Neuropilin-2 (NRP2) is a single transmembrane receptor and was first found in the nervous system to play a role in axon guidance. Interestingly, NRP2 was also found on many tumor cells and various studies showed that NRP2 is associated with a poor prognosis in different cancers and is involved in migration and therapy resistance. We investigated the prognostic potential of NRP2 in the pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) and found out that in contrast to other kinds of cancer a high expression of NRP2 is associated with a longer cancer specific survival. We hypothesized that this effect could be either triggered through an expression of different interaction partners of NRP2. Both semaphorine 3F and VEGFs can bind to NRP2 but have different effects on cancer cells. Semaphorine 3F was found to have a great potential as a cancer inhibitor in pancreatic cancer whereas VEGFs are often associated with a worse prognosis. Both compete for the binding to NRP2. Furthermore, we found high expression of NRP2 in tumor-associated macrophages (TAMs) in PDACs. Until now, NRP2 expression and function is poorly analyzed in the immune system. Therefore, we next focused on the investigation of NRP2 in the immune system during cancer progression. We used LysM:cre-NRP2LoxP/LoxP (conditional knock-out of NRP2 in macrophages) and Vav:cre-NRP2LoxP/LoxP (conditional knock-out in all immune cells) for our experiments. We showed that NRP2 is upregulated during the differentiation/maturation of macrophages. Next, we injected LLC cells subcutaneously to analyze the effect of NRP2 knock-out in macrophages (LysM:cre) or in the all immune cells (Vav:cre). No difference was detected in tumor size, but the vascularization was impaired in both mouse models. Different tumor models with extended tumor growth times and metastasis should be performed next to proof the importance of NRP2 in immune cells during tumor progression. Due to the broad expression of NRP2 in the immune system we used the Vav:cre-NRP2LoxP/LoxP mouse to investigate the role of NRP2 during an immune response. We used a mild allergic inflammation model of the lung and analyzed the different immune cell populations. Interestingly, T cells and eosinophils were reduced during the inflammation indicating, that the conditional knock-out of NRP2 is inhibiting the immune response. We further analyzed the role of NRP2 in T cells and found out, that the expression of NRP2 is very different in the various T cell populations. CD8+ T cells express ca. 10 times as much mRNA for NRP2 compared to CD4+ T cells. Also, the CD4 subpopulation showed a diverse expression of NRP2. Th2 and Th17 express a lot of NRP2 and Treg and Th1 very low levels. These results suggest an important role of NRP2 in certain cells. The knock-out of NRP2 in Th2 cells leads to an upregulation of IL-13, IL-5 and IL10. We first showed the importance of NRP2 during an immune response and found interesting regulations in immune cell populations and important cytokines. More work needs to be done to understand the functions of NRP2 during an immune response.

Die „donor lymphocyte infusion“ (DLI) stellt eine wirksame Therapieoption für ein Rezidiv bei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) nach allogener Stammzelltransplantation (SZT) dar. Jedoch ist die DLI oft mit einer „graft-versus-host disease” (GvHD) assoziiert, die auf einer proinflammatorischen, gegen den Empfänger gerichteten T-Zell-vermittelten Immunantwort beruht. Eine Strategie, den „graft-versus-leukemia” (GvL)-Effekt zu steigern und dabei das Risiko einer GvHD zu mindern, besteht in dem adoptiven Transfer hoch-avider CD8+ T-Zell-Klone, welche selektiv AML-assoziierte Antigene erkennen. Daher bestand das Ziel dieser Arbeit darin, eine neue Strategie zur Generierung hoch-avider CD8+ T-Zell-Klone, welche die Leukämie-assoziierten Antigene (LAAs) Wilms‘-Tumor-Antigen 1 (WT1), Proteinase 3 (PR3), Nucleophosmin 1 (NPM1) und Survivin als attraktive Ziele für spezifische Immuntherapien erkennen, zu entwickeln. Zunächst wurden mithilfe der innovativen Streptamer-Technologie die Frequenzen von CD8+ T-Zellen mit Reaktivität gegen WT1, PR3, NPM1 und Survivin im peripheren Blut von 10 gesunden HLA-A*02:01+ Spendern analysiert. Auf diese Weise konnten jedoch nur sehr geringe bis keine detektierbaren Frequenzen LAA-spezifischer CD8+ T-Lymphozyten nachgewiesen werden. Diese Beobachtungen führten zu dem Schluss, dass AML-Peptid-spezifische CD8+ T-Zellen im Gegensatz zu Virus-spezifischen T-Zellen aufgrund deutlich geringerer Frequenzen nicht direkt aus dem peripheren Blut isoliert werden können. Daher erfolgte die in vitro-Expansion der CD8+ T-Zellen mithilfe von autologen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (MoDCs). DCs sind als professionelle Antigen-präsentierende Zellen in der Lage, Effektorzellen des adaptiven Immunsystems zu stimulieren sowie deren Expansion zu induzieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein geeignetes Protokoll für die Generierung von Fast-MoDCs etabliert. Diese zeichneten sich durch die ausgeprägte Expression kostimulatorischer und Antigen-präsentierender Moleküle, die Sekretion großer Mengen des proinflammatorischen Zytokins IL-12 sowie ein effizientes stimulatorisches Potenzial gegenüber CD4+ T-Zellen aus. Erneute Frequenzanalysen nach zweimaliger in vitro-Stimulation mit Peptid-beladenen Fast-MoDCs mittels ELISpot ergaben einen Anstieg der Frequenzen AML-Peptid-spezifischer CD8+ T-Zellen, insbesondere von WT1126-spezifischen CD8+ T-Zellen. Daraufhin erfolgte die Anreicherung der stimulierten CD8+ T-Zellen mit Spezifität für die vier untersuchten LAAs WT1, PR3, NPM1 und Survivin mittels Streptamer-Technologie. Dabei erzielte die Anreicherung WT1126-spezifischer CD8+ T-Lymphozyten deutlich höhere Reinheiten als die von CD8+ T-Zellen mit Reaktivität gegen die Peptide PR1169, NPM1283,mut A/D und Survivin95. Aus diesem Grund wurden die weiteren Untersuchungen auf WT1126 als das bisher vielversprechendste der untersuchten Peptide begrenzt. CD8+ T-Zellen von drei gesunden Spendern wurden mit bestrahlten T2-Zellen und Fast-MoDCs, welche mit dem HLA-A*02:01-restringierten Peptid WT1126 beladen waren, stimuliert. Anschließend erfolgte die Anreicherung WT1126-spezifischer CD8+ T-Zellen mittels Streptamer-Technologie. Bereits nach einmaliger Stimulation kam es zu einer deutlichen Anreicherung WT1126-spezifischer CD8+ T-Zellen, welche effektiv in der Lage waren, Peptid-beladene Zielzellen zu lysieren. Jedoch konnte nach zweimaliger Stimulation nochmals eine deutliche Steigerung in Reinheit und Ausbeute erzielt werden. Die angereicherten Zellen wurden als Effektor-Gedächtnis-T-Zellen charakterisiert. Ausgehend von den Streptamer-isolierten CD8+ T-Zellen eines Spenders erfolgte die Generierung WT1126-spezifischer CD8+ T-Zell-Klone. Im Rahmen der Klonierung wurden 32 WT1126-spezifische CD8+ T-Zell-Klone generiert. Drei vielversprechende Klone wurden genauer hinsichtlich ihrer funktionellen Eigenschaften charakterisiert. Diese exprimierten hoch-avide T-Zell-Rezeptoren und zeigten einen heterogenen Phänotyp von zentralen Gedächtnis-T-Zellen hin zu terminal differenzierten Effektor-Gedächtnis-T-Zellen. Zudem führten sie zu einer effizienten Lyse der HLA-A*02:01+ und WT1+ Zelllinien T2 und SET-2. Darüber hinaus wurde demonstriert, dass die untersuchten Klone auch HLA-A*02:01- und WT1-exprimierende primäre Blasten von AML-Patienten effektiv lysieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Streptamer-basierte Anreicherung stimulierter Tumorpeptid-spezifischer CD8+ T-Zellen vor anschließender Klonierung eine geeignete Strategie für die Generierung hoch-avider CD8+ T-Zell-Klone mit anti-tumoraler Aktivität darstellt. So generierte CD8+ T-Zell-Klone mit Reaktivität gegen AML-assoziierte Antigene können für die Entwicklung neuer immuntherapeutischer Strategien zur Therapie eines Rezidivs bei AML-Patienten nach allogener SZT verwendet werden.

