Le raccourcissement progressif des télomères, en grande partie dû à la réplication incomplète des télomères, est l’une des caractéristiques principales du vieillissement. De façon encore plus frappante, une attrition trop marquée ou rapide des télomères est l’une des causes majeures d’un vieillissement prématuré. Les patients diagnostiqués avec un tel syndrome présentent généralement des mutations délétères dans un gène de maintien de l’homéostasie des télomères. Parmi les symptômes physiologiques, on remarque chez ces patients, des dégénérescences dans les tissus hautement prolifératifs, dus à l’exhaustion des cellules souches. Les cellules souches adultes, spécialisées et présentes dans nos tissus, permettent normalement la régénération des organes grâce à leur potentiel prolifératif et de différenciation. Afin de maintenir leur intégrité génomique, les cellules souches expriment une enzyme, la télomérase, capable de rallonger les extrémités terminales des chromosomes, et ainsi de maintenir intègre les télomères de ces cellules subissant des divisions cellulaire et subsistant dans l’organisme durant la vie de l’individu. En revanche, l’expression de la télomérase s’amenuise au cours du temps, les télomères se raccourcissent et les fonctions des cellules souches sont altérées. Nous étudions ce phénomène en utilisant comme modèle cellulaire, les cellules souches embryonnaires de souris, dont le gène de la télomérase réverse transcriptase a été anéanti génétiquement (mESC Tert -/-). Notamment, ces cellules, qui possèdent des télomères extrêmement courts n’arrivent pas à se différencier correctement. D’une étude précédente, mon laboratoire avait montré que ces cellules ne réussissaient pas à réprimer l’expression des gènes de pluripotence, comme Pou5F1/Oct4 et Nanog, et donc montraient des difficultés à sortir de l’état indifférencié. Au cours de mes recherches, nous avons montré que ce défaut était en fait dû à une altération en profondeur de l’épigénétique de ces cellules. Après avoir observé une déméthylation globale de l’ADN, nous avons constaté une augmentation de la marque d’histone H3K27me3 à travers le génome. De plus, moduler la présence de H3K27me3 via des petits inhibiteurs du complexe PRC2, ou par une approche génétique, modifie également le potentiel de différenciation des cellules souches. À la suite de cette étude, nous avons voulu en savoir davantage sur le signal liant attrition des télomères et défaut de différenciation. Lorsque les télomères sont très courts, la voie de réparation de l’ADN les reconnait comme une cassure double-brin. Parmi les acteurs de la réparation de l’ADN, la protéine p53 joue un rôle central puisqu’elle influence le destin cellulaire. Candidat idéal, nous avons cherché à savoir si p53 influençait la différenciation des mESC Tert -/- en utilisant une approche génétique. Nous avons été surpris de constater que l’absence de p53 restaurait le potentiel de différenciation des mESC Tert -/-. Ainsi et pour la première fois, nous avons montré que le raccourcissement des télomères pouvait avoir un effet très global sur les cellules. Nos recherches permettront de mieux appréhender certaines problématiques, notamment en matière de vieillissement. / The progressive decline of telomere length, mainly due to incomplete DNA replication at telomeres, is one of the main features of aging. Even more strikingly, excessive or rapid telomere attrition is one of the major causes of premature aging. Patients diagnosed with such syndromes have deleterious mutations in genes that maintain telomere homeostasis. For these patients, physiological manifestations include degeneration in highly proliferative tissues due to stem cell exhaustion. Adult stem cells, present in our tissues, typically allow the regeneration of organs due to their proliferative and differentiation potential. To maintain their replicative potential, stem cells express an enzyme, called telomerase, that is capable of lengthening the terminal ends of chromosomes. The maintenance of telomere length and, consequently favoring genomic stability, is crucial for stem cells that undergo cell division and remain in the organism throughout the individual's life. However, in stem cells, telomerase expression decreases over time, leading to telomere attrition and defects in stem cell functions. We studied this phenomenon using mouse embryonic stem cells disrupted for telomerase reverse transcriptase (mESC Tert -/-) as a model. In particular, these cells, which have extremely short telomeres, are unable to differentiate appropriately. Previously, my colleagues had shown that these cells failed to repress the expression of pluripotency genes, such as Pou5f1/Oct4 and Nanog, and therefore were refractory to differentiation. Here, we uncovered that profound epigenetic alterations influenced mESC Tert-/- cell fate. In addition to global DNA demethylation, we found an increase in H3K27me3 throughout the genome. Furthermore, modulating the levels of H3K27me3 via small inhibitors of the PRC2 complex or by a genetic approach also altered the differentiation potential of stem cells. Following this study, we wanted to learn more about the signals linking telomere attrition and differentiation failure. When telomeres are very short, the DNA repair pathway recognizes them as a double-strand break. Among the actors in DNA repair, the p53 protein plays a central role in influencing cell fate. As an ideal candidate, we investigated whether p53 influenced the differentiation of Tert-/- mESCs using a genetic approach. We were surprised to find that the absence of p53 restored the differentiation potential of Tert-/- mESCs. Thus, for the first time, we have shown that telomere shortening can have a very global effect on stem cells. Our research will allow us to better understand specific problems, particularly in the field of aging.

