Citrus aurantium L. var. amara. (CA) é uma árvore pertencente à família Rutaceae que apresenta a amina adrenérgica p-sinefrina como principal constituinte de seus frutos. A p-sinefrina constitui-se uma feniletilamina similar em termos estruturais com a efedrina, principal alcalóide do gênero Ephedra (Ephedraceae). Em abril de 2004, após a proibição da utilização de suplementos alimentares contendo Ephedra e/ou efedrina pela agência americana FDA (Food and Drug Administration), suplementos conhecidos como "Ephedra-free", geralmente contendo CA associado com extratos de outras plantas, proteínas e aminoácidos, foram lançados no mercado internacional. A quantificação de p-sinefrina em produtos derivados de CA geralmente é realizada por cromatografia a líquido acoplada a detector de ultravioleta (CLAE/UV ou CLAE/DAD). A principal limitação desta metodologia devese a falta de especificidade. Um método apropriado para quantificação desta amina por extração em fase sólida (SPE) e cromatografia a gás acoplada com detector de ionização de chama (CG/DIC) e detector de massas (CG/EM) em produtos de origem vegetal ainda não se encontra disponível. Assim, o objetivo deste trabalho foi desenvolver e validar um novo procedimento mais seletivo para a quantificação e identificação de p-sinefrina em produtos derivados de CA por CG/DIC, seguido pela confirmação por CG/EM, após clean-up por SPE e derivação. Derivados trifluoroacetilados e oxazolidinas foram preparados, após reação com anidrido trifluoroacético e cicloexanona, e analisados por ressonância magnética nuclear (RMN 1H e 13C), CG/DIC e GC/EM. Cartuchos de troca iônica (SCX) e a cicloexanona apresentaram melhor desempenho como fase estacionária e reagente de derivação, respectivamente. O método de CG/DIC apresentou-se linear na faixa de concentração de 125-500 mg% (r=0,9997; R2= 0,9993; y = 535,11x-30063). A precisão intra-dia (expressa como DPR%) foi de 3,60% e a precisão inter-dias foi de 3,59%. A recuperação média estabelecida a partir do extrato de CA foi de 78,1 ± 3,64%. Melhor seletividade foi alcançada por confirmação do derivado oxazolidina de p-sinefrina por CG/EM. O método validado foi aplicado para a análise de psinefrina em derivados de CA como frutos, extrato e composto emagrecedor com resultados satisfatórios. / Citrus aurantium var. amara (CA) is a plant belonging to the Rutaceae family, characterized by the presence of adrenergic amine p-synephrine in its fruits. p- Synephrine is a phenyletilamine structurally similar to ephedrine, the main active component of plants of the genus Ephedra (Ephedraceae). After the ban of Ephedra and/or ephedrine in dietary supplements in April 2004 by FDA (Food and Drug Administration), "Ephedra-free" products generally containing CA associated with other herbs extracts, proteins, and aminoacids, gain the international market. The quantification of p-synephrine in products containing CA is currently out by HPLC/UV or HPLC/DAD analysis. The limit of this approach is that of lack in the specificity. An appropriated method to the quantification of this amine by solid phase extraction (SPE), gas chromatography method with flame ionization detection (GC/FID) and mass spectrometry detector (GC/MS) in herbal products, need to be developed. In this way, the aim of this study was to develop and validate a new procedure for quantification and identification of p-synephrine in CA products based on GC/FID followed by GC/MS confirmation analysis, after clean-up by solid phase extraction and derivatization. Trifluoroacetylated derivatives and oxazolidines were prepared after reaction with trifluoroacetic anhydride and cyclohexanone (CH), respectively, and were subjected to analysis by nuclear magnetic ressonance (NMR 1H and 13C), GC/FID and GC/MS. The results indicate that SCX stationary phase for SPE and CH agent afforded the best performance. The GC/FID method developed was validated and was found to be linear in the range of 125-500 mg% (r=0.9997; R2= 0.9993; y = 535,11x-30063). Intra-day precision (calculated as %R.S.D) was 3.60% and interday precision was 3.59%. Mean recovery from extract of CA was 78.1 ± 3.64%. The method selectivity was further improved by confirmation of oxazolidine derivative of p-synephrine by CG/MS. The validated method was applied to analysis in products containing CA like extract, fruits and weight loss preparation with satisfactory results.

