Résumé : Les télomères sont des structures nucléoprotéiques spécialisées qui assurent la stabilité du génome en protégeant les extrémités chromosomiques. Afin d’empêcher des activités indésirables, la réparation des dommages à l’ADN doit être convenablement régulée au niveau des télomères. Pourtant, il existe peu d’études de la réparation des dommages induits par les ultraviolets (UVs) dans un contexte télomérique. Le mécanisme de réparation par excision de nucléotides (NER pour « Nucleotide Excision Repair ») permet d’éliminer les photoproduits. La NER est un mécanisme très bien conservé de la levure à l’humain. Elle est divisée en deux sous voies : une réparation globale du génome (GG-NER) et une réparation couplée à la transcription (TC-NER) plus rapide et plus efficace. Dans notre modèle d’étude, la levure Saccharomyces cerevisiae, une forme compactée de la chromatine nommée plus fréquemment « hétérochromatine » a été décrite. Cette structure particulière est présente entre autres, au niveau des régions sous-télomériques des extrémités chromosomiques. La formation de cette chromatine particulière implique quatre protéines nommées Sir (« Silent Information Regulator »). Elle présente différentes marques épigénétiques dont l’effet est de réprimer la transcription. L’accès aux dommages par la machinerie de réparation est-il limité par cette chromatine compacte ? Nous avons donc étudié la réparation des lésions induites par les UVs dans différentes régions associées aux télomères, en absence ou en présence de protéines Sir. Nos données ont démontré une modulation de la NER par la chromatine, dépendante des nucléosomes stabilisés par les Sir, dans les régions sous-télomériques. La NER était moins efficace dans les extrémités chromosomiques que dans les régions plus proches du centromère. Cet effet était dépendant du complexe YKu de la coiffe télomérique, mais pas dépendant des protéines Sir. La transcription télomériques pourrait aider la réparation des photoproduits, par l’intermédiaire de la sous-voie de TC-NER, prévenant ainsi la formation de mutations dans les extrémités chromosomiques. Des ARN non codants nommés TERRA sont produits mais leur rôle n’est pas encore clair. Par nos analyses, nous avons confirmé que la transcription des TERRA faciliterait la NER dans les différentes régions sous-télomériques. / Abstract : Telomeric DNA is made of short tandem repeats located at the ends of chromosomes and their maintenance is critical to prevent genome instability. DNA lesions constitute a serious risk to genome integrity. Thus, DNA repair mechanisms are required for continuous and unabridged cell divisions. The nucleotide excision repair (NER) pathway removes bulky DNA lesions such as UV-induced photoproducts, like the cyclobutane pyrimidine dimers (CPD). NER is divided in two sub-pathways: global genome repair (GGR) and the faster transcription-coupled repair (TCR), which only differ in how they recognize UV-induced lesions. In eukaryotes, NER must find and repair DNA lesions that are buried in nucleosomes. In the yeast S. cerevisiae, genes positioned close to telomeres are silenced by a heterochromatin-like structure that is formed by silent information regulator proteins (Sir). To determine if nucleosomes and chromatin in subtelomeric regions affect the efficiency of NER, we studied the repair of photoproducts in different telomere-associated regions in both, WT and SIR genes deleted cells (sirΔ). We found that NER efficiency was modulated by the presence of nucleosomes on the subtelomeric type X element. In addition, in absence of Sir proteins, NER efficiency increased and was not modulated by nucleosomes, indicating that nucleosome positioning was less defined in sirΔ cells. Remarkably, in telomeric restriction fragment, NER was less efficient at telomeres than in the subtelomere type Y’ element. We suggest that low NER efficiency at the very end of chromosomes results from attachment sites to the nuclear periphery. Our data indicate that NER in sub-telomeric chromatin is modulated by Sir proteins stabilized-nucleosomes, and that NER is inhibited in telomeric chromatin by the presence of YKu, independently from the presence of Sir proteins. It was recently shown that the chromosome ends are transcribed and a non-coding RNA, called TERRA, is produced. Currently the precise functions of TERRA are not understood. Our second goal is to help understand the function of TERRA. We think that transcription at the chromosome ends could facilitate the removal of DNA lesions from heterochromatin by TCR, which would prevent the formation of mutations and, ultimately, chromosome shortening. Our data showed that TC-NER is effective in Y’ element and the telomere. Without Sir proteins, TERRA transcription is found in a particular region at the end of the X element. The transcription of TERRA could improve the repair of UV-induced lesions.