Les télomères sont les extrémités des chromosomes et sont protégés par le complexe shelterin pour ne pas être reconnus comme des cassures accidentelles d'ADN double brin. Un enjeu majeur dans la recherche sur les télomères est de comprendre comment l'intégrité des extrémités des chromosomes au cours de l'oncogenèse est modifiée. La perte de répétitions télomériques à chaque division cellulaire peut être compensée par l’activité de l’enzyme télomérase qui ajoute "de novo" des motifs télomériques. Bien que la télomérase soit surexprimée dans la majorité des cellules cancéreuses, l’impact de modifications des protéines shelterin qui coiffent les télomères dans le processus oncogénique n'est pas clair. Dans la première étude, nous avons analysé l'état des télomères de patients atteints de la Leucémie Lymphoïde Chronique (LLC) uniquement au stade précoce de la LLC, stade A de Binet. La LLC est une leucémie commune aux pays occidentaux et se développe chez les personnes âgées. Nous avons montré que la majorité des patients atteints de la maladie présente des télomères dysfonctionnels. Les dommages télomériques ne corrèlent pas avec la longueur des télomères ou le statut mutationnel des patients, mais corrèlent avec la faible expression des protéines télomériques TIN2 et TPP1. Dans la seconde étude, nous avons montré que l'expression de l'oncogène H-RasV12 confère une résistance accrue vis-à-vis des télomères dysfonctionnels et aucun défaut de croissance n’est observable lorsque TRF2, une protéine télomérique est inhibée. Cet effet dépend de l'expression de l'interleukine 6 (IL-6), révélant un rôle inattendu de cette cytokine dans la fonction des télomères. De plus, la co-inhibition de TRF2 et IL-6 dans les cellules RasV12 conduit à blocage G2 / M associé à une séparation des chromatides sœurs. Ces résultats suggèrent que l'induction de la tumorigénicité par l’oncogène Ras protège les télomères contre les dommages et que la ségrégation des chromosomes est dépendante de TRF2 et IL-6. / Telomeres protect the chromosome extremities from being repaired and recognized as accidental DNA breaks double-strand. A major issue in telomere research is to understand how systems monitoring the integrity of chromosomes ends change during oncogenesis. Although telomerase overexpression occurs in the majority of cancer cells, whether other types of telomere changes play roles in the oncogenic process is unclear. In the first study, we analyzed the status of telomeres in patients with early stage Chronic Lymphocytic Leukemia (B-CLL), which is a common leukemia in Western countries that develops in the elderly. We showed that the majority of CLL patients exhibit telomeric dysfunction. It does not correlate with telomere length or mutation status of patients, but correlates with low expression of telomeric proteins TIN2 and TPP1. In the second study, we showed that expression of the H-RasV12 oncogene confers increased resistance to telomere uncapping and protects against to growth defects when TRF2, a telomeric protein, is depleted. This effect depends upon the expression of interleukin 6 (IL-6), revealing an unexpected role for this cytokine in telomere function. Notably, the co-inhibition of TRF2 and IL-6 in RasV12 cells led to G2/M block associated with an increased incidence of premature sister chromatid separation. These findings suggest that the induction of a tumorigenic state by oncogenic Ras protects against telomere damage and chromosome segregation defects in TRF2-compromised cells through an increase of IL-6 expression

La pathologie athéromateuse avec ses complications cardio-vasculaires reste aujourd’hui une des principales causes de mortalité dans les pays développés. Dans ce contexte, l’élaboration de nouveaux bio-marqueurs de la maladie athéromateuse occupe une place importante. Les objectifs de ces bio-marqueurs sont : de définir les populations les plus à risque de développer une complication cardio-vasculaire, de stratifier les groupes de patients de manière à optimiser leur prise en charge clinique et thérapeutique , de dévoiler de nouvelles cibles thérapeutiques dans le traitement de la pathologie. Dans ce contexte, nous avons ciblé trois bio-marqueurs d’intérêt à savoir la longueur des télomères leucocytaires (LTL) et le niveau d’expression leucocytaire des gènes c-Fos (impliqué dans les processus inflammatoires et oxydatifs) et OGG1 (nécessaire à la réparation des lésions oxydatives de l’ADN). Nous avons donc dans une première partie de ce travail voulu vérifier l’hypothèse selon laquelle la LTL pouvait être préservée par la prise régulière de statine, une thérapeutique ayant déjà démontré ses bienfaits en terme de prévention primaire et