Citrus aurantium L. var. amara. (CA) é uma árvore pertencente à família Rutaceae que apresenta a amina adrenérgica p-sinefrina como principal constituinte de seus frutos. A p-sinefrina constitui-se uma feniletilamina similar em termos estruturais com a efedrina, principal alcalóide do gênero Ephedra (Ephedraceae). Em abril de 2004, após a proibição da utilização de suplementos alimentares contendo Ephedra e/ou efedrina pela agência americana FDA (Food and Drug Administration), suplementos conhecidos como "Ephedra-free", geralmente contendo CA associado com extratos de outras plantas, proteínas e aminoácidos, foram lançados no mercado internacional. A quantificação de p-sinefrina em produtos derivados de CA geralmente é realizada por cromatografia a líquido acoplada a detector de ultravioleta (CLAE/UV ou CLAE/DAD). A principal limitação desta metodologia devese a falta de especificidade. Um método apropriado para quantificação desta amina por extração em fase sólida (SPE) e cromatografia a gás acoplada com detector de ionização de chama (CG/DIC) e detector de massas (CG/EM) em produtos de origem vegetal ainda não se encontra disponível. Assim, o objetivo deste trabalho foi desenvolver e validar um novo procedimento mais seletivo para a quantificação e identificação de p-sinefrina em produtos derivados de CA por CG/DIC, seguido pela confirmação por CG/EM, após clean-up por SPE e derivação. Derivados trifluoroacetilados e oxazolidinas foram preparados, após reação com anidrido trifluoroacético e cicloexanona, e analisados por ressonância magnética nuclear (RMN 1H e 13C), CG/DIC e GC/EM. Cartuchos de troca iônica (SCX) e a cicloexanona apresentaram melhor desempenho como fase estacionária e reagente de derivação, respectivamente. O método de CG/DIC apresentou-se linear na faixa de concentração de 125-500 mg% (r=0,9997; R2= 0,9993; y = 535,11x-30063). A precisão intra-dia (expressa como DPR%) foi de 3,60% e a precisão inter-dias foi de 3,59%. A recuperação média estabelecida a partir do extrato de CA foi de 78,1 ± 3,64%. Melhor seletividade foi alcançada por confirmação do derivado oxazolidina de p-sinefrina por CG/EM. O método validado foi aplicado para a análise de psinefrina em derivados de CA como frutos, extrato e composto emagrecedor com resultados satisfatórios. / Citrus aurantium var. amara (CA) is a plant belonging to the Rutaceae family, characterized by the presence of adrenergic amine p-synephrine in its fruits. p- Synephrine is a phenyletilamine structurally similar to ephedrine, the main active component of plants of the genus Ephedra (Ephedraceae). After the ban of Ephedra and/or ephedrine in dietary supplements in April 2004 by FDA (Food and Drug Administration), "Ephedra-free" products generally containing CA associated with other herbs extracts, proteins, and aminoacids, gain the international market. The quantification of p-synephrine in products containing CA is currently out by HPLC/UV or HPLC/DAD analysis. The limit of this approach is that of lack in the specificity. An appropriated method to the quantification of this amine by solid phase extraction (SPE), gas chromatography method with flame ionization detection (GC/FID) and mass spectrometry detector (GC/MS) in herbal products, need to be developed. In this way, the aim of this study was to develop and validate a new procedure for quantification and identification of p-synephrine in CA products based on GC/FID followed by GC/MS confirmation analysis, after clean-up by solid phase extraction and derivatization. Trifluoroacetylated derivatives and oxazolidines were prepared after reaction with trifluoroacetic anhydride and cyclohexanone (CH), respectively, and were subjected to analysis by nuclear magnetic ressonance (NMR 1H and 13C), GC/FID and GC/MS. The results indicate that SCX stationary phase for SPE and CH agent afforded the best performance. The GC/FID method developed was validated and was found to be linear in the range of 125-500 mg% (r=0.9997; R2= 0.9993; y = 535,11x-30063). Intra-day precision (calculated as %R.S.D) was 3.60% and interday precision was 3.59%. Mean recovery from extract of CA was 78.1 ± 3.64%. The method selectivity was further improved by confirmation of oxazolidine derivative of p-synephrine by CG/MS. The validated method was applied to analysis in products containing CA like extract, fruits and weight loss preparation with satisfactory results.

Citrus aurantium L. var. amara. (CA) é uma árvore pertencente à família Rutaceae que apresenta a amina adrenérgica p-sinefrina como principal constituinte de seus frutos. A p-sinefrina constitui-se uma feniletilamina similar em termos estruturais com a efedrina, principal alcalóide do gênero Ephedra (Ephedraceae). Em abril de 2004, após a proibição da utilização de suplementos alimentares contendo Ephedra e/ou efedrina pela agência americana FDA (Food and Drug Administration), suplementos conhecidos como "Ephedra-free", geralmente contendo CA associado com extratos de outras plantas, proteínas e aminoácidos, foram lançados no mercado internacional. A quantificação de p-sinefrina em produtos derivados de CA geralmente é realizada por cromatografia a líquido acoplada a detector de ultravioleta (CLAE/UV ou CLAE/DAD). A principal limitação desta metodologia devese a falta de especificidade. Um método apropriado para quantificação desta amina por extração em fase sólida (SPE) e cromatografia a gás acoplada com detector de ionização de chama (CG/DIC) e detector de massas (CG/EM) em produtos de origem vegetal ainda não se encontra disponível. Assim, o objetivo deste trabalho foi desenvolver e validar um novo procedimento mais seletivo para a quantificação e identificação de p-sinefrina em produtos derivados de CA por CG/DIC, seguido pela confirmação por CG/EM, após clean-up por SPE e derivação. Derivados trifluoroacetilados e oxazolidinas foram preparados, após reação com anidrido trifluoroacético e cicloexanona, e analisados por ressonância magnética nuclear (RMN 1H e 13C), CG/DIC e GC/EM. Cartuchos de troca iônica (SCX) e a cicloexanona apresentaram melhor desempenho como fase estacionária e reagente de derivação, respectivamente. O método de CG/DIC apresentou-se linear na faixa de concentração de 125-500 mg% (r=0,9997; R2= 0,9993; y = 535,11x-30063). A precisão intra-dia (expressa como DPR%) foi de 3,60% e a precisão inter-dias foi de 3,59%. A recuperação média estabelecida a partir do extrato de CA foi de 78,1 ± 3,64%. Melhor seletividade foi alcançada por confirmação do derivado oxazolidina de p-sinefrina por CG/EM. O método validado foi aplicado para a análise de psinefrina em derivados de CA como frutos, extrato e composto emagrecedor com resultados satisfatórios. / Citrus aurantium var. amara (CA) is a plant belonging to the Rutaceae family, characterized by the presence of adrenergic amine p-synephrine in its fruits. p- Synephrine is a phenyletilamine structurally similar to ephedrine, the main active component of plants of the genus Ephedra (Ephedraceae). After the ban of Ephedra and/or ephedrine in dietary supplements in April 2004 by FDA (Food and Drug Administration), "Ephedra-free" products generally containing CA associated with other herbs extracts, proteins, and aminoacids, gain the international market. The quantification of p-synephrine in products containing CA is currently out by HPLC/UV or HPLC/DAD analysis. The limit of this approach is that of lack in the specificity. An appropriated method to the quantification of this amine by solid phase extraction (SPE), gas chromatography method with flame ionization detection (GC/FID) and mass spectrometry detector (GC/MS) in herbal products, need to be developed. In this way, the aim of this study was to develop and validate a new procedure for quantification and identification of p-synephrine in CA products based on GC/FID followed by GC/MS confirmation analysis, after clean-up by solid phase extraction and derivatization. Trifluoroacetylated derivatives and oxazolidines were prepared after reaction with trifluoroacetic anhydride and cyclohexanone (CH), respectively, and were subjected to analysis by nuclear magnetic ressonance (NMR 1H and 13C), GC/FID and GC/MS. The results indicate that SCX stationary phase for SPE and CH agent afforded the best performance. The GC/FID method developed was validated and was found to be linear in the range of 125-500 mg% (r=0.9997; R2= 0.9993; y = 535,11x-30063). Intra-day precision (calculated as %R.S.D) was 3.60% and interday precision was 3.59%. Mean recovery from extract of CA was 78.1 ± 3.64%. The method selectivity was further improved by confirmation of oxazolidine derivative of p-synephrine by CG/MS. The validated method was applied to analysis in products containing CA like extract, fruits and weight loss preparation with satisfactory results.

