateurs adéquats dans les tissus absorbants. Plusieurs évidences lient leur toxicité à ce stress oxydatif, mais les événements moléculaires sous-tendant ce lien restent à définir. L'objectif global des travaux présentés dans cette thèse était donc d'identifier les déterminants de la toxicité tissulaire reliés à l'effet pro-oxydant de ces rayons. Bien que majoritairement absorbés par le cristallin, la cornée filtre une portion significative des rayons UVA parvenant à la surface oculaire et les conséquences de cette filtration sont très peu documentées. Le premier volet de nos travaux s'est donc penché sur les conséquences précoces d'une exposition de la cornée à ces rayons. L'exposition d'yeux de lapins aux UVA a permis de confirmer que ceux-ci induisent de nombreux phénomènes d'oxydation tout le long du tissu cornéen. Nous avons décrit les altérations moléculaires immédiates causées par ces phénomènes et leur profil de distribution à travers les trois couches cellulaires cornéennes (épithélium, stroma et endothélium). Nous avons ainsi déterminé que dans sa configuration native, la sensibilité aux dommages et la réponse de la cornée aux UVA ne sont pas uniformes d'une région à l'autre du tissu. Par exemple, alors que l'épithélium subit d'importantes altérations moléculaires en réponse à l'exposition, ses cellules limitent efficacement les manifestations immédiates de la toxicité des UVA par des mécanismes compensatoires. En contraste, l'endothélium à la surface postérieure de la cornée, présente une grande susceptibilité à une toxicité immédiate, et l'oxydation induite par une exposition prolongée aux UVA pose un risque particulier pour sa santé. Le second volet visait à déterminer les mécanismes cellulaires mis en œuvre dans l'action toxique de la lumière HEV. Les données disponibles sur la toxicité oculaire de ce rayonnement montrent que celle-ci touche principalement l'épithélium pigmenté de la rétine (EPR) et repose sur une accumulation de photosensibilisateurs endogènes dans ce tissu avec l'âge. Nous avons toutefois identifié un photosensibilisateur exogène de la lumière HEV susceptible de s'accumuler dans l'EPR, l'indénopyrène (IcdP), un hydrocarbure aromatique polycyclique abondant dans la fumée de tabac. Par l'exposition de cellules d'EPR humain à l'IcdP et/ou la lumière HEV, nous avons mis en évidence une synergie toxique émanant de leur interaction. L'IcdP devient au moins 3000 fois plus cytotoxique en présence de doses sous-létales de lumière HEV, causant un stress oxydatif, des altérations structurelles et une mort cellulaire rappelant les événements dégénératifs observés dans la dégénérescence maculaire liée à l'âge (première cause de cécité chez les personnes âgées). L'étude des mécanismes derrière cette synergie révèle que l'interaction IcdP-lumière HEV induit une perte du contrôle synchrone des phases assurant le métabolisme normal du xénobiotique dans l'EPR, ce qui semble précipiter le déclin cellulaire. Nos travaux ouvrent la perspective que la toxicité de la lumière HEV pour l'EPR soit significativement modulée, entre autres, par le style de vie des individus et la pollution environnementale. En évaluant leur toxicité sous des angles nouveaux, cette thèse démontre que le caractère nocif des rayons UVA et de la lumière HEV pour les tissus oculaires est largement sous-estimé. / The eye, a complex organ, faces the ambient electromagnetic spectrum on a daily basis. Its unique sensory functions require the specific delivery of light, a small portion of that spectrum, to the retina, the inside lining of eye fundus. To achieve such specificity, the optical path is made up of different tissues, each showing a remarkable ability to absorb or transmit precise wavelengths. However, high energy wavelengths absorption is associated with a risk of toxicity, which might threaten the integrity of absorbing tissues. This is particularly true for ultraviolet B or UVB (most energetic naturally occurring radiation that reach the ocular surface). UVB deleterious effects have been documented and mainly arise from direct photochemical processes. There is now a growing consensus that UVA and high energy visible blue light (HEV), the wavelengths adjacent to UVB in the spectrum, hold a significant potential for ocular toxicity. However, the basis for such toxicity is poorly understood. UVA rays are absorbed by the cornea and the lens, while HEV light is absorbed by the retina. Both spectral regions are characterized by a strong ability to promote oxidative stress in target tissues through indirect oxygen-dependent processes that rely on the presence of specific photosensitizers in tissues. Several data show that oxidative stress correlates with the toxic effects induced by eye exposure to UVA or HEV light, but the molecular events underlying such correlation remain to be clarified. The overall goal of the work presented in this thesis was therefore to identify key oxidation-related determinants of UVA and HEV light toxicity for ocular tissues. Even if the lens absorbs the majority of UVA rays reaching