secondaire des maladies cardio-vasculaires. De plus, nous nous sommes intéressés aux possibles relations entre les niveaux d’expression des gènes c-Fos et OGG1 et la LTL. Nous nous sommes placés dans un contexte de patients à haut risque cardiovasculaire que représentent les patients en phase aigue de l’infarctus du myocarde (IDM). Ce travail a permis de montrer que la prise régulière de statine pouvait préserver la longueur des télomères leucocytaires et ce particulièrement chez les sujets les plus jeunes (moins de 64 ans), suggérant un nouvel effet « pléïotrope » des statines. Ce travail a également permis d’identifier les gènes c-Fos et OGG1 comme étant des acteurs potentiels du maintien de l’intégrité des télomères. La seconde partie de notre travail a porté sur une étude plus approfondie du niveau de transcription du gène c-Fos en relation avec l’un des principaux facteurs de risque de la maladie athéromateuse que représente le statut tabagique chez des patients présentant une maladie coronaire. Ce travail a permis de mettre en évidence pour la première fois une relation entre le niveau d’expression de c-Fos et le statut tabagique des sujets, suggérant que l’une des voies possibles de toxicité du tabac pourrait faire intervenir les voies de signalisations impliquant c-Fos. Ainsi, ce travail de thèse a permis de mettre en évidence trois bio-marqueurs intéressants dans le domaine de la pathologie athéromateuse : 1- La longueur des télomères leucocytaires qui peut être une des voies d’action bénéfique des statines en prévention précoce des maladies cardio-vasculaires, 2- Le niveau d’expression du gène OGG1 comme étant un des acteurs potentiels du maintien de l’intégrité des télomères, 3- Le niveau d’expression du gène c-Fos comme marqueur cumulatif d’exposition tabagique et potentiel acteur des effets délétères du tabac. Restent à préciser les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu et ainsi développer des stratégies thérapeutiques adéquates afin d’optimiser la prise en charge des patients souffrant de pathologies athéromateuses. / Atherosclerosis with cardiovascular complications remains today one of the leading causes of death in developed countries. In this context, development of new biomarkers of atherosclerosis has an important place. Objectives of these biomarkers are: • to identify populations most at risk of developing cardiovascular complications, • to stratify patient groups to optimize their clinical management and therapeutic, • to reveal new therapeutic targets in the treatment of the disease. In this context, we identified three biomarkers of interest, leukocyte telomere length (LTL) and level of expression of leukocyte genes c-Fos (involved in inflammatory processes and oxidative) and OGG1 (necessary repair of oxidative DNA damage). We therefore first part of this study wanted to test the hypothesis that LTL may be maintained by regular use of statin therapy which has already demonstrated its benefits in terms of primary and secondary prevention of cardiovascular disease. In addition, we examined the possible relationship between gene expression levels of c-Fos and OGG1 and LTL. We placed in the context of patients at high cardiovascular risk posed by patients in acute phase of myocardial infarction (MI). This work has shown that regular use of statins could preserve leukocyte telomere length and particularly among the younger subjects (under 64), suggesting a new effect "pleiotropic" statin. This work has also identified the genes c-Fos and OGG1 as potential actors for the maintenance of telomere integrity. The second part of our work focused on further study of the level of transcription of c-Fos in connection with one of the main risk factors for atherosclerosis posed by smoking status in patients with coronary artery disease. This work has to show for the first time a relationship between the expression level of c-Fos and smoking status of subjects, suggesting that one possible way of tobacco toxicity may involve the signaling pathways involving c-Fos. Thus, this thesis has highlighted three biomarkers of interest in the area of atherosclerotic disease: 1. Leukocyte telomere length may be one way of beneficial action of statins in early prevention of cardiovascular disease, 2. The level of OGG1 gene expression as a potential actor for maintained the integrity of telomeres, 3. The level of expression of the gene c-Fos as a marker of cumulative smoking exposure and potential actor of deleterious effects of tobacco. Remains to clarify the cellular and molecular mechanisms brought into play and thus develop appropriate therapeutic strategies to optimize the management of patients with atherosclerotic disease.

