Double stranded RNA (dsRNA), the genomic material of some viruses and a replication intermediate in others, is recognized by multiple signaling receptors that initiate the anti-viral response1. Viruses have developed mechanisms to circumvent the anti-viral response by targeting components of the signaling pathway. An example of one such pathway is the TLR3 signaling pathway, which contains a kinase complex that activates interferon regulatory factor 3 (IRF3), leading to production of type I interferons. The kinase complex consists of a scaffold protein, NAK-associated protein 1 (NAP1), and two kinases, TANK-binding kinase 1 (TBK-1) and IκB kinase epsilon (IKKε). A fourty residue sequence in NAP1 was discovered that mediated its interaction with TBK1 and IKKε, termed the kinase binding domain (KBD)1. However, the function of NAP1 in mediating kinase activation is unknown and understanding this is the long-term goal of this project. The goal of this thesis was to test the dependency of NAP1’s dimeric structure on mediating interactions with the kinases. Biochemical characterization of recombinant targets was completed using size-exclusion chromatography (SEC) and NAP1 KBD WT eluted as a dimeric species. CFP/YFP/Alexa Fluor 546 fusion proteins of the NAP1 KBD and scaffold binding motif (SBM) of the kinases, TBK-1 and IKKε, were generated to assess interactions using fluorescence resonance energy transfer (FRET). NAP1 KBD directly interacts with TBK1 and IKKε, with low micromolar affinity in vitro. Mutagenesis was attempted to identify the residues necessary for NAP1 dimerization and any effect dimerization may have on kinase recognition. This thesis shows data to support that NAP1 KBD forms stable homo-oligomers and directly interacts with a small C-terminal portion of TBK1 and IKKε.

Suite à une stimulation de macrophages au LPS, TANK est phosphorylé en C-terminal et polyubiquitiné de manière non dégradative en N-terminal. Ces deux phénomènes sont indépendants mais dépendent tout deux des kinases IKKe/TBK1. TANK comme ces deux kinases est indispensable à l'activations des facteurs transcriptionnels IRF3/7. Le signalosome COP9/CSN semble aussi intervenir dans la régulation de cette activation via l'interaction TANK/IKKe/CSN5.

L'encéphalite herpétique (EH), causée par l'herpès simplex virus-1 (HSV-1), peut résulter de défauts monogéniques de l'immunité médiée par TLR3. L'induction d'interférons (IFNs)-α/β ou -λ via TLR3 est cruciale à la protection après infection primaire avec HSV-1 dans le système nerveux central (SNC). Nous décrivons deux enfants avec l'EH portant différentes mutations hétérozygotes (D50A et G159A) dans TBK1, encodant TANK-Binding Kinase 1, une kinase aux carrefours de multiples voies de signalisation induisant des IFNs. Les deux allèles mutants de TBK1 sont perte-de-fonction par des mécanismes différents: instabilité de la protéine (D50A) ou perte d'activité kinase (G159A). Ces allèles sont associés à un trait autosomal dominant (AD) par des mécanismes différents: haplotype-insuffisance (D50A) ou dominance négative (G159A). Un défaut de réponses à poly(I:C) par TLR3 est observable dans les fibroblastes hétérozygotes pour G159A, et non pour D50A TBK1. Néanmoins, la réplication virale et la mortalité cellulaire après infection par deux virus dépendants de TLR3 (HSV-1 et VSV) étaient élevées dans les fibroblastes des deux patients. Ces phénotypes peuvent être sauvés par IFN-α2b. De plus, la production d'IFNs en réponse à des agonistes et virus indépendants de TLR3 est maintenue dans les PBMCs et fibroblastes des patients. Le phénotype cellulaire restreint, partiel représente ainsi le phénotype clinique de ces patients, limité à l'EH. Ces données identifient la déficience partielle AD de TBK1 comme une nouvelle étiologie génétique de l'EH de l'enfance, et indiquent que TBK1 est essentiel pour le contrôle de HSV-1 dans le SNC, médié par TLR3 et dépendant des IFNs

