NASCIMENTO, Demétrius Fernandes do. Quantificação de fármacos com atividade antimicrobiana em plasma humano por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massa (LC-MS/MS) : aplicação em estudos de farmacocinética comparada. 2011. 213 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2011. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-06-06T16:35:30Z No. of bitstreams: 1 2011_tese_dfnascimento.pdf: 4128278 bytes, checksum: 543f6060440b0214fdcc91a986f0fecd (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-06-11T15:29:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_tese_dfnascimento.pdf: 4128278 bytes, checksum: 543f6060440b0214fdcc91a986f0fecd (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-11T15:29:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_tese_dfnascimento.pdf: 4128278 bytes, checksum: 543f6060440b0214fdcc91a986f0fecd (MD5) Previous issue date: 2011 / Two robust, fast and sensitive methods for quantification of sulfamethoxazole (SMX), trimethoprim (TMP) and sulfadiazine (SDZ) in plasma using high performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS/MS) was developed and validated. The methods involved liquid-liquid extraction with ethyl acetate using metoprolol and sulfamethoxazole as internal standards (PI). The chromatographic separations were performed using Genesis C18 column 100 x 2.1 mm, 4 microns (sulfadiazine) and Genesis C18 150 x 4.6 mm, 4 microns (SMX+TMP), with elution systems consisting of solutions of methanol/water (35/65, v/v) + 0.5% Formic Acid (sulfadiazine) and methanol/water (45/55, v/v) + 0.5% Formic Acid (SMX+TMP). Calibration curves were linear in the range from 0.05 to 25 mg/mL (sulfadiazine); 0.5 to 100 mg/mL (SMX) and 0.02 to 3.5 mg/mL (TMP). The recoveries corresponding to the analysis of quality controls were 66.8, 59 and 63.4% for sulfadiazine; 67.7, 63.3 and 74.4% for SMX; 74.5, 70.5 and 78.1% for TMP. The recovery values relating to internal standards sulfamethoxazole and metoprolol were 66.2% and 76.8% respectively. The validated bioanalytical methods included evaluation of precision and accuracy being the results within the required limits. The methods were successfully applied in studies of comparative bioavailability of formulations containing a combination of sulfamethoxazole-trimethoprim (suspension containing 40mg of SMX and TMP 8mg per milliliter) and formulations containing sulfadiazine (tablets 500 mg) in healthy volunteers of both sexes. / Foram desenvolvidos e validados dois métodos robustos, rápidos e sensíveis para a quantificação de sulfametoxazol (SMX), trimetoprima (TMP) e sulfadazina (SDZ) em plasma, utilizando cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massa (LC-MS/MS). Os métodos envolveram extração líquido-líquido, com acetato de etila utilizando metoprolol e sulfametoxazol como padrões internos (PI). As separações cromatográficas foram realizadas utilizando colunas Genesis C18 100 x 2.1 mm, 4µ (sulfadiazina) e Genesis C18 150 x 4,6mm, 4µ (SMX + TMP), com sistemas de eluição constituídos por soluções de Metanol/Água (35/65, v/v) + 0,5 % Ácido Fórmico (sulfadiazina) e Metanol/água (45/55; v/v) + 0,5% Ácido Fórmico (SMX + TMP). As curvas de calibração foram lineares, nas faixas de 0,05 a 25 µg/mL (sulfadiazina), 0,5 a 100 µg/mL (SMX) e 0,02 a 3,5 µg/mL (TMP). As recuperações correspondentes às análises dos controles de qualidade foram de 66,8, 59 e 63,4 % para sulfadiazina; 67,7, 63,3 e 74,4% para SMX; 74,5, 70,5 e 78,1% para TMP. Os valores da recuperação referentes aos padrões internos sulfametoxazol e metoprolol foram de 66,2% e 76,8% respectivamente. As metodologias bioanalíticas validadas incluíram avaliação de precisão e exatidão intra e interlote, assegurando que estas estavam dentro de limites admissíveis. Os métodos foram aplicados com sucesso em estudos de biodisponibilidade comparativa de formulações contendo a associação de sulfametoxazol + trimetoprima (suspensão contendo 40 mg de SMX e 8 mg de TMP por mililitro) e de formulações contendo sulfadiazina (comprimidos de 500 mg) em voluntários sadios de ambos os sexos.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T07:00:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 294610.pdf: 1292455 bytes, checksum: 80b6d21e26e8373d5fa70c7f4fb56edf (MD5) / Diferenças relacionadas às características fisico-químicas do fármaco, componentes da formulação e processos de fabricação podem gerar problemas na biodisponibilidade de medicamentos. Partindo deste princípio, e da necessidade de realização de testes mais específicos prévios a execução de estudos de biodisponibilidade relativa / bioequivalência farmacêutica em humanos foi desenvolvida uma ferramenta em modelo animal para predizer o comportamento farmacocinético de formulações desenvolvidas previamente a realização dos testes em humanos. Foram avaliados os perfis farmacocinéticos de formulações da associação sulfametoxazol + trimetoprima suspensão e comprimido administrados a ratos Wistar. Os