the ocular surface, the cornea also filters out a significant part of these wavelengths, and there is very little information on the repercussion for the cornea. In the first section of my thesis, we thus sought to determine the early consequences of cornea exposure to UVA. Using UVA-irradiated rabbit eyes as a model, we confirmed the induction of numerous oxidation reactions through corneal entire thickness. We reported oxidatively generated molecular changes occurring in the cornea very shortly after exposure and we described their distribution within the three corneal cellular layers (epithelium, stroma and endothelium). We provide evidence that in corneal native conformation, damage susceptibility and responsiveness to UVA-induced oxidation vary from one layer to another. For example, while corneal epithelial cells are subjected to important modifications in response to UVA exposure, they efficiently limit the early manifestations of UVA-induced toxicity by using compensatory mechanisms. On the other hand, the endothelium, the posterior portion of the cornea, is more susceptible to UVA-induced immediate toxicity. Oxidation resulting from extended exposure of the cornea to UVA is therefore expected to pose a hazard to corneal endothelium integrity. The second section of my thesis aimed to define cellular mechanisms involved in HEV light toxic action. Available data in the literature show that HEV light ocular toxicity primarily affects retinal pigment epithelium (RPE) and relies on the age-related accumulation of endogenous photosensitizers in RPE cells. However, we have identified an exogenous HEV light photosensitizer, indenopyrene (IcdP), an important tobacco smoke derived polycyclic aromatic hydrocarbon, which may accumulate in RPE. Using IcdP and/or HEV light-exposed human RPE cells as a model, we highlighted a toxic synergy between IcdP and HEV light. IcdP is at least 3000 times more toxic for RPE cells when irradiated with sub-lethal amounts of HEV light. It then promotes degenerative changes comparable to those observable in age-related macular degeneration (the leading cause of irreversible vision loss among elderly people). These changes include oxidative stress, structural defects and apoptotic cell death. A study of the molecular processes underlying this synergy reveals that IcdP HEV light interaction results in loss of the tight coupling required between the two metabolic phases ensuring IcdP efficient detoxification in RPE. Such loss seems to precipitate cell deterioration. Our work raises the prospect that HEV light toxicity for RPE is significantly modulated, among other things, by lifestyle and environmental pollution. This thesis, addressing UVA and HEV light ocular toxicity from a new perspective, proves that their harmful nature in ocular tissues is largely underestimated

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le syndrome de Werner (SW) est une maladie génétique de transmission autosomique récessive qui cause le vieillissement prématuré. La maladie est causée par une mutation dans le gène Werner (WRN). Étant donné que le niveau d'espèces réactives d'oxygène (EROs) est élevé chez les personnes atteintes du SW et que c'est probablement un facteur causant une partie du phénotype, nous avons vérifié le phénomène au niveau cellulaire. Pour ce faire, nous avons analysé des fibroblastes de souris embryonnaires (FSEs) de type sauvage (TS) et des FSEs ayant une deletion dans une partie du domaine hélicase de la protéine homologue de WRN (Wrn[delta]hel/[delta]hel). Nous avons mesuré le niveau d'EROs dans ces cellules. Après avoir constaté que le niveau d'EROs est plus élevé dans les FSEs Wrn[delta]hel/[delta]hel que dans les FSEs TS, nous avons mesuré les effets directs et indirects de cette augmentation du niveau d'EROs au plan de la transcription globale dans ces cellules. Finalement, pour mieux comprendre l'impact des EROs dans le phénotype, nous avons étudié l'effet de l'addition d'EROs exogènes sur les cellules en culture. Nous avons donc traité des FSEs TS et Wm mutants avec du peroxyde d'hydrogène. À l'aide de biopuces à ADN, nous avons comparé le profil d'expression génique des FSEs traités au peroxyde d'hydrogène par rapport aux cellules non traitées. Nous avons par la suite validé les résultats des biopuces à ADN par transcriptase inverse suivi d'une réaction de polymerase en chaîne quantitative (TI-RPC) et analysé les données avec le programme PANTHER (Protein ANalysis THrough Evolutionary Relationships). Les EROs exogènes ont peu d'impact sur le profil d'expression des gènes chez les FSEs Wrn mutants en comparaison avec les FSEs TS car ces cellules démontrent déjà un niveau d'EROs plus élevé que la normale. Toutefois, plusieurs sentiers biologiques déjà affectés chez les FSEs Wrn mutants ont été affectés de la même façon dans les FSEs TS traités au peroxyde d'hydrogène. D'ailleurs, plusieurs de ces sentiers biologiques sont étroitement reliés au phénotype observé chez notre modèle de souris Wrn mutantes ainsi que chez les patients atteints du SW.