Dans les cellules somatiques, les télomères s'érodent à chaque division cellulaire. Ce processus appelé « Sénescence Réplicative» est contrebalancé de manière basale chez la levure bourgeonnante S. cerevisiae par l'action de la télomérase qui, alors qu'elle est inactive dans les cellules somatiques des eucaryotes supérieures, est activée dans 85% des cancers. Un autre mécanisme impliqué dans les 15% des cas de cancer restants et est appelé Alternative Lengthening of Telomere (ALT). Dans ce processus, le maintien des télomères est assuré par des mécanismes de recombinaison télomérique induisant des échanges de séquences télomériques de chromatides sœurs (T-SCE).Nous avons évalué l'existence d'ALT dans la LLC-B connue pour rarement exprimer la télomérase. Nous avons montrer que 90% des patients LLC-B présentent une diminution de l'expression de TopoIIIα corrélée à une méthylation plus importante des îlots CpG de la région promotrice du gène suggérant que dans les LLC-B le maintien des télomères est défectueux.Nous avons étudié l'implication de la SUMOylation de TopoIIIα/Top3 dans les mécanismes de régulation du ALT. Nous avons montré que TopoIIIα était SUMOylée in vitro et in vivo au sein des cellules U2-OS ALT. Nous avons aussi observé chez S. cerevisiae que Top3 ne serait SUMOylée qu'en absence d'une activité télomérase. Nos résultats suggèrent que la SUMOylation de TopoIIIα augmenterait son activité in vitro et in vivo en diminuant son affinité pour les télomères une fois la recombinaison achevée et qu'elle serait requise pour son accumulation dans les APBs mais pas pour leur formation. / In somatic cells, telomeres erode with each cell division. This process named « Replicative Senescence » is basically counterbalanced in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae by the action of telomerase which, while it is inactive in somatic cells of higher eukaryotes is activated in 85 % of cancer cases. Another process of telomere maintenance is involved in 15% of remaining cancer cases and is called Alternative Lengthening of Telomere (ALT). In this process, telomere maintenance is provided by telomeric recombination mechanisms inducing exchange of telomeric sister chromatid (T-SCE).We assessed the existence of an ALT mechanism in B-CLL known to rarely express telomerase. We have shown that 90% of B-CLL patients have a decreased expression of TopoIIIα correlated with largest methylation of CpG islands of the gene promoter region. Our results suggest that in B-CLL, telomere maintenance is defective either by telomerase or ALT mechanism.We investigated the involvement of post- SUMOylation of TopoIIIα/Top3 in mechanisms regulating ALT phenomenon. We have shown that TopoIIIα was SUMOylated in vitro and in vivo in U2-OS ALT cells. We also observed in S. cerevisiae that Top3p might be SUMOylated in absence of telomerase activity. Our results suggested that the SUMOylation of TopoIIIα increased its activity in vitro and in vivo by reducing its affinity for telomeres once recombination occurred and would be required for its accumulation in APBs but not for their formation.

Le carcinome hépatocellulaire (HCC) est une tumeur de mauvais pronostic caractérisée, comme la plupart de cancers, par l'association paradoxale de télomères courts et d'une importante activité télomérase. Cette attrition télomérique joue un rôle central dans l'instabilité chromosomique à l'origine de la promotion et de l'évolution tumorale. Les premières causes d'HCC correspondent aux infections chroniques par les virus hépatotropes : virus de l'hépatite B (VHB) et virus de l'hépatite C (VHC). Dans une première étape nous avons disséqué les dérégulations télomériques dans les HCC et les cirrhoses liées au VHB, VHC ou encore à l'alcool. Nous avons observé que ces dérégulations sont acquises tôt, au stade prétumoral, et persistent au stade tumoral. Ces dérégulations sont spécifiques d'un carcinogène donné. Aux stades tardifs et tumoraux de l'infection par le VHB, les cellules hépatiques expriment fréquemment une protéine tronquée en partie C-terminale d'HBx ainsi que des formes réarrangées du gène PreS/S telle que PreS2. Dans une seconde étape nous avons trouvé qu'à l'opposé de la forme sauvage, HBx tronquée réprime hTERT, diminue l'activité télomérase, raccourcit les télomères, augmente la proportion de ponts anaphasiques et déclenche la sénescence de cellules primaires. Sachant qu'au stade tumoral les cellules transformées ré-expriment hTERT nous avons testé l'effet d'une coexpression de PreS2 et d'HBx tronquée et avons pu montrer que PreS2 contrecarrait l'effet répresseur d'HBx sur hTERT. Néanmoins de façon étonnante, PreS2 ne parvenait pas à rallonger les télomères en présence d'HBx tronquée. Les facteurs protégeant les télomères coopèrent avec la télomérase pour l'élongation et plusieurs de ces protéines sont par ailleurs impliquées dans la réparation des dommages à l'ADN. Nous avons trouvé