Les vecteurs rétroviraux dérivés du virus Moloney de la leucémie murine (MoMLV) ont été utilisés pour livrer des gènes depuis plus de 20 ans et ils continuent d’être le meilleur outil disponible pour transférer de façon stable et efficace des gènes thérapeutiques dans différents types de cellules. Bien que la plupart des études précliniques de thérapie génique utilisent des surnageants bruts ou concentrés de vecteurs rétroviraux, l’étape de purification, pour éliminer le sérum et les impuretés dérivées des cellules hôtes contenus dans ces préparations, est incontournable pour les applications cliniques. Cette thèse décrit le développement de stratégies de purification des vecteurs rétroviraux. Au cours de ce projet, deux procédés complets de purification (à partir d’un surnageant brut de rétrovirus jusqu’au virus de grade clinique) ont été établis, vérifiés, et leurs performances ont été analysées en détail. La filtration sur membrane a contribuée à la clarification, la concentration, à l’échange de tampon et à la purification partielle des particules retrovirales à partir de surnageants à l’état brut sans aucune perte significative d’infectivité virale. Deux nouvelles méthodes de purification, spécifiquement adaptées aux caractéristiques biochimiques et physiques des particules rétrovirales, ont été développées. La première méthode de purification des particules rétrovirales, utilise la chromatographie d’affinité sur colonne d'héparine suivie d’un tamis moléculaire. L’avantage principal d’utiliser les techniques de chromatographie pour la purification des virus, est d’offrir la possibilité de purifier à grande échelle les rétrovirus de façon sélective et efficace. De plus, la chromatographie d’affinité sur colonne d'héparine a donné lieu à des taux de récupération exceptionnels de particules infectieuses et s’est avérée utile pour la purification des vecteurs rétroviraux produits par différentes lignées cellulaires indépendamment de l’enveloppe protéique utilisée pour le pseudo-typage. La deuxième méthode de purification est basée sur la technique de centrifugation zonale transitoire utilisant l’iodixanol comme milieu pour former un gradient. La force de cette technique repose sur les hauts niveaux de pureté obtenus en une seule étape de purification et la capacité à séparer les particules virales des espèces proches telles que les vecteurs défectueux et / ou les vésicules membranaires, qui posent un sérieux défi dans les procédés de purification. Les récupérations finales en particules infectieuses (~38%) et le degré de pureté atteint (plus de 95%) étaient comparables avec l’une ou l’autre des stratégies de purification utilisées. Les méthodes décrites dans cette thèse représentent une amélioration significative sur la méthodologie conventionnelle utilisant un gradient de densité de sucrose pour la purification des rétrovirus et contribuera certainement à l’avancement technologique dans le domaine de la thérapie génique. / Retroviral vectors derived from the Moloney murine leukemia virus (MoMLV) have been used as gene delivery vehicles for more than two decades and continue to be the best available tool for stable and efficient transfer of therapeutic genes into various cell types. Although most gene therapy preclinical studies use crude or concentrated retroviral vector supernatants, purification to eliminate serum and host-derived impurities contained in these stocks is a must for clinical applications. This thesis describes the development of downstream processing strategies for retroviral vectors. During the course of this project, two complete multi-step purification schemes (from crude retrovirus supernatant to clinical-grade virus) were designed, tested and their performance analyzed in detail. Membrane filtration contributed to the clarification, concentration, buffer exchange and partial purification of retroviral particles from crude supernatants with essentially no loss in vector infectivity. Two novel purification methods specifically tailored to the biochemical and physical features of retroviral particles were developed. The first method consists of the chromatographic purification of retroviral particles by heparin affinity chromatography followed by size exclusion chromatography. The main advantage of employing chromatography technology for virus purification is that it offers the possibility to selectively and efficiently purify retroviruses on a large-scale. Moreover, heparin affinity chromatography resulted in exceptional recoveries of infective particles and proved to be useful for the purification of retroviral vectors produced by different packaging cell lines independently of the Env-protein used for pseudotyping. The second purification method is based on a rate zonal centrifugation technique using iodixanol as gradient medium. The power of this technique was revealed by the high levels of purity achieved in a single purification step and its potential to separate viral particles from closely-related species such as defective vector forms and/or cell membrane vesicles, all of which pose a serious challenge in downstream processing. The overall yield of infective particles (~38%) and level of purity achieved (over 95%) using either purification strategy was comparable. The methods described in this thesis represent a significant improvement over the conventional sucrose density gradient methodology used for retrovirus purification and will hopefully contribute to the technological progress in the field of gene therapy.