Die Funktionalität von T-Zellen wird von ihrem Differenzierungsgrad beeinflusst, sodass das Ausmaß der Differenzierung von T-Zellen und deren Verteilung auf verschiedene Differenzierungsstadien als Parameter für die T-Zell-Funktionalität gesehen werden kann. Hochdifferenzierte, seneszente T-Zellen werden beispielsweise als eine mögliche Ursache häufig auftretender Tumorerkrankungen im Alter vermutet. Weiterhin wurden in der Literatur Auswirkungen durch das Geschlecht und den Raucherstatus auf das adaptive Immunsystem beschrieben. Eine chronische Tabakrauchexposition könnte in Folge einer chronischen Inflammation und damit andauernden Aktivierung des adaptiven Immunsystems zu einem höheren Differenzierungsgrad von T-Zellen im Sinne eines vorzeitigen Alterungsprozesses führen. Tumorerkrankungen als Folge einer gescheiterten T-Zell-Antwort mit verminderter T- Zell-Funktionalität könnte unter anderem ein höherer Differenzierungsgrad von T-Zellen zugrunde liegen. Auch die T-Zell-Erschöpfung, also die gesteigerte Expression negativer Immuncheckpoints auf T-Zellen, stellt neben der Seneszenz einen für die Tumorgenese relevanten Mechanismus dar. Durch die therapeutische Gabe von Immuncheckpointinhibitoren kann dieser verringert oder unterbunden werden und im Rahmen dieser, die Funktionalität von T-Zellen positiv beeinflussenden, Therapieoption könnte sich auch der Differenzierungsgrad von T-Zellen verändern. Mit der fortschreitenden Differenzierung von T-Zellen gehen Veränderungen von Oberflächenmolekülen einher, sodass durch deren Analyse Rückschlüsse auf den Differenzierungsgrad von T-Zellen und damit deren Funktionalität gezogen werden können. In der Literatur wurden diesbezüglich Oberflächenmoleküle wie CD45RA und CD197 auf T-Zellen beschrieben, anhand derer eine Einteilung in verschiedene Differenzierungsstadien erfolgen kann. Darüber hinaus wurde insbesondere die verminderte Expression von CD28 und CD27 sowie die Reexpression von CD45RA mit fortgeschrittener T-Zell-Differenzierung assoziiert, wobei letztere mit einer veränderten T-Zell-Funktion im Sinne einer verminderten Proliferationskapazität sowie gesteigerten Zytotoxizität einhergeht. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss der Parameter Alter, Geschlecht und Raucherstatus sowie den Einfluss eines vorliegenden Nicht-Kleinzelligen Bronchialkarzinoms (NSCLC) und der Therapie mit gegen Programmed Cell Death Protein 1 (PD-1) und Programmed Death Ligand (PD-L1) gerichteten Immuncheckpointinhibitoren auf den Differenzierungsstatus von T-Zellen zu untersuchen. Dafür wurde zunächst eine durchflusszytometrische Methode zur quantitativen Analyse von T-Lymphozyten etabliert. Sie wurden einerseits anhand ihres Differenzierungsstadiums analysiert, wobei dieses durch die Expression von CD45RA und CD197 definiert wurde und eine Einteilung in naive Zellen (CD45RA+CD197+), Zentrale T-Gedächtniszellen (ZM-Zellen, CD45RA-CD197+), Effektor-T-Gedächtnis-Zellen (EM-Zellen, CD45RA-CD197-) und CD45RA re- exprimierende Effektor-T-Gedächtniszellen (TEMRA-Zellen, CD45RA+CD197-) erfolgte. Weiterhin wurden die T-Lymphozyten anhand der Ausprägungen der Expression von CD27 und CD28 in CD27+CD28+, CD27-CD28-, CD27+CD28- und CD27-CD28+ unterteilt. Drittens wurde darüber hinaus die Verteilung der anhand von CD27 und CD28 definierten Subpopulationen innerhalb der vier anhand von Cd45RA und CD197 definierten Differenzierungsstadien untersucht. Für die Untersuchung der T-Zellen gesunder Personen wurden venöse Blutproben von 35 gesunden Personen verwendet. Dabei wurden sowohl bezüglich der Verteilung auf naive, ZM-, EM- und TEMRA-Zellen als auch bezüglich der Expression von CD27 und CD28 durch T-Zellen allgemein sowie innerhalb der Differenzierungsstadien Hinweise auf eine weiter fortgeschrittene Differenzierung bei CD8+ T-Zellen im Vergleich zu CD4+ T-Zellen beobachtet. Um den Einfluss von Alter, Geschlecht und Raucherstatus auf die Differenzierung von T-Zellen zu untersuchen, wurden die gesunden Probandinnen und Probanden jeweils in zwei Gruppen unterteilt und diese miteinander verglichen: jünger (n = 19) vs. älter (n = 16), männlich (n = 19) vs. weiblich (n = 16) und rauchend (n = 12) vs. nicht rauchend (n = 13). Dabei lag das mediane Alter der jüngeren Personen bei 23 Jahren und das der älteren Probandinnen und Probanden bei 68 Jahren. Bei der Untersuchung altersabhängiger Unterschiede in der Verteilung von T-Zellen auf die anhand von CD45RA, CD197, CD27 und CD28 definierten Populationen wurde eine mit dem Alter fortschreitende Differenzierung und Seneszenz von T-Zellen beobachtet. Diese äußerte sich einerseits in einem signifikanten Abfall naiver CD8+ T-Zellen und signifikanten Anstieg von CD8+ TEMRA-Zellen. Andererseits wurde eine verminderte Expression von CD27 und CD28 auf CD8+ T-Zellen beobachtet und jüngere Personen wiesen sowohl signifikant mehr CD27+CD28+ T-Zellen als auch signifikant weniger CD27-CD28- T-Zellen auf. Innerhalb CD4+ T-Zellen wurden dieselben Unterschiede beobachtet, erreichten jedoch mit Ausnahme zweier signifikanter negativer Korrelationen zwischen der Zahl zirkulierender CD4+ naiver sowie CD27+CD28+ Zellen und dem Alter keine statistische Signifikanz. Auch innerhalb der CD8+ naiven T-Zellen sank die Expression von CD27 und CD28 altersabhängig und die Zellzahl CD27+CD28+ und CD27+CD28- naiver Zellen war bei den jüngeren Personen signifikant höher als in der Gruppe älterer. Weiterhin wiesen diese beiden Subpopulationen innerhalb CD4+ und CD8+ naiver T-Zellen sowie CD4+ TEMRA-Zellen eine signifikante negative