Os gliomas representam a maioria dos tumores do sistema nervoso central, sendo o glioblastoma o mais maligno entre eles. O tratamento destes tumores ainda é ineficiente e a sobrevida média dos pacientes é de aproximadamente um ano após o diagnóstico. A remoção cirúrgica, quando possível, acompanhada de radioterapia e quimioterapia é o tratamento padrão. A tendência é que a quimioterapia assuma um papel mais importante, uma vez que possibilita a ativação de mecanismos endógenos antitumorais, como senescência celular. Este mecanismo possui potencial de induzir a perda irreversível da capacidade da divisão de células tumorais. O resveratrol e a quercetina, dois polifenóis naturais, induzem senescência em diferentes linhagens tumorais, incluindo os glioblastomas. Ambos têm efeitos pleiotrópicos e induzem a ativação de vários alvos moleculares, sendo SIRT1, um desses alvos. SIRT1 é uma histona desacetilase (HDAC) associada ao desenvolvimento de vários tipos de tumores. Por este motivo, foi avaliada a indução de senescência em células de glioblastomas pelo resveratrol e quercetina combinados com butirato de sódio, um inibidor de HDAC classe I e II. Os resultados mostram um efeito combinado do butirato de sódio e estes polifenóis para induzir a senescência nas linhagens celulares U87 e C6, mas não em astrócitos normais de ratos. Os co-tratamentos induzem perda de capacidade proliferativa e aumento do número de células positivas para β-galactosidase, um marcador de senescência. Estes resultados foram acompanhados de parada no ciclo celular na fase G2 na linhagem U87, mas nenhum efeito foi observado sobre o ciclo de células C6. A análise por Western Blot sugere o aumento do supressor tumoral p21 após co-tratamentos. Além disso, o co-tratamento com quercetina e butirato de sódio aumenta a produção de espécies reativas de oxigênio, mas não os níveis de gama-H2AX (um marcador de dano). Estes dados sugerem que o butirato de sódio em combinação com os polifenóis tem potencial terapêutico para a supressão de glioblastomas. Por outro lado, um dos problemas em biologia e medicina é entender como células pré-cancerosas e cancerosas entram em senescência ou conseguem evitá-la. A chave para a compreensão da indução da senescência e do seu bypass é a ativação da enzima telomerase (TERT), presente em 85 % dos tumores. Na segunda parte desta tese, ferramentas de biologia de sistemas foram utilizadas para projetar uma rede câncer e senescência humana com o objetivo de estudar a relação entre senescência e câncer (incluindo glioblastoma). Os resultados mostram uma interação direta entre TERT e oncogenes como MYC, E2F1, AKT1 e ABL1, que podem induzir a senescência. Além disso, uma associação metabólica forte entre estes oncogenes e sua capacidade de induzir senescência foi mostrada através de análise por ontologia gênica. Estes oncogenes também atuam como reguladores da transcrição e/ou pós-transcrição da subunidade catalítica de TERT. Resultados obtidos a partir da análise de centralidade da rede juntamente com dados de microarranjos derivados de tumores foram utilizados para conceber um modelo dinâmico da regulação de TERT em câncer. Com base nestes resultados, foi gerado um modelo hipotético no qual a expressão de TERT pode ser transitória ou induzida por espécies reativas de oxigênio, aumentando a sobrevivência de diferentes tipos de tumores, como o glioblastoma. Este estudo fornece novas evidências para a relação entre senescência e câncer. Além disso, esta hipótese, se verificada experimentalmente, pode permitir a formulação de novas abordagens quimioterapêuticas para o tratamento de gliobastomas. / Gliomas are the majority of central nervous system tumours, being glioblastoma the most malign among them. The treatment for these tumors is still inefficient and survival average of patients is approximately one year after diagnosis. Surgical removal, if possible, followed by radiotherapy and chemotherapy is the standard treatment. The trend is that chemotherapy assumes a greater role, since it allows the activation of antitumour mechanisms, such as cellular senescence. This mechanism has potential to induce irreversible loss of division ability in tumor cells. Resveratrol and quercetin, two natural polyphenols, are able to induce senescence in different cancer models, including glioblastoma. Resveratrol and quercetine are molecules with pleiotropic effects and leads to SIRT1 activation. SIRT1 is a histone deacetylase (HDAC) which has been linked positively to cancer development. Therefore, we analyzed the ability of sodium butyrate, a HDAC class I and II inhibitor combined with resveratrol or quercetin to induce senescence in glioblastoma cell lines. Results show a combined effect of sodium butyrate and these polyphenols to induce senescence in U87 and C6 cell lines, but not in normal rat astrocytes. Co-treatments induce a loss of proliferative capacity and increase the number of positive cells for β-galactosidase, a senescence marker. These results were accompanied with cell cycle arrest in G2 checkpoint in U87, but no effect on cell cycle phase‟s distribution in C6 was observed. Western blott analysis suggests that these arrests are result of tumour suppressor p21 increase. Moreover, co-treatments increased reactive oxygen species, but not gamma-H2AX levels (a damage marker). The data underline that tumor cells can be driven towards cellular senescence by sodium butyrate combined with polyphenols, which may further arise as a possibility for tumor suppression. On the other hand, one of the challenging problems in biology and medicine is to understand how pre-cancerous or cancer cells enter in senescence or can avoid it. The key to understanding senescence induction and its bypass is the telomerase (TERT), which is present in 85 % of tumors. In a second part of this thesis, system biology tools were used to design a human cancer-senescence network with the aim to study the relationship between senescence and cancer (included glioblastoma). The results show a direct interaction between TERT and oncogenes such as MYC, E2F1, AKT1 and ABL1, which can induce senescence. Moreover, a strong metabolic association between these oncogenes and their ability to induce senescence was shown by gene ontology analysis. These oncogenes also act as transcriptional and/or post-transcriptional regulators of TERT catalytic subunit. Results obtained from centrality analysis and microarray data derived from tumors were used to design a dynamic model for TERT regulation in cancer. Based on these results, a hypothetical model was generated in which TERT expression may be transient or induced by reactive oxygen species, increasing the survival of different tumor types, such as glioblastoma. This study provides new evidence for the relationship between senescence and cancer. Furthermore, this hypothesis, if experimental verified, can enable the development of new chemotherapy approaches to glioblastoma treatment. and ABL1, which can induce senescence. Moreover, a strong metabolic association between these oncogenes and their ability to induce senescence was shown by gene ontology analysis. These oncogenes also act as transcriptional and/or post-transcriptional regulators of TERT catalytic subunit. Based on these results, a hypothetical model was generated in which TERT expression may be transient or induced by reactive oxygen species, increasing the survival of different tumor types, such as glioblastoma. This study provides new evidence for the relationship between senescence and cancer. Furthermore, this hypothesis, if experimental verified, can enable the development of new chemotherapy approaches.

Os gliomas representam a maioria dos tumores do sistema nervoso central, sendo o glioblastoma o mais maligno entre eles. O tratamento destes tumores ainda é ineficiente e a sobrevida média dos pacientes é de aproximadamente um ano após o diagnóstico. A remoção cirúrgica, quando possível, acompanhada de radioterapia e quimioterapia é o tratamento padrão. A tendência é que a quimioterapia assuma um papel mais importante, uma vez que possibilita a ativação de mecanismos endógenos antitumorais, como senescência celular. Este mecanismo possui potencial de induzir a perda irreversível da capacidade da divisão de células tumorais. O resveratrol e a quercetina, dois polifenóis naturais, induzem senescência em diferentes linhagens tumorais, incluindo os glioblastomas. Ambos têm efeitos pleiotrópicos e induzem a ativação de vários alvos moleculares, sendo SIRT1, um desses alvos. SIRT1 é uma histona desacetilase (HDAC) associada ao desenvolvimento de vários tipos de tumores. Por este motivo, foi avaliada a indução de senescência em células de glioblastomas pelo resveratrol e quercetina combinados com butirato de sódio, um inibidor de HDAC classe I e II. Os resultados mostram um efeito combinado do butirato de sódio e estes polifenóis para induzir a senescência nas linhagens celulares U87 e C6, mas não em astrócitos normais de ratos. Os co-tratamentos induzem perda de capacidade proliferativa e aumento do número de células positivas para β-galactosidase, um marcador de senescência. Estes resultados foram acompanhados de parada no ciclo celular na fase G2 na linhagem U87, mas nenhum efeito foi observado sobre o ciclo de células C6. A análise por Western Blot sugere o aumento do supressor tumoral p21 após co-tratamentos. Além disso, o co-tratamento com quercetina e butirato de sódio aumenta a produção de espécies reativas de oxigênio, mas não os níveis de gama-H2AX (um marcador de dano). Estes dados sugerem que o butirato de sódio em combinação com os polifenóis tem potencial terapêutico para a supressão de glioblastomas. Por outro lado, um dos problemas em biologia e medicina é entender como células pré-cancerosas e cancerosas entram em senescência ou conseguem evitá-la. A chave para a compreensão da indução da senescência e do seu bypass é a ativação da enzima telomerase (TERT), presente em 85 % dos tumores. Na segunda parte desta tese, ferramentas de biologia de sistemas foram utilizadas para projetar uma rede câncer e senescência humana com o objetivo de estudar a relação entre senescência e câncer (incluindo glioblastoma). Os resultados mostram uma interação direta entre TERT e oncogenes como MYC, E2F1, AKT1 e ABL1, que podem induzir a senescência. Além disso, uma associação metabólica forte entre estes oncogenes e sua capacidade de induzir senescência foi mostrada através de análise por ontologia gênica. Estes oncogenes também atuam como reguladores da transcrição e/ou pós-transcrição da subunidade catalítica de TERT. Resultados obtidos a partir da análise de centralidade da rede juntamente com dados de microarranjos derivados de tumores foram utilizados para conceber um modelo dinâmico da regulação de TERT em câncer. Com base nestes resultados, foi gerado um modelo hipotético no qual a expressão de TERT pode ser transitória ou induzida por espécies reativas de oxigênio, aumentando a sobrevivência de diferentes tipos de tumores, como o glioblastoma. Este estudo fornece novas evidências para a relação entre senescência e câncer. Além disso, esta hipótese, se verificada experimentalmente, pode permitir a formulação de novas abordagens quimioterapêuticas para o tratamento de gliobastomas. / Gliomas are the majority of central nervous system tumours, being glioblastoma the most malign among them. The treatment for these tumors is still inefficient and survival average of patients is approximately one year after diagnosis. Surgical removal, if possible, followed by radiotherapy and chemotherapy is the standard treatment. The trend is that chemotherapy assumes a greater role, since it allows the activation of antitumour mechanisms, such as cellular senescence. This mechanism has potential to induce irreversible loss of division ability in tumor cells. Resveratrol and quercetin, two natural polyphenols, are able to induce senescence in different cancer models, including glioblastoma. Resveratrol and quercetine are molecules with pleiotropic effects and leads to SIRT1 activation. SIRT1 is a histone deacetylase (HDAC) which has been linked positively to cancer development. Therefore, we analyzed the ability of sodium butyrate, a HDAC class I and II inhibitor combined with resveratrol or quercetin to induce senescence in glioblastoma cell lines. Results show a combined effect of sodium butyrate and these polyphenols to induce senescence in U87 and C6 cell lines, but not in normal rat astrocytes. Co-treatments induce a loss of proliferative capacity and increase the number of positive cells for β-galactosidase, a senescence marker. These results were accompanied with cell cycle arrest in G2 checkpoint in U87, but no effect on cell cycle phase‟s distribution in C6 was observed. Western blott analysis suggests that these arrests are result of tumour suppressor p21 increase. Moreover, co-treatments increased reactive oxygen species, but not gamma-H2AX levels (a damage marker). The data underline that tumor cells can be driven towards cellular senescence by sodium butyrate combined with polyphenols, which may further arise as a possibility for tumor suppression. On the other hand, one of the challenging problems in biology and medicine is to understand how pre-cancerous or cancer cells enter in senescence or can avoid it. The key to understanding senescence induction and its bypass is the telomerase (TERT), which is present in 85 % of tumors. In a second part of this thesis, system biology tools were used to design a human cancer-senescence network with the aim to study the relationship between senescence and cancer (included glioblastoma). The results show a direct interaction between TERT and oncogenes such as MYC, E2F1, AKT1 and ABL1, which can induce senescence. Moreover, a strong metabolic association between these oncogenes and their ability to induce senescence was shown by gene ontology analysis. These oncogenes also act as transcriptional and/or post-transcriptional regulators of TERT catalytic subunit. Results obtained from centrality analysis and microarray data derived from tumors were used to design a dynamic model for TERT regulation in cancer. Based on these results, a hypothetical model was generated in which TERT expression may be transient or induced by reactive oxygen species, increasing the survival of different tumor types, such as glioblastoma. This study provides new evidence for the relationship between senescence and cancer. Furthermore, this hypothesis, if experimental verified, can enable the development of new chemotherapy approaches to glioblastoma treatment. and ABL1, which can induce senescence. Moreover, a strong metabolic association between these oncogenes and their ability to induce senescence was shown by gene ontology analysis. These oncogenes also act as transcriptional and/or post-transcriptional regulators of TERT catalytic subunit. Based on these results, a hypothetical model was generated in which TERT expression may be transient or induced by reactive oxygen species, increasing the survival of different tumor types, such as glioblastoma. This study provides new evidence for the relationship between senescence and cancer. Furthermore, this hypothesis, if experimental verified, can enable the development of new chemotherapy approaches.

Glioblastoma multiforme é o tipo mais frequente de tumor cerebral primário, sendo caracterizado por uma alta agressividade e um prognóstico bastante limitado. O ácido hidroxâmico suberoilanilida (SAHA) é um inibidor específico de histonas desacetilases aprovado para o tratamento de linfoma cutâneo de células T, e em fase de crescente investigação clínica e pré-clínica em tumores sólidos. Neste estudo, avaliamos a eficácia do ácido hidroxâmico suberoilanilida em tratamento combinado com temozolomida, o agente alquilante já utilizado em glioblastomas. Através de testes de viabilidade e analises por citometria de fluxo em células tumorais das linhagens U251MG e C6, observamos que não houve sinergismo de potenciação entre temozolomida e ácido hidroxâmico suberoilanilida, apenas efeito sinergismo de adição O tratamento combinado inicialmente promoveu parada do ciclo celular em fase G2/M (≥48 h) ao passo que a apoptose foi detectada apenas em exposição prolongada (≥96 h) aos fármacos em estudo. Ainda, as células tratadas com TMZ/SAHA apresentaram fenótipo autofágico, como determinado por citometria de fluxo e imunodetecção de proteínas marcadoras de autofagia como LC3 e o p62/SQSTM1. A autofagia temporalmente precedeu a apoptose e exerceu função citoprotetora, uma vez que o bloqueio da terminação autofágica com cloroquina promoveu uma significante redução na viabilidade celular, a qual foi associada a um aumento de apoptose em células de glioma tratadas com TMZ/SAHA. Portanto, os dados apresentados neste trabalho demonstram que a autofagia é um processo que diminui a eficácia antiglioma do temozolomida e do ácido hidroxâmico suberoilanilida, e a inibição deste fenômeno pode ser uma estratégia para aperfeiçoar a terapia com esses fármacos. / Glioblastoma multiforme (GBM) is the most frequent and aggressive type of primary brain tumor which has been associated with a dismal prognosis. In this study, we tested the efficacy of combining temozolomide (TMZ) with suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA) - an inhibitor of HDACs 1, 2, 3, and 6 approved for the treatment of cutaneous T-cell lymphoma - in the viability of tumor cells. The data showed that potentiation synergism between TMZ e SAHA was not achieved due to activation of protective autophagy in vitro. The SAHA/TMZ treatment promoted arrest in the G2/M phase of the cell cycle as soon as 48 h after drug exposure whereas apoptosis was only detected after long-lasting exposure (≥96 h). In addition, SAHA and TMZ induced autophagy as detected by flow cytometry of acridine orange stained cells and immunodetection of the lipidated form of LC3 as well as decreases in p62/SQSTM1. Autophagy preceded apoptosis, and by blocking the termination step of autophagy with chloroquine promoted a significant reduction in the viability of glioma cells which was accompanied by increased apoptosis in SAHA/TMZ treatment. Overall, the herein presented data demonstrate that autophagy impairs the efficacy of combined TMZ/SAHA, and inhibiting this phenomenon could provide novel opportunities to improve the therapeutic potential of these compounds.

Glioblastoma multiforme é o tipo mais frequente de tumor cerebral primário, sendo caracterizado por uma alta agressividade e um prognóstico bastante limitado. O ácido hidroxâmico suberoilanilida (SAHA) é um inibidor específico de histonas desacetilases aprovado para o tratamento de linfoma cutâneo de células T, e em fase de crescente investigação clínica e pré-clínica em tumores sólidos. Neste estudo, avaliamos a eficácia do ácido hidroxâmico suberoilanilida em tratamento combinado com temozolomida, o agente alquilante já utilizado em glioblastomas. Através de testes de viabilidade e analises por citometria de fluxo em células tumorais das linhagens U251MG e C6, observamos que não houve sinergismo de potenciação entre temozolomida e ácido hidroxâmico suberoilanilida, apenas efeito sinergismo de adição O tratamento combinado inicialmente promoveu parada do ciclo celular em fase G2/M (≥48 h) ao passo que a apoptose foi detectada apenas em exposição prolongada (≥96 h) aos fármacos em estudo. Ainda, as células tratadas com TMZ/SAHA apresentaram fenótipo autofágico, como determinado por citometria de fluxo e imunodetecção de proteínas marcadoras de autofagia como LC3 e o p62/SQSTM1. A autofagia temporalmente precedeu a apoptose e exerceu função citoprotetora, uma vez que o bloqueio da terminação autofágica com cloroquina promoveu uma significante redução na viabilidade celular, a qual foi associada a um aumento de apoptose em células de glioma tratadas com TMZ/SAHA. Portanto, os dados apresentados neste trabalho demonstram que a autofagia é um processo que diminui a eficácia antiglioma do temozolomida e do ácido hidroxâmico suberoilanilida, e a inibição deste fenômeno pode ser uma estratégia para aperfeiçoar a terapia com esses fármacos. / Glioblastoma multiforme (GBM) is the most frequent and aggressive type of primary brain tumor which has been associated with a dismal prognosis. In this study, we tested the efficacy of combining temozolomide (TMZ) with suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA) - an inhibitor of HDACs 1, 2, 3, and 6 approved for the treatment of cutaneous T-cell lymphoma - in the viability of tumor cells. The data showed that potentiation synergism between TMZ e SAHA was not achieved due to activation of protective autophagy in vitro. The SAHA/TMZ treatment promoted arrest in the G2/M phase of the cell cycle as soon as 48 h after drug exposure whereas apoptosis was only detected after long-lasting exposure (≥96 h). In addition, SAHA and TMZ induced autophagy as detected by flow cytometry of acridine orange stained cells and immunodetection of the lipidated form of LC3 as well as decreases in p62/SQSTM1. Autophagy preceded apoptosis, and by blocking the termination step of autophagy with chloroquine promoted a significant reduction in the viability of glioma cells which was accompanied by increased apoptosis in SAHA/TMZ treatment. Overall, the herein presented data demonstrate that autophagy impairs the efficacy of combined TMZ/SAHA, and inhibiting this phenomenon could provide novel opportunities to improve the therapeutic potential of these compounds.

Glioblastoma multiforme é o tipo mais frequente de tumor cerebral primário, sendo caracterizado por uma alta agressividade e um prognóstico bastante limitado. O ácido hidroxâmico suberoilanilida (SAHA) é um inibidor específico de histonas desacetilases aprovado para o tratamento de linfoma cutâneo de células T, e em fase de crescente investigação clínica e pré-clínica em tumores sólidos. Neste estudo, avaliamos a eficácia do ácido hidroxâmico suberoilanilida em tratamento combinado com temozolomida, o agente alquilante já utilizado em glioblastomas. Através de testes de viabilidade e analises por citometria de fluxo em células tumorais das linhagens U251MG e C6, observamos que não houve sinergismo de potenciação entre temozolomida e ácido hidroxâmico suberoilanilida, apenas efeito sinergismo de adição O tratamento combinado inicialmente promoveu parada do ciclo celular em fase G2/M (≥48 h) ao passo que a apoptose foi detectada apenas em exposição prolongada (≥96 h) aos fármacos em estudo. Ainda, as células tratadas com TMZ/SAHA apresentaram fenótipo autofágico, como determinado por citometria de fluxo e imunodetecção de proteínas marcadoras de autofagia como LC3 e o p62/SQSTM1. A autofagia temporalmente precedeu a apoptose e exerceu função citoprotetora, uma vez que o bloqueio da terminação autofágica com cloroquina promoveu uma significante redução na viabilidade celular, a qual foi associada a um aumento de apoptose em células de glioma tratadas com TMZ/SAHA. Portanto, os dados apresentados neste trabalho demonstram que a autofagia é um processo que diminui a eficácia antiglioma do temozolomida e do ácido hidroxâmico suberoilanilida, e a inibição deste fenômeno pode ser uma estratégia para aperfeiçoar a terapia com esses fármacos. / Glioblastoma multiforme (GBM) is the most frequent and aggressive type of primary brain tumor which has been associated with a dismal prognosis. In this study, we tested the efficacy of combining temozolomide (TMZ) with suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA) - an inhibitor of HDACs 1, 2, 3, and 6 approved for the treatment of cutaneous T-cell lymphoma - in the viability of tumor cells. The data showed that potentiation synergism between TMZ e SAHA was not achieved due to activation of protective autophagy in vitro. The SAHA/TMZ treatment promoted arrest in the G2/M phase of the cell cycle as soon as 48 h after drug exposure whereas apoptosis was only detected after long-lasting exposure (≥96 h). In addition, SAHA and TMZ induced autophagy as detected by flow cytometry of acridine orange stained cells and immunodetection of the lipidated form of LC3 as well as decreases in p62/SQSTM1. Autophagy preceded apoptosis, and by blocking the termination step of autophagy with chloroquine promoted a significant reduction in the viability of glioma cells which was accompanied by increased apoptosis in SAHA/TMZ treatment. Overall, the herein presented data demonstrate that autophagy impairs the efficacy of combined TMZ/SAHA, and inhibiting this phenomenon could provide novel opportunities to improve the therapeutic potential of these compounds.

Gliomas apresentam um prognóstico precário apesar das múltiplas modalidades terapêuticas como ressecção neurocirúrgica, radioterapia e quimioterapia, possivelmente pelo seu alto nível de invasividade e resistência aos tratamentos. Estudos recentes demonstraram que o peptídeo liberador de gastrina (GRP), assim como seu receptor, possui efeitos importantes no desenvolvimento de muitos tumores, inclusive de gliomas. O receptor de GRP está super expresso em linhagens celulares de glioblastomas tendo sua função relacionada com a proliferação celular, estimulando o crescimento tumoral. No presente estudo, foi investigado o efeito do RC-3095, um antagonista seletivo do receptor de GRP, como mono terapia e em associação à temozolamida (TMZ), um agente citotóxico alquilante de DNA, em modelos experimentais de células de glioma da linhagem C6 de rato in vitro e in vivo. A proliferação celular foi reduzida tanto por RC-3095 quanto por TMZ, porém quando ambos os agentes foram administrados em associação, a redução da proliferação foi significativamente mais efetiva. Nos experimentos in vivo, o grupo controle apresentou os tumores maiores (52 ± 15.5 mm3), enquanto RC-3095 reduziu o tamanho tumoral, tendo um efeito mais efetivo na dose 0.3 mg/kg (21 ± 9.7 mm3). Porém, a combinação dos dois agents produziu a maior redução no tamanho tumoral (10 ± 7.5 mm3), assim como, apresentou índices histológicos menos agressivos. Nossos resultados demonstram que a combinação de RC-3095 e temozolamida produz uma maior redução tumoral em modelos experimentais de glioma de rato indicando que RC-3095 pode ser um forte candidato para associação à temozolamida potencializando os efeitos de agentes alquilantes de DNA no tratamento de gliomas multiformes. / Malignant gliomas have a dismal prognosis despite multi-modality treatments like neurosurgical resection, radiation therapy and chemotherapy, mainly due to their high level of invasion. Recent studies demonstrated that gastrin-releasing peptide (GRP) and its receptors play a role in the development of a variety of cancers including gliomas. The GRP receptor was shown to be over-expressed on glioblastoma cell lines and its function is related with cellular growth. In the present study, we investigated the effects of RC-3095, a selective antagonist of the GRP receptor, alone and in combination with temozolomide (TMZ), a DNA alkylating agent, in vitro and in vivo using experimental rat C6 glioma models. Cellular proliferation was reduced in all treatments (TMZ, RC-3095 and TMZ + RC-3095) with the administration of TMZ together with RC-3095 being the most effective. In in vivo experiments, the control group displayed the largest tumors (52 ± 15.5 mm3), whereas RC-3095 reduced the tumor size, with the most significant effect observed at the dose of 0.3mg/kg (21 ± 9.7 mm3). The combined therapy produced the largest reduction in tumor size (10 ± 7.5 mm3), greater than with either treatment alone. Ours results show that the combination of RC-3095 and TMZ have additive effects on the in vitro and in vivo glioma growth therefore making RC-3095 a candidate drug to potentiate the effects of the DNA alkylanting agent temozolomide in the treatment of malignant gliomas.

Gliomas apresentam um prognóstico precário apesar das múltiplas modalidades terapêuticas como ressecção neurocirúrgica, radioterapia e quimioterapia, possivelmente pelo seu alto nível de invasividade e resistência aos tratamentos. Estudos recentes demonstraram que o peptídeo liberador de gastrina (GRP), assim como seu receptor, possui efeitos importantes no desenvolvimento de muitos tumores, inclusive de gliomas. O receptor de GRP está super expresso em linhagens celulares de glioblastomas tendo sua função relacionada com a proliferação celular, estimulando o crescimento tumoral. No presente estudo, foi investigado o efeito do RC-3095, um antagonista seletivo do receptor de GRP, como mono terapia e em associação à temozolamida (TMZ), um agente citotóxico alquilante de DNA, em modelos experimentais de células de glioma da linhagem C6 de rato in vitro e in vivo. A proliferação celular foi reduzida tanto por RC-3095 quanto por TMZ, porém quando ambos os agentes foram administrados em associação, a redução da proliferação foi significativamente mais efetiva. Nos experimentos in vivo, o grupo controle apresentou os tumores maiores (52 ± 15.5 mm3), enquanto RC-3095 reduziu o tamanho tumoral, tendo um efeito mais efetivo na dose 0.3 mg/kg (21 ± 9.7 mm3). Porém, a combinação dos dois agents produziu a maior redução no tamanho tumoral (10 ± 7.5 mm3), assim como, apresentou índices histológicos menos agressivos. Nossos resultados demonstram que a combinação de RC-3095 e temozolamida produz uma maior redução tumoral em modelos experimentais de glioma de rato indicando que RC-3095 pode ser um forte candidato para associação à temozolamida potencializando os efeitos de agentes alquilantes de DNA no tratamento de gliomas multiformes. / Malignant gliomas have a dismal prognosis despite multi-modality treatments like neurosurgical resection, radiation therapy and chemotherapy, mainly due to their high level of invasion. Recent studies demonstrated that gastrin-releasing peptide (GRP) and its receptors play a role in the development of a variety of cancers including gliomas. The GRP receptor was shown to be over-expressed on glioblastoma cell lines and its function is related with cellular growth. In the present study, we investigated the effects of RC-3095, a selective antagonist of the GRP receptor, alone and in combination with temozolomide (TMZ), a DNA alkylating agent, in vitro and in vivo using experimental rat C6 glioma models. Cellular proliferation was reduced in all treatments (TMZ, RC-3095 and TMZ + RC-3095) with the administration of TMZ together with RC-3095 being the most effective. In in vivo experiments, the control group displayed the largest tumors (52 ± 15.5 mm3), whereas RC-3095 reduced the tumor size, with the most significant effect observed at the dose of 0.3mg/kg (21 ± 9.7 mm3). The combined therapy produced the largest reduction in tumor size (10 ± 7.5 mm3), greater than with either treatment alone. Ours results show that the combination of RC-3095 and TMZ have additive effects on the in vitro and in vivo glioma growth therefore making RC-3095 a candidate drug to potentiate the effects of the DNA alkylanting agent temozolomide in the treatment of malignant gliomas.

Gliomas apresentam um prognóstico precário apesar das múltiplas modalidades terapêuticas como ressecção neurocirúrgica, radioterapia e quimioterapia, possivelmente pelo seu alto nível de invasividade e resistência aos tratamentos. Estudos recentes demonstraram que o peptídeo liberador de gastrina (GRP), assim como seu receptor, possui efeitos importantes no desenvolvimento de muitos tumores, inclusive de gliomas. O receptor de GRP está super expresso em linhagens celulares de glioblastomas tendo sua função relacionada com a proliferação celular, estimulando o crescimento tumoral. No presente estudo, foi investigado o efeito do RC-3095, um antagonista seletivo do receptor de GRP, como mono terapia e em associação à temozolamida (TMZ), um agente citotóxico alquilante de DNA, em modelos experimentais de células de glioma da linhagem C6 de rato in vitro e in vivo. A proliferação celular foi reduzida tanto por RC-3095 quanto por TMZ, porém quando ambos os agentes foram administrados em associação, a redução da proliferação foi significativamente mais efetiva. Nos experimentos in vivo, o grupo controle apresentou os tumores maiores (52 ± 15.5 mm3), enquanto RC-3095 reduziu o tamanho tumoral, tendo um efeito mais efetivo na dose 0.3 mg/kg (21 ± 9.7 mm3). Porém, a combinação dos dois agents produziu a maior redução no tamanho tumoral (10 ± 7.5 mm3), assim como, apresentou índices histológicos menos agressivos. Nossos resultados demonstram que a combinação de RC-3095 e temozolamida produz uma maior redução tumoral em modelos experimentais de glioma de rato indicando que RC-3095 pode ser um forte candidato para associação à temozolamida potencializando os efeitos de agentes alquilantes de DNA no tratamento de gliomas multiformes. / Malignant gliomas have a dismal prognosis despite multi-modality treatments like neurosurgical resection, radiation therapy and chemotherapy, mainly due to their high level of invasion. Recent studies demonstrated that gastrin-releasing peptide (GRP) and its receptors play a role in the development of a variety of cancers including gliomas. The GRP receptor was shown to be over-expressed on glioblastoma cell lines and its function is related with cellular growth. In the present study, we investigated the effects of RC-3095, a selective antagonist of the GRP receptor, alone and in combination with temozolomide (TMZ), a DNA alkylating agent, in vitro and in vivo using experimental rat C6 glioma models. Cellular proliferation was reduced in all treatments (TMZ, RC-3095 and TMZ + RC-3095) with the administration of TMZ together with RC-3095 being the most effective. In in vivo experiments, the control group displayed the largest tumors (52 ± 15.5 mm3), whereas RC-3095 reduced the tumor size, with the most significant effect observed at the dose of 0.3mg/kg (21 ± 9.7 mm3). The combined therapy produced the largest reduction in tumor size (10 ± 7.5 mm3), greater than with either treatment alone. Ours results show that the combination of RC-3095 and TMZ have additive effects on the in vitro and in vivo glioma growth therefore making RC-3095 a candidate drug to potentiate the effects of the DNA alkylanting agent temozolomide in the treatment of malignant gliomas.

Orientadora: Profa. Dra. Maria Cristina Carlan da Silva / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2018. / A relação entre a presença do Citomegalovírus Humano (HCMV) e diversos tipos de tumores tem sido alvo de investigação por décadas, e em especial, em Glioblastoma Multiforme (GBM). O GBM é o mais maligno tumor do Sistema Nervoso Central (SNC), com baixa sobrevida mesmo após o tratamento. Nosso grupo e outros demonstraram a presença do HCMV neste tipo de tumor restrita a uma pequena quantidade de células, além disso, vários mecanismos de aumento de malignidade tumoral mediados pelo HCMV já foram demonstrados in vitro e in vivo. As principais drogas utilizadas durante o tratamento quimioterápico, Temozolamida (TMZ) e Carmustina (BCNU), levam a adição de adutos no DNA, criando erros durante a replicação celular. Estudos demonstram que o HCMV pode modular vias de reparo de DNA em fibroblastos, entretanto, o possível efeito durante a quimioterapia não é conhecido. Com isto, neste trabalho avaliou-se a infecção viral de linhagens celulares de GBM bem como a resposta das mesmas ao tratamento com TMZ e BCNU. Demonstrou-se que linhagens de GBM U87MG, A172, U251MG e TP365MG são suscetíveis a infecção por HCMV, mas não igualmente permissíveis as linhagens virais laboratoriais (AD169) e clínica (TB40), provavelmente refletindo a infectividade do vírus nos tumores. Observou-se também uma diminuição na viabilidade celular nas linhagens TP365MG e U251MG infectadas com HCMV, de maneira dependente da multiplicidade de infecção (MOI). Na presença concomitante de drogas e vírus também ocorre a diminuição de viabilidade MOI dependente, especificamente em TP365MG tratada com BCNU. Em suma, os resultados indicam que a permissibilidade do HCMV em células de GBM é determinada por fatores celulares/hospedeiro e não por fatores virais. Por fim, o vírus também não aumenta a resistência ao tratamento por TMZ e BCNU em linhagens U251MG e TP365MG, entretanto, devido a heterogeneidade tumoral mais estudos são necessários em outros tipos celulares, especialmente em células tronco tumorais, levando a um melhor entendimento do possível efeito do vírus durante o tratamento quimioterápico / The relationship between the Human Cytomegalovirus (HCMV) and different types of tumors has been investigated for many decades, especially in Glioblastoma Multiforme (GBM). GBM is the most malignant tumor of the Nervous Central System (SNC), with a low overall survival even after treatment. We and others demonstrated the presence of HCMV in this type of tumor, restricted to a small number of cells, and various studies showed that the virus can increase cell malignancy both in vitro and in vivo. The chemotherapeutic agents Temozolomide (TMZ) and Carmustine (BCNU) used in GBM treatment lead to insertion of adducts in the DNA, creating errors during replication. It is well known that HCMV can modulate DNA repair pathways in fibroblasts, however, the possible effect of the virus during chemotherapy is not known. In this work we analyzed viral infection in GBM cell lines and their response to the TMZ and BCNU. We demonstrated that A172, U251MG and TP365MG GBM cell lines are susceptible to HCMV infection, but not equally permissive to both laboratory (AD169) and clinical strains (TB40), likely reflecting infection in the tumor. Additionally, we show a decrease in cell viability in TP365MG and U251MG infected with HCMV, in a MOI dependent manner. In infected and treated with chemotherapeutic drugs cells, there is also a reduction in cell viability MOI dependent in TP365MG treated with BCNU. Overall our results indicate that HCMV permissiveness in GBM cells is determined by host/cellular rather than viral factors and that the virus does not increase cell resistance to chemotherapeutic drugs in U251MG and TP365MG. Due to the tumor heterogeneity, more studies need to be performed in other tumor cells, especially in cancer stem cells, to lead to a better understanding of the possible effect of the virus during chemotherapy.

O glioblastoma (GBM) é o tumor primário do sistema nervoso central mais frequente no adulto, com sobrevida média de aproximadamente 12 meses. Múltiplas alterações genéticas e epigenéticas presentes neste tumor determinam sua biologia e fenótipo bastante agressivos. Assim, o presente estudo objetivou estudar a expressão dos genes envolvidos no Índice de Radiossensibilidade (RSI) e do gene MGMT em amostras de tumor primário humano de GBM, buscando identificar a associação destes com radiossensibilidade e sobrevida. Foram analisadas as características epidemiológicas, de evolução e desfecho clínico de 28 pacientes com GBM que fizeram uso de temozolamida (TMZ), cujos prontuários físicos e eletrônicos foram revisados no Serviço de Arquivo Médico (SAM) e Sistema Athos. Foi observado que 64,29% dos pacientes possuíam mais de 50 anos de idade e eram do sexo masculino; 86,36% possuíam o Karnofsky Performance Status acima ou igual a 80%; 57,14% possuíam localização não eloquente; 78,57% apresentavam lesão residual; 89,29% não foram reexpostos à radioterapia; 64,29% não fizeram uso de temozolamida metronômica; 96,43% não foram submetidos a outra quimioterapia; 78,57% não realizaram reabordagem cirúrgica; 60,71% tiveram progressão tardia e/ou não tiveram progressão da doença. Também foi evidenciado que tanto a regressão bruta de cada gene separadamente, quanto a regressão ajustada para os fatores clínicos mais relevantes (idade ao diagnóstico, localização do tumor e presença de lesão residual) não evidenciaram significância estatística em relação à progressão tardia. A relação entre o tempo de sobrevida global e a expressão dos genes ajustada para os mesmos fatores clínicos evidenciou significância estatística para os genes RELA (HR 1,265 / p = 0,01); c-Jun (HR 1,237 / p = 0,03) e c-ABL (HR 0,33 / p = 0,04). A análise de sobrevida livre de progressão ajustada mostrou diferença significativa (p = 0,04) entre os grupos com tumor de localização eloquente e não eloquente, assim como para a expressão do gene RELA (HR 1,107 / p = 0,03). Em relação à expressão gênica e a sobrevida global ou sobrevida livre de progressão dos pacientes pelo teste de Log-rank não foi observada diferença estatística. Na análise da expressão gênica com as variáveis clínico-epidemiológicas, a expressão do gene SUMO1 foi significativamente aumentada (p = 0,009) no grupo com progressão tardia com relação ao grupo com progressão precoce da doença, a expressão do AR apresentou aumento significativo (p = 0,021) no grupo em que a TMZ metronômica não foi administrada e as expressões dos genes RELA (p = 0,03),c-Jun (p = 0,005), STAT1 (p = 0.009) e HDAC1 (p = 0.044) estava elevada nos pacientes que apresentaram o exame neurológico pré-operatório normal. Esses dados indicam que o conjunto dos genes do RSI e o MGMT não demonstraram ser preditores de radiossensibilidade. Podemos inferir que RELA, c-Jun e c-ABL são potenciais marcadores de pior prognóstico e que SUMO1 pode ser um marcador de bom prognóstico / Glioblastoma (GBM) is the primary tumor of the central nervous system most common in adults, with a median survival of approximately 12 months. Multiple genetic and epigenetic alterations present in this tumor determine its biology and phenotype very aggressive. Thus, the present study aimed to study the expression of genes involved in radiosensitivity index (RSI) and the MGMT gene in GBM human primary tumor samples, seeking to identify the association of these with radiosensitivity and survival. The epidemiological evolution and clinical characteristics of 28 GBM patients who used temozolamide (TMZ), whose physical and electronic medical records were reviewed in the Medical File Service (SAM) and Athos System, were analyzed. It was observed that 64.29% of the patients were over 50 years of age and were male; 86.36% had Karnofsky Performance Status of 80 or more; 57.14% had no eloquent location; 78.57% had residual lesion; 89.29% did not have reexposure to radiotherapy; 64.29% did not use metronomic temozolamide; 96.43% did not undergo another chemotherapy; 78.57% did not undergo surgical reassessment; 60.71% had late progression and / or had no disease progression. It was also evidenced that both the gross regression of each gene separately and the regression adjusted for the most relevant clinical factors (age at diagnosis, tumor location and presence of residual lesion) did not show statistical significance in relation to the late progression. The relationship between overall survival time and gene expression adjusted for the same clinical factors showed statistical significance for RELA genes (HR 1.265 / p = 0.01), c-Jun (HR 1.237 / p = 0.03) and c-ABL (HR 0.33 / p = 0.04). Adjusted progression-free survival analysis showed a significant difference (p = 0.04) between the groups with eloquent and noneloquent localization, as well as RELA gene expression (HR 1,107 / p = 0.03). Regarding the gene expression and overall survival or progression-free survival of the patients by the Logrank test, no statistical difference was observed. In the analysis of the expression genes with the clinical-epidemiological variables the expression of the SUMO1 gene was significantly increased (p = 0.009) in the group with late progression in relation to the group with early disease progression, the expression of AR showed a significant increase (p = 0.021) in the group in which the metronomic TMZ was not administered and the RELA (p = 0.03), c-Jun (p = 0.005), STAT1 (p = 0.009) and HDAC1 (p = 0.044) gene expressions were elevated in patients who had normal preoperative neurologic examination. These data indicate that the set of RSIgenes and MGMT were not shown to be predictors of radiosensitivity. We can infer that RELA, c-Jun and c-ABL are potential markers of worse prognosis and that SUMO1 may be a marker of good prognosis