resultados foram comparados com dados previamente obtidos em estudos de biodisponibilidade relativa/bioequivalência com indivíduos sadios. Observou-se que, no caso da suspensão, os resultados se apresentaram mais consistentes e foi possível correlacionar o perfil dos fármacos em ratos e humanos. Nos comprimidos também houve relação entre os valores, entretanto, limitações do modelo animal não permitiram uma relação completa com os resultados encontrados em humanos. Os resultados encontrados no estudo permitem avaliações do comportamento farmacocinético individual de cada formulação testada, contribuindo para que problemas sejam identificados e corrigidos anteriormente à submissão dos medicamentos à testes oficiais de biodisponibilidade relativa / bioequivalência em humanos.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-05-19T04:07:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 333531.pdf: 1500890 bytes, checksum: f705b71d68de1395043e09c4d57aa013 (MD5) Previous issue date: 2014 / Nanopartículas de ferro têm demonstrado bom desempenho como catalisadores e são amplamente utilizadas em diferentes reações químicas, inclusive para degradação de fármacos. É reportado na literatura que oozônio é uma alternativa eficaz para o tratamento de poluentes emergentes, devido ao seu poder oxidante. No entanto, reduzidas taxas de mineralização constituem um verdadeiro empecilho para a popularização deste sistema, sendo a utilização de processos catalíticos capaz de promover um aumento na eficiência do processo de ozonização quanto à remoção de carga orgânica. O objetivo deste trabalho é a síntese, caracterização e aplicação de catalisadores de óxidos de ferro (goetita a-FeOOH e hematita Fe2O3) na ozonização catalítica de sulfametoxazol. Foram preparados catalisadores de óxido de ferro (H300, H400, H600 e H800) que se diferenciam a partir da temperatura aplicada no tratamento térmico da goetita, proveniente da drenagem ácida de mina (DAM) da Carbonífera Criciúma/SC. Testes de atividade catalítica a 25ºC e pH 5.5, mostraram que o catalisador H600 resultou na maior mineralização do sulfametoxazol (71%), seguido do H300 com 55%. O catalisador H600 foi utilizado para avaliação da influência do pH na reação de mineralização do sulfametoxazol. Os resultados obtidos foram superiores para pH 12.0 com 96.7% de remoção de matéria orgânica em 2 horas. Reações de ozonização com pH>12.0 são efetivamente consideradas como processos oxidativos avançados (POAs), já que ocorrem por via indireta, por meio da produção de um forte agente oxidante, o radical HO?. Para pH 5.5 a remoção foi de 70.7% em 2 horas, com a vantagem de não ser necessário ajuste ao meio reacional. Para avaliação da dosagem do catalisador o catalisador H600 foi testado em pH 5.5 e 12.0. Os resultados para ambos os pHs mostram que a mineralização nas concentrações de catalisador de 0.25 e 0.50 g.L-1 são similares. Os catalisadores preparados neste trabalho se mostraram eficientes para a mineralização de sulfametoxazol, e possuem a vantagem de serem produzidos a partir de matéria-prima abundante e de baixo custo.<br> / Abstract : Iron nanoparticles have showngood performance as catalysts and are widely used in chemical reactions, including drugs degradation. It is reported in literature that ozone is an effective alternative for the emerging pollutants treatment. However, reduced mineralization rates constitute a real obstacle to the popularization of this system, and the catalytic processes can promote an increase in the ozonation process as the organic load removal. The subject of this work is the synthesis, characterization and application of catalytic iron oxides (goethite a-FeOOH and hematite Fe2O3) in the sulfamethoxazole (SMX) catalytic ozonation. Iron oxide catalysts were prepared (H300, H400, H600 and H800) that differ from the temperature applied for the thermal treatment of goethite, from the Carbonífera Criciúma´s acid mine drainage (AMD). Catalytic activity at 25ºC and pH 5.5 showed that the H600 catalyst has higher SMX mineralization (71%), followed by H300 with 55%. The H600 catalyst was used to assess the pH influence on the SMX mineralization. The best results were obtained at pH12.0 with 96.7% of organic matter removal in 2 hours. Ozonation reaction sat pH>12.0 are effectively considered as advanced oxidation processes. This occurs from indirect pathway, through the production of a strong oxidizing agent, HO? radical. To pH 5.5 the organic matter removal was equal to 70.7% in 2 hours, with the advantage of not having to adjust to the reaction medium. To evaluate the catalyst dosage, H600 was tested at pH 5.5 and 12.0. The results showed that SMX mineralization are similar to 0.25 and 0.50 g.L-1 catalyst concentration. Toxicity analyses show that after the reaction end products are innocuous. The catalysts synthesized in this work were effective for the SMX mineralization and have the advantage of being produced by abundant and low cost raw materials.