Korrelation mit dem Alter auf. Bei der Untersuchung der Differenzierungsmuster von T-Lymphozyten auf geschlechtsabhängige Unterschiede konnte hingegen kein Einfluss durch das Geschlecht beobachtet werden. Weiterhin wurde ein Einfluss des Raucherstatus untersucht. Dabei wurden Unterschiede zwischen rauchenden und nicht rauchenden Personen beobachtet sowie nicht-signifikante Trends im Rahmen der Gruppenvergleiche, welche einen Hinweis auf eine fortgeschrittene Differenzierung von T- Zellen im Blut von rauchenden Personen darstellen könnten. Darüber hinaus wurde eine signifikante negative Korrelation zwischen der Zellzahl CD8+ naiver Zellen mit der kumulativen inhalierten Rauchdosis beobachtet. Diese auch altersabhängig beobachtete Veränderung deutet auf eine höhere Differenzierung von T-Zellen bei Raucherinnen und Rauchern hin. Neben gesunden Probandinnen und Probanden wurden auch elf NSCLC-Patientinnen und - Patienten in die Untersuchungen eingeschlossen. Auch die CD4+ T-Zellen von NSCLC- Patientinnen und Patienten wiesen wie die CD4+ T-Zellen der gesunden Probandinnen und Probanden einen weniger seneszenten Phänotyp auf als CD8+ T-Zellen. Weiterhin wurde ein Vergleich des untersuchten T-Zell-Phänotyps zwischen gesunden und erkrankten Personen durchgeführt, wobei als Unterschied eine bei den erkrankten Personen gegenüber älteren gesunden Personen signifikant geringere Lymphozytenzahl sowie nicht-signifikant verminderte Zahl zirkulierender T-Zellen auffiel. Insgesamt konnten darüber hinaus bei dem Vergleich des Differenzierungsgrades von T-Zellen kleine Unterschiede festgestellt werden, wie eine signifikant kleinere Zahl CD8+ CD27-CD28+ TEMRA-Zellen bei den Patientinnen und Patienten im Vergleich zu der gesunden Vergleichsgruppe mit älteren Personen. Limitierend ist dabei die im Vergleich zu durchgeführten Untersuchungen in der Literatur geringe Stichprobengröße, die die Beurteilung von zentralen Tendenzen erschwert. Im letzten Schritt wurden die T-Zell-Populationen im Verlauf der antitumorösen Therapie mit Immuncheckpointinhibitoren untersucht, wobei signifikante negative Korrelationen zwischen der Zellzahl CD4+ CD27+CD28+ ZM-Zellen sowie CD4+ CD27-CD28+ EM-Zellen und dem Therapietag ermittelt wurden. Diese könnte einerseits durch allgemein abnehmende Zellzahlen im Rahmen der Therapie erklärt werden sowie andererseits im Zusammenhang mit einer gesteigerten T-Zell-Aktivierung im Rahmen einer Therapie mit Immuncheckpointinhibitoren stehen. Zusammenfassend konnte somit im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein Assay zur Untersuchung des Differenzierungsmusters von T-Zellen anhand der Oberflächenmoleküle CD45RA, CD197, CD27 und CD28 erarbeitet und etabliert werden. Es wurden starke Hinweise auf einen Einfluss des Alterns im Sinne einer altersabhängig zunehmenden Differenzierung von T-Zellen beobachtet sowie diskretere Hinweise auf einen Einfluss durch chronische Tabakrauchexposition, das Vorliegen eines NSCLC und die Therapie mit Immuncheckpointinhibitoren. Ein geschlechtsspezifischer Einfluss wurde hingegen nicht beobachtet. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigen damit einerseits den aktuellen Kenntnisstand insbesondere in Bezug auf den Einfluss des Alterns auf T-Zellen. Die bezüglich der anderen untersuchten Parameter gewonnen Erkenntnisse wurden hingegen in der Literatur noch nicht beschrieben. Als limitierend ist die begrenzte Stichprobengröße einzuordnen. Perspektivisch können die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit durch eine Untersuchung mit mehr eingeschlossenen Personen validiert werden. Darüber hinaus können Untersuchungen der T-Zellen von Personen mit anderen Tumorerkrankungen mithilfe des in der vorliegenden Arbeit erarbeiteten Assays durchgeführt werden. Auch funktionelle Untersuchungen beispielsweise der Zytotoxizität und Proliferationskapazität von T-Zellen in Abhängigkeit des untersuchten Expressionsmusters würden eine neue Perspektive eröffnen.:Abkürzungsverzeichnis 1 Einführung 1.1 Grundlagen des menschlichen Immunsystems 1.2 Grundlagen der Funktionsweise der Aktivierung und Differenzierung von T-Zellen 1.3 Immunphänotypische Quantifizierung der T-Zell-Differenzierung 1.4 Alter, Raucherstatus und Geschlecht als Einflussfaktoren auf die T-Zell-Differenzierung 1.5 T-Zellen in der Prävention von Tumoren und Immuncheckpointinhibitoren als T-Zell-basierte Tumortherapie 2 Aufgabenstellung 3 Probandinnen und Probanden, Material und Methoden 3.1 Charakterisierung der untersuchten Personen bezüglich Alter, Geschlecht und Raucherstatus 3.2 Material und Methoden 3.2.1 Blutentnahme und durchflusszytometrische Immunphänotypisierung 3.2.2 Graphische Auswertung der durchflusszytometrisch gewonnenen Daten 3.2.3 Statistische Auswertung 4 Ergebnisse 4.1 Unter CD8+ T-Zellen ist die Seneszenz stärker ausgeprägt als unter CD4+ T-Zellen 4.1.1 Seneszente Differenzierungsstadien sind innerhalb CD8+ T-Zellen größer als innerhalb CD4+ T-Zellen 4.1.2 Der Verlust von CD27 und CD28 ist unter CD8+ T-Zellen im Vergleich zu CD4+ T-Zellen stärker ausgeprägt 4.1.3 Der Verlust von CD27 und CD28 durch EM- und TEMRA-Zellen ist bei CD8+ T-Zellen ausgeprägter als bei CD4+ T-Zellen 4.2 Die T-Zell-Seneszenz steigt altersabhängig und die Veränderungen sind unter CD8+ T-Zellen ausgeprägter als unter CD4+ T-Zellen 4.3 Das Geschlecht beeinflusst die T-Zell-Seneszenz nicht und T-Zellen von rauchenden Personen weisen verstärkte Zeichen der Seneszenz auf 4.4 Die Zahl zirkulierender Lymphozyten ist bei NSCLC-Erkrankten vermindert und T-Zellen