qu'HBx tronquée modifiait spécifiquement l'expression de la plupart des protéines du télosome selon un patron connu pour inhiber l'effet de la télomérase. Nous avons montré que des dommages à l'ADN télomérique liés à l'incubation de cellules primaires avec la néocarcinostatine inhibaient l'élongation des télomères par hTERT. Ayant trouvé que PreS2 et HBx tronquée induisaient des dommages à l'ADN, nous proposons que cet effet explique l'impossibilité pour PreS2 d'allonger les télomères de cellules exprimant HBx tronquée / Among the numerous genetic defects that underly with hepatocarcinogenesis, telomere abnormalities seem to play a role both in tumor promotion and maintenance. Telomeres, the chromosome extremities, are protected by specific proteins, the Shelterin complex and by additional factors. Besides telomerase dysregulation, changes in the expression of these telomere factors have been observed in cancers. Herewe first tested the hypothesis that such dysregulations might occur in HCC with patterns depending onthe cause of HCC. For HBV-, HCV- and alcool-dependant HCC we found that telomeric dysregulations appear to be carcinogen-specific and occur early during the course of the disease and are persistent in the tumor. At the late stage of HBV-dependent disease and corresponding tumors, hepatocytes produce 3’ deleted mutants of HBx (3’DM HBx) but also a rearranged form of the PreS/S gene: PreS2. We then found that, unlike WT HBx, 3’ DM HBx repress hTERT transcription, decrease telomerase activity, shorten telomere length, increase anaphase bridges and trigger senescence in transfected primary cells. It’s well known that hTERT it re-expressed in tumors, so we tested PreS2 and 3’DM HBx transfection. We show that PreS2 counteracts 3’DM HBx effect on hTERT transcription and telomerase activity. However surprisingly PreS2 wasn’t able to elongate telomeres in 3’DM HBx expressing cells. Telomeric factors interact with telomerase allowing telomere elongation. Moreover many of these factors are implicated in DNA damage repair systems. We found that all Shelterin’s and some other telomeric factors’s expression in dyregulated in 3’DM HBx expressing cells. Moreover we show that neocarcinostatin dependent DNA damage in MRC5 primary cell prevent hTERT-based telomere elongation. Also finding that PreS2 and 3’DM induce DNA damage, we suggest that 3’DM HBx prevents PreS2 and hTERT- based telomere elongation

Les télomères sont les extrémités des chromosomes linéaires des eucaryotes.Ils sont constitués de répétitions en tandem d'un motif court riche enguanine, et liés par des protéines spécifiques. Chez les vertébrés cesprotéines forment un complexe appelé le shelterin et dont l'intégrité estcritique pour assurer la réplication correcte des extrémités deschromosomes, et pour les protéger contre une prise en charge illicite parles voies de réparation des cassures double-brin de l'ADN. Des dysfonctionsdes télomères engendrent une instabilité du génome qui peut conduire à lasénescence ou au cancer. Les télomères représentent une région subnucléaireoù les protéines du shelterin sont fortement enrichies, ce qui permetl'implication dans les fonctions biologiques d'interactions de basseaffinité. Parmi les protéines du shelterin, la protéine de liaison auxrépétitions télomériques TRF2 et son partenaire constitutif RAP1 sont lesfacteurs majeurs responsables de la protection des extrémités. Nous avonsétudié en détails l'assemblage du complexe TRF2/RAP1 par des approchesintégrées de biologie structurale, de biophysique et de biochimie.Nous avons montré que cet assemblage s'accompagne d'importants ajustementsde conformation des deux protéines, et implique une interaction de basseaffinité qui engage de grandes régions des deux protéines et affecte leurspropriétés d'interactions. / Telomeres are the ends of eukaryotic linear chromosomes. They are made oftandem repeats of a short guanine-rich motif and bound by specific proteins.In vertebrates, these proteins form a complex called shelterin, theintegrity of which is critical to ensure proper replication of chromosomeends and to protect them against illicit targeting by DNA double-strandbreak repair pathways. Telomere dysfunctions lead to genome instability,which can ultimately cause senescence or cancer. Telomeres are a subnuclearregion in which shelterin proteins are highly enriched, enhancing lowaffinity interactions of important biological function. Among shelterinproteins, telomeric repeat-binding protein TRF2 and its constitutive partnerRAP1 are the main factors responsible for end protection. We studied indetails the assembly of TRF2/RAP1 complex by means of integrated structural,biophysical and biochemical approaches. We showed that this assemblydisplays important conformational adjustments of both proteins, and involvesa low affinity interaction engaging large regions in both proteins whichaffects their interaction properties.