A ocorrência de produtos farmacêuticos e de cuidados pessoais no meio ambiente tem levado a preocupações sobre seu impacto ambiental e à saúde pública. O sulfametoxazol (SMX) é um fármaco que tem sido encontrado amplamente no ambiente. Neste estudo foi verificada a eficácia de vários processos, a saber eletroquímico, eletroquímico foto assistido, fotoquímico, Fenton e foto-Fenton, para a degradação de SMX em solução aquosa. A degradação eletroquímica e eletroquímica foto assistida foram realizadas em uma célula de fluxo do tipo filtro-prensa, usando um ânodo dimensionalmente estável comercial com composição nominal Ti/Ru0,3Ti0,7O2. Durante ambos os processos, efeitos de diferentes parâmetros foram analisados, como a natureza do eletrólito, a concentração de eletrólito suporte (NaCl) e a densidade de corrente aplicada. Os experimentos fotoquímicos, Fenton e foto-Fenton foram realizados em um reator de vidro cilíndrico de compartimento único. O efeito das concentrações inicias de Fe2+ e de H2O2 foram estudados para os processos Fenton e foto-Fenton. Similarmente, o efeito do pH inicial, a concentração inicial do SMX e a temperatura foram investigados para todos os processos. A variação da concentração de SMX foi determinada por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e a quantidade de matéria orgânica foi monitorada por análise de carbono orgânico total (COT). Os resultados obtidos indicaram que o SMX foi completamente degradado, porém, o COT foi apenas parcialmente removido em todos os processos. No período de tempo de ensaio estabelecido o aumento da densidade de corrente e da concentração de NaCl mais eficiente para a degradação e remoção de COT nos processos eletroquímicos. A quantidade de Fe2+ e H2O2 aumenta a eficiência do processo Fenton e foto-Fenton, e meio ácido foi favorável para todos os processos. O consumo de energia elétrica, baseado no parâmetro EEO (energia por ordem) mostrou que os processos eletroquímicos são energeticamente mais eficientes do que os fotoquímicos. As degradações acompanhadas por CLAE acoplado à espectrometria de massas, permitiu que vários intermediários fossem identificados, sendo então proposta uma sequência reacional para a degradação do SMX. O radical hidroxila e o cloro ativo atacam os anéis benzílico e isoxazólico, tendo sido demonstrado que os compostos iniciais formados foram os compostos hidrolisados e clorados. Os íons inorgânicos, tais como: NO3-, NH4+ e SO42-, também foram identificados durante os processos de degradação. / The occurrence of pharmaceuticals and personal care products in the environment has raised concerns about their impact upon environmental and public health. Sulfamethoxazole (SMX) is a pharmaceutical that has been found widely in the environment. This study investigated the effectiveness of various processes such as electrochemical, photo assisted electrochemical, photochemical, Fenton photo-Fenton to SMX degradation in aqueous solution. The electrochemical and photo-assisted electrochemical degradations were performed in a filter press type flow cell using a dimensionally stable anode with nominal composition of Ti/Ru0.3Ti0.7O2. During both these processes the effects of different parameters were analyzed, such as, nature of the electrolyte concentration of the supporting electrolyte (NaCl) and the applied current density. The photochemical, Fenton and photo - Fenton experiments were carried out in a single compartment cylindrical glass reactor. The effects initial iron concentrations and H2O2 were studied for Fenton and photo-Fenton processes. Similarly the effect of initial pH, initial concentration of SMX and temperature were investigated for all processes. The variation of SMX concentration was determined by high performance liquid chromatography (HPLC) and the amount of organic matter was monitored by analysis of total organic carbon (TOC). The results indicated that SMX was completely degraded, but TOC was partially removed in all processes studied, during experimental period the increase of the current density and NaCl concentration enhanced the degradation and TOC removal in the electrochemical processes. The amount of iron and H2O2 increases the efficiency of Fenton and photo-Fenton processes and acidic media was favorable for all processes. The electrical energy consumption parameter based on EEO (energy per order) was also evaluated and it was observed that the electrochemical processes are more energetically efficient than the photochemical. The degradations followed by HPLC coupled with mass spectrometry, in which several intermediates were identified and proposed a reaction sequence for the degradation of SMX. The hydroxyl radical and active chlorine attack benzene and isoxazólico rings, and has been demonstrated that the initial compounds formed were hydrolyzed and chlorinated compounds. Inorganic ions such NO3-, NH4+ and SO42- were also identified during degradation processes.