L'hypertension de grossesse (HG) se retrouve chez 5 à 10% des femmes enceintes. Son étiologie demeure inconnue à ce jour, mais sa physiopathologie impliquerait une perfusion sanguine abaissée de l'unité foeto-maternelle entraînant un stress oxydatif suivi d'une dysfonction de l'endothélium vasculaire maternel. Nos travaux de recherche visent l'identification des facteurs génétiques liés au stress oxydatif et pouvant prédisposer à l'HG chez la femme. Dans ce but, nous avons évalué certains polymorphismes de gènes impliqués dans la biotransformation des dérivés actifs de l'oxygène et des xénobiotiques : glutathion S-transférase pi (GSTP1), mu (GSTM1) et thêta (GSTT1) ; cytochrome p450 (CYP1A1), époxyde hydrolase (EPXH), NO-synthase endothéliale (eNOS), catalase (CAT) et superoxyde dismutase (MnSOD). Notre étude a permis de mettre en évidence quatre polymorphismes associés au risque d'HG et/ou de prééclampsie (PE) : GST[pi] A313 [313 en exposant]G (RC= 0.42 IC 95% [0.22-0.80]) ; GSTM1dél [dél en exposant] (RC= 0.26 [0.07-0.91]) ; eNOS G849 [849 en exposant]T (RC = 3.19 [1.33-7.67]) ainsi que CAT G-844 [-844 en exposant]A (RC= 0.24 [0.07-0.85]). Nos résultats montrent également plusieurs associations d'allèles indépendants combinés deux à deux prédictives d'un risque d'HG. En corollaire, certains marqueurs génétiques d'enzymes impliquées dans la biotransformation pourraient permettre d'identifier précocement les femmes à risque d'HG et pourraient avoir des implications sur le risque de maladies cardiovasculaires à long terme.

La maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) est principalement causée par le tabagisme chronique. Les sujets atteints présentent des altérations pulmonaires et systémiques les rendant intolérants à l'effort et réduisant leurs qualité et espérance de vie. Le poumon des sujets MPOC compte un plus grand nombre de cellules inflammatoires, notamment de macrophages, de neutrophiles et de lymphocytes T CD8+, que les sujets non-MPOC. On note également la présence d'un stress oxydant chronique ainsi qu'une augmentation du niveau d'apoptose alvéolaire. Les raisons pour lesquelles le niveau d'apoptose alvéolaire est augmenté chez ces sujets ne sont pas connues. L'accumulation des lymphocytes T CD8+, ou lymphocytes T cytotoxiques, dans le poumon MPOC pourrait expliquer cette augmentation de l'apoptose alvéolaire. Nous avons démontré que les lymphocytes T CD8+ circulants de sujets MPOC n'étaient pas plus activés que ceux de sujets contrôles, suggérant que l'activation des lymphocytes T CD8+ se ferait davantage au niveau pulmonaire. Le stress oxydant chronique, de pair avec les cellules inflammatoires, pourrait également influencer fortement la survie des cellules épithéliales alvéolaires pulmonaires. En effet, nous avons démontré que le tissu pulmonaire MPOC ainsi que les cellules épithéliales alvéolaires exposées in vitro au peroxyde d'hydrogène (stress oxydant) présentaient des niveaux plus élevés des molécules pro-apoptotiques p53, Bax et récepteurs de TRAIL 1 et 2. De plus, ces derniers étaient davantage sensibles à l'apoptose induite de manière extrinsèque par le ligand TRAIL, un ligand de mort relâché par les Natural killer, les lymphocytes T et les macrophages activés. Les résultats retrouvés dans cette thèse ont permis de souligner l'importance de l'activation locale des lymphocytes T CD8+ ainsi que le rôle du stress oxydant dans la sensibilisation du tissu pulmonaire MPOC à l'apoptose induite par TRAIL. Ensemble, ces données mettent l'emphase sur l'importance des cellules cytotoxiques et du stress oxydant dans l'augmentation de l'apoptose alvéolaire observée dans le poumon MPOC.