O uso descontrolado de suplementos alimentares indicados para emagrecer e alcançar maior definição muscular desencadeou uma grande preocupação. Dentre estes produtos, destacam-se aqueles contendo efedrina (de Ephedra sinica). Devido à associação com problemas cardíacos, isquemias e hipertensão, alguns países proibiram a venda de suplementos contendo este alcalóide, o qual tem sido substituído por p-sinefrina (de Citrus aurantium). Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar o perfil toxicológico de extratos de C. aurantium e do padrão racêmico de psinefrina. Foi validada uma metodologia analítica por CLAE/UV para a quantificação de p-sinefrina nos extratos. Para a avaliação do perfil toxicológico os extratos (300, 500, 1000, 2500, 3500 e 5000 mg/kg) e a p-sinefrina (150, 300, 450, 600, 800, 1000 e 2000 mg/kg) foram submetidos ao teste de toxicidade aguda em camundongos, onde foram observados sinais como piloereção, ofego, sialorréia, exoftalmia e diminuição da atividade locomotora em todos os tratamentos, porém, não foram observadas mortes. A diminuição da locomoção foi confirmada através da avaliação em caixas de atividade locomotora. No teste de toxicidade subcrônica, camundongos foram tratados por 28 dias com C. aurantium 400, 2000 e 4000 mg/kg e p-sinefrina 30 e 300 mg/kg, foram realizadas análises hematológicas, bioquímicas e de marcadores do estresse oxidativo. Pode-se observar aumento dos níveis de GSH nas doses de C. aurantium 4000 mg/kg e p-sinefrina 30 e 300 mg/kg, e inibição da enzima GPx nos animais tratados com C. aurantium 400 e 2000 mg/kg e psinefrina 30 e 300 mg/kg. Devido ao alto consumo destes produtos por mulheres em idade reprodutiva, os efeitos de C. aurantium e p-sinefrina foram avaliados, juntamente com E. sinica e efedrina, no sistema reprodutor feminino através do ensaio uterotrófico em ratas imaturas. Foi detectada uma ação antiestrogênica para a efedrina na dose de 5 mg/kg, e houve diminuição do peso relativo das adrenais em todos os tratamentos. Assim, apesar da baixa toxicidade apresentada, suplementos contendo C. aurantium/p-sinefrina devem ser usados com cautela, pois estão geralmente associados a estimulantes, que podem potencializar seus efeitos. / The uncontrolled use of dietary supplements to lose weight and reach a higher muscular definition is concerning. Among these products, are the ones containing ephedrine (from Ephedra sinica). Due to the association with cardiac problems, ischemia and hypertension, some countries banned the commercialization of supplements containing this alkaloid, which has been substituted by p-synephrine (from Citrus aurantium). The aim of this study was to investigate the toxicological profile of C. aurantium extracts and the racemic standard of p-synephrine. An analytical method using HPLC/UV was validated and optimized for quantification of p-synephrine in the extracts. To toxicological profile evaluation extracts (300, 500, 1000, 2500, 3500 or 5000 mg/kg) and p-synephrine (150, 300, 450, 600, 800, 1000 or 2000 mg/kg) where submitted to acute toxicology test in mice, being observed signs such as: piloerection, gasping, salivation, exophtalmy and decrease in locomotor activity in all treatments, however deaths not occurred. Decrease in locomotion was confirmed in spontaneous locomotor activity test. In subchronic toxicity, mice were treated for 28 days with C. aurantium 400, 2000 or 4000 mg/kg and p-synephrine 30 or 300 mg/kg, it were analyzed hematological and biochemical parameters, and oxidative stress biomarkers. It was noted an increase in GSH levels in C. aurantium 4000 mg/kg and p-sinefrina 30 and 300 mg/kg and inhibition of the GPx activity in animals treated with C. aurantium 400 and 2000 mg/kg and psinefrina 30 and 300 mg/kg. Due to the high consume of these products by young women, the effects of C. aurantium and p-synephrine, so as E. sinica and ephedrine, were evaluated in female reproductive system by means of uterotrophic assay in immature female rats. An antiestrogenic activity was detected in ephedrine 5 mg/kg treated-rats, and there were a decrease in adrenals relative weight in all treated groups. In spite of low toxicity presented, dietary supplements containing C. aurantium/p-synephrine should be used with concern, since they are frequently associated to stimulants, which can potentializes his action.