Face à la menace des pathogènes présents dans l’environnement, l’immunité représente une fonction cruciale pour la survie des organismes. Cependant, cette fonction représente divers coûts de développement et d’utilisation, et le caractère limité des ressources dans l’environnement impose des compromis d’allocation entre différentes fonctions (immunité, croissance, reproduction). Sur le long-terme, ces choix peuvent avoir de lourdes conséquences sur les probabilités de se reproduire et de survivre à chaque âge. L’objectif de cette thèse a été de décrire les variations avec l’âge du phénotype immunitaire d’un mammifère longévif, le chevreuil (Capreolus capreolus) et de mieux comprendre les compromis régissant l’allocation de ressources entre l’immunité et les autres grandes fonctions de l’organisme. Cette thèse a été menée au sein de deux populations naturelles, permettant de tester l’influence de conditions environnementales contrastées sur ces variations. Nous avons montré qu’une croissance rapide pendant les premiers mois de vie du chevreuil n’imposait pas de coûts en terme de développement du phénotype immunitaire sur la même période (niveaux des traits innés et acquis), ni sur le long-terme. Nous avons aussi montré que le développement de l’immunité des jeunes n’était pas dépendant de l’âge de leur mère, mais était fortement influencé par la condition corporelle de celle-ci. Chez les adultes, nous avons décrit les variations avec l’âge d’une dizaine de traits reflétant l’immunité innée et adaptative. Cela a permis de mettre en évidence de profondes modifications du profil immunitaire aux âges avancés, i.e. une augmentation de la production de marqueurs inflammatoires (haptoglobine, beta-globulines) et une diminution de la réponse adaptative (lymphocytes). L’augmentation parallèle avec l’âge de la charge parasitaire des individus appuie l’idée que le chevreuil est sujet à l’immunosenescence. Enfin, nous avons montré que la longueur des télomères leucocytaires varie avec l’âge. Nous n’avons pas trouvé d’associations entre la longueur des télomères et les proportions de chaque forme leucocytaire (neutrophiles, monocytes, lymphocytes). Cependant, nous avons montré que de forts niveaux de certains marqueurs inflammatoires (beta- et alpha1-globulines) semblent être associés à des télomères courts dans les cellules immunitaires. Ces résultats ouvrent de nombreuses pistes pour une meilleure compréhension des mécanismes physiologiques à la base du vieillissement / Immunity determines an organism’s sensitivity to pathogens and parasites and thus represent a crucial function that affects survival of individuals in the wild. However, this function represents several energy costs for development and use, and in natural conditions, resources are limited. Organisms consequently face energy allocation trade-offs between costly functions such as immunity, growth or reproduction. On the long term, these allocations are supposed to have serious consequences on probability of individuals to reproduce and to survive at each age.The aim of this thesis was to describe age-related variations of immune phenotype in a wild and long-lived mammal, the roe deer (Capreolus capreolus), and to provide a better understanding of energy trade-offs between immune function and other life-history traits. This thesis was conducted in roe deer of both sexes and from two natural populations, which allow to test the influence of sex and contrasting environmental conditions on these variations.We first described that rapid growth did not impair the development of young roe deer immune phenotype (levels of innate and adaptive traits), neither on the short-term (during growth), neither on the long-term (during adulthood). We also proved that immune development of juveniles was not dependent of maternal age, but was strongly influenced by maternal body condition. In adult roe deer, we have described the precise patterns of age-related changes in ten immune traits reflecting both innate and adaptive immunity. It revealed that roe deer are subjected to profound changes in their immune profile with increasing age, i.e. an increase in the production of inflammatory markers (haptoglobin, beta-globulin) and a decrease in the adaptive response (lymphocytes). In the same individuals, the parallel increase with age of parasite load supports the idea that deer are subject to immunosenescence. Finally, we described age-related changes in leukocyte telomere length. We found no associations between telomere length and proportions of each leukocyte form (neutrophils, monocytes, lymphocytes). However, we observed that high levels of some inflammatory markers (beta- and alpha1-globulin) tend to be associated with short telomeres in immune cells. These results open many avenues for a better understanding of the physiological mechanisms underlying aging