La mastocytose est une maladie hétérogène, caractérisée par une accumulation de mastocytes dans l’organisme. Les enfants et les adultes ont des mutations différentes de c-Kit. Dans un premier travail, nous avons montré que seules les formes adultes sont associées à la réactivation de la télomérase, alors que les formes pédiatriques ne sont pas. Cela semble être lié aux différences de mutations de c-Kit observées entre adultes et enfants et pourrait expliquer pourquoi seules les formes pédiatriques de mastocytose régressent spontanément et non les formes adultes. Ces résultats aident à mieux comprendre la physiopathologie de la mastocytose. Dans un second travail, nous a étudié le lien entre la longueur des télomères et les troubles psychologiques des adultes atteints de mastocytose. Nous avons montré que réactions émotionnelles négatives sont corrélées au raccourcissement de la longueur des télomères des leucocytes et que l’érosion télomérique est fortement prédite par les défauts de régulation des émotions. Nous émettons l'hypothèse qu’au cours des troubles neuropsychologiques, le mastocyte pourrait être impliqué dans le raccourcissement de la longueur des télomères en périphérie. / Mastocytosis is a heterogeneous disease characterized by an accumulation of mast cells. Children and adults hold different c-Kit mutations. In a first work, we showed that only adult forms are associated with reactivation of telomerase whereas pediatric forms are not. This seems to be linked to the differential c-Kit mutations observed between adults and children and could explain why only pediatric mastocytosis spontaneously regress in comparison with adult forms. These results help to better elucidate the pathophysiology of mastocytosis. In a second work, we studied the link between the telomere length and the psychological features of adults with mastocytosis and showed that negative emotionality correlated negatively to telomere length and that telomere shortening was strongly predicted by emotion regulation deficits. We hypothesize that in psychological disorders, mast cell may represent the link between brain and periphery and induce telomere shortening.

Le vieillissement de l'organisme prédispose à de nombreuses pathologies chroniques telles que l'insuffisance cardiaque (IC). Des études récentes ont montré que l'accumulation de cellules sénescentes dans les organes au cours du vieillissement est associée à l'apparition de ces pathologies. La sénescence cellulaire a initialement été décrite comme un arrêt stable du cycle cellulaire permettant de limiter la prolifération des cellules dont l'ADN est endommagé. Ce processus s'accompagne de profondes modifications de la fonction cellulaire, avec notamment l'acquisition d'un phénotype sécrétoire associé à la sénescence. La sénescence peut être induite par un raccourcissement des télomères ou par l'exposition à des signaux de stress, tels que le stress oxydant ou l'irradiation, qui entrainent l'activation de la réponse cellulaire aux dommages de l'ADN et l'expression des gènes suppresseurs de tumeurs (p16INK4a, p21CIP1, p53). Ces inhibiteurs du cycle cellulaire sont classiquement utilisés comme marqueur de sénescence car leur expression augmente de manière ubiquitaire au cours du vieillissement. Toutefois, ces marqueurs ne sont pas spécifiques du tissu concerné et un des objectifs de ma thèse a été d'identifier de nouveaux marqueurs de sénescence tissu-spécifiques qui pourraient caractériser un vieillissement cardiaque pathologique. Le vieillissement cardiaque se caractérise par une hypertrophie des cardiomyocytes, une sensibilité accrue au stress et une prédisposition à l'IC. Les cardiomyocytes étant des cellules post-mitotiques, les mécanismes de sénescence mis en jeu, les marqueurs associés et leur rôle potentiel dans l'IC demeurent à l'heure actuelle peu caractérisés. Au cours de ce travail de thèse nous avons donc entrepris : 1) d'étudier le rôle des télomères et des dysfonctions mitochondriales dans l'induction de la sénescence du cardiomyocyte et 2) d'identifier des marqueurs spécifiques. Nous avons tout d'abord montré que les cardiomyocytes de souris âgées expriment les marqueurs classiques de la sénescence comme p16INK4a, p53 et p21CIP1. Concernant les mécanismes inducteurs, nous avons étudié l'implication des dommages télomériques (telomere associated foci, TAF). Au cours du vieillissement, nous avons observé une augmentation du nombre de TAFs par cardiomyocytes en association avec l'hypertrophie. De plus, l'induction de TAFs in vitro est suffisante à l'activation de la voie de sénescence p53/p21CIP1 et l'hypertrophie dans une lignée de cardiomyoblastes H9c2. La formation des TAFs est augmentée chez des souris avec une dysfonction