A ocorrência de produtos farmacêuticos e de cuidados pessoais no meio ambiente tem levado a preocupações sobre seu impacto ambiental e à saúde pública. O sulfametoxazol (SMX) é um fármaco que tem sido encontrado amplamente no ambiente. Neste estudo foi verificada a eficácia de vários processos, a saber eletroquímico, eletroquímico foto assistido, fotoquímico, Fenton e foto-Fenton, para a degradação de SMX em solução aquosa. A degradação eletroquímica e eletroquímica foto assistida foram realizadas em uma célula de fluxo do tipo filtro-prensa, usando um ânodo dimensionalmente estável comercial com composição nominal Ti/Ru0,3Ti0,7O2. Durante ambos os processos, efeitos de diferentes parâmetros foram analisados, como a natureza do eletrólito, a concentração de eletrólito suporte (NaCl) e a densidade de corrente aplicada. Os experimentos fotoquímicos, Fenton e foto-Fenton foram realizados em um reator de vidro cilíndrico de compartimento único. O efeito das concentrações inicias de Fe2+ e de H2O2 foram estudados para os processos Fenton e foto-Fenton. Similarmente, o efeito do pH inicial, a concentração inicial do SMX e a temperatura foram investigados para todos os processos. A variação da concentração de SMX foi determinada por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e a quantidade de matéria orgânica foi monitorada por análise de carbono orgânico total (COT). Os resultados obtidos indicaram que o SMX foi completamente degradado, porém, o COT foi apenas parcialmente removido em todos os processos. No período de tempo de ensaio estabelecido o aumento da densidade de corrente e da concentração de NaCl mais eficiente para a degradação e remoção de COT nos processos eletroquímicos. A quantidade de Fe2+ e H2O2 aumenta a eficiência do processo Fenton e foto-Fenton, e meio ácido foi favorável para todos os processos. O consumo de energia elétrica, baseado no parâmetro EEO (energia por ordem) mostrou que os processos eletroquímicos são energeticamente mais eficientes do que os fotoquímicos. As degradações acompanhadas por CLAE acoplado à espectrometria de massas, permitiu que vários intermediários fossem identificados, sendo então proposta uma sequência reacional para a degradação do SMX. O radical hidroxila e o cloro ativo atacam os anéis benzílico e isoxazólico, tendo sido demonstrado que os compostos iniciais formados foram os compostos hidrolisados e clorados. Os íons inorgânicos, tais como: NO3-, NH4+ e SO42-, também foram identificados durante os processos de degradação. / The occurrence of pharmaceuticals and personal care products in the environment has raised concerns about their impact upon environmental and public health. Sulfamethoxazole (SMX) is a pharmaceutical that has been found widely in the environment. This study investigated the effectiveness of various processes such as electrochemical, photo assisted electrochemical, photochemical, Fenton photo-Fenton to SMX degradation in aqueous solution. The electrochemical and photo-assisted electrochemical degradations were performed in a filter press type flow cell using a dimensionally stable anode with nominal composition of Ti/Ru0.3Ti0.7O2. During both these processes the effects of different parameters were analyzed, such as, nature of the electrolyte concentration of the supporting electrolyte (NaCl) and the applied current density. The photochemical, Fenton and photo - Fenton experiments were carried out in a single compartment cylindrical glass reactor. The effects initial iron concentrations and H2O2 were studied for Fenton and photo-Fenton processes. Similarly the effect of initial pH, initial concentration of SMX and temperature were investigated for all processes. The variation of SMX concentration was determined by high performance liquid chromatography (HPLC) and the amount of organic matter was monitored by analysis of total organic carbon (TOC). The results indicated that SMX was completely degraded, but TOC was partially removed in all processes studied, during experimental period the increase of the current density and NaCl concentration enhanced the degradation and TOC removal in the electrochemical processes. The amount of iron and H2O2 increases the efficiency of Fenton and photo-Fenton processes and acidic media was favorable for all processes. The electrical energy consumption parameter based on EEO (energy per order) was also evaluated and it was observed that the electrochemical processes are more energetically efficient than the photochemical. The degradations followed by HPLC coupled with mass spectrometry, in which several intermediates were identified and proposed a reaction sequence for the degradation of SMX. The hydroxyl radical and active chlorine attack benzene and isoxazólico rings, and has been demonstrated that the initial compounds formed were hydrolyzed and chlorinated compounds. Inorganic ions such NO3-, NH4+ and SO42- were also identified during degradation processes.

Stenotrophomonas maltophilia é um bacilo Gram-negativo, não fermentador, considerado um microorganismo pouco virulento, relacionado principalmente a infecções associadas à assistência a saúde. A S. maltophilia apresenta um padrão de resistência intrínseca à maioria das classes de antibióticos. A droga de escolha para o tratamento das infecções por S. maltophilia é a sulfametoxazol/ trimetoprima (SMX/TMP). Entretanto, estudos atuais relatam o aumento da resistência a esse antibiótico, o que limita assim as opções para terapia efetiva. Outras opções de tratamento são o levofloxacino e a tigeciclina, porém, faltam estudos clínicos e in vitro dessas drogas. A proposta deste estudo foi avaliar os possíveis mecanismos de resistência a SMX/TMP e as quinolonas em isolados clínicos de pacientes internados no Instituto Central do Hospital das Clínicas e do Hospital A.C. Camargo. Foram avaliadas 106 amostras de S. maltophilia isoladas de pacientes adultos com infecção relacionada à assistência a saúde, internados no Instituto Central do Hospital das Clínicas da FMUSP e no Hospital de Câncer A.C Camargo durante o período de dezembro de 2008 a dezembro de 2010. A sensibilidade à SMX/TMP foi de 78,3%, para levofloxacino de 82% e 14,2% para cirpofloxacino, para minociclina de 100% e tigeciclina 91,6%. Foi realizado PCR para detecção dos genes sul1, sul2 e dfrA1 para avaliar a resistência à SMX/TMP, os genes int1 e iscr2 para avaliação da presença de elementos genéticos móveis e os genes gyrA, qnr, smeD, smeT e aac(6)-Ib-cr para avaliação da resistência as quinolonas. Quatorze amostras (13,2%) foram positivas para o gene sul1. Desses isolados, nove amostras apresentavam resistência ao SMX/TMP com CIM50 de 8 g/mL e CIM90 de 128 g/mL. Cinco amostras positivas para o gene sul1 foram sensíveis a SMX/TMP com CIM50 de 1 g/mL e CIM90 de 1 g/mL. A sequencia do integron1 da amostra com CIM >125 g/mL mostrou um tamanho aproximado de 4000 pb contendo os genes cassetes aac4 e aadA1 e a região qac/sul1. Uma amostra resistente a SMX/TMP foi positiva para o gene sul2 localizado na transposase-like ISCR 2. Observamos a presença de quatro novos qnr em cepas de S. maltophilia e a presença da enzima aac(6)-ib-cr em 4 amostras. 