NSCLC-Erkrankter weisen diskrete Zeichen verstärkter Seneszenz auf 4.5 Zusammenfassung der Ergebnisse 5 Diskussion 5.1 Diskussion der Methoden 5.1.1 Die Durchflusszytometrie stellt eine gut etablierte und geeignete Untersuchungsmethode dar 5.1.2 Die Verwendung von Vollblut ermöglicht eine exakte Untersuchung von T-Zell-Populationen in vivo 5.2 Diskussion der Ergebnisse 5.2.1 Unter CD8+ T-Zellen ist die Seneszenz stärker ausgeprägt als unter CD4+ T-Zellen 5.2.2 Die T-Zell-Seneszenz steigt altersabhängig und die Veränderungen sind unter CD8+ T-Zellen ausgeprägter als unter CD4+ T-Zellen 5.2.3 Das Geschlecht beeinflusst die T-Zell-Seneszenz nicht und T-Zellen von rauchenden Personen weisen verstärkte Zeichen der Seneszenz auf 5.2.4 Die Zahl zirkulierender Lymphozyten ist bei NSCLC-Erkrankten vermindert und T-Zellen NSCLC-Erkrankter weisen diskrete Zeichen verstärkter Seneszenz auf 6 Zusammenfassung der Arbeit Literaturverzeichnis Selbstständigkeitserklärung Lebenslauf Verzeichnis der wissenschaftlichen Präsentationen Danksagung

Background Previously, we identified a major myeloid-derived proinflammatory subpopulation of human blood dendritic cells which we termed slanDCs (e.g. Schäkel et al. (2006) Immunity 24, 767–777). The slan epitope is an O-linked sugar modification (6-sulfo LacNAc, slan) of P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1). As slanDCs can induce neoantigen-specific CD4+ T cells and tumor-reactive CD8+ cytotoxic T cells, they appear as promising targets for an in vivo delivery of antigens for vaccination. However, tools for delivery of antigens to slanDCs were not available until now. Moreover, it is unknown whether or not antigens delivered via the slan epitope can be taken up, properly processed and presented by slanDCs to T cells. Methodology/Principal Findings Single chain fragment variables were prepared from presently available decavalent monoclonal anti-slan IgM antibodies but failed to bind to slanDCs. Therefore, a novel multivalent anti-slanDC scaffold was developed which consists of two components: (i) a single chain bispecific recombinant diabody (scBsDb) that is directed on the one hand to the slan epitope and on the other hand to a novel peptide epitope tag, and (ii) modular (antigen-containing) linker peptides that are flanked at both their termini with at least one peptide epitope tag. Delivery of a Tetanus Toxin-derived antigen to slanDCs via such a scBsDb/antigen scaffold allowed us to recall autologous Tetanus-specific memory T cells. Conclusions/Significance In summary our data show that (i) the slan epitope can be used for delivery of antigens to this class of human-specific DCs, and (ii) antigens bound to the slan epitope can be taken up by slanDCs, processed and presented to T cells. Consequently, our novel modular scaffold system may be useful for the development of human vaccines.

Immunologische Toleranz ist eine elementare Eigenschaft des Immunsystems, die primär durch die klonale Deletion autoreaktiver T-Zellen im Thymus gewährleistet wird. Neben diesem als zentrale Toleranz bezeichneten Mechanismus, verfügt ein Organismus gleichzeitig über periphere Toleranzmechanismen wie Ignoranz, Anergie und regulatorische T-Zellen. Trotz dieser Kontrollmechanismen können in bestimmten Situationen autoreaktive CD4+ und CD8+ T-Zellen aktiviert werden und meistens zu örtlich und zeitlich begrenzten Autoimmunreaktionen führen. Ursache hierfür kann die hormonelle Regulation oder das gewebespezifische Vorkommen eines Selbsttantigens sein. Am Beispiel von HSP60-kreuzreaktiven CD8+ T-Zellen konnte gezeigt werden, dass der Transfer dieser T-Zellen in Tiere zu einer Entzündung des Dünndarms aber nicht des Dickdarms führt, obwohl das Selbstantigen im letzteren wesentlich stärker exprimiert wird. Die Gewebespezifität der Autoimmunpathologie konnte durch die in den Organen unterschiedliche, proteasomale Antigenprozessierung, erklärt werden. Proteinbiochemische und immunologische Analysen ergaben, dass sich die 20S Proteasomen verschiedener Organe strukturell und funktionell deutlich unterscheiden und somit jedes Gewebe ein individuelles Repertoire von MHC-Klasse I restringierten Peptiden präsentiert. Damit wurde ein weiterer Mechanismus entdeckt, durch den Reaktivität von protektiven und pathologischen CD8+ T-Zellen kontrolliert wird. / Immunological tolerance which is primarily mediated by the clonal deletion of autoreactive T cells in the thymus is a key feature of the immune system. Besides this central tolerance, several mechanisms act also in the periphery including ignorance, anergy and regulatory T cells. Despite all these checkpoints, autoreactive CD4+ and CD8+ T cells may still be activated causing local and time restricted autoimmune-reactions. This may refer primarily to self-antigens which are hormonally regulated or tissue-specifically expressed. Adoptive transfer of crossreactive, hsp60-specific CD8+ T cells into mice induced an local inflammation of the small intestine but not the colon despite elevated expression of hsp60 in the latter organ. The pathology could be explained by the finding that the proteasomal antigen processing varies between different organs. Biochemical and immunological analyses revealed that 20S proteasomes of different organs vary in their structural and functional properties indicating that every tissue displays an individual and distinct repertoire of MHC class I peptides. This represents a new mechanism by which the activity of protective and pathological CD8+ T cell responses may be controlled.