mitochondriale et est associée à l'activation des voies p53/p21CIP1. Par ailleurs, les cardiomyocytes âgés présentent une dérégulation des gènes impliqués dans la biologie mitochondriale pouvant rendre compte de l'augmentation des TAFs. Par l'analyse haut débit du transcriptome (RNAseq) nous avons identifié six nouveaux gènes qui sont surexprimés dans les cardiomyocytes sénescents (Prom2, Kcnk1, Pah, Edn3, Gdf15, Tgfb2). La comparaison d'expression de ces gènes dans le cœur avec d'autres tissus et avec le stroma cardiaque lors vieillissement a permis de confirmer la spécificité d'expression de ces marqueurs au niveau des cardiomyocytes. Nous avons validé cette signature dans deux modèles in vitro de sénescence induite par le stress et démontré que l'expression de certains de ces marqueurs est dépendante de la voie p53. De plus, l'expression de Prom2 est associée à l'hypertrophie des cardiomyocytes. En conclusion, nous avons démontré, qu'avec le vieillissement, les cardiomyocytes présentent un programme de sénescence associé à une dysfonction mitochondriale et une augmentation des TAFs. Cette sénescence se caractérise par l'activation des voies classiques de sénescence (p16INK4, p53/p21CIP1), une hypertrophie et l'acquisition d'une signature spécifique. Ces marqueurs offrent de nouvelles perspectives dans la compréhension de la sénescence cardiaque et dans son implication potentielle dans l'IC. / Ageing of the organism is associated with several chronic pathologies such as heart failure (HF). Recent studies have demonstrated the link between the accumulation of senescent cells during ageing and age-associated diseases. Cellular senescence, originally defined as a stable cell cycle arrest, acts as a tumorigenic repressor by limiting the proliferation of DNA damaged cells. Despite this protective effect, senescence is characterized by deep remodeling of cell biology which drives functional disorders, such as the acquisition of a senescence-associated secretory phenotype (SASP). Senescence can be induced by telomeric attrition and by exposition to cellular stress signals such as oxidative stress or irradiation, which induce telomeric damage, activation of the DNA Damage Response (DDR) and increased expression of antitumoral genes (p16INK4a, p21CIP1, p53). These genes are classically used as markers of senescence because their expression increases in several tissues during ageing but they are not tissue-specific. Therefore, At the cardiac level, ageing is characterized by cardiomyocytes hypertrophy, increased sensitivity to stress and highest risk of developing HF. Cardiomyocytes are post- mitotic cells and the senescence inductor mechanisms, specifics markers and their role in HF remains poorly understood. This thesis project is articulated around two aims, 1/ studying the role of telomeric damages and mitochondrial dysfunction in triggering cardiomyocyte senescence and 2/ identification of specifics markers. Fisrtly, we shown that aged cardiomyocytes overexpress classic markers of senescence such as p16INK4a, p53 et p21CIP1. Concerning the inductors mechanisms, we studied the implication of telomeric damages (telomere associated foci, TAF). During ageing, we found an increased number of TAFs per cardiomyocytes and their association with hypertrophy. Moreover, TAF- induction in cardiac H9c2 in vitro activated the p53/p21 pathway and induced senescence. These data confirmed the role of TAFs in cardiomyocyte senescence induction. Furthermore, aged cardiomyocytes exhibit a global alteration of genes involved in mitochondrial biology, oxidative stress and metabolism in aged cardiomyocytes that could play a prominent role in TAF accumulation with ageing. In a second part of the study, by using a next generation sequencing method (RNA-seq) we identified 6 new genes highly expressed in senescent cardiomyocytes (Prom2, Kcnk1, Pah, Edn3, Gdf15 and Tgfb2). Expression comparison with other senescent organs and cardiac stromal cells confirmed these new genes as cardiomyocyte specific. Thanks to an in vitro approach, we validate this signature by using different models of stress-induced senescence in cardiac H9c2 cells and demonstrated the implication of the p53 in the regulation of some of these genes. Moreover, Prom2 expression is associated with cardiomyocytes hypertrophy. In conclusion, we demonstrated that, with ageing, cardiomyocytes display a senescence phenotype associated with mitochondrial dysfunction and TAFs. This process is characterized by classic markers (p16INK4, p53/p21CIP1), hypertrophy and new identified signature. These new markers offer innovative perspectives in the understanding and the identification of the cardiac senescence and their potential deleterious role in heart failure.