La protéine p53 est surtout étudiée pour sa capacité à empêcher la prolifération de cellules dont le génome est endommagé. Toutefois, en analysant les souris p53Δ31/Δ31 qui expriment une protéine p53 hyperactive, notre laboratoire a découvert un rôle inattendu de p53 dans la régulation du métabolisme des télomères. Ces souris modélisent la dyskératose congénitale (DC), un syndrome d’insuffisance médullaire héréditaire (SIMH) causé par un dysfonctionnement télomérique. Mon projet de thèse a combiné les analyses de modèles murins et de lignées cellulaires humaines afin d’approfondir l'étude de cette nouvelle fonction de p53 et de mieux comprendre le rôle de la voie p53 dans le développement des SIMH.En poursuivant notre analyse du modèle murin p53Δ31, nous avons montré que les cellules p53Δ31/Δ31 présentent une diminution d’expression de 12 gènes mutés dans l’anémie de Fanconi (AF), un autre SIMH étroitement lié à la DC. De plus, ces cellules montrent une capacité réduite à réparer les ponts inter-brins de l’ADN, une caractéristique typique de l’AF. Notre étude suggère que l’activation soutenue de p53 pourrait ainsi contribuer aux similitudes cliniques entre ces deux syndromes. Par ailleurs, nous avons identifié par quel mécanisme p53 régule négativement le métabolisme des télomères et la voie Fanconi de réparation de l’ADN. Ce mécanisme de régulation indirect, via p21 et E2F4, est très conservé entre la souris et l’Homme. De fait, les cellules p53Δ31/Δ31 constituent un outil puissant pour identifier de nouvelles cibles de p53 réprimées par ce mécanisme. Ainsi, elles nous ont permis de montrer que deux gènes essentiels pour la structure des centromères sont réprimés par p53.L’activation de p53 est clairement impliquée dans les étapes ultimes d’une insuffisance médullaire, mais le rôle d’une suractivation de p53 dans l’initiation d’un SIMH chez l'Homme reste, à ce jour, controversé. En effet, une mutation inactivatrice de la ribonucléase PARN a été trouvée chez des patients atteints de DC. Il a été proposé que cette protéine déstabilise l’ARNm de p53 tout en favorisant la maturation de l’ARN de la télomérase, si bien que les conséquences d’une inactivation de PARN restent mal comprises. Au cours de ma thèse, j'ai également étudié de nouveaux modèles murins et établi des modèles cellulaires humains pour déterminer l’implication d’une activation de p53 dans l’initiation d’un SIMH chez l’homme. Les résultats en cours, particulièrement prometteurs, devraient notamment déterminer l’impact d’une déficience en Parn sur la voie de régulation de p53.En conclusion, nous avons montré qu’une activation soutenue de p53 conduit à des phénotypes principalement associés aux SIMH. Par ailleurs, nous avons montré que p53 réprime de nombreux gènes impliqués dans la maintenance du génome, ce qui peut sembler surprenant au regard du concept de « gardien du génome » communément attribué à p53, et nous a amené à rediscuter ce concept. Ainsi, les résultats obtenus pendant ma thèse devraient permettre de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’insuffisance médullaire, la suppression tumorale et le vieillissement. / The p53 protein is mostly studied for its capacity to prevent the proliferation of cells with damaged genome. However, while studying p53Δ31/Δ31 mice that express a hyperactive p53 protein, our laboratory uncovered an unexpected role of p53 in the regulation of telomere metabolism. These mice model dyskeratosis congenita (DC), an inherited bone marrow failure syndrome (IBMFS) caused by defects in telomere maintenance. My PhD project combined analyses of mouse models and human cell lines to extend the study of this new function for p53 and to understand the role of the p53 pathway in the development of IBMFS.By extending our analysis of the p53Δ31 mouse model, we revealed that the p53Δ31/Δ31 cells exhibit decreased expression levels for 12 genes mutated in Fanconi anemia (FA), another IBMFS closely related to DC. Furthermore, these cells display a reduced capacity to repair DNA inter-strand crosslinks, a typical feature of FA cells. Our study suggests that a sustained activation of p53 might actually contribute to the clinical overlap between both syndromes. Importantly, we identified the mechanism used by p53 to downregulate telomere metabolism and the FA DNA repair pathway. This regulatory mechanism is indirect, via p21 and E2F4, and largely conserved between mice and humans. In fact, the p53Δ31/Δ31 cells constitute a powerful tool to find p53 target genes downregulated through this regulatory pathway. Accordingly, they were useful to show that two genes essential for centromere structure are also downregulated by p53.p53 activation is clearly involved in the final stages of bone marrow failure, but to-date, the role of p53 hyperactivation in the initiation of IBMFS remains controversial. Indeed, an inactivating mutation of the PARN gene, encoding a ribonuclease, was found in patients with DC. This protein was proposed to destabilize the p53 mRNA while promoting the maturation of the telomerase RNA, so that the consequences of PARN inactivation remain poorly understood. During my thesis, I also studied new mouse models and established human cellular models to determine the contribution of p53 activation in initiating IBMFS in humans. The current results, which are particularly promising, should notably determine the impact of Parn deficiency on the p53 regulatory pathway.In conclusion, we demonstrated that a sustained activation of p53 leads to phenotypes mainly associated with IBMFS. In addition, we showed that p53 suppresses many genes involved in genome maintenance, which may seem surprising in view of the concept of "guardian of the genome" commonly attributed to p53, leading us to revisit this concept. Hence, the results obtained during my thesis should help to better understand the mechanisms involved in bone marrow failure, tumor suppression and aging.