Charakterisierung des Zytokinprofils in Erwachsenen mit einer latenten oder aktiven Tuberkulose in einem hoch endemischen Gebiet Die Tuberkulose (TB) stellt mit rund 2 Milliarden Infizierten weltweit ein globales gesundheitliches Problem dar. Während die große Mehrheit der infizierten Personen in der Lage sind die Krankheit zu kontrollieren, entwickelt sich bei ungefähr 10 % die aktive Form der TB aus. Der zugrunde liegende immunologische Prozess für diese Verteilung ist bis heute nicht bekannt und im Fokus dieser Arbeit. Das adaptive Immunsystem spielt eine entscheidende Rolle in der Immunabwehr gegen Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), dem Erreger der TB. Hierbei sind besonders CD4+ T-Zellen für die erfolgreiche Eingrenzung der Erkrankung verantwortlich. Im Vorfeld konnte bereits mehrmals eine Assoziation zwischen polyfunktionalen CD4+ T-Zellen und einem Schutz gegen verschiedenste Krankheitserreger gezeigt werden. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wird versucht die Frage zu beantworten, ob eine erhöhte Frequenz von polyfunktionalen CD4+ T-Zellen auch gegen die Ausbildung einer aktiven TB schützen kann. Zur Bearbeitung dieser Fragestellung wurde das TH1 Zytokinprofil von Patienten mit aktiver TB untersucht und mit dem von gesunden latent infizierten Probanden (LTBI) verglichen. Desweiteren wurden die TB Patienten während der antimikrobiellen Therapie begleitet um Änderungen im Zytokinprofil von CD4+ T-Zellen beobachten zu können. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zum ersten Mal die simultane Expression der vier TH1 Zytokine IFNg, TNFa, IL-2 und GM-CSF mit Hilfe der multifarben Durchflusszytometrie untersucht. Nach antigenspezifischer Stimulation konnten sowohl in unbehandelten und behandelten Patienten mit aktiver TB ein großer Anteil an multifunktionale Gedächtnis-T-Zellen nachgewiesen werden, die alle vier Zytokine gleichzeitig exprimierten. Bemerkenswerterweise konnte diese Population ebenfalls in LTBI gezeigt werden. Nach den ersten zwei Monaten der Therapie war der Anteil an multifunktionalen T-Zellen signifikant erhöht welches auf einen positiven Einfluss dieser Zellen auf die Behandlung hinweist. Um detaillierte Information über das Expressionspotential von CD4+ T-Zellen zu gewinnen wurden PBMCs mit einem Superantigen inkubiert. Hierbei unterschied sich das Zytokinprofil zwischen den beiden Studiengruppen signifikant und veränderte sich ebenfalls unter Therapie. Während die Expression von IFNg in TB Patienten niedriger war als in LTBI, war die Frequenz von TNFa, IL-2 und GM-CSF-positiver CD4+ T-Zellen signifikant höher in Patienten mit aktiver TB. Zusammenfassend ist zu sagen, dass sowohl in TB Patienten vor und nach Therapie, als auch in LTBI, multifunktionale CD4+ T-Zellen nachgewiesen werden können. Ein Unterschied in der Frequenz konnte dabei nicht festgestellt werden. Daher kann ein Zusammenhang zwischen der Existenz von multifunktionellen CD4+ T-Zellen und einem Schutz gegen eine mögliche Reaktivierung von der latenten zu der aktiven TB nicht beschrieben werden. / Characterization of the cytokine profile in adults with latent and active tuberculosis from a high endemic country Tuberculosis (TB) is a global health problem with ~2 billion infected people worldwide. The vast majority of infected individuals is able to control TB, while only ~10% develop active disease. The immunologic correlates determining the protection against reactivation of the latent form of active TB remain elusive. The adaptive immune system plays an important role in the response against Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), especially CD4+ T cells are crucial for efficient containment of the pathogen. Since polyfunctional CD4+ T cells have been associated with protection against various pathogens, the question was raised if higher frequencies of polyfunctional CD4+ T cells can be linked to protection against reactivation of active TB. To address this the TH1 T cell cytokine profile of active TB patients was analyzed and compared with healthy latently infected individuals (LTBI). Furthermore TB patients were followed up under anti-microbial therapy to monitor changes in the cytokine pattern expressed by CD4+ T cells. Hereby, for the first time, the simultaneous expression of four TH1 cytokines, IFNg, TNFa, IL-2 and GM-CSF, was investigated using multi color flow cytometry. After antigen-specific stimulation multifunctional memory T cells (CD45RO+) co-expressing IFNg, TNFa, IL-2 and GM-CSF were strongly represented in both treated and untreated TB patients. Interestingly, this proportion of polyfunctional memory T cells was also found in LTBI. After the first two months of drug treatment the proportion of antigen-specific polyfunctional T cells was significantly increased, indicating a positive impact of these cells during therapy. To gain detailed information about the potential of CD4+ T cells to produce cytokines we incubated PBMCs with a superantigen. In this case the profile was significantly different between these two groups and it changed during therapy. While the expression of IFNg was significantly lower in CD4+ T cell of TB patients in comparison to LTBI, the expression of TNFa, IL2 and GM-CSF showed significant higher frequencies in memory T cells of TB patients. To conclude, upon antigen stimulation, polyfunctional memory T cells are found in TB patients pre- and post therapy as well as in LTBI. A difference in the frequency between active TB patients and LTBI could not be detected and therefore a correlation with protection against reactivation from the latent to the active form of TB cannot be drawn.

Background Previously, we identified a major myeloid-derived proinflammatory subpopulation of human blood dendritic cells which we termed slanDCs (e.g. Schäkel et al. (2006) Immunity 24, 767–777). The slan epitope is an O-linked sugar modification (6-sulfo LacNAc, slan) of P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1). As slanDCs can induce neoantigen-specific CD4+ T cells and tumor-reactive CD8+ cytotoxic T cells, they appear as promising targets for an in vivo delivery of antigens for vaccination. However, tools for delivery of antigens to slanDCs were not available until now. Moreover, it is unknown whether or not antigens delivered via the slan epitope can be taken up, properly processed and presented by slanDCs to T cells. Methodology/Principal Findings Single chain fragment variables were prepared from presently available decavalent monoclonal anti-slan IgM antibodies but failed to bind to slanDCs. Therefore, a novel multivalent anti-slanDC scaffold was developed which consists of two components: (i) a single chain bispecific recombinant diabody (scBsDb) that is directed on the one hand to the slan epitope and on the other hand to a novel peptide epitope tag, and (ii) modular (antigen-containing) linker peptides that are flanked at both their termini with at least one peptide epitope tag. Delivery of a Tetanus Toxin-derived antigen to slanDCs via such a scBsDb/antigen scaffold allowed us to recall autologous Tetanus-specific memory T cells. Conclusions/Significance In summary our data show that (i) the slan epitope can be used for delivery of antigens to this class of human-specific DCs, and (ii) antigens bound to the slan epitope can be taken up by slanDCs, processed and presented to T cells. Consequently, our novel modular scaffold system may be useful for the development of human vaccines.