100% das cepas foram positivas para o gene do sistema de efluxo smeDEF e 12/38 amostras tiveram o gene smeT do sistema de efluxo smeDEF, ,porém não foi observada mutação nesse gene. Na sequencia de aminoácidos da girase A de 15 amostras resistentes a levofloxacino não observamos mutações relacionadas à resistência a quinolonas. As cepas resistentes a SMX/TMP apresentaram um padrão policlonal. Dezoito amostras resistentes ao levofloxacino apresentaram 14 perfis clonais, distribuídos em 10 clusters. S. maltophilia exibe múltiplos mecanismos de resistência, nesse estudo observamos um grande número de cepas com elementos genéticos móveis carregando o gene sul1 e outros genes de resistência. A S. maltophilia pode ser um importante reservatório de transmissão de genes de resistência / Stenotrophomonas maltophilia is a gram-negative, non-fermenter, considered a low virulent organism, mainly related to healthcare associated infections. S. maltophilia shows a pattern of intrinsic resistance to many classes of antibiotics. The drug of choice for the treatment of infections caused by S. maltophilia is SMX/TMP, however, current studies have reported increased resistance to this antibiotic, thus limiting the options for effective therapy. Among the treatment options appear tigecycline and levofloxacin, but clinical trials and studies in vitro to such drugs are lacking. The purpose of this study was to evaluate the possible mechanisms of resistance to SMX/TMP and quinolones in clinical isolates from patients admitted to the Institute\'s Central Clinical Hospital and the Hospital A.C Camargo. We evaluated 106 strains of S. maltophilia isolated from adult patients with healthcare associated infections, at the Instituto Central do Hospital das Clínicas and the Cancer Hospital AC Camargo in the period of December 2008 to December 2010. The sensitivity to SMX/TMP was 78.3%, 82% for levofloxacin, 14,2% for ciprofloxacin, minocycline 100% and for tigecycline 91.6%. PCR was performed for detection of gene sul1, sul2 and dfrA1 to evaluate the resistance to SMX/TMP, genes iscr2 int1 was performed to evaluate the presence of mobile genetic elements and genes gyrA, qnr, smeD , smeT and aac (6 \')-Ib-cr for evaluation of resistance to quinolones. Fourteen samples (13.2%) were positive for the gene sul1. In these isolates, nine samples showed resistance to SMX/TMP with MIC50 of 8 g/ml and MIC90 of 128 g/mL. Five strains were positive for sul1 gene and were susceptible to SMX/TMP with MIC50 of 1 g/ml and MIC90 of 1 g/mL. The sequence of the integron class 1 strain with an MIC> 125 g/mL showed an approximate size of 4000 bp containing the gene cassettes aadA1, aac4 and qac/sul1. A strain resistant to SMX/TMP was positive for the gene sul2 located on ISCR2 a transposase-like. We observed the presence of four new qnr in strains of S. maltophilia and the presence of the enzyme aac (6 \')-ib-cr in 4 samples. 100% of the strains were positive for the gene of the efflux system smeDEF and 12/38 samples had the gene smeT repressor of smeDEF efflux system, however there was no mutation in this gene. In the amino acid sequence of gyrase A of 15 strains resistant to levofloxacin did not observe mutations related to resistance to quinolones. Strains resistant to SMX/TMP had a polyclonal PFGE pattern. Eighteen strains resistant to levofloxacin showed 14 clonal profiles 14 divided into 10 clusters S. maltophilia displays multiple mechanisms of resistance. In this study, we observed a large number of strains with mobile genetic elements carrying the sul1 gene and other resistance genes. S. maltophilia is may be an important source for transmission of genes of resistance

Stenotrophomonas maltophilia é um bacilo Gram-negativo, não fermentador, considerado um microorganismo pouco virulento, relacionado principalmente a infecções associadas à assistência a saúde. A S. maltophilia apresenta um padrão de resistência intrínseca à maioria das classes de antibióticos. A droga de escolha para o tratamento das infecções por S. maltophilia é a sulfametoxazol/ trimetoprima (SMX/TMP). Entretanto, estudos atuais relatam o aumento da resistência a esse antibiótico, o que limita assim as opções para terapia efetiva. Outras opções de tratamento são o levofloxacino e a tigeciclina, porém, faltam estudos clínicos e in vitro dessas drogas. A proposta deste estudo foi avaliar os possíveis mecanismos de resistência a SMX/TMP e as quinolonas em isolados clínicos de pacientes internados no Instituto Central do Hospital das Clínicas e do Hospital A.C. Camargo. Foram avaliadas 106 amostras de S. maltophilia isoladas de pacientes adultos com infecção relacionada à assistência a saúde, internados no Instituto Central do Hospital das Clínicas da FMUSP e no Hospital de Câncer A.C Camargo durante o período de dezembro de 2008 a dezembro de 2010. A sensibilidade à SMX/TMP foi de 78,3%, para levofloxacino de 82% e 