Les télomères sont des structures nucléoprotéiques particulières conférant une stabilité aux extrémités de chromosomes. La plupart des mécanismes télomériques sont conservée chez les eucaryotes supérieurs notamment chez l'homme. Parmi les fonctions exercées, les télomères développent des stratégies visant à limiter la recombinaison impropre aux télomères afin de préserver l'intégrité chromosomique. Au cours de ma thèse, j'ai étudié les mécanismes de maintenance et de protection des télomères chez l'homme, et plus particulièrement le rôle de la recombinaison homologue et recombinaison illégitime. Je me suis plus particulièrement intéressé au rôle de P53 dans le maintien des télomères, à travers sa fonction dans la recombinaison. Bien que son rôle soit établi dans la maintenance des télomères des cellules ALT, sa fonction est en revanche moins bien décrite dans les cellules présentant une activité télomérase. Dans cette perspective, nous avons établi des clones télomèrase (+) exprimant de manière stable le transgène P53R175H, décrit comme stimulant la RH. Cependant, la surexpression de P53R175H ne modifie pas le profil télomérique des ces cellules, se révélant ainsi incapable de stimuler la recombinaison télomérique. L'absence de phénotype pourrait être en fait la conséquence d'une interférence de la télomérase dans la mise en place d'un processus de recombinaison télomérique. Le deuxième volet de notre étude nous amené à préciser le rôle la recombinaison dans le maintien des télomères. Pour cela, nous avons construit des lignées isogéniques invalidées pour les deux voies majeures de la recombinaison grâce à une nouvelle famille de vecteurs ARNi basée sur des vecteurs EBV (brevet CEA N° 0501483) développé par Biard D. Ce système permet d'obtenir une réduction importante, spécifique et à long terme (plus de 300 jours en culture) de l'expression d'un gène cible. Plusieurs partenaires du NHEJ (DNA-PKcs, XRCC4, LigIV, Ku70), ou de la RH (RAD54, RAD51, RAD52) ou du complexe MRN ont été inhibés dans la lignée HeLa (adénocarcinome cervical). Dès les premiers jours d'invalidation du gène cible, des altérations de la stabilité des télomères sont constatées. Ces altérations se maintiennent au cours de la sélection (de 100 à 300 jours selon les clones). Ainsi, il semble que l'invalidation du NHEJ conduise à une instabilité télomérique associée à un raccourcissement de la taille des télomères dans le cas de XRCC4 et LigaseIVKD. Malgré une instabilité télomérique prononcée, les cellules RHKD se distinguent pourtant des clones NHEJKD par des altérations télomériques particulières. En effet, la dérégulation du RH mène à des signaux hétérogènes au sein du même bras chromosomique. En revanche, les anomalies dites de structure (perte associée à des cassures) sont plus abondantes dans les cellules déficientes pour le NHEJ. Ces résultats suggèrent que le NHEJ jouerait un rôle de protection alors que le RH serait plutôt impliqué dans l'élongation et la réplication des télomères. Cette étude s'est poursuit avec l'examen de clones MRE11KD, RAD50KD, NBS1KD permettant de clarifier dans un premier temps le rôle de du complexe dans les différentes voies de recombinaison puis sur la maintenance des télomères. A l'image des autres protéines de la recombinaison, RAD50 préserverait l'intégrité télomérique. L'invalidation des protéines NBS1 et MRE11 initie une élongation des télomères, probable manifestation de l‘activation de la recombinaison télomérique, absente des cellules RAD50KD. Ainsi, la présence de cercles télomériques extrachromosomiques dans le clone NBS1KD vient étayer cettehypothèse. Le complexe MRE11/RAD50/NBS1 constituerait alors un répresseur de la RH aux télomères.

Une question fondamentale de la biologie évolutive porte sur la compréhension des mécanismes sous-tendant les processus évolutifs et l'évolution des compromis entre les traits d'histoire de vie. Parmi ces mécanismes, les télomères suscitent un intérêt particulier. Les télomères sont localisés à l'extrémité des chromosomes eucaryotes et participent à la sénescence cellulaire et au vieillissement des individus. La longueur des télomères est susceptible de donner des indications sur le mode de vie et l'état physiologique des organismes. Le but de cette thèse a été de comprendre quels sont les facteurs déterminant la longueur des télomères et leur implication dans les compromis évolutifs, ceci en établissant : si la taille des télomères est-elle héritable? Le taux de perte des télomères est-il affecté par des facteurs environnementaux? Quel lien entre les télomères, la maintenance individuelle et la qualité des individus? Il résulte de ce travail que la longueur des télomères est partiellement déterminée par les facteurs génétiques, elle semble aussi influencée par les facteurs environnementaux. En effet, le coût de la reproduction, ainsi que la modification des trajectoires de croissance, ont des effets néfastes sur la longueur des télomères. L'effet de la manipulation expérimentale de l'activité télomérase indique un lien entre les télomères et la maintenance individuelle, suggérant que les télomères sont susceptibles de donner des indications sur la qualité des individus. Ce travail de thèse montre que la dynamique des télomères est un mécanisme sous-jacent des compromis évolutifs, et présente un intérêt considérable pour la compréhension des processus évolutifs.