Background Regulatory T cells (Treg) are a subpopulation of CD4+ T cells that play an important role in the peripheral tolerance mechanisms of the immune system. Their suppressive function on autoreactive T cells can prevent autoimmunity. In type 1 diabetes (T1D), Treg have been inconsistently reported to be impaired in their capability to suppress autoreactive T cells (Tan, et al., 2014; Zhang, et al., 2012). Treg can be thymus derived (tTreg) or generated from naïve CD4+ CD25- T cells in the periphery (pTreg), which exhibit similar suppressive qualities as tTreg. They have also been reported to be actively induced (iTreg) under tolerogenic conditions (Kleijwegt, et al., 2010; Yuan and Malek, 2012). Although several Treg subpopulations have been described, the archetypical Treg express the major markers CD4, CD25 and FOXP3, while CD127 is heavily downregulated. However, activated conventional T cells (Tconv) show a similar phenotype, at least transiently (Miyara, et al., 2009). Since Treg and Tconv have opposing functions and therapeutic indications, it is important to obtain markers that confidently identify bona fide Treg. Scientific aim The aim of my thesis is to define the heterogeneity of human T cells with a specific emphasis to identify bona fide Treg. I examined heterogeneity of this population in healthy controls and T1D patients, as my model disease, and examined how T cells that are exposed to antigen can be defined as Treg or Tconv. Material and Methods For marker phenotyping I used samples from new onset T1D patients (age 7-11 years), autoantibody positive (Aab+) patients and age-matched healthy controls, which were tested by flow cytometry with an array of Treg-associated markers. Separately, freshly isolated CD4+CD25+CD127lo Treg and CD+CD25- Tconv were used for transcriptomic analysis, which was done by RNAseq on isolated whole RNA. For functional analysis of antigen specific gene expression patterns I developed a multi-dye proliferation assay. Treg (CD4+CD25+CD127lo) and Tconv (CD4+CD25-CD127+/lo) were sorted from isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMC). I recombined the sorted and proliferation dye stained subsets with CD4- cells to simulate whole PBMC assays and stimulated them with tetanus-, influenza- or auto-antigens (GAD65, proinsulin). Cells were incubated for 5 days and responding proliferating cells as well as non-responding cells were single cell sorted and analyzed by multiplex qPCR. In investigating therapeutic approaches to expand or generate Treg, I examined in vitro approaches for de novo induction of Tregs with tolerogenic dendritic cells (tDCs). The tDCs were differentiated from monocytes either in the presence of 1α,25-OH(2)Vitamin D3 and/or Dexamethasone and matured with lipopolysaccharide. In a multistep assay, naïve T cells were incubated with DCs for two rounds and functional suppression assays were performed. The resultant T cells were analyzed at the DNA, protein, and functional level. Results Substantial phenotypic heterogeneity of peripheral blood CD4+ T cells was observed and documented for three major populations: resting Tconv (CD25-CD127+/lo), activated Tconv (CD25+CD127+) and Treg (CD25+CD127lo) in healthy controls. Despite this, I observed no differences between the Treg subpopulations from new onset T1D patients, Aab+ patients and healthy controls. In addition, there were no differences in the Treg transcriptome of T1D patients and healthy controls by RNAseq. I was, however, able to identify a small set of differentially expressed genes was discovered in Tconv suggesting a role of neutrophils in the onset of T1D. Heterogeneity of antigen-responsive Tconv and Treg was identified by gene expression profiling. I was able to define Treg specific as well as activation specific profiles, and found different expression profiles if T cells are foreign antigen or autoantigen activated and if the responding cells are Treg or Tconv. Genes that define the specific profiles include FOXP3, CD127, several cytokines, transcription factors and activation markers. The manipulation of naïve CD4+CD25- T cells by tDCs led to an unstable CD25+CD127loFOXP3+ phenotype of the generated cells. However, none of the subsequently performed functional assays could confirm that the resultant cells were iTreg or exhausted activated Tconv. In particular, methylation status of the Treg-specific demethylated region (TSDR) was inconsistent with stable Treg, suggesting that so-called tolerogenic protocols may not lead to a long-lived Treg phenotype. Conclusion CD4+CD25+ T cells are heterogeneous. I defined marker combinations that will help distinguish Treg from ex vivo and in vitro activated Tconv cells. With these tools, I was able to show that healthy controls and patients with type 1 diabetes cannot be distinguished by Treg phenotype. Comprehensive single cell analysis of antigen activated T cells provided the most promising avenue for identifying antigen-specific Treg and opens new possibilities to analyze immune therapeutic approaches, particularly when Treg expansion is the therapeutic objective. The findings will be used for monitoring children participating in antigen-based prevention studies in children at risk for T1D. / Hintergrund Regulatorische T Zellen (Treg) sind eine Subpopulation der CD4+ T Zellen, welche eine wichtige Rolle in den peripheren Toleranzmechanismen des Immunsystems spielen. Ihre suppressive Funktion auf autoreaktive T Zellen kann Autoimmunität verhindern. Verschiedene Studien berichteten widersprüchlich, dass Treg in Typ 1 Diabetes (T1D) in ihrer Fähigkeit beeinträchtigt sind autoreaktive T Zellen zu supprimieren (Tan et al., 2014; Zhang et al., 2012). Treg können im Thymus differenzieren (tTreg) oder aus peripheren naïven CD4+CD25- T Zellen generiert werden (pTreg), welche ähnliche suppressive Eigenschaften wie tTreg besitzen. Es wurde außerdem berichtet, dass Treg aktiv unter tolerisierenden Konditionen induziert werden können (iTreg) (Kleijwegt et al., 2010; Yuan and Malek, 2012). Obwohl verschiedene Treg Subpopulationen beschrieben wurden, exprimieren die archetypischen humanen Treg die Hauptmarker CD4, CD25 und FOXP3 exprimieren, während CD127 herunterreguliert ist. Jedoch zeigen auch aktivierte konventionelle T Zellen (Tconv) diesen Phänotyp (Miyara et al., 2009). Da Treg und Tconv gegensätzliche Funktionen und therapeutische Indikationen aufweisen, ist es wichtig Marker zu erhalten, die sicher bona fide Treg identifizieren. Fragestellung Das Ziel meiner Arbeit ist es, die Heterogenität von humanen T Zellen zu