O uso descontrolado de suplementos alimentares indicados para emagrecer e alcançar maior definição muscular desencadeou uma grande preocupação. Dentre estes produtos, destacam-se aqueles contendo efedrina (de Ephedra sinica). Devido à associação com problemas cardíacos, isquemias e hipertensão, alguns países proibiram a venda de suplementos contendo este alcalóide, o qual tem sido substituído por p-sinefrina (de Citrus aurantium). Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar o perfil toxicológico de extratos de C. aurantium e do padrão racêmico de psinefrina. Foi validada uma metodologia analítica por CLAE/UV para a quantificação de p-sinefrina nos extratos. Para a avaliação do perfil toxicológico os extratos (300, 500, 1000, 2500, 3500 e 5000 mg/kg) e a p-sinefrina (150, 300, 450, 600, 800, 1000 e 2000 mg/kg) foram submetidos ao teste de toxicidade aguda em camundongos, onde foram observados sinais como piloereção, ofego, sialorréia, exoftalmia e diminuição da atividade locomotora em todos os tratamentos, porém, não foram observadas mortes. A diminuição da locomoção foi confirmada através da avaliação em caixas de atividade locomotora. No teste de toxicidade subcrônica, camundongos foram tratados por 28 dias com C. aurantium 400, 2000 e 4000 mg/kg e p-sinefrina 30 e 300 mg/kg, foram realizadas análises hematológicas, bioquímicas e de marcadores do estresse oxidativo. Pode-se observar aumento dos níveis de GSH nas doses de C. aurantium 4000 mg/kg e p-sinefrina 30 e 300 mg/kg, e inibição da enzima GPx nos animais tratados com C. aurantium 400 e 2000 mg/kg e psinefrina 30 e 300 mg/kg. Devido ao alto consumo destes produtos por mulheres em idade reprodutiva, os efeitos de C. aurantium e p-sinefrina foram avaliados, juntamente com E. sinica e efedrina, no sistema reprodutor feminino através do ensaio uterotrófico em ratas imaturas. Foi detectada uma ação antiestrogênica para a efedrina na dose de 5 mg/kg, e houve diminuição do peso relativo das adrenais em todos os tratamentos. Assim, apesar da baixa toxicidade apresentada, suplementos contendo C. aurantium/p-sinefrina devem ser usados com cautela, pois estão geralmente associados a estimulantes, que podem potencializar seus efeitos. / The uncontrolled use of dietary supplements to lose weight and reach a higher muscular definition is concerning. Among these products, are the ones containing ephedrine (from Ephedra sinica). Due to the association with cardiac problems, ischemia and hypertension, some countries banned the commercialization of supplements containing this alkaloid, which has been substituted by p-synephrine (from Citrus aurantium). The aim of this study was to investigate the toxicological profile of C. aurantium extracts and the racemic standard of p-synephrine. An analytical method using HPLC/UV was validated and optimized for quantification of p-synephrine in the extracts. To toxicological profile evaluation extracts (300, 500, 1000, 2500, 3500 or 5000 mg/kg) and p-synephrine (150, 300, 450, 600, 800, 1000 or 2000 mg/kg) where submitted to acute toxicology test in mice, being observed signs such as: piloerection, gasping, salivation, exophtalmy and decrease in locomotor activity in all treatments, however deaths not occurred. Decrease in locomotion was confirmed in spontaneous locomotor activity test. In subchronic toxicity, mice were treated for 28 days with C. aurantium 400, 2000 or 4000 mg/kg and p-synephrine 30 or 300 mg/kg, it were analyzed hematological and biochemical parameters, and oxidative stress biomarkers. It was noted an increase in GSH levels in C. aurantium 4000 mg/kg and p-sinefrina 30 and 300 mg/kg and inhibition of the GPx activity in animals treated with C. aurantium 400 and 2000 mg/kg and psinefrina 30 and 300 mg/kg. Due to the high consume of these products by young women, the effects of C. aurantium and p-synephrine, so as E. sinica and ephedrine, were evaluated in female reproductive system by means of uterotrophic assay in immature female rats. An antiestrogenic activity was detected in ephedrine 5 mg/kg treated-rats, and there were a decrease in adrenals relative weight in all treated groups. In spite of low toxicity presented, dietary supplements containing C. aurantium/p-synephrine should be used with concern, since they are frequently associated to stimulants, which can potentializes his action.