Sous conditions de stress métabolique ou environnemental, l’activation instantanée de voies moléculaires puissantes permet aux cellules de prévenir la formation et l’accumulation d’agrégats protéiques toxiques. HSF1 (Heat Shock Factor 1) est le facteur de transcription majeur capable d’orchestrer cette réponse cellulaire au stress et cela via l’activation de protéines au rôle protecteur nommées chaperonnes. Cependant, il est aujourd’hui évident que les fonctions initialement attribuées au facteur HSF1 s’étendent bien au-delà de l’activation de la transcription de chaperonnes. En effet, il a été démontré que HSF1 joue un rôle essentiel dans l’activation et le remodelage de régions répétées appartenant à l’hétérochromatine péricentromérique sous stress thermique et plus récemment qu’HSF1 contribuerait significativement au processus de tumorigenèse dans différents types de cancers. Dans cette étude, nous avons identifié pour la première fois les régions subtélomériques comme étant une nouvelle cible génomique d’HSF1 sous conditions de stress thermique. Nous avons démontré, que la liaison directe et spécifique d’HSF1 avec plusieurs de ces régions sous stress thermique est à l’origine d’une surexpression de longs ARNs non codants issus des télomères, aussi connus sous le nom de TERRA. De façon intéressante nous avons trouvé que cette transcription était corrélée à un enrichissement de la marque épigénétique répressive H3K9me3 au niveau télomérique. De plus, nos données ont permis de démontrer que l’intégrité de la chromatine télomérique était significativement atteinte sous conditions de stress thermique. Nous observons à la fois, une dissociation partielle de la protéine TRF2 (Telomeric repeat-binding factor 2) et une accumulation de dommages à l’ADN détectés grâce au marqueur moléculaire H2AX-P, au niveau des télomères. Finalement, nos résultats ont également permis de souligner un rôle d’HSF1 dans le maintien de cette intégrité télomérique. L’ensemble de ce travail établit un premier lien entre la voie cellulaire puissante de réponse au stress, son acteur majeur HSF1 et les régions de l’hétérochromatine télomérique, dans des lignées de cellules humaines cancéreuses. Ces données fournissent des indications précieuses sur une voie de maintien de télomères sous stress et nous permettant de proposer un modèle dans lequel cette nouvelle fonction d’HSF1 aux télomères pourrait être étroitement liée à l’expression des ARNs non codants télomériques. Sur la base de nos données ainsi que sur les multiples publications démontrant l’implication d’HSF1 dans la tumorigenèse, la définition exacte du rôle d’HSF1 au niveau de l’intégrité des télomères dans un contexte pathologique comme le cancer apparait aujourd’hui comme un défi prometteur. / In response to metabolic or environmental stress, cells rapidly activate powerful defense mechanisms to prevent the formation and accumulation of toxic protein aggregates. The main orchestrator of this cellular response is HSF1 (Heat Shock Factor 1), a transcription factor involved in the up-regulation of protein-coding genes with protective roles. However, it is now becoming clear, that HSF1 function extends beyond what was previously predicted and that HSF1 can contribute to pericentromeric heterochromatin remodeling and activation as well as to efficiently support malignancy. In this study, we identify subtelomeric DNA as a new genomic target of HSF1 upon heat shock (HS). We show that HSF1 binding to subtelomeric regions plays an essential role in the upregulation of TERRA lncRNAs transcription and in the accumulation of repressive H3K9me3 histone mark at telomeres upon HS. Additionally, we demonstrate that HS significantly affects telomere capping and telomere integrity. We bring evidence of a partial TRF2 telomeric-binding factor dissociation and we reveal an accumulation of DNA damage at telomeres using the DNA damage marker H2A.X-P. In line with this, we bring solid evidences that under heat shock, HSF1 contributes to preserve telomere integrity by significantly limiting telomeric DNA damage accumulation. Altogether, our findings therefore reveal a new direct and essential function of HSF1 in transcription activation of TERRA and in telomere protection upon stress in human cancer cell lines. This work provides new insights into how telomeres are preserved under stressful heat shock conditions and allow us to propose a model where HSF1 may exert its protective function at telomeres via the expression of TERRA ncRNAs. Based on our results and given the important role of HSF1 in tumor development, defining the role of HSF1 with regard to telomere stability in tumor development already emerges as a promising challenge.