definieren mit einen spezifischen Fokus bona fide Treg zu identifizieren. Dafür untersuchte ich die Heterogenität dieser Zellpopulation in gesunden Individuen und T1D Patienten, als Krankheitsmodell, und wie T Zellen als Treg oder Tconv definiert werden können wenn sie einem Antigen ausgesetzt sind. Material und Methoden Für das Phänotypisieren habe ich Proben von Patienten mit beginnendem T1D (Alter 7-11 Jahre), Autoantikörper positiven Patienten (Aab+) und gesunden Individuen mittels Durchflusszytometrie auf eine Reihe von Treg-assoziierten Markern getestet. Des Weiteren wurden frisch isolierte CD4+CD25+CD127lo Treg und CD+CD25- Tconv für die Transkriptomanalyse (RNAseq) genutzt, welche mit der Gesamt-RNA durchgeführt wurden. Für die funktionelle Analyse von Antigen-spezifischen Genexpressionsmustern habe ich ein Multifarbenproliferationstest entwickelt. Treg (CD4+CD25+CD127lo) und Tconv (CD4+CD25-CD127+/lo) wurden aus isolierten mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) sortiert. Ich habe die sortierten und gefärbten Zellen mit CD4- Zellen zusammengefügt, um einen Gesamt-PBMC-Test zu simulieren und habe die Zellen mit Tetanus-, Influenza- oder Auto-antigen (GAD65, Proinsulin) stimuliert. Die Zellen wurden für 5 Tage inkubiert und die Antigen-reagierenden und -proliferierenden Zellen sowie die nicht-reagierenden Zellen Einzelzell sortiert und mittels Multiplex qPCR analysiert. Um therapeutische Ansätze zum Expandieren oder Generieren von Treg zu untersuchen, habe ich in vitro Ansätze für die de novo Induktion von Treg durch die Nutzung von tolerisierenden dendritischen Zellen (tDCs) untersucht. Die tDCs wurden von Monozyten in Anwesenheit von 1α,25-OH(2)Vitamin D3 und/oder Dexamethason differenziert und mit Lipoploysaccharid maturiert. Naïve T Zellen wurden in einem Mehrschrittverfahren mit DCs inkubiert. Die resultierenden T Zellen wurden auf DNA, Protein und funktioneller Ebene analysiert. Ergebnisse Substantielle phänotypische Heterogenität von peripheren Blut CD4+ T Zellen wurde in drei Hauptpopulationen in gesunden Individuen beobachtet und dokumentiert: ruhende Tconv (CD25-CD127+/lo), aktivierte Tconv (CD25+CD127+) und Treg (CD25+CD127lo). Weiterführend ergab der phänotypische Vergleich von Patienten mit beginnender T1D, Aab+ Patienten und gesunden Individuen keine Unterschiede in den Treg Subpopulationen. Außerdem zeigten sich keine Unterschiede in den durch RNAseq gemessenen Treg Transkriptomen von T1D Patienten und gesunden Individuen. Jedoch wurde ein kleine Gruppe von differentiell exprimierten Genen in Tconv entdeckt, welche eine mögliche Rolle von Neutrophilen in T1D andeuten. Heterogenität von Antigen-spezifischen Tconv und Treg Antworten wurde durch Genexpressionsanalysen identifiziert. Ich konnte Treg- sowie Aktivierungs-spezifische Muster definieren und verschiedene Expressionsprofile finden, wenn T Zellen durch Fremd- oder Autoantigen aktiviert wurden und ob sie die reagierenden Zellen Treg oder Tconv sind. Folgende Gene waren hauptsächlich in die Profilbildung involviert: FOXP3, CD127, mehrere Zytokine, Transkriptionsfaktoren und Aktivierungsmarker. Die Manipulation von naïven CD4+CD25- T Zellen durch tDCs führte zu einem instabilen CD25+CD127loFOXP3+ Phänotyp der generierten Zellen. Jedoch konnte keiner der weiterführenden funktionellen Analysen unterscheiden, ob die resultierenden Zellen iTreg oder aktivierte erschöpfte T Zellen waren. Insbesondere war der Methylierungsstatus der Treg-spezifisch demethylierten Region (TSDR) nicht konsistent mit einen stabilen Treg Phänotyp, was darauf hinweist, dass sogenannte tolerisiernde Protokolle nicht zu einem langlebigen Treg Phänotyp führen. Schlussfolgerungen CD4+CD25+ T Zellen sind heterogen. Ich habe Markerkombinationen definiert die helfen werden Treg von ex vivo und in vitro aktivierten Tconv Zellen zu unterscheiden. Mit diesen Mitteln war ich in der Lage zu zeigen, dass gesunde Individuen und Patienten mit Typ 1 Diabetes nicht anhand ihres Treg Phänotyps unterschieden werden können. Umfassende Einzelzell-Analysen von Antigen aktivierten T Zellen lieferten den vielversprechendsten Ansatz für die Identifizierung von Antigen-spezifischen Treg und eröffnen neue Möglichkeiten um immuntherapeutische Ansätze zu analysieren, insbesondere wenn Treg Expansion das therapeutische Ziel ist. Diese Erkenntnisse werden zukünftig für das Monitoring von Kindern, mit einem hohen T1D Risiko, genutzt die an Antigen-basierten Präventionsstudien teilnehmen.

Gegenstand dieser Arbeit ist die Herstellung funktioneller Polymerpartikel und deren Nutzung für biomedizinische Applikationen. Die Anwendungsgebiete der resultierenden Hybridmaterialien reichen vom Einsatz als Kontrastmittel in bildgebenden Verfahren der medizinischen Diagnostik über die Verwendung als Antimikrobium bis hin zum Einsatz als „Werkzeug“ zur Zellisolierung und aktivierung. Dazu wurden kompakte Latexpartikel und sensitive, poröse Mikrogelpartikel mittels emulgatorfreier Heterophasenpolymerisation synthetisiert. Als funktionelles Monomer wurde Glycidylmethacrylat verwendet, über dessen reaktive Epoxygruppen anschließend weitere Moleküle angebunden werden können. Die Funktionalisierung der Polymerpartikel erfolgte einerseits mit anorganischen Nanopartikeln (dotierte Lanthanfluorid-Nanopartikel, Gold- und Silbernanopartikel) und andererseits mit Biomolekülen wie Nukleotiden und Antikörpern. Einige Verwendungsgebiete, wie die Stimulierung von Memory-T-Zellen mit Antikörper-Polymer-Konjugaten oder der Einsatz der Silberkomposite aufgrund ihrer antimikrobiellen Wirkung, wurden näher untersucht. / The aim of this work was the synthesis of functional polymeric particles and their use for biomedical purposes. The application areas of the resulting hybrid materials range from contrast agents in medical diagnostics and usage due to antimicrobial properties to “tools” for cell isolation and activation. Compact core-shell particles and porous microgel particles were prepared by surfactant-free heterophase polymerization in water. All particles contain glycidyl methacrylate whose epoxy groups are capable to bind other molecules covalently. On the one hand, polymeric particles were functionalized with inorganic nanoparticles (doped lanthanum fluoride nanoparticles, gold and silver nanopariticles) and on the other hand with biomolecules such as nucleotides and antibodies. Selected application fields like the stimulation of memory T-cells with polymer-antibody-conjugates or the use of the silver composites due to their antimicrobial activity were investigated in detail.