O uso descontrolado de suplementos alimentares indicados para emagrecer e alcançar maior definição muscular desencadeou uma grande preocupação. Dentre estes produtos, destacam-se aqueles contendo efedrina (de Ephedra sinica). Devido à associação com problemas cardíacos, isquemias e hipertensão, alguns países proibiram a venda de suplementos contendo este alcalóide, o qual tem sido substituído por p-sinefrina (de Citrus aurantium). Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar o perfil toxicológico de extratos de C. aurantium e do padrão racêmico de psinefrina. Foi validada uma metodologia analítica por CLAE/UV para a quantificação de p-sinefrina nos extratos. Para a avaliação do perfil toxicológico os extratos (300, 500, 1000, 2500, 3500 e 5000 mg/kg) e a p-sinefrina (150, 300, 450, 600, 800, 1000 e 2000 mg/kg) foram submetidos ao teste de toxicidade aguda em camundongos, onde foram observados sinais como piloereção, ofego, sialorréia, exoftalmia e diminuição da atividade locomotora em todos os tratamentos, porém, não foram observadas mortes. A diminuição da locomoção foi confirmada através da avaliação em caixas de atividade locomotora. No teste de toxicidade subcrônica, camundongos foram tratados por 28 dias com C. aurantium 400, 2000 e 4000 mg/kg e p-sinefrina 30 e 300 mg/kg, foram realizadas análises hematológicas, bioquímicas e de marcadores do estresse oxidativo. Pode-se observar aumento dos níveis de GSH nas doses de C. aurantium 4000 mg/kg e p-sinefrina 30 e 300 mg/kg, e inibição da enzima GPx nos animais tratados com C. aurantium 400 e 2000 mg/kg e psinefrina 30 e 300 mg/kg. Devido ao alto consumo destes produtos por mulheres em idade reprodutiva, os efeitos de C. aurantium e p-sinefrina foram avaliados, juntamente com E. sinica e efedrina, no sistema reprodutor feminino através do ensaio uterotrófico em ratas imaturas. Foi detectada uma ação antiestrogênica para a efedrina na dose de 5 mg/kg, e houve diminuição do peso relativo das adrenais em todos os tratamentos. Assim, apesar da baixa toxicidade apresentada, suplementos contendo C. aurantium/p-sinefrina devem ser usados com cautela, pois estão geralmente associados a estimulantes, que podem potencializar seus efeitos. / The uncontrolled use of dietary supplements to lose weight and reach a higher muscular definition is concerning. Among these products, are the ones containing ephedrine (from Ephedra sinica). Due to the association with cardiac problems, ischemia and hypertension, some countries banned the commercialization of supplements containing this alkaloid, which has been substituted by p-synephrine (from Citrus aurantium). The aim of this study was to investigate the toxicological profile of C. aurantium extracts and the racemic standard of p-synephrine. An analytical method using HPLC/UV was validated and optimized for quantification of p-synephrine in the extracts. To toxicological profile evaluation extracts (300, 500, 1000, 2500, 3500 or 5000 mg/kg) and p-synephrine (150, 300, 450, 600, 800, 1000 or 2000 mg/kg) where submitted to acute toxicology test in mice, being observed signs such as: piloerection, gasping, salivation, exophtalmy and decrease in locomotor activity in all treatments, however deaths not occurred. Decrease in locomotion was confirmed in spontaneous locomotor activity test. In subchronic toxicity, mice were treated for 28 days with C. aurantium 400, 2000 or 4000 mg/kg and p-synephrine 30 or 300 mg/kg, it were analyzed hematological and biochemical parameters, and oxidative stress biomarkers. It was noted an increase in GSH levels in C. aurantium 4000 mg/kg and p-sinefrina 30 and 300 mg/kg and inhibition of the GPx activity in animals treated with C. aurantium 400 and 2000 mg/kg and psinefrina 30 and 300 mg/kg. Due to the high consume of these products by young women, the effects of C. aurantium and p-synephrine, so as E. sinica and ephedrine, were evaluated in female reproductive system by means of uterotrophic assay in immature female rats. An antiestrogenic activity was detected in ephedrine 5 mg/kg treated-rats, and there were a decrease in adrenals relative weight in all treated groups. In spite of low toxicity presented, dietary supplements containing C. aurantium/p-synephrine should be used with concern, since they are frequently associated to stimulants, which can potentializes his action.

Submitted by Sandro Camargo (sandro.camargo@unipampa.edu.br) on 2015-05-08T02:31:25Z No. of bitstreams: 1 127110043.pdf: 1117718 bytes, checksum: d6d7a14f6753e1dcd024e07172767a54 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-08T02:31:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 127110043.pdf: 1117718 bytes, checksum: d6d7a14f6753e1dcd024e07172767a54 (MD5) Previous issue date: 2014-07-21 / A incidência de sobrepeso e obesidade na população em geral vem revelando-se um grave problema de saúde pública. Este fato, aliado aos parâmetros atuais de beleza, que prezam pela magreza, geram uma busca desenfreada por formulações “naturais” que contenham substâncias ditas emagrecedoras. Nesse sentido, o Citrus aurantium, conhecido popularmente como laranja amarga, está sendo amplamente utilizado. No entanto, até o momento não existem métodos indicativos da estabilidade para o controle de qualidade desses produtos e estudos da estabilidade do seu marcador, a sinefrina. Portanto, o presente trabalho tem como objetivo desenvolver e validar método indicativo da estabilidade, realizar estudo preliminar da estabilidade e verificar a toxicidade da sinefrina na presença dos produtos de degradação formados em condições fotolíticas. O método indicativo de estabilidade foi desenvolvido por CLAE-DAD para determinação de sinefrina em extrato seco de Citrus aurantium. A separação cromatográfica utilizou coluna C18 (250 x 4,6 mm, 5μm), fase móvel composta por acetonitrila : ácido ortofosfórico 0,01% (pH 3,0) na proporção 15:85, vazão de 1 mL min -1 e detecção em 220 nm. A resposta do detector foi linear, na faixa de 7,5 a 45 μg mL -1 . A especificidade do método e a capacidade indicativa de estabilidade foram confirmadas utilizando degradação forçada, em condições ácidas, básicas, oxidativas e fotolíticas. Tanto a sinefrina como o extrato demonstraram ser susceptível a degradação em todas as condições testadas. A precisão intradia demonstrou valores de DPR menores que 1,77% e a precisão interdia DPR de 2,48%. A recuperação média, no teste de exatidão, foi de 102,03%. A cinética de fotodegradação foi calculada, para ambas as amostras, sinefrina e extrato, através da concentração do fármaco em função do tempo. A degradação da sinefrina SQR dissolvida em acetonitrila seguiu cinética de segunda ordem, enquanto que o extrato de Citrus aurantium demonstrou cinética de primeira ordem. O estudo toxicológico da sinefrina na presença dos produtos de degradação formados foi realizado. Os