14,2% para cirpofloxacino, para minociclina de 100% e tigeciclina 91,6%. Foi realizado PCR para detecção dos genes sul1, sul2 e dfrA1 para avaliar a resistência à SMX/TMP, os genes int1 e iscr2 para avaliação da presença de elementos genéticos móveis e os genes gyrA, qnr, smeD, smeT e aac(6)-Ib-cr para avaliação da resistência as quinolonas. Quatorze amostras (13,2%) foram positivas para o gene sul1. Desses isolados, nove amostras apresentavam resistência ao SMX/TMP com CIM50 de 8 g/mL e CIM90 de 128 g/mL. Cinco amostras positivas para o gene sul1 foram sensíveis a SMX/TMP com CIM50 de 1 g/mL e CIM90 de 1 g/mL. A sequencia do integron1 da amostra com CIM >125 g/mL mostrou um tamanho aproximado de 4000 pb contendo os genes cassetes aac4 e aadA1 e a região qac/sul1. Uma amostra resistente a SMX/TMP foi positiva para o gene sul2 localizado na transposase-like ISCR 2. Observamos a presença de quatro novos qnr em cepas de S. maltophilia e a presença da enzima aac(6)-ib-cr em 4 amostras. 100% das cepas foram positivas para o gene do sistema de efluxo smeDEF e 12/38 amostras tiveram o gene smeT do sistema de efluxo smeDEF, ,porém não foi observada mutação nesse gene. Na sequencia de aminoácidos da girase A de 15 amostras resistentes a levofloxacino não observamos mutações relacionadas à resistência a quinolonas. As cepas resistentes a SMX/TMP apresentaram um padrão policlonal. Dezoito amostras resistentes ao levofloxacino apresentaram 14 perfis clonais, distribuídos em 10 clusters. S. maltophilia exibe múltiplos mecanismos de resistência, nesse estudo observamos um grande número de cepas com elementos genéticos móveis carregando o gene sul1 e outros genes de resistência. A S. maltophilia pode ser um importante reservatório de transmissão de genes de resistência / Stenotrophomonas maltophilia is a gram-negative, non-fermenter, considered a low virulent organism, mainly related to healthcare associated infections. S. maltophilia shows a pattern of intrinsic resistance to many classes of antibiotics. The drug of choice for the treatment of infections caused by S. maltophilia is SMX/TMP, however, current studies have reported increased resistance to this antibiotic, thus limiting the options for effective therapy. Among the treatment options appear tigecycline and levofloxacin, but clinical trials and studies in vitro to such drugs are lacking. The purpose of this study was to evaluate the possible mechanisms of resistance to SMX/TMP and quinolones in clinical isolates from patients admitted to the Institute\'s Central Clinical Hospital and the Hospital A.C Camargo. We evaluated 106 strains of S. maltophilia isolated from adult patients with healthcare associated infections, at the Instituto Central do Hospital das Clínicas and the Cancer Hospital AC Camargo in the period of December 2008 to December 2010. The sensitivity to SMX/TMP was 78.3%, 82% for levofloxacin, 14,2% for ciprofloxacin, minocycline 100% and for tigecycline 91.6%. PCR was performed for detection of gene sul1, sul2 and dfrA1 to evaluate the resistance to SMX/TMP, genes iscr2 int1 was performed to evaluate the presence of mobile genetic elements and genes gyrA, qnr, smeD , smeT and aac (6 \')-Ib-cr for evaluation of resistance to quinolones. Fourteen samples (13.2%) were positive for the gene sul1. In these isolates, nine samples showed resistance to SMX/TMP with MIC50 of 8 g/ml and MIC90 of 128 g/mL. Five strains were positive for sul1 gene and were susceptible to SMX/TMP with MIC50 of 1 g/ml and MIC90 of 1 g/mL. The sequence of the integron class 1 strain with an MIC> 125 g/mL showed an approximate size of 4000 bp containing the gene cassettes aadA1, aac4 and qac/sul1. A strain resistant to SMX/TMP was positive for the gene sul2 located on ISCR2 a transposase-like. We observed the presence of four new qnr in strains of S. maltophilia and the presence of the enzyme aac (6 \')-ib-cr in 4 samples. 100% of the strains were positive for the gene of the efflux system smeDEF and 12/38 samples had the gene smeT repressor of smeDEF efflux system, however there was no mutation in this gene. In the amino acid sequence of gyrase A of 15 strains resistant to levofloxacin did not observe mutations related to resistance to quinolones. Strains resistant to SMX/TMP had a polyclonal PFGE pattern. Eighteen strains resistant to levofloxacin showed 14 clonal profiles 14 divided into 10 clusters S. maltophilia displays multiple mechanisms of resistance. In this study, we observed a large number of strains with mobile genetic elements carrying the sul1 gene and other resistance genes. S. maltophilia is may be an important source for transmission of genes of resistance

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The bacterial deposition on surface and also the biofilm form occurring widely in the nature as a protection strategy developed for the bacteria against the harmful external factors. Microorganism, when was in biofilm form was able to generate several problems for the public heath justly for showed a higher resistance from the action of antibacterial agents when compared with the planktonic form. Bacteria are the microorganism more involved with the biofilm production in the presence of beneficial environmental conditions. In this way, Escherichia coli were the strain more involved with the process of adhesion in the surfaces. Few studies were developed to found new antimicrobial drugs precisely because the researches presented more interest to improve the known drugs. Thus, the present study was evaluated the antibiofilm capability of sulfamethoxazole (SMTZ) alone and when complexed with metals as mercury, copper, cadmium and silver. The