Les cellules souches de gliomes (CSG), une sous-population de cellules tumorales, seraient en partie responsables de l’échec des traitements des gliomes de par leur résistance et leur capacité régénérative. Le mécanisme alternatif (ALT) de maintenance des télomères, basé sur la recombinaison homologue et non pas sur la télomérase, est détecté dans environ 30% des gliomes humains suggérant que des stratégies thérapeutiques spécifiquement dirigées contre ALT pourraient avoir un intérêt thérapeutique. Dans ce travail, nous avons poursuivi la caractérisation du premier exemple de CSG humaines ayant un phénotype ALT, les cellules TG20. Nous avons montré que malgré leur très fort taux de recombinaison, les télomères de ces cellules continuaient à assurer leur fonction de protection des chromosomes. Nous avons vérifié que les cellules TG20 conservaient leur capacité à générer des tumeurs intracérébrales après des transplantations sériées chez les souris immunodéprimées tout en gardant un phénotype ALT. Ces résultats confirment à la fois les propriétés de cellules souches cancéreuses des cellules TG20 et la capacité de ALT à assurer la maintenance des télomères nécessaire à l’autorenouvellement et au fort taux de prolifération des CSG in vivo. La greffe intracérébrale de cellules TG20 chez des souris immunodéprimées représente donc un bon modèle d’étude préclinique des gliomes ALT. Nous avons ainsi montré qu’un traitement précoce par un ligand des G-quadruplexes télomériques, 360B, juste après la greffe de cellules TG20, était capable d’inhiber le développement tumoral suggérant l’intérêt de l’utilisation de ligands des G-quadruplexes pour cibler spécifiquement les CSG ALT. Une étude des profils d'expression transcriptomique des cellules TG20 et de plusieurs lignées de CSG humaines exprimant la télomérase, nous a conduit à nous intéresser aux rôles de deux lysine acétyl transférases homologues, PCAF (P300/CBP Associated Factor) et GCN5 (General Control Nonderepressible 5) dans la régulation de la recombinaison télomérique des cellules ALT. Nous avons montré que les inhibitions de ces deux protéines ont des effets opposés sur le mécanisme ALT. Nous proposons qu’une balance d’expression de PCAF et GCN5 régule la maintenance des télomères dans les cellules ALT via le contrôle du turnover de TRF1 ce qui pourrait constituer la base d’une nouvelle stratégie thérapeutique vis-à-vis des gliomes ayant un phénotype ALT. / Glioma stem cells (GSC), a subpopulation of tumor cells, are partly responsible for the failure of treatment of gliomas because of their resistance and regenerative capacity. The mechanism of alternative lengthening of telomere (ALT), based on homologous recombination, is detected in approximately 30 % of human gliomas. Therefore, therapeutic strategies directed specifically against ALT may have a therapeutic value. In this work, we further characterized the first model of human ALT GSC, the TG20 cells. We showed that despite their very high rate of recombination, the telomeres were still capable of fulfilling their protective function of chromosomes. We verified that the TG20 cells retained their ability to generate intracerebral tumors after serial transplantations in immunocompromised mice, while preserving an ALT phenotype. These results confirm the cancer stem properties of TG20 cells and the ability of ALT to ensure telomeres maintenance, which is required for the self-renewal and the high proliferation rate of GSC in vivo. Intracerebral grafts of TG20 cells in immunocompromised mice represent thus a good preclinical model for studying ALT gliomas. We have shown that treatment with a ligand of telomeric G-quadruplexes, the 360B, at an early stage of TG20 tumor engraftment, was able to inhibit tumor growth, showing the interest of the use of G-quadruplex ligands to specifically target ALT GSC. Transcriptomic profiling of TG20 cells and several other GSC telomerase-positive lines, incited us to study the roles of two homologous lysine acetyl transferases, PCAF (p300/CBP Associated Factor) and GCN5 (General Control Nonderepressible 5), in the regulation of telomeric recombination in ALT cells. We showed that the inhibition of these two proteins has opposite effects on the ALT mechanism. We propose that a balance of expression of PCAF and GCN5 regulates the telomere maintenance in ALT cells by controlling the turnover of TRF1. This model could serve for the development of new therapeutic strategies targeting ALT gliomas.