La protéine TRF2 est une protéine clé dans la dynamique des télomères, ces structures nucléoprotéiques présentes à l'extrémité des chromosomes linéaires et responsables de leur protection. Bien que la manière dont les télomères s'organisent pour protéger l'ADN soit encore méconnue, il a été montré récemment que TRF2 est à l'origine de la formation d'une structure en boucle, ou boucle télomérique qui empêcherait les extrémités télomériques d'être reconnus comme des coupures double brin. Un modèle propose que TRF2 permette la formation de cette boucle en induisant l'invasion du simple brin télomérique terminal à l'intérieur de la séquence double brin après repliement du télomère sur lui même. Les études réalisées lors de cette thèse montrent que TRF2 est en mesure de stimuler l'invasion télomérique de manière indirecte facilitant l'ouverture de la double hélice grâce à des modifications d'ordre topologique de l'ADN cible. Par ailleurs, les travaux réalisés mettent également en évidence un second mode de fixation à l'ADN de TRF2, par l'intermédiaire de son domaine N-terminal qui possède une affinité remarquable pour la structure des jonctions de Holliday. La dernière partie de cette thèse met en évidence l'activité 5' exonucléase d'une nouvelle protéine télomérique, la protéine Apollon, qui serait impliquée dans la protection des télomères. Tous ces résultats participent à une meilleure compréhension du fonctionnement de TRF2 sur les télomères et en particulier de son rôle dans la formation de la boucle télomérique.

Les télomères sont des structures complexes associant des répétitions de séquences nucléotidiques TTAGGG à diverses protéines dont le complexe shelterin. Le TRF2 (Telomeric repeat-binding Factor 2) est un composant majeur de ce complexe, indispensable à la formation de la boucle télomérique T-loop qui permet la protection des extrémités vis-à-vis des exonucléases et systèmes de réparation de l'ADN. Ce facteur est aussi impliqué dans la tumorigenèse de nombreux cancers. Le carcinome épidermoïde oral représente 90% des cancers des Voies Aéro-Digestives Supérieures (VADS) sixième cause de cancer dans le monde avec une incidence de plus de 14000 nouveaux cas en France en 2012. Souvent diagnostiqué par des chirurgiens-dentistes, c'est un cancer de mauvais pronostic traité par chirurgie, radiothérapie, chimiothérapie et thérapies ciblant le R-EGF. Peu d'études se sont intéressées à l'expression de TRF2 dans le carcinome épidermoïde oral et leurs résultats contradictoires ne permettent pas de comprendre son rôle dans leur agressivité.L'expression de TRF2 a été analysée dans les biopsies de 62 patients atteints d'un carcinome épidermoïde oral, à l'aide d'un score de lecture en immunohistochimie. Une forte expression de TRF2 est associé une survie globale significativement plus faible ce qui en fait un facteur pronostique pertinent. In vitro, une faible expression de TRF2 induit une modification du profil sécrétoire des cellules tumorales qui se traduit in vivo par des modifications de l'architecture tissulaire de tumeurs chez la souris nude. Enfin, TRF2 est un marqueur prédictif de réponse aux thérapies ciblées, leur efficacité étant optimale lorsque TRF2 est faiblement exprimé. / Telomeres are composed of tandmely repeated TTAGGG nucleotidic sequences associated with various proteins including shelterin complex. TRF2 (Telomeric repeat-binding Factor 2) is the major component of this complex, necessary for T-loop formation which protects telomeres from DNA damage response and exonucleases. Oral Squamous Cell Carcinoma (OSCC) is the most incident subtype of head and neck cancer (90%), sixth most common cancer in the world with an incidence of 14000 cases in France in 2012. Often diagnosed by dental surgeons,this bad prognosis malignancy is treated by surgery, radiotherapy, chemotherapy and targeted therapies against EGFR. Few studies evaluated TRF2 expression in OSCC and their results are discrepant. TRF2 expression has been assessed in immunohistochemistry in 62 tumoral samples of patients with an history of OSCC. TRF2 overexpression is associated with bad prognosis. TRF2 knockdown changes cells' secretome thus modifying tumoral tissue architecture. Our results showed that TRF2 is predictive for treatment response in targeted therapies in OSCC.