compounds were tested against Escherichia coli (ATCC 25922). For evaluated the inhibition of the biofilm formation we were used microplates of polystyrene to observe the turbidity through the 570 nm in an ELISA plate reader. The results presented that the sulfamethoxazole compounds had an excellent antibiofilm activity and also that the complex SMTZ-Ag showed the best inhibitory activity against E. coli biofilm formation. Therefore, we conclude that these sulfamethoxazole complexed compounds require more researches in order to expand their antimicrobial activity. / A deposição de bactérias em uma superfície e a sucessiva formação de biofilmes são fenômenos que ocorrem naturalmente na natureza, servem como estratégia de proteção frente a fatores agressivos externos. Os micro-organismos, quando em biofilme, geram grande impacto à saúde pública, pois possuem maior resistência à ação de agentes antibacterianos e métodos de desinfecção quando comparados aos micro-organismos na forma planctônica. As bactérias são os agentes microbianos que mais comumente produzem biofilmes em condições favoráveis. Neste contexto, Escherichia coli inclui-se como uma das bactérias com maior participação nos processos de adesão. Pesquisas visando a descoberta de novos antibacterianos são escassas, uma vez que os esforços estão mais direcionados no aprimoramento da das drogas já existentes. Dessa forma, o presente trabalho se propôs avaliar a capacidade antibiofilme do sulfametoxazol complexado com os metais mercúrio, cobre, cádmio e prata. Esses foram testados frente a bactéria Escherichia coli (ATCC 25922). Para avaliar o grau de inibição da formação do biofilme foram utilizadas microplacas de poliestireno e a leitura da turvação bacteriana foi realizada em densidade óptica de 570nm em leitor de ELISA. Os resultados obtidos demonstram que os compostos de sulfametoxazol apresentaram uma excelente atividade antibiofilme, sendo que o complexo SMTZ-Ag foi o que exibiu melhor atividade contra a formação do biofilme de E. coli. Em vista disso torna-se válido investir em pesquisas no sentido de ampliar as atividades desses compostos.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo deste estudo foi caracterizar a identificacao, o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos, a similaridade genetica e os mecanismos de resistencia a trimetoprim/sulfametoxazol (SXT) entre os isolados clinicos do complexo Burkholderia cepacia (CBc). Metodologia: Foram avaliados 82 isolados clinicos do CBc recuperados de pacientes atendidos em dois hospitais universitarios localizados na regiao sudeste do Brasil. A identificacao bacteriana foi realizada pelo sequenciamento do gene recA e pela espectrometria de massas MALDI-TOF MS. O perfil de sensibilidade aos antimicrobianos foi determinado para ceftazidima, cloranfenicol, levofloxacina, meropenem, minociclina, ticarcilina/acido clavulanico e SXT. Os resultados do perfil de sensibilidade tambem foram comparados entre quatro tecnicas distintas, microdiluicao em caldo, diluicao em agar, Etest e disco difusao, sendo a microdiluicao em caldo considerada a tecnica referencia. A concordancia geral e por categoria de sensibilidade, assim como as taxas de erros, foram calculadas de acordo com as recomendacoes do CLSI M23-A3. Os genes que conferem resistencia aos betalactamicos e ao SXT foram pesquisados por meio das tecnicas de PCR e sequenciamento dos respectivos amplicons. A similaridade genetica entre os isolados que carreavam genes de resistencia foi determinada por PFGE. O DNA plasmidial e cromossomal dos isolados foram extraidos utilizando as tecnicas de Kieser e kits comerciais, respectivamente. A localizacao dos genes de resistencia foi determinada por Southern blot e hibridizacao utilizando sondas especificas. O contexto genetico dos genes de resistencia encontrados entre os isolados do CBc foi determinado por PCR e sequenciamento das regioes conservadas 3ÆCS e 5ÆCS do integron de classe 1. A tecnica de conjugacao foi realizada utilizando como amostra receptora E.coli J53. Resultados: Foram identificadas, pelo sequenciamento do gene recA, B. cenocepacia (n=44), B. multivorans (n=12), B. vietnamiensis (n=10), B. contaminans (n=9) e B. cepacia (n=7). Comparando os resultados obtidos pelo recA com aqueles do MALDI-TOF MS, 100% e 75,6% dos isolados foram concordantes na identificacao ao nivel de genero e especie, respectivamente. Boas taxas de sensibilidade foram encontradas para ceftazidima (86,6%), meropenem (87,8%), minociclina (87,8%) e SXT (97,6%). A concordancia geral entre as tecnicas avaliadas foi maior que 93% entre microdiluicao em caldo e diluicao em agar, exceto para cloranfenicol (89%). Entre a tecnica referencia e os resultados obtidos pelo Etest, a concordancia geral foi maior que 92%, exceto para ceftazidima (78%), SXT (80,4%) e cloranfenicol (85,3%). A concordancia por categoria entre microdiluicao em caldo e disco difusao foi maior que 90% para a maioria dos antimicrobianos testados, exceto para cloranfenicol (52,4%), SXT (74,4%) e levofloxacina (83,3%). Dois isolados (B. cenocepacia e B. cepacia) apresentaram resistencia ao SXT e carreavam o gene dhfr22 inserido em um integron que classe 1. Entre os isolados resistentes a ceftazidima (7,3%), em apenas um (B. cenocepacia) foi detectado o gene blaOXA-10-like, tambem inserido em um integron de classe 1 o qual continha um gene cassete que confere resistencia aos aminoglicosideos, aadA1. De acordo com os resultados da hibridizacao, blaOXA-10-like estava inserido em um plasmideo de ~70 Kb. Entretanto, nao conseguimos realizar a transferencia deste plasmideo pela tecnica de conjugacao. Os dois isolados de B. cenocepacia que carreavam genes de resistencia apresentaram perfil clonal semelhante pelo PFGE. Conclusoes: O MALDI-TOF MS demonstrou ser uma excelente tecnica alternativa para a identificacao dos isolados do CBc. Boas taxas de sensibilidade foram observadas para os antimicrobianos usualmente empregados no tratamento das infeccoes causadas por estes micro-organismos. Em geral, foi observada boa concordancia entre as tecnicas de sensibilidade avaliadas neste estudo, exceto para as metodologias Etest e disco difusao na predicao da sensibilidade ao SXT. O gene dhfr22 demonstrou ser o principal mecanismo entre os isolados resistentes ao SXT. De acordo com os nossos conhecimentos, descrevemos, pela primeira vez, a presenca do gene blaOXA-10-like em um isolado clinico do CBc / FAPESP: 2012/04910-9 / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-08T12:28:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 22.pdf: 1754861 bytes, checksum: 1ffad18e038e83070b6bf0ce1cc6f7d7 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde / O Sulfametoxazol (SMX) é um antibiótico de amplo espectro, pertencente à classe das sulfonamidas. Ele inibe competitivamente a enzima bacteriana diidropteroato-sintetase, enquanto a trimetoprima (TMP) é uma inibidora da diidrofolato-redutase. Ambas as drogas bloqueiam o metabolismo do ácido fólico produzindo uma atividade sinérgica antibacteriana. A associação é utilizada no tratamento de infecções bacterianas urinárias, das vias aéreas e de infecções oportunistas em portadores do vírus da imunodeficiência humana causadas por Pneumocystis jiroveci. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e validar uma metodologia analítica para a avaliação da associação de SMX e TMP em comprimidos por eletroforese capilar de zona (CZE). Desenvolveu-se e validou-se o método utilizando capilar de sílica de 56 cm de comprimento efetivo e diâmetro de 75 µm, mantido à temperatura de 25 ºC com detecção por arranjo de diodos no comprimento de onda de 221 nm. Utilizou-se como eletrólito de corrida uma solução contendo tampão fosfato 15 mM, pH 6,2 e a diferença de potencial aplicada foi de 25 kV. O tempo de introdução da amostra foi de 15 segundos utilizando-se pressão de 45 mbar. O tempo de corrida foi de 10 minutos, com tempo de migração de aproximadamente 4 minutos para a TMP e 8 minutos para o SMX. A metodologia foi validada avaliando-se os parâmetros de linearidade, seletividade (efeito matriz e degradação acelerada), precisão, exatidão (procedimento de recuperação) e robustez. A faixa linear estabelecida na alíquota de análise para a TMP foi de 17 47 µg/mL e para o SMX foi de 100 220 µg/mL. O estudo do efeito matriz demonstrou que, para comprimidos de SMX e TMP, o método não apresenta efeito matriz. A precisão foi estudada pela repetitividade, precisão intermediária e reprodutibilidade. Os resultados da repetitividade apresentaram um valor HorRat de 0,510 para o SMX e 0,572 para a TMP, sendo o critério de aceitabilidade ≤ 2,0. / Sulfamethoxazole (SMX) is a broad-spectrum antimicrobial that belongs to a class of sulfonamide. It inhibits the bacterial enzyme dihydropteroate synthetase while trimethoprim (TMP) blocks the dihydrofolate reductase. Both drugs act synergistically and have a pronounced antibacterial activity, as they sequentially block two chemical reactions essential to bacterial survival. Clinically, the associated drugs are used to treat many kinds of infection caused by bacteria such as urinary infection, respiratory system infection and opportunistic infections in human immunodeficiency virus patients caused by Pneumocystis jiroveci. The aim of the present work was to develop and validate a capillary zone electrophoresis (CZE) method for the analysis of SMX and TMP in tablets. The CZE method was carried out on a silica capillary (56 cm effective length; 75µm internal diameter), maintained at 25ºC using photodiode array (PDA) detection at 221 nm. The running buffer consisted of 15 mM of phosphate buffer adjusted to pH 6.2 and the applied voltage was 25 kV. The time of sample introduction was 15 seconds using a pressure of 45 mbar. Under these conditions, the running time was 10 min with a migration time of 4 minutes for the TMP and 8 minutes for the SMX. The method was validated by evaluating the following parameters: linearity, selectivity (matrix effect and accelerated degradation), precision, recovery and robustness. The method was linear in the range of 100 - 220 µg/mL for SMX and 17 – 47 µg/mL for TMP, not presenting matrix effect. Precision was studied by repeatability, intermediate precision and reproducibility. Repeatability showed HorRat values of 0.510 for SMX and 0.572 for TMP, considering the acceptability criteria ≤ 2.0. The intermediate precision was evaluated on the basis of CV %, presenting 4,95 % and 5.03% for SMX and TMP, respectively. These values were considered satisfactory based on the acceptance criteria (less than 8%). The reproducibility showed a HorRat value of 1.25 for TMP, which is a value considered suitable based on the acceptance criteria (below 2.0). For SMX, the reproducibility HorRat value was 0.52 and the limit of acceptance was 2.0. Recovery range was 96.7 % to 97.6 % for SMX and 96.5 % to 102.4 % for TMP. The robustness was assessed by small and deliberate changes in the method parameters, observing slight variations in migration times. The proposed method can be applied to the quantitative analysis of SMX and TMP in tablets and can contribute for the improvement of the quality control of pharmaceutical products, reducing the use of organic solvents and waste generation, ensuring the safety and therapeutic efficacy of the formulations.