Regulatorische CD4+CD25+ T-Zellen (Tregs) stellen eine kleine Zellpopulation dar (1-5% der peripheren Blutzellen), die hauptsächlich für die Regulierung von Immunreaktionen verantwortlich ist. In der vorliegenden Arbeit wurden diese Zellen gemeinsam mit Stammzellen syngen und allogen kotransplantiert, um ihren Effekt auf das Anwachsen der Spenderzellen und die Rekonstitution der Hämatopoese nach Ganzkörperbestrahlung zu untersuchen. Es wurden humanisierte dreifach transgene Empfängermäuse (C57Bl/6-TTG) verwendet (human CD4+, murin CD4-, human HLA-DR+), wodurch sowohl bei syngener als auch bei allogener Transplantation eine Unterscheidung zwischen Spender- und Empfängerzellen möglich ist. Zunächst wurden CD4+CD25+ T-Zellen durch Separation aus Milzzellen bzw. Buffy Coats gewonnen und in vitro mittels Durchflusszytometrie und ELISpot charakterisiert. Anschließend fanden syngene und allogene Transplantationen mit einer Laufzeit von 61 Tagen statt. Überleben und Gewicht wurden täglich ermittelt und außerdem wurden wöchentlich Blutbilder erstellt und durchflusszytometrische Chimärismusanalysen (murines und humanes CD4, CD8, MHC (H2Db, H2Kd)) durchgeführt. Durch die magnetische Separation konnte die FoxP3-Expression der murinen Zellen (Transplantat) von 1,6% in der Ausgangspopulation auf 68,5% in der CD4+CD25+ Population gesteigert werden. In den ELISpot-Assays zeigten diese separierten Zellen, wie für Tregs typisch, keine Produktion von Interleukin-2. Nach syngener Transplantation (Spender: wildtyp C57Bl/6) von 2x106 Knochenmarkzellen und 1x106 CD4+CD25+ T-Zellen überlebten 100% der Tiere, wie zu erwarten war. Dabei setzte bei Tregs-kotransplantierten Tieren die Blutbildung nach bestrahlungsbedingter Leukozytopenie aufgrund bisher nicht bekannter Mechanismen früher wieder ein und der Donor-Zell-Chimärismus war an Tag 19 nach Transplantation signifikant höher als in der Kontrollgruppe. Dies zeigt, dass regulatorische T-Zellen im syngenen Transplantationsmodell einen positiven Effekt auf die Akzeptanz bzw. das Anwachsen des Transplantats haben. Dieses Modell entspricht klinisch einer autologen Transplantation. Nach einer knochenmarkzerstörenden Therapie werden dem Patienten eigene Stammzellen reinfundiert, um die Blutbildung und das Immunsystem wieder in Gang zu bringen. Der Zusatz von regulatorischen T-Zellen zum autologen Stammzelltransplantat könnte das Anwachsen der Zellen beschleunigen und die gefährliche Phase der Immunsuppression, in der es häufig zu Sekundärinfektionen kommt, verkürzen. Die Transplantation der gleichen Zahl von allogenen Spenderzellen (wildtyp Balb/c) führte überraschend zum Tod aller dreifach transgenen Empfängertiere. Der Vergleich zu Experimenten mit wildtyp C57Bl/6-Empfängertieren zeigte, dass dreifach transgene Mäuse sehr viel höhere Zellzahlen im Transplantat zum Überleben benötigen (Daten nicht gezeigt). Das Ausbleiben der Blutbildung nach der Bestrahlung führte zu vermindertem Allgemeinbefinden, gestörter Futter- und Wassseraufnahme und Exsikkose bis zum Tod bzw. aus Tierschutzgründen zur Euthanasie. Durch Erhöhung der Zellzahl im Transplantat auf 1x107 Knochenmark + 5x106 Milzzellen überlebten 25% der Mäuse, bei 3x107 Knochenmark + 5x106 Milzzellen waren es 50%. Anders als im syngenen Modell führte die Kotransplantation 1,5x106 allogener CD4+CD25+ T-Zellen zu 3x107 Knochenmark + 5x106 Milzzellen zum Versterben der Tiere. Dies verdeutlicht, dass regulatorische T-Zellen in diesem allogenen Transplantationsmodell das Anwachsen des Transplantats behindern (Transplantatversagen). Hier gilt es zu klären, ob dieser Effekt spezifisch für die gewählten Mausstämme ist und welche Mechanismen für das Transplantatversagen verantwortlich sind. In einem dreifach transgenen Mausmodell konnte ein positiver Effekt von regulatorischen T-Zellen auf die Rekonstitution der Hämatopoese bei syngener Kotransplantation nachgewiesen werden. Im allogenen Transplantationsmodell hingegen führte die Kotransplantation CD4+CD25+ T-Zellen zum Versterben der Empfänger. Der beschriebene und schon publizierte positive Effekt spenderspezifischer Tregs zur Behandlung von Graft versus Host Disease nach allogener Stammzelltransplantation widerspricht diesen Ergebnissen nicht, da es bei diesen Patienten schon zum Engraftment von hämatopoetischen Stammzellen gekommen ist. Dies hat weitreichende Konsequenzen für die therapeutische Anwendung regulatorischer T-Zellen bei hämatologischen Erkrankungen in der Human- und Veterinärmedizin. / Regulatory CD4+CD25+ T cells (Tregs) represent a small cell population (1-5% of peripheral blood cells) mainly responsible for the regulation of the immune system. In the present work, these cells were cotransplanted with syngeneic and allogeneic stem cells in order to analyze the effect of Tregs on the reconstitution of hematopoiesis after total body irradiation. Humanized triple transgenic hosts (C57Bl/6-TTG) (human CD4+, murine CD4-, human HLA-DR+) were applied allowing differentiation of donor and host cells in syngeneic and allogeneic transplantation settings. Murine and human CD4+CD25+ T cells were magnetically separated out of splenocytes or buffy-coats and characterized in vitro by means of flow cytometry and ELISpot. Afterwards syngeneic and allogeneic transplantation experiments were performed for a period of 61 days. Survival and weight were assessed daily and once a week blood parameters and chimerism analyses (murine and human CD4, CD8, MHC (H2Db/ H2Kd)) were carried out. FoxP3 expression increased from 1,6% in the initial murine cell fraction to 68,5% in the separated CD4+CD25+ T cells. ELISpot assays showed the typical lack of interleukin 2 production of Tregs. After syngeneic transplantation (donor: wildtype C57Bl/6) of 2x106 bone marrow cells and 1x106 CD4+CD25+ T cells, 100% of mice survived what was to be expected. Cotransplanted animals showed earlier reconstitution of hematopoiesis after leukocytopenia and significant higher donor-cell-chimerism on day 19 after transplantation. The mechanisms for this positive effect of Tregs in syngeneic transplantation on the engraftment have to be investigated. This model clinically correspond an autologous transplantation where patients are treated with their own stem cells after a myeloablative treatment (chemotherapy or irradiation). The addition of regulatory T cells to the transplant could accelerate the engraftment and shorten the risky period of immunosuppression. Injection of the same numbers of allogeneic cells (donor: wildtype Balb/c) did not preserve hosts from mortality. Compared to experiments with wildtype recipients, results showed that triple transgenic mice need much higher cell numbers in the transplant for survival (data not shown). The failure of hematopoiesis after irradiation led to reduced general condition, disordered ingestion and exsikkosis leading to death respectively to euthanasia for reasons of protection of animals. By scaling up the cell number in the inoculum to 1x107 bone marrow cells + 5x106 splenocytes 25% of mice survived, with 3x107 bone marrow cells + 5x106 splenocytes survival was 50%. In contrast to syngeneic experiments, cotransplantation of 1,5x106 allogeneic CD4+CD25+ T cells and 3x107 bone marrow cells + 5x106 splenocytes did not prevent animals from mortality. In this allogeneic transplantation model Tregs restrain engraftment (graft failure). It has to be clarified if this effect is specific for the utilized mouse strains and which mechanisms are responsible for the graft failure. In the syngeneic triple transgenic mouse model cotransplantation of CD4+CD25+ T cells showed a positive effect on reconstitution of hematopoiesis after irradiation. In the allogeneic setting however cotransplantation of allogeneic regulatory T cells avoided the engraftment of transplanted cells. The described and published effect of donor-specific Tregs for treatment of graft versus host disease after allogeneic transplantation does not contradict the presented results because treated patients already possessed engrafted hematopoietic stem cells. The results have wide consequences for the therapeutic appliance of regulatory T cells in hematological diseases in human and veterinary medicine.