resultados indicam que as amostras não apresentaram efeito mutagênico, mas causaram dano ao DNA e diminuição da viabilidade celular. Os dados obtidos colaboram com os estudos na área e podem ser utilizados como subsídios para elaboração de preparações farmacêuticas ou suplementos alimentares a base dessa substância. / The incidence of overweight and obesity in the general population is proving to be a serious public health problem. This fact, coupled with existing parameters of beauty, which consider the thinness, generate an unbridled pursuit for "natural" formulations which contains substances called slimming. In this sense, Citrus aurantium, popularly known as bitter orange, it is being widely used. However, so far there are no methods for quality control of these products and stability studies of its marker, synephrine. Therefore, this study aims to develop and validate the stability indicating method, perform a stability preliminary study and the toxicity of synephrine and photolytic degradation products formed. Stability indicating method was developed by HPLC - PDA for determination of synephrine in Citrus aurantium dry extract. The chromatographic separation used C18 (250 x 4.6 mm, 5μm) column and a mobile phase consisting of acetonitrile: 0.01% orthophosphoric acid (pH 3.0) in the ratio 15:85, flow rate 1 mL min -1 and detection at 220 nm. The detector response was linear in the range 7.5-45 mg mL -1 . The specificity and stability indicating capability were confirmed using forced degradation under conditions of acidic, basic, oxidative and photolytic. Both the extract and synephrine shown to be susceptible to degradation in all conditions tested. Intraday precision shown RSD values lower than 1.77% and interday precision of 2.48% RSD. The average recovery accuracy of the test was 102.03%. The photodegradation kinetics was calculated for both samples, through the concentration of the drug in function of time. The degradation of synephrine SQR diluted in acetonitrile followed second-order kinetics, while the extract of Citrus aurantium showed first-order kinetics. The toxicological study of synephrine in the presence of degradation products formed was performed. The results indicate that the samples showed no mutagenic effect, but its highest concentration showed DNA damage and decreased the cell viability. Data obtained collaborate with studies in the area and can be used as input for the preparation of pharmaceutical preparations or dietary supplements that the base substance.

A busca por um padrão estético globalizado e o aumento da obesidade fazem crescer o uso de suplementos alimentares e compostos emagrecedores à base de extratos vegetais. Produtos contendo a associação de p-sinefrina, efedrina, salicina e cafeína são amplamente consumidos e não apresentam efetividade e segurança bem esclarecidas. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a toxicidade subcrônica de p-sinefrina, efedrina, cafeína e salicina, isoladas e em associação, em ratos Wistar machos. Doses de salicina 6 mg/kg, efedrina 4 mg/kg, p-sinefrina 10 mg/kg, cafeína 80 mg/kg e a associação de salicina, efedrina, p-sinefrina e cafeína 100 mg/kg (6:4:10:80, respectivamente) foram testadas via oral por 28 dias consecutivos. A massa corporal foi verificada semanalmente e o teste da atividade locomotora foi realizado no 28º dia. O sangue foi coletado para análise bioquímica e órgãos vitais como fígado e rins foram utilizados para avaliação histológica. Os resultados mostraram uma redução significativa (p<0,05) na massa corporal nos dias 21 e 28 do grupo tratado com cafeína comparado ao grupo controle. Nos dias 14, 21 e 28 ocorreu um aumento significativo (p<0,05) da massa corporal no grupo tratado com p-sinefrina comparado com os grupos efedrina, salicina, cafeína e associação. No teste da atividade locomotora houve um aumento significativo (p<0,05) no grupo tratado com a associação comparado ao grupo controle. Não foram encontradas alterações nos marcadores bioquímicos de fígado, rim e coração, bem como nas avaliações macroscópicas dos órgãos vitais. Entretanto, na análise histológica do fígado, verificou-se em todos os grupos a presença de vacuolização e tumefação celular, congestão vascular e alargamento dos sinusóides, e apenas os grupos p-sinefrina, efedrina e salicina apresentaram degeneração hidrópica. Na histologia dos rins todos os grupos demonstraram vacuolização celular e aumento do espaço da cápsula de Bowman e o grupo p-sinefrina mostrou a presença de infiltrado inflamatório. Esses resultados sugerem que o uso dessas substâncias, tanto na forma isolada como em associação, apresenta um perfil toxicológico considerável. / The search for a globalized aesthetic standard and the increasing obesity are enhancing the use of food supplements and weight loss compounds from plant base extracts. Products containing the combination of p-synephrine, ephedrine, caffeine and salicin are widely consumed and the effectiveness and safety are not well understood. Therefore, the aim of this study was to evaluate the subchronic toxicity of p-synephrine, ephedrine, caffeine and salicin, isolated and in combination, in male Wistar rats. Doses of salicin 6 mg/kg, ephedrine 4 mg/kg, p-synephrine 10 mg/kg, caffeine 80 mg/kg and the association of salicin, ephedrine, p-synephrine and caffeine (100 mg/kg; 6:4:10:80, respectively) were administered orally for 28 consecutive days. Body weight was recorded weekly and a locomotor activity test was performed on the 28th day. Blood was collected for biochemical analysis and vital organs such as liver and kidneys were used for histologic evaluation. The results showed a significant reduction (p <0.05) in body mass on days 21 and 28 in the caffeine-treated group compared to control group. Besides that, on days 14, 21 and 28 a significant increase (p <0.05) in body weight was observed in the group treated with p-synephrine compared to the ephedrine, salicin, caffeine and association-treated groups. In the test of locomotor activity, a significant increase (p <0.05) was observed in the association-treated group treated compared to the control group. No changes were found in biochemical markers associated with liver, kidney and heart conditions or in macroscopic evaluations of vital organs. However, the histological analysis of the liver in all groups shown presence of cellular vacuolization and swelling, vascular congestion and enlargement of the sinusoids, whereas the p-synephrine, ephedrine and salicin groups exhibited hydropic degeneration. In the histology of kidneys, all groups showed cellular vacuolation and increased of the Bowman's capsule space and the p-synephrine group showed the presence of inflammatory infiltrate. These results suggest that the use of these substances either in isolation or in combination showed a considerable toxicological profile.