Les télomères sont raccourcis à chaque cycle de réplication de l’ADN à cause du problème de réplication des extrémités. Leur longueur dicte la capacité proliférative des cellules eucaryotes. Des télomères trop courts, aillant atteints la limite de Hayflick, feront entrer les cellules en sénescence réplicative. Pourtant dans les cellules progénitrices ainsi que 90% des cellules cancéreuses la longueur des télomères est maintenue par un complexe ribonucléoprotéique, la télomérase. L’assemblage de ce complexe ainsi que son recrutement aux télomères son des processus dynamiques sous le contrôle d’une régulation fine. Toutefois, comment cette régulation à un impact sur la dynamique de la télomérase dans le noyau n’est toujours pas complétement compris. Dans ce projet nous avons développé une nouvelle méthode se basant sur le système MS2 permettant d’observer pour la première des particules uniques d’ARN de télomérase (hTR) par microscopie à fluorescence sur cellules cancéreuse humaines vivantes. Le suivi en temps réel de ces particules aux télomères a permis de révéler que la télomérase scanne activement les télomères via des interactions courtes avec la protéine télomérique TPP1. Des interactions plus stables nécessaires à l’allongement des télomères peuvent être formées grâce à l’appariement entre hTR et l’ADN simple brin du télomère sous contrôle du domaine OB-fold de la protéine télomérique POT1. Le suivi de ces particules au cours du cycle cellulaire a révélé que ces interactions ne sont pas restreintes à la phase S, la phase d’élongation des télomères. La mesure de la dynamique de hTR dans les corps de Cajal (CBs) couplé à des expériences de photo-activation ont pu montrer que hTERT joue un rôle dans la sortie de hTR des CBs. Enfin des mesures d’intensités de fluorescence de hTR aux télomères montrent qu’une seule particule est recruté sur un télomère en phase S. / Telomeres are shortened at each DNA replication cycle, due to the end replication problem. Their length dictates the proliferative capacity of eukaryotic cells. Too short telomeres, reaching the Hayflick limit, will lead the cells to replicative senescence. However, in stem cells and 90% of cancer cells telomere length is maintained by a ribonucleoproteic complex named telomerase. The assembly of this complex and its recruitment to telomeres are process under a fine regulation. Yet, how this regulation impacts the nuclear dynamics of telomerase is not fully understood. In this project, we developed a new method based on the MS2 system to image for the first time telomerase RNA (hTR) particles in living human cancer cells by fluorescence microscopy. The real time tracking of these particles at telomeres revealed that telomerase actively scan all telomeres by short interactions with the TPP1 shelterin protein. Long stable interaction needed for telomere elongation can be made by the pairing of hTR template and single stranded telomeric DNA under the control of the OB-fold domains of the shelterin protein POT1. By tracking telomerase particle during the cell cycle, we revealed that telomerase recruitment to telomeres is not restricted to S phase, when telomeres are elongated. By measuring the dynamics of hTR in Cajal bodies (CBs) with photo-activation and photo-bleaching technics we showed that hTERT play a role in the hTR exit from CBS. Finally, fluorescence intensity measures of hTR at telomeres showed the recruitment of only one particle on a telomere.

La mastocytose se définit par une accumulation excessive de mastocytes dans un ou plusieurs organes ou tissus. Si dans la plupart des cas la maladie ne diminue pas l’espérance de vie, elle reste néanmoins associée à un handicap souvent mal connu et mal compris. Malgré l’importance des manifestations neuropsychiatriques accompagnant la mastocytose, les efforts concentrés sur leur compréhenson et celle de leurs liens avec la maladie ont été longtemps mis au second plan. L’objectif de cette thèse était de mieux connaître ces troubles neuropsychologiques, notamment la dépression et les troubles de l’attention/ mémoire, d’investiguer les liens entre ces troubles et des aspects biologiques et émotionnels comme l’effet d’un inhibiteur de tyrosine kinase bloquant les mastocytes sur la dépression ; les liens entre le stress perçu, la dépression et la longueur des télomères ; et les liens entre dépression et compétences de régulation émotionnelle. Nos résultats montrent que la dépression est un symptôme fréquent dans la mastocytose, ainsi que les troubles de la mémoire. Ces derniers ne semblent pas liés à la dépression. Par ailleurs, la dépression est améliorée par un traitement visant les mastocytes ; le stress perçu chez ces patients est lié à la longueur des télomères et le métaolisme du tryptophane, en particulier l’activité de l’IDO est associée aux troubles neuropsychologiques chez ces patiens. Ces résultats ouvrent des nouvelles perspectives dans la compréhension des symptômes psychologiques associés à la mastocytose. / Mastocytosis is defined as an excessive accumulation of mast cells in one or more organs or tissues. While in most cases the disease does not reduce life expectancy, it is associated with a disability often poorly known and poorly understood relate to the symptoms due to the release of mast cell mediators. Despite the importance of these neuropsychiatric manifestations, efforts focused on their understanding and their relationship to the disease has been put into the background. The aim of this thesis was to better know these neuropsychological disorders present in mastocytosis, including depression and attention deficit disorder and to investigate the relationship between these disorders and biological and emotional aspects as effect of an inhibitor of tyrosine kinase locking mast cells, the relationship between perceived stress, depression, and telomere length, and the links between depression and emotional regulation skills. Our results show that depression and memory disorders are common symptoms in mastocytosis. Attention impairment do not seem related to depression. Furthermore, depression is improved by masitinib treatment. Perceived stress in these patients is related to telomere length and tryptophan metabolism; in particular the activity of IDO is associated with neuropsychological disorders. These results open new perspectives in understanding the psychological symptoms associated with mastocytosis.