L’immunité innée antivirale repose en grande partie sur la production des interférons de type I (IFN-α/β) par les cellules infectées et les cellules immunitaires. Cette synthèse résulte de la reconnaissance de motifs viraux caractéristiques par des récepteurs cellulaires, parmi lesquels les RIG-I-Like Récepteurs (RLR) et le Toll-Like Récepteur 3 (TLR3) détectent l’ARN viral respectivement au niveau du cytosol et des endosomes. La signalisation induite par les RLRs et TLR3 conduit à l’activation d’IRF3 et de NF-κB, deux facteurs de transcription impliqués respectivement dans la production d’IFN-α/β et de cytokines pro-inflammatoires. TBK1 (TANK-Binding Kinase 1) joue un rôle essentiel dans l’immunité innée antivirale, de par la phosphorylation du facteur de transcription IRF3, nécessaire à la production des IFNs de type I. Bien que de nombreuses études aient montré le rôle crucial de cette kinase dans la signalisation antivirale, le processus entrainant son activation est encore mal déterminé à ce jour. Lors de cette étude nous avons démontré que suite à la stimulation du TLR3 et des RLRs, la forme active, ubiquitinylée et phosphorylée, de TBK1 se relocalise au niveau de l’appareil de golgi, grâce à son ubiquitination sur les résidus K30 et K401. Ce mécanisme implique la reconnaissance des chaines d’ubiquitines associées à TBK1 par l’Optineurine (OPTN), permettant la formation d’un complexe autorisant le rapprochement des molécules de TBK1 puis la trans-autophosphorylation au niveau de l’appareil de Golgi. Au cours de ce travail nous avons également découvert qu’OPTN est la cible d’une protéine virale, la protéine NS3 du BTV (Bluetongue Virus), qui neutralise son activité et diminue ainsi l’activation de TBK1 et la signalisation responsable de la sécrétion de cytokines antivirales. / Type-I interferons (IFN-α/β) production and release is a major event in innate antiviral immunity. IFN production depends on the interaction between viral structures and their corresponding cellular sensors. RIG-I-Like Receptors (RLRs) and Toll-Like Receptor 3 (TLR3) sense dsRNAs in the cytosol and endosomes respectively. Stimulation of these receptors by their ligands promotes a signal transduction leading to the activation of the transcription factors NF-κB and IRF3, and consequently to the production of proinflammatory cytokines and Type I Interferons (IFN-I). TBK1 (TANK-Binding Kinase 1), plays a crucial role in antiviral innate immunity, by phosphorylating the transcription factor IRF3, required for the production of type I IFNs. Although many studies have shown the critical role of this kinase in antiviral signaling, the molecular mechanism of its activation are largely unknown. We report here the localization of the ubiquitinated and phosphorylated active form of TBK1 to the Golgi apparatus after the stimulation of RLRs or TLR3, due to TBK1 ubiquitination on lysine residues 30 and 401. The ubiquitin-binding protein optineurin (OPTN) recruits ubiquitinated TBK1 to the Golgi apparatus, leading to the formation of complexes in which TBK1 is activated by trans-autophosphorylation. We also found that a viral protein binds OPTN at the Golgi apparatus, neutralizing its activity and thereby decreasing TBK1 activation and downstream signaling.

L’inflammation est un procédé complexe qui vise l’élimination de l’agent causal de dommages tissulaires en vue de faciliter la réparation du tissu affecté. La persistance de l’agent causal ou l’incapacité à résoudre l’inflammation mène à un dérèglement homéostatique chronique qui peut avoir une incidence sur la morbidité et la mortalité. L’athérosclérose est une condition inflammatoire chronique des vaisseaux sanguins dont l’origine est multifactorielle. L’hypertension et l’état infectieux représentent respectivement des facteurs de risque classiques et émergents du développement de cette maladie. Les fondements initiaux de l’inflammation font intervenir l’immunité innée, la première ligne de défense dont disposent les cellules pour répondre à un signal de danger. Le but de cette thèse est d’examiner le rôle pro-inflammatoire d’une famille de kinases essentielles à l’immunité innée, soit celle des kinases de IkappaB (IKK) et des kinases IKK-related. Les kinases IKKalpha et IKKbeta forment le complexe IKK avec la molécule adaptatrice NEMO/IKKgamma. Ce complexe est chargé d’effectuer la phosphorylation de l’inhibiteur de NF-kappaB, IkappaBalpha, ce qui mène à sa dégradation et à la libération du facteur de transcription NF-kappaB. Nous montrons que le peptide vasoactif angiotensine II (AngII) induit l’activité phosphotransférase d’IKKbeta dans les VSMC par immunoprécipitation de NEMO puis essai kinase in vitro. Grâce à une approche ARN interférence (ARNi) dirigée contre IKK, nous montrons que cette kinase est responsable de la phosphorylation de p65/RelA. Nous montrons que le mécanisme d’induction de NF-kappaB par l’AngII est atypique, puisqu’il ne module pas IkappaBalpha, et montrons à l’aide d’inhibiteurs pharmacologiques que l’activation de p65 est indépendante des voies MEK-ERK-RSK, PI3K et de la transactivation du récepteur de l’EGF. Les kinases IKK-related Tank-binding kinase 1 (TBK1) et IKK-i sont quant à elles principalement activées suite à une infection bactérienne ou virale. Ces kinases phosphorylent directement le facteur de transcription interferon regulatory factor (IRF)-3. Nous montrons que le cytomégalovirus humain, un pathogène associé à l’athérosclérose, a la capacité d’induire l’activation de TBK1 dans les VSMC. L’usage d’ARNi dirigé contre TBK1 et IKKi montre que les 2 kinases sont impliquées dans l’activation d’IRF-3. De plus, nous montrons à l’aide d’une lignée de VSMC exprimant une version dominante négative d’IRF-3 que ce dernier est essentiel à la synthèse des chimiokines RANTES et IP-10, tel qu’analysé par RT-PCR. Par ailleurs, il a récemment été montré que les kinases IKK-related étaient étroitement liées à la transformation oncogénique, et que TBK1 était pro-angiogénique. Or, l’angiogenèse est le plus souvent modulée par la réponse hypoxique qui est d’ailleurs commune à la majorité des processus inflammatoires. Le facteur de transcription hypoxia inducible factor (HIF)-1 module l’angiogenèse, l’inflammation et la survie cellulaire. Nous montrons à l’aide de cellules Tbk1 et Ikbke -/- et d’une approche lentivirale que TBK1 est spécifiquement impliquée dans l’induction traductionnelle de HIF-1alpha en condition de stress hypoxique. L’expression de TBK1 est induite sous ces conditions, et cette kinase module la phosphorylation de ERK, RSK, Akt et TSC1. Les résultats originaux présentés dans cette thèse montrent donc que les kinases IKK et IKK-related exercent leurs actions pro-inflammatoires par des mécanismes distincts. / Inflammation is a complex process that allows elimination of tissular damaging agents and thus facilitates wound repair. Persistance of a damaging agent or the incapacity to resolve the inflammatory state leads to chronic homeostatic deregulation with putative incidence on morbidity and mortality. Atherosclerosis is an inflammatory state of blood vessels which origins are multifactorial. Hypertension and the infectious state represent classical and emerging factors of atherosclerosis development, respectively. The innate immune response takes place in the initial steps of inflammation, and represents the first cellular line of defense against danger signals. The goal of this thesis is to examine the pro-inflammatory roles of the IkB kinases (IKK) and the IKK-related kinases, which are essential innate immune response protein kinases. IKKalpha and IKKbeta form, together with NEMO/IKKgamma, the IKK complex. This complex is responsible of the phosphorylation of the inhibitor of NF-kappaB, IkappaBalpha, a process that leads to its degradation and NF-kappaB release. By immunoprecipitation of NEMO and assessment of the IKK complex activity in vitro, we show that the vasoactive peptide angiotensin II (AngII) induces IKKbeta phosphotransferase activity in vascular smooth muscle cells (VSMC). The use of RNA interference (RNAi) against IKKbeta reveals that this kinase is responsible for p65/RelA phosphorylation. AngII modulation of NF-kappaB is atypical since it does not modulate IkappaB. Moreover, the use of pharmacological inhibitors shows that p65 induction is independent of both MEK-ERK-RSK and PI3K pathways, and that it does not involve EGF receptor transactivation. IKK-related kinases Tank-binding kinase 1 (TBK1) and IKK-i are known to be induced by bacterial and viral infections. These kinases are able to phosphorylate directly interferon regulatory factor (IRF)-3 transcription factor. Human cytomegalovirus (HCMV) seropositivity was shown to be linked to atherosclerosis development. We show that TBK1 activity is induced in HCMV-infected VSMC. RNAi directed against TBK1 and IKK-i reveals that both kinases are required for IRF-3 activation. The use of a VSMC line that express a dominant negative version if IRF-3 shows that this transcription factor is involved in the induction of RANTES and IP-10 chemokines, as assessed by RT-PCR. In addition, IKK-related kinases were recently shown to be implicated in oncogenic transformation. TBK1 was also shown to be pro-angiogenic. Angiogenesis is known to be regulated by the hypoxic response, a common condition of inflammatory processes. Hypoxia-inducible factor (HIF)-1 is a transcription factor that modulates angiogenesis, inflammation and cell survival. We show with the use of Tbk1 and Ikbke -/- cells combined with the use of a lentiviral approach that TBK1 is specifically involved in HIF-1alpha translational induction under hypoxic stress. We also show that TBK1 expression is enhanced under theses conditions, and that this kinase modulates the phosphorylation of ERK, RSK, Akt and TSC1. In conclusion, the results presented in this thesis show that the IKK and IKK-related kinases are both pro-inflammatory, and exert their actions by distinct mechanisms.

L’inflammation est un procédé complexe qui vise l’élimination de l’agent causal de dommages tissulaires en vue de faciliter la réparation du tissu affecté. La persistance de l’agent causal ou l’incapacité à résoudre l’inflammation mène à un dérèglement homéostatique chronique qui peut avoir une incidence sur la morbidité et la mortalité. L’athérosclérose est une condition inflammatoire chronique des vaisseaux sanguins dont l’origine est multifactorielle. L’hypertension et l’état infectieux représentent respectivement des facteurs de risque classiques et émergents du développement de cette maladie. Les fondements initiaux de l’inflammation font intervenir l’immunité innée, la première ligne de défense dont disposent les cellules pour répondre à un signal de danger. Le but de cette thèse est d’examiner le rôle pro-inflammatoire d’une famille de kinases essentielles à l’immunité innée, soit celle des kinases de IkappaB (IKK) et des kinases IKK-related. Les kinases IKKalpha et IKKbeta forment le complexe IKK avec la molécule adaptatrice NEMO/IKKgamma. Ce complexe est chargé d’effectuer la phosphorylation de l’inhibiteur de NF-kappaB, IkappaBalpha, ce qui mène à sa dégradation et à la libération du facteur de transcription NF-kappaB. Nous montrons que le peptide vasoactif angiotensine II (AngII) induit l’activité phosphotransférase d’IKKbeta dans les VSMC par immunoprécipitation de NEMO puis essai kinase in vitro. Grâce à une approche ARN interférence (ARNi) dirigée contre IKK, nous montrons que cette kinase est responsable de la phosphorylation de p65/RelA. Nous montrons que le mécanisme d’induction de NF-kappaB par l’AngII est atypique, puisqu’il ne module pas IkappaBalpha, et montrons à l’aide d’inhibiteurs pharmacologiques que l’activation de p65 est indépendante des voies MEK-ERK-RSK, PI3K et de la transactivation du récepteur de l’EGF. Les kinases IKK-related Tank-binding kinase 1 (TBK1) et IKK-i sont quant à elles principalement activées suite à une infection bactérienne ou virale. Ces kinases phosphorylent directement le facteur de transcription interferon regulatory factor (IRF)-3. Nous montrons que le cytomégalovirus humain, un pathogène associé à l’athérosclérose, a la capacité d’induire l’activation de TBK1 dans les VSMC. L’usage d’ARNi dirigé contre TBK1 et IKKi montre que les 2 kinases sont impliquées dans l’activation d’IRF-3. De plus, nous montrons à l’aide d’une lignée de VSMC exprimant une version dominante négative d’IRF-3 que ce dernier est essentiel à la synthèse des chimiokines RANTES et IP-10, tel qu’analysé par RT-PCR. Par ailleurs, il a récemment été montré que les kinases IKK-related étaient étroitement liées à la transformation oncogénique, et que TBK1 était pro-angiogénique. Or, l’angiogenèse est le plus souvent modulée par la réponse hypoxique qui est d’ailleurs commune à la majorité des processus inflammatoires. Le facteur de transcription hypoxia inducible factor (HIF)-1 module l’angiogenèse, l’inflammation et la survie cellulaire. Nous montrons à l’aide de cellules Tbk1 et Ikbke -/- et d’une approche lentivirale que TBK1 est spécifiquement impliquée dans l’induction traductionnelle de HIF-1alpha en condition de stress hypoxique. L’expression de TBK1 est induite sous ces conditions, et cette kinase module la phosphorylation de ERK, RSK, Akt et TSC1. Les résultats originaux présentés dans cette thèse montrent donc que les kinases IKK et IKK-related exercent leurs actions pro-inflammatoires par des mécanismes distincts. / Inflammation is a complex process that allows elimination of tissular damaging agents and thus facilitates wound repair. Persistance of a damaging agent or the incapacity to resolve the inflammatory state leads to chronic homeostatic deregulation with putative incidence on morbidity and mortality. Atherosclerosis is an inflammatory state of blood vessels which origins are multifactorial. Hypertension and the infectious state represent classical and emerging factors of atherosclerosis development, respectively. The innate immune response takes place in the initial steps of inflammation, and represents the first cellular line of defense against danger signals. The goal of this thesis is to examine the pro-inflammatory roles of the IkB kinases (IKK) and the IKK-related kinases, which are essential innate immune response protein kinases. IKKalpha and IKKbeta form, together with NEMO/IKKgamma, the IKK complex. This complex is responsible of the phosphorylation of the inhibitor of NF-kappaB, IkappaBalpha, a process that leads to its degradation and NF-kappaB release. By immunoprecipitation of NEMO and assessment of the IKK complex activity in vitro, we show that the vasoactive peptide angiotensin II (AngII) induces IKKbeta phosphotransferase activity in vascular smooth muscle cells (VSMC). The use of RNA interference (RNAi) against IKKbeta reveals that this kinase is responsible for p65/RelA phosphorylation. AngII modulation of NF-kappaB is atypical since it does not modulate IkappaB. Moreover, the use of pharmacological inhibitors shows that p65 induction is independent of both MEK-ERK-RSK and PI3K pathways, and that it does not involve EGF receptor transactivation. IKK-related kinases Tank-binding kinase 1 (TBK1) and IKK-i are known to be induced by bacterial and viral infections. These kinases are able to phosphorylate directly interferon regulatory factor (IRF)-3 transcription factor. Human cytomegalovirus (HCMV) seropositivity was shown to be linked to atherosclerosis development. We show that TBK1 activity is induced in HCMV-infected VSMC. RNAi directed against TBK1 and IKK-i reveals that both kinases are required for IRF-3 activation. The use of a VSMC line that express a dominant negative version if IRF-3 shows that this transcription factor is involved in the induction of RANTES and IP-10 chemokines, as assessed by RT-PCR. In addition, IKK-related kinases were recently shown to be implicated in oncogenic transformation. TBK1 was also shown to be pro-angiogenic. Angiogenesis is known to be regulated by the hypoxic response, a common condition of inflammatory processes. Hypoxia-inducible factor (HIF)-1 is a transcription factor that modulates angiogenesis, inflammation and cell survival. We show with the use of Tbk1 and Ikbke -/- cells combined with the use of a lentiviral approach that TBK1 is specifically involved in HIF-1alpha translational induction under hypoxic stress. We also show that TBK1 expression is enhanced under theses conditions, and that this kinase modulates the phosphorylation of ERK, RSK, Akt and TSC1. In conclusion, the results presented in this thesis show that the IKK and IKK-related kinases are both pro-inflammatory, and exert their actions by distinct mechanisms.

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