Les télomères sont des structures nucléoprotéiques spécialisées qui assurent l’intégrité des extrémités des chromosomes linéaires. Ils sont composés d’une séquence d’ADN qui leur est propre, sont associées à des protéines spécifiques, et sont maintenus par la télomérase. Leur fonction est d’empêcher le raccourcissement progressif des extrémités des chromosomes dû à la réplication ainsi que leur reconnaissance par les mécanismes de réparation des cassures double brin. La réparation des cassures double-brin consiste en deux mécanismes généraux : la recombinaison non-homologue et la recombinaison homologue. L’activation de ces voies de recombinaison en réponse à la déprotection télomérique est un mécanisme de survie cellulaire, mais qui conduit fréquemment à une instabilité génomique.Nous avons testé l’implication des voies de recombinaison non-homologue dans la prise en charge des télomères déprotégés par inactivation de chacune de ces voies. La génération d’un multiple mutant ne présentant pas de voies de recombinaison non-homologue fonctionnelles a permis de restaurer la capacité des plantes à se développer normalement en présence de télomères déprotégés. Nos résultats ont mis en évidence une compétition entre les voies de recombinaison non-homologue et la télomérase en absence de protection télomérique.L’étude des homologues de la protéine GEN1 – impliquée dans la résolution de structures d’ADN branchées lors de la recombinaison homologue – a permis d'identifier l'homologue fonctionnel de GEN1 chez Arabidopsis et de mettre en évidence un rôle télomérique de cette protéine. En effet, cette nucléase s’avère essentielle à la stabilité des télomères en favorisant leur réplication.L’inhibition de la recombinaison homologue en absence de télomérase entraine l’apparition précoce et significative d’instabilité chromosomique. L’induction d’un stress réplicatif exacerbe cette instabilité télomérique, indiquant que la recombinaison homologue facilite la réplication des télomères en absence de télomérase. Nos données indiquent que la télomérase participe également au déroulement correct de la réplication des télomères. De façon inattendue, le rôle positif de la recombinaison homologue est dépendant de l’hélicase RTEL1. / Telomeres are specialized nucleoprotein structures that ensure the integrity of the ends of linear eukaryotic chromosomes. They are composed of a particular DNA sequence, associated with specific proteins and are maintained by telomerase. Their function is to prevent the progressive shortening of chromosome due to replication and to protect chromosome ends from recognition by cellular double-strand break repair proteins. Double-strand break repair involves two general mechanisms: non-homologous recombination and homologous recombination. Activation of these recombination pathways in response to unprotected telomeres is a cell survival mechanism, which frequently leads to genomic instability.We tested the involvement of non-homologous recombination pathways in fusions of unprotected telomeres by inactivation of each of these pathways. The generation of a triple KO mutant without non-homologous recombination restores the normal growth and development of the plants with deprotected telomeres. These results show a competition between non-homologous recombination pathways and telomerase in the absence of telomeric protection.Study of GEN1 homologues – involved in the resolution of branched DNA structures during homologous recombination – permitted identification of the functional GEN1 homologue of Arabidopsis and the demonstration of a telomeric role of this protein. Indeed, this nuclease proves to be essential to the stability of the telomeres by promoting their replication.Inhibition of homologous recombination in absence of telomerase leads to the early and significant appearance of chromosomal instability. Induction of replicative stress exacerbates this telomere instability, indicating that homologous recombination facilitates telomere replication in the absence of telomerase. Our data indicate that telomerase also contributes to correct replication of telomeres. Unexpectedly, the positive role of the homologous recombination in telomere stability is dependent on the RTEL1 helicase.