A busca por um padrão estético globalizado e o aumento da obesidade fazem crescer o uso de suplementos alimentares e compostos emagrecedores à base de extratos vegetais. Produtos contendo a associação de p-sinefrina, efedrina, salicina e cafeína são amplamente consumidos e não apresentam efetividade e segurança bem esclarecidas. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a toxicidade subcrônica de p-sinefrina, efedrina, cafeína e salicina, isoladas e em associação, em ratos Wistar machos. Doses de salicina 6 mg/kg, efedrina 4 mg/kg, p-sinefrina 10 mg/kg, cafeína 80 mg/kg e a associação de salicina, efedrina, p-sinefrina e cafeína 100 mg/kg (6:4:10:80, respectivamente) foram testadas via oral por 28 dias consecutivos. A massa corporal foi verificada semanalmente e o teste da atividade locomotora foi realizado no 28º dia. O sangue foi coletado para análise bioquímica e órgãos vitais como fígado e rins foram utilizados para avaliação histológica. Os resultados mostraram uma redução significativa (p<0,05) na massa corporal nos dias 21 e 28 do grupo tratado com cafeína comparado ao grupo controle. Nos dias 14, 21 e 28 ocorreu um aumento significativo (p<0,05) da massa corporal no grupo tratado com p-sinefrina comparado com os grupos efedrina, salicina, cafeína e associação. No teste da atividade locomotora houve um aumento significativo (p<0,05) no grupo tratado com a associação comparado ao grupo controle. Não foram encontradas alterações nos marcadores bioquímicos de fígado, rim e coração, bem como nas avaliações macroscópicas dos órgãos vitais. Entretanto, na análise histológica do fígado, verificou-se em todos os grupos a presença de vacuolização e tumefação celular, congestão vascular e alargamento dos sinusóides, e apenas os grupos p-sinefrina, efedrina e salicina apresentaram degeneração hidrópica. Na histologia dos rins todos os grupos demonstraram vacuolização celular e aumento do espaço da cápsula de Bowman e o grupo p-sinefrina mostrou a presença de infiltrado inflamatório. Esses resultados sugerem que o uso dessas substâncias, tanto na forma isolada como em associação, apresenta um perfil toxicológico considerável. / The search for a globalized aesthetic standard and the increasing obesity are enhancing the use of food supplements and weight loss compounds from plant base extracts. Products containing the combination of p-synephrine, ephedrine, caffeine and salicin are widely consumed and the effectiveness and safety are not well understood. Therefore, the aim of this study was to evaluate the subchronic toxicity of p-synephrine, ephedrine, caffeine and salicin, isolated and in combination, in male Wistar rats. Doses of salicin 6 mg/kg, ephedrine 4 mg/kg, p-synephrine 10 mg/kg, caffeine 80 mg/kg and the association of salicin, ephedrine, p-synephrine and caffeine (100 mg/kg; 6:4:10:80, respectively) were administered orally for 28 consecutive days. Body weight was recorded weekly and a locomotor activity test was performed on the 28th day. Blood was collected for biochemical analysis and vital organs such as liver and kidneys were used for histologic evaluation. The results showed a significant reduction (p <0.05) in body mass on days 21 and 28 in the caffeine-treated group compared to control group. Besides that, on days 14, 21 and 28 a significant increase (p <0.05) in body weight was observed in the group treated with p-synephrine compared to the ephedrine, salicin, caffeine and association-treated groups. In the test of locomotor activity, a significant increase (p <0.05) was observed in the association-treated group treated compared to the control group. No changes were found in biochemical markers associated with liver, kidney and heart conditions or in macroscopic evaluations of vital organs. However, the histological analysis of the liver in all groups shown presence of cellular vacuolization and swelling, vascular congestion and enlargement of the sinusoids, whereas the p-synephrine, ephedrine and salicin groups exhibited hydropic degeneration. In the histology of kidneys, all groups showed cellular vacuolation and increased of the Bowman's capsule space and the p-synephrine group showed the presence of inflammatory infiltrate. These results suggest that the use of these substances either in isolation or in combination showed a considerable toxicological profile.