Dans cette thèse, deux nouvelles méthodes ont été étudiées en vue de synthétiser des nanozéolithes à savoir la synthèse en mono-phase et la synthèse en deux-phases. La méthode en deux-phases consiste à introduire un solvant organique contenant l'organosilane à la solution aqueuse de synthèse de zéolithe donnant lieu à un mélange de deux-phases. Après agitation et traitement hydrothermique de ce mélange, des nanozéolithes organosilane-fonctionnalisées ont été obtenues en phase organique, tandis que de gros cristaux de zéolithe ont été trouvés dans la phase aqueuse. Dans la méthode mono-phasée, une quantité appropriée de gel de zéolithes en solution a été ajoutée à une solution du toluène/n-butanol contenant des organosilanes. Après 12 heures d'agitation à 60°C, on obtient un mélange en une seule phase. Ce mélange a subit ensuite une cristallisation hydrothermique pour donner naissance à des nanozéolithes fonctionnalisées. En principe, les deux méthodes utilisent l'organosilane pour empêcher la croissance de zéolithe. Le solvant organique agit en tant que milieu favorable à la dispersion des nanozéolithes fonctionnalisées par l'organosilane provenant de la phase aqueuse, ce qui mène à un arrêt complet du processus de croissance. On démontre que ces deux méthodes sont applicables à la synthèse des nanozéolithes de silicalite-1 et FAU et peuvent s'appliquer à la synthèse d'autres types de zéolithes. Des techniques de caractérisation comprenant DRX, IR ont été employées pour déterminer la structure zéolithique des échantillons. La taille de cristal a été vérifiée par analyses de MEB et de MET. Adsorption/désorption de l'azote a été effectuée pour évaluer la surface spécifique des échantillons. La fonctionnalisation des nanozéolithes a été étudie par29SiRMN. L'activité catalytique des nanozéolithes synthétisées a été évaluée par la réaction du craquage de TIPB. Les résultats préliminaires ont montré que les nanozéolithes de FAU peuvent être un excellent catalyseur pour la réaction du craquage. / In this thesis, two novel methods e.g. single-phase and two-phase for the synthesis of nanozeohtes were reported. In the single-phase synthesis method, a proper amount of zeolite gel solution was added to toluene/n-butanol solution containing an organosilane. After 12 hours at 60°C, a single phase mixture was obtained. This mixture was then subjected to hydrothermal crystallization to produce uniform functionalized nanozeolites. In contrast, the two-phase synthesis method involved the introduction of an organic solvent containing an organosilane to the aqueous zeolite gel solution, resulting in a two-phase mixture. Upon mixing and hydrothermal treatment of this mixture, organosilane-functionalized nanozeolites were obtained in the organic phase whereas, large zeolite crystals were found in the aqueous phase. In principle, both methods employed the use of an organosilane to inhibit the crystal growth. The organic solvent acted as the medium for dispersion of nanozeolites functionalized with organosilane from the aqueous phase, which led to the complete half of the growth process. These two methods were demonstrated to be applicable to the synthesis of silicalite-1 and FAU nanozeolites and could be applied to the synthesis of other types of zeolites. Characterization techniques including XRD and IR were used to determine the zeolite structure of the samples. The crystal size was verified by SEM and TEM analyses. Nitrogen adsorption/desorption equilibrium isotherms was measured to assess the surface area of the samples. The functionalization of nanozeolites was investigated by 29Si NMR technique. Catalytic activity of the synthesized nanozeolites was evaluated by the cracking reaction of TIPB. Preliminary results showed that FAU nanozeolites can be good catalysts for the cracking reaction.

Étudier la mégakaryopoïèse sans utiliser de méthode systématique d'optimisation freine le développement de systèmes efficaces de culture ex vivo des mégakaryocytes (MK) qui produisent les plaquettes sanguines. Grâce à l'utilisation d'une stratégie statistique de planification d'expériences, cette étude de doctorat a permis de quantifier les effets individuels et interactifs de cytokines sur la mégakaryopoïèse in vitro et d'optimiser les rendements en MK matures et en plaquettes. Les cellules de sang de cordon enrichies en CD34+ ont été cultivées pendant 7 jours dans des conditions favorisant la différenciation mégakaryocytaire. Les cellules ainsi obtenues ont ensuite été placées dans différentes combinaisons de cytokines définies par les plans d'expériences. Les plans Plackett Burman utilisés pour analyser 13 cytokines au total, ont été peu efficaces pour identifier les facteurs importants dû à leur faible niveau de résolution. Par contre, l'analyse statistique des plans factoriels à deux niveaux a démontré qu'en présence de la thrombopoïétine (TPO), la cytokine clé de la mégakaryopoïèse, la différenciation et la maturation des MK étaient significativement stimulées par le « stem cell factor » (SCF), l'interleukine (IL)-6 et l'IL-9, alors que le « Flt-3 ligand » (FL) favorisait uniquement les MK immatures. De plus, l'érythropoïétine (EPO), souvent utilisée pour la culture des MK, était un inhibiteur de la maturation des MK. Au niveau de la polyploïdisation, une réduction de la concentration en IL-6, IL-9 et surtout TPO semble favorable. La méthode de surface dose-réponse a permis de déterminer la concentration optimale en cytokines sélectionnées (TPO, SCF, IL-6 et IL-9). Le nouveau mélange de cytokines mis au point (BS1) maximise l'expansion et la maturation des MK, tout en donnant une proportion de MK très élevée (-90%). Un autre optimum, identifié à une concentration plus élevée en SCF, permet d'augmenter davantage la production de MK matures et plaquettes mais réduit la pureté en MK. Ces méthodes statistiques constituent des outils efficaces pour analyser un système complexe de cytokines et pour développer des systèmes prometteurs de production ex vivo des MK et plaquettes à des fins cliniques. / Studying megakaryopoiesis without using a rationale optimization method limits the development of efficient ex vivo culture Systems for megakaryocytes (MK) which produce blood platelets. In this thesis, individual and interactive cytokine effects on in vitro megakaryopoiesis were quantified and yields of mature MK and platelets were optimized by applying a statistical design of experiment strategy. CD34+ -enriched cord blood cells were first cultured for 7 days in conditions favoring commitment into the MK lineage. The obtained cells were then placed in different cytokine combinations defined by experimental designs. Because of their low resolution, the Plackett and Burman designs first used to screen 13 cytokines, were not efficient to identify the important factors. In contrast, the statistical analysis of the two-level factorial designs revealed that in the presence of thrombopoietin (TPO), the key cytokine for megakