A cell that senses signals from its environment uses proteins for signal transduction via post translational modifications (PTMs) and protein- protein interactions (PPIs) from cell membrane into the nucleus where genes controlling cell proliferation, differentiation and apoptosis can be turned on or off, i.e. changing the phenotype or fate of the cell. Aberrations within such proteins are prone to cause diseases, such as cancer. Therefore, it is important so study aberrant signaling to be able to understand and treat diseases. In this thesis, signaling aberrations of PTMs and PPIs were analyzed with the use of the in situ proximity ligation assay (in situ PLA), and the thesis also contain method development of rolling circle amplification (RCA), which is the method used for signal amplification of in situ PLA reaction products. Paper I considers the integrity of RCA products. Here, the aim was to generate a smaller and more compact RCA product, for more accurate either visual or automated analysis. This was achieved with the use of an additional so called compaction oligonucleotide that during RCA was able to bind and pull segments of RCA products closer together. The compaction oligonucleotide served to increase the signal to noise ratio and decrease the number of false positive signals. The crosstalk between the Hippo and TGFβ signaling pathways were studied in paper II. Activity of the Hippo signaling pathway is regulated by cell density sensing and tissue control. We found differences in amounts and localization of interactions between the effector proteins of the two pathways depending on cell density and TGFβ stimulation. In paper III the NF-кB signaling pathway constitutively activated in chronic lymphocytic leukemia (CLL) was studied. A 4 base-pair frameshift deletion within the NFKBIE gene, which encodes the negative regulator IкBε, was found among 13 of a total 315 cases by the use of targeted deep sequencing. We found reduced levels of IкBε protein, decreased p65 inhibition, and increased phosphorylation, along with increased nuclear localization of p65 in NFKBIE deleted cases compared to healthy cases. Crosstalk between the Hippo and Wnt signaling pathway are studied within paper IV. Here, we found differences in cellular localization of TAZ/β-catenin interactions depending on colon cancer tumor stage and by further investigate Hippo/WNT crosstalk in cell line model systems we found an increase of complex formations involved in the crosstalk in sparse growing HEK293 cells compared to dense growing cells. Also, active WNT3a signaling was affected by cell density. Since cell density showed to have a big effect on Hippo/WNT crosstalk we continued to investigated the effect of E-cadherin, which has a function in cell junctions and maintenance of epithelial integrity on Hippo/WNT crosstalk. Interestingly, we found that E-cadherin is likely to regulate Hippo/WNT crosstalk.

Le TGFB(bêta) est un facteur clé dans l'homéostasie du réseau vasculaire. Le laboratoire a découvert que le TGFB(bêta) induit des podosomes dans les cellules endothéliales (CE) artérielles in vitro. Ces microdomaines riches en F-actine, sont capables de dégrader localement la matrice extracellulaire. Nous avons mis en évidence des structures de même type dans l’endothélium natif, démontrant la pertinence des observations in vitro. Les CE expriment 2 récepteurs de type I au TGFB(bêta), ALK5 et ALK1, dont les fonctions respectives sur les CE font l’objet de controverses. Nous montrons in vitro, que l’assemblage des podosomes est dépendant de ALK1 et est induit dans un contexte d'activation de la CE. La fibronectine, présente dans la matrice lors de situations d'activation de la CE, est régulée par TGFB(bêta) /ALK1 dans notre modèle et est essentielle à la formation des podosomes. L'ensemble des données obtenues laisse présager un rôle des podosomes endothéliaux dans le remodelage artériel en réponse au TGFB(bêta). / TGFB(beta), a pleiotrop cytokine, acts as an important regulator for the maintenance of vascular homeostasis. Our team has discovered, for the first time, that TGFB(beta) induces podosomes formation in aortic endothelial cells (EC) in vitro. Podosomes are highly dynamic adhesion microdomains formed at the ventral membrane, consisting of a core of F-actin and actin-associated proteins, surrounded by a ring structure which in turn is consisting of plaque proteins as well as signaling proteins. In addition to the presence of specific markers, they are distinguished from other adhesion structures by the presence of metalloproteases, endowing them with the ability to degrade the extracellular matrix locally. We have bringing to light these structures in the endothelium of native arterial vessel exposed to biologically active TGFB(beta), showing relevance of these structures. Endothelial cells express two types I receptors of TGFB(beta), ALK5 and ALK1, which relative function on EC are controversial. We show in our model in vitro, that podosomes formation is ALK1-dependent and are induced when EC are in an active background. Fibronectin, an extracellular matrix component which is present during active situation, is regulated by TGFB(beta)/ALK1 signaling pathway and is essential for podosomes formation. This work open up new avenues to study the role of podosomes in vascular pathophysiology. We propose that podosomes are involved in arterial vessel remodeling.

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Neste estudo avaliou-se os efeitos do diabetes mellitus (DM) sobre dois sistemas: glândula parótida de ratos e células cultivadas in vitro. Foram avaliados respectivamente a composição da matriz extracelular e a migração de células expostas a elevada concentração de glicose. Na parótida observou-se aumento de colágenos III, IV e V, laminina e fibronectina, mediado por TGFb2. Em células isoladas observou-se que a glicose dificultou a polarização celular, reduziu a velocidade e direcionalidade de migração, reduziu a persistência e estabilidade das protrusões celulares e a maturação de adesões. Estas alterações estão relacionadas à ativação da GTPase Rac1, dependente de estresse oxidativo. Este estudo sugere, pela primeira vez, que: 1) a hipofunção salivar pode envolver um espessamento da lâmina basal de capilares e parênquima por mecanismos previamente observados em outros orgãos-alvo de complicações diabéticas e 2) que a glicose exerce um efeito direto sobre a migração celular, fator que pode contribuir para a cicatrização deficiente em indivíduos diabéticos. / In this study we evaluated the effects of DM on two different systems: the rat parotid gland and in vitro cultured cells. Extracellular matrix composition and the migratory behavior of cells exposed to a high glucose concentration (HG) were evaluated, respectively. In the parotid, DM led to an increase in collagens III, IV and V, laminin and fibronectin, through a TGFb2-dependent mechanism. In cultured cells, HG impaired cell polarization, reduced migration velocity and directionality, reduced the persistence and stability of protrusive cellular processes, as well as adhesion maturation. These effects were related to Rac1 GTPase activation, dependent on the oxidative stress promoted by HG. This study suggests, for the first time, that: 1) salivary hypofunction in DM might involve the thickening of capillary and parenchyma basal lamina, through mechanisms already described in other target organs for diabetic complications and 2) that glucose directly impairs cell migration, and this effect may contribute to the chronic wound healing observed in diabetic patients.

Neste estudo avaliou-se os efeitos do diabetes mellitus (DM) sobre dois sistemas: glândula parótida de ratos e células cultivadas in vitro. Foram avaliados respectivamente a composição da matriz extracelular e a migração de células expostas a elevada concentração de glicose. Na parótida observou-se aumento de colágenos III, IV e V, laminina e fibronectina, mediado por TGFb2. Em células isoladas observou-se que a glicose dificultou a polarização celular, reduziu a velocidade e direcionalidade de migração, reduziu a persistência e estabilidade das protrusões celulares e a maturação de adesões. Estas alterações estão relacionadas à ativação da GTPase Rac1, dependente de estresse oxidativo. Este estudo sugere, pela primeira vez, que: 1) a hipofunção salivar pode envolver um espessamento da lâmina basal de capilares e parênquima por mecanismos previamente observados em outros orgãos-alvo de complicações diabéticas e 2) que a glicose exerce um efeito direto sobre a migração celular, fator que pode contribuir para a cicatrização deficiente em indivíduos diabéticos. / In this study we evaluated the effects of DM on two different systems: the rat parotid gland and in vitro cultured cells. Extracellular matrix composition and the migratory behavior of cells exposed to a high glucose concentration (HG) were evaluated, respectively. In the parotid, DM led to an increase in collagens III, IV and V, laminin and fibronectin, through a TGFb2-dependent mechanism. In cultured cells, HG impaired cell polarization, reduced migration velocity and directionality, reduced the persistence and stability of protrusive cellular processes, as well as adhesion maturation. These effects were related to Rac1 GTPase activation, dependent on the oxidative stress promoted by HG. This study suggests, for the first time, that: 1) salivary hypofunction in DM might involve the thickening of capillary and parenchyma basal lamina, through mechanisms already described in other target organs for diabetic complications and 2) that glucose directly impairs cell migration, and this effect may contribute to the chronic wound healing observed in diabetic patients.

La variante lymphocytaire du syndrome hyperéosinophilique (L-SHE) est une pathologie extrêmement rare caractérisée par une prolifération monoclonale de lymphocytes T surproduisant l’interleukine IL-5, responsable d’une hyperéosinophilie persistante. En outre, un immunophénotype aberrant CD3−CD4+ est fréquemment observé à la surface des cellules T clonales. Cette pathologie se distingue par une lymphoprolifération chronique indolente habituellement révélée par une hyperéosinophilie sanguine et une infiltration éosinophilique des tissus cutanés. Toutefois, l’évolution vers un lymphome T observée chez certains patients suggère la présence d’un potentiel malin des cellules T. Ce modèle représente donc une rare opportunité d’identifier les changements moléculaires liés aux différentes étapes du processus transformant lymphoïde T. Dans le cadre de ce travail, nous avons cherché à établir les caractéristiques cytogénétiques et moléculaires des cellules T CD3−CD4+ d’une cohorte de patients L-SHE. L’analyse cytogénétique de cellules T CD3−CD4+ isolées au moment du diagnostic chez deux patientes (P1 et P2) a révélé la présence d’une délétion similaire 6q13-q22.1. En étudiant les stades cliniques successifs de P1 et P2, nous avons montré la persistance des cellules porteuses de la délétion 6q au cours de la progression chronique et leur prédominance lors du développement d’un lymphome T chez P1. Ces résultats suggèrent l’implication précoce et potentiellement critique de la délétion 6q dans cette pathologie lymphoproliférative T. L’analyse des dérégulations transcriptionnelles résultant de ce remaniement a montré une réduction de l’expression des gènes pro-apototiques BACH2 et PA26 dans les cellules T CD3−CD4+ de P1 et P2. En particulier, BACH2, dont l’expression diminue continuellement au cours de l’évolution de P1, jouerait un rôle oncosuppresseur dans la lymphogenèse T. Afin d’identifier les modifications moléculaires des cellules T clonales, nous avons analysé l’expression de 95% des gènes humains dans les cellules T CD3−CD4+ de trois patients en phase chronique (P1, P2 et P3). La grande homologie des changements transcriptionnels chez les trois patients indique une altération des mêmes mécanismes moléculaires. Ainsi, un profil immunophénotypique exhaustif, validé chez trois patients supplémentaires, a pu être établi. En outre, les dérégulations des voies apoptotiques, TGFβ ou 9 encore de signalisation intracellulaire altèrent l’homéostasie des cellules T CD3−CD4+ pouvant favoriser la perte de la capacité apoptotique et/ou la croissance cellulaire. Cette signature moléculaire a été étendue par l’identification de 20 microARNs dont l’expression est dérégulée dans les cellules T CD3−CD4+ d’une cohorte de 6 patients. Par ailleurs, la modification de l’expression des récepteurs impliqués dans la migration leucocytaire au cours de l’évolution de P1 pourrait expliquer l’infiltration ganglionnaire des cellules T clonales et la progression du lymphome. La caractérisation des désordres cytogénétiques et moléculaires des cellules T CD3−CD4+ chez les patients L-SHE permettrait à terme d’identifier de nouveaux marqueurs diagnostiques et contribuer ainsi au développement de nouvelles cibles thérapeutiques dans une grande diversité de pathologies lymphoprolifératives de type Th2.

The transforming growth factor beta (TGFβ)/activin signaling pathway has a number of documented roles during wound healing and is becoming increasingly appreciated as a vital component of multi-tissue regeneration. The leopard gecko (Eublepharis macularius) is able to spontaneously, and repeatedly, regenerate its tail following tail loss. We thus examined the expression and localization of several key components of the TGFβ/activin signaling pathway during tail regeneration of the leopard gecko. We observed a marked increase in phosphorylated-Smad2 expression among regenerating tissues corresponding to the location of the regenerate blastema. Interestingly, we observe that during early regeneration there appears to be an absence of TGFβ family member TGFβ1 and instead a strong upregulation of activin-βA. We also observe the expression of EMT transcription factors Snail1 and Snail2 in blastemal tissue. These observations combined with other data provide strong support for the importance of unique and non-overlapping expression patterns of different TGFβ ligands during multi-tissue regeneration

As some of the most important and widely utilised intercellular signalling molecules, transforming growth factor βs (TGFβs) play critical roles in normal development and in human disease. Establishing appropriate levels of signalling involves positive and negative feedback, driven by the same signal transduction components, but whether or how the two are distinguished has not previously been understood. Here we show that LIM domain binding proteins (Ldbs) drive the Smad6/7-mediated negative feedback of TGFβ signalling, but they are not required for the ligand-driven positive feedback or other downstream transcriptional activation. In Ldb-deficient zebrafish embryos, the homeostasis of TGFβ signalling is perturbed. As a consequence, signalling of TGFβ family members, Nodal and BMP, is stably enhanced, giving rise to excess mesoderm and endoderm, an effect that can be rescued by reducing Nodal and BMP. Later in development, conditional ldb2a knockdown causes defective vascular, angiogenic and haemogenic development, likely also by elevating TGFβ signalling. Thus, Ldbs control the homeostatic regulation of TGFβ signalling and therefore play critical roles in diverse developmental processes.

La variante lymphocytaire du syndrome hyperéosinophilique (L-SHE) est une pathologie extrêmement rare caractérisée par une prolifération monoclonale de lymphocytes T surproduisant l’interleukine IL-5, responsable d’une hyperéosinophilie persistante. En outre, un immunophénotype aberrant CD3−CD4+ est fréquemment observé à la surface des cellules T clonales. Cette pathologie se distingue par une lymphoprolifération chronique indolente habituellement révélée par une hyperéosinophilie sanguine et une infiltration éosinophilique des tissus cutanés. Toutefois, l’évolution vers un lymphome T observée chez certains patients suggère la présence d’un potentiel malin des cellules T. Ce modèle représente donc une rare opportunité d’identifier les changements moléculaires liés aux différentes étapes du processus transformant lymphoïde T.<p>Dans le cadre de ce travail, nous avons cherché à établir les caractéristiques cytogénétiques et moléculaires des cellules T CD3−CD4+ d’une cohorte de patients L-SHE. L’analyse cytogénétique de cellules T CD3−CD4+ isolées au moment du diagnostic chez deux patientes (P1 et P2) a révélé la présence d’une délétion similaire 6q13-q22.1. En étudiant les stades cliniques successifs de P1 et P2, nous avons montré la persistance des cellules porteuses de la délétion 6q au cours de la progression chronique et leur prédominance lors du développement d’un lymphome T chez P1. Ces résultats suggèrent l’implication précoce et potentiellement critique de la délétion 6q dans cette pathologie lymphoproliférative T. L’analyse des dérégulations transcriptionnelles résultant de ce remaniement a montré une réduction de l’expression des gènes pro-apototiques BACH2 et PA26 dans les cellules T CD3−CD4+ de P1 et P2. En particulier, BACH2, dont l’expression diminue continuellement au cours de l’évolution de P1, jouerait un rôle oncosuppresseur dans la lymphogenèse T.<p>Afin d’identifier les modifications moléculaires des cellules T clonales, nous avons analysé l’expression de 95% des gènes humains dans les cellules T CD3−CD4+ de trois patients en phase chronique (P1, P2 et P3). La grande homologie des changements transcriptionnels chez les trois patients indique une altération des mêmes mécanismes moléculaires. Ainsi, un profil immunophénotypique exhaustif, validé chez trois patients supplémentaires, a pu être établi. En outre, les dérégulations des voies apoptotiques, TGFβ ou<p>9<p>encore de signalisation intracellulaire altèrent l’homéostasie des cellules T CD3−CD4+ pouvant favoriser la perte de la capacité apoptotique et/ou la croissance cellulaire. Cette signature moléculaire a été étendue par l’identification de 20 microARNs dont l’expression est dérégulée dans les cellules T CD3−CD4+ d’une cohorte de 6 patients. Par ailleurs, la modification de l’expression des récepteurs impliqués dans la migration leucocytaire au cours de l’évolution de P1 pourrait expliquer l’infiltration ganglionnaire des cellules T clonales et la progression du lymphome.<p>La caractérisation des désordres cytogénétiques et moléculaires des cellules T CD3−CD4+ chez les patients L-SHE permettrait à terme d’identifier de nouveaux marqueurs diagnostiques et contribuer ainsi au développement de nouvelles cibles thérapeutiques dans une grande diversité de pathologies lymphoprolifératives de type Th2. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Au sein des tumeurs, y compris pour le carcinome hépatocellulaire (CHC), des sous-populations de cellules néoplasiques ont révélé une grande capacité à initier de nouvelles tumeurs et à induire des métastases. Les premières études sur ces cellules ont rapidement montré que la présence de ces cellules était déterminante dans le développement tumoral et elles ont donc été renommées « cellules souches cancéreuses » (CSCs). Malheureusement les mécanismes impliqués dans la maintenance de ces CSCs ne sont que partiellement compris. Par ailleurs dans le CHC un lien a été établi entre les signaux du facteur de croissance de transformation (Transforming Growth Factor, TGF-ß) provenant du microenvironnement tumoral et certaines populations de cellules cancéreuses dont la présence est corrélée à un faible pronostic. La façon dont TGF-ß peut ainsi établir et modifier un phénotype cellulaire dans le CHC reste néanmoins obscure. La méthylation de l’ADN étant un acteur majeur dans la mise en place des programmes cellulaires, notre but a été de caractériser le méthylome de CSCs hépatiques et son lien avec la capacité de TGF-ß à induire des CSCs. Nous nous sommes appuyés sur l’expression du marqueur CD133 pour définir la population de CSCs hépatiques. Afin comprendre l’importance des marques de méthylation de l’ADN dans les CSCs hépatiques, nous avons dans un premier temps déterminé quelle était la signature des cellules CD133+ au niveau de la méthylation de l’ADN en utilisant des puces de méthylation à grande échelle. Les sites CpG différentiellement méthylés ont montré un enrichissement pour d’une part des voies de signalisation déjà identifiées dans les CSCs et, d’autre part, pour des voies de signalisation associées au processus inflammatoire dont la voie TGF-ß/SMAD. Par la suite, nous avons montré que TGF-ß pouvait induire de façon permanente les cellules CD133+ contrairement à une autre cytokine influente dans le cancer du foie, l’interleukine 6. Cette augmentation de cellules CD133+ induite par TGF-ß est associée à des changements de méthylation de l’ADN sur l’ensemble du génome et qui sont, de plus, maintenus au cours des divisions cellulaires. La comparaison entre les deux méthylomes (liés aux cellules CD133+ et à l’action de TGF-ß) a exposé une signature commune significative indiquant que TGF-ß pourrait promouvoir le phénotype de CSC via le processus de méthylation de l’ADN. Mais nous avons également déterminé qu’une grande partie des effets sur la méthylation induits par TGF-ß était totalement indépendante de l’induction de cellules CD133+. Enfin, nous avons observé que les sites de méthylation sensibles au signal de TGF-ß étaient regroupés de façon significative au niveau de régions « enhancer » qui régulent la transcription des gènes. Par ailleurs, ces sites incluaient également des gènes précédemment identifiés comme cibles de TGF-ß mais aussi des gènes codant pour des acteurs épigénétiques de premier ordre comme les méthyltransférases de l’ADN. Ces résultats constituent la première description d’une signature de méthylation de l’ADN induite par TGF-ß permettant une reprogrammation stable vers un profil épigénétique de CSC hépatiques. / Distinct subpopulations of neoplastic cells within tumors, including hepatocellular carcinoma (HCC), display a pronounced ability to initiate new tumors and induce metastasis. Investigations on theses cells rapidly described them as essential for tumor growth and based on theses observations they have been named “cancer stem cells” (CSCs). Unfortunately, the mechanisms involved in sustaining their programs are only partially known. In HCC, there is an established link between microenvironmental signals from Transforming Growth Factor beta (TGF-ß) and survival of certain cell subpopulations which is results in a bad prognosis. However, how TGF-ß establishes and modifies cell behavior in HCC is not fully understood. As DNA methylation is involved in establishing cellular programs, our aim was to characterize the methylome of putative liver CSCs, and its link to the ability of TGF-ß to induce liver CSCs. We used CD133 expression as a positive marker for liver CSC. To understand the relevance of DNA methylation programs in liver CSCs, we first defined the methylome signature of CD133+ cells in liver cancer cells using methylation bead arrays. Differentially methylated CpG sites were enriched in known pathways related to CSC survival and to inflammation, including the TGF-ß/SMAD pathway. Next, we showed that TGF-ß persistently induces CD133+ cells in opposition to another cytokine related to HCC, interleukin 6. We observed that this increase is associated with genome-wide changes in the methylome induced by TGF-ß and that are perpetuated through cell division. We observed a significant overlap between the CD133+ methylome and the methylome induced by TGF-β, indicating that TGF-ß may induce CSC phenotype through DNA methylation reprogramming. Additionally, we observed genome-wide effects of TGF-ß that are independent of the induction of CD133. Finally, TGF-ß methyl-sensitive sites were significantly concentrated in enhancer regions of the genome, and include well-known targets of TGF-ß, and epigenetic players, such as de novo DNA methyl-transferases. In conclusion our results are the first indication of the ability of TGF-ß to induce genome-wide changes of DNA methylation, leading to a stable switch to a liver cancer stem cell epigenetic program.