Os suplementos alimentares e compostos emagrecedores a base de extratos vegetais têm uso muito difundido e indiscriminado, principalmente pela diversidade de produtos disponíveis e facilidade de acesso aos mesmos, aliada à falsa crença popular de que “o que é natural não faz mal”. Produtos contendo a associação de psinefrina, efedrina, salicina e cafeína são amplamente consumidos pela população. Entretanto, a efetividade e, sobretudo, a segurança da associação dessas substâncias ainda não é conhecida, visto que estudos sobre o sinergismo farmacológico e toxicológico dessa associação ainda são praticamente inexistentes. Logo, o objetivo deste trabalho foi elucidar o perfil toxicológico agudo e subcrônico, incluindo avaliação do estresse oxidativo e de alterações fisiológicas, bem como o desenvolvimento de metodologias que permitam analisar e quantificar o teor dessas substâncias nos produtos comerciais. Para avaliação da toxicidade aguda, doses de 300, 350 e 400 mg/kg da associação de p-sinefrina, efedrina, salicina e cafeína (10:4:6:80) foram testadas via oral em camundongos machos e fêmeas. Foi possível observar redução da atividade locomotora, ptose (em todas as doses em ambos os sexos), convulsões (350 mg/kg em fêmeas e 400 mg/kg em machos e fêmeas), além de salivação, agitação, piloereção em fêmeas, bem como mortes em machos (350 e 400 mg/kg) oriunda de hemorragia cardiopulmonar. Redução na atividade locomotora foi confirmada através do teste de atividade locomotora espontânea em machos que mostrou diminuição significativa (p<0,01) em todos os grupos tratados, sendo o mesmo resultado observado quando do teste de temperatura corporal, havendo decréscimo da mesma em todas as doses testadas. O teste de rota-rod mostrou ocorrência de neurotoxicidade em machos tratados com 400 mg/kg. A DL50 da mistura foi estimada entre 350 e 400 mg/kg. No teste de avaliação da toxicidade subcrônica, ratos machos e fêmeas foram tratados por via oral com a mesma mistura por 28 dias consecutivos nas doses de 50, 75, 100 e 150 mg/kg. Avaliações hematológicas, bioquímicas e de marcadores de estresse oxidativo foram realizadas, observando-se ocorrência de peroxidação lipídica e de dano hepático e renal em ratos machos (100 e 150 mg/kg), além de diminuição da GSH em todos os machos tratados. Nas fêmeas não houve indicação de estresse oxidativo, mas sim, ocorrência de alterações hepáticas não conclusivas. O diferente perfil de toxicidade apresentado por machos e fêmeas sugere influência hormonal sobre os efeitos fármaco-toxicológicos da mistura. Os resultados obtidos mostraram que a associação de p-sinefrina, efedrina, salicina e cafeína, nas doses testadas, apresenta considerável perfil de toxicidade, tanto agudo quanto subcrônico, indicando a necessidade de testes toxicológicos mais detalhados para total elucidação dos efeitos, incluindo avaliações relacionadas à influência da presença de estrogênio, avaliações que permitam períodos mais longos de exposição e avaliação de outros marcadores de estresse oxidativo, visto o grande número de acidentes toxicológicos relatados após utilização de suplementos alimentares e compostos emagrecedores cujas formulações frequentemente contém essa associação de substâncias. Com base no desenvolvimento da metodologia de análise, a extração em fase sólida com cartuchos de troca iônica SCX, seguida de extracção líquido-líquido com clorofórmio, subsequente reação de derivatização com anidrido trifluoroacético e posterior análise em CG/DIC (e GC/EM para confirmação) pode ser considerada uma alternativa promissora para analisar simultaneamente sinefrina, efedrina e cafeína em suplementos alimentares e compostos emagrecedores. O método por CG/DIC foi validado pela definição da faixa de linearidade para as substâncias (50, 100, 200, 500, 1000 e 2000 ug/mL para octopamina efedrina e p-sinefrina e 250, 500, 1000, 2500, 5000 e 10000 ug/mL para cafeína), limite de detecção, limite de quantificação, precisão, exatidão, seletividade, especificidade e robustez. O método de análise desenvolvida pode ser utilizado no controle de qualidade de produtos, para identificar e quantificar estas substâncias em uma ampla variedade de matrizes. / Dietary supplements and weight loss compounds plant-based are indiscriminate and widespread use, mainly for the diversity of products available and easy acess to them, coupled with the false popular belief that “what is natural does not hurt”. Products containing p-synephrine associated to ephedrine, salicin and caffeine are largely consumed. However, the effectiveness and safety of this mixture is still unknown, since studies about pharmacological and toxicological synergism are still nonexistent. Therefore, the aim of this study was evaluate the acute and subchronic toxicological profile, including assessment of oxidative stress physiological alterations, as well as the development of methodologies to analyze and quantify these substances in commercial products. To acute toxicological evaluation, 300, 350 and 400 mg/kg doses of association of p-synephrine, ephedrine, salicin and caffeine (10:4:6:80 w/w) were tested by oral gavage in male and female mice and was possible to observed a reduction in locomotor activity and ptose (in all treated groups for both male and female mice), seizures (350 mg/kg in female and 400 mg/kg in male and female), besides salivation, agitation and piloerection in female. Deaths occurred in male (350 and 400 mg/kg) and necropsy showed cardiopulmonary hemorrhage. The decrease in locomotor activity was confirmed throught the spontaneous locomotor activity, in which the number of crossings significantly decreased (p<0.01) in all treated groups, being the similar result obtained in body temperature evaluation, reducing in the all same doses. The rotarod test showed neurotoxicity in male treated with 400 mg/kg. The LD50 of the mixture was estimated between 350 and 400 mg/kg. In subchronic toxicity evaluation, male and female rats were treated by oral gavage with the mixture for 28 consecutive days at doses of 50, 75, 100 and 150 mg/kg. Hematological, biochemical and oxidative stress biomarkers were performed and showed lipid peroxidation, and hepatic and renal damages in male rats (100 and 150 mg/kg) and reduction in GSH levels and all treated male groups. In females, there were no indications of oxidative stress, but were observed not conclusive hepatic enzyme changes. The different toxicity profile displayed by male and female rats suggests hormonal influence in mixture effects. All the results obtained showed that the association of p-synephrine, ephedrine, salicin and caffeine in tested doses has considerable toxicity both acute and subchronic profiles, indicating the need of more detailed investigations for elucidate all the effects, including assessments related to protector role of estrogen, and more longterm studies of exposure, besides evaluations of more oxidative biomarkers, since the large number of toxicological report cases related to these products whose formulations usually contain these substances´s combination. On the basis of analytical methodology development, the SPE with SCX stationary phases followed by liquid-liquid extraction with chloroform and subsequent derivatization with anhydride trifluoroacetic and GC/FID (and GC/MS confirmation) analysis can be considered a promising alternative to analyze simultaneously synephrine, ephedrine and caffeine in supplements and weight loss products. The GC/FID method was validated by defining the linearity (50, 100, 200, 500, 1000 and 2000 μg/mL to ephedrine, octopamine and p-synephrine and 250, 500, 1000, 2500, 5000 and 10000 μg/mL to caffeine), limit of detection, limit of quantification, precision, accuracy, selectivity, specificity and robustness. The analysis method developed can be used in quality control to identify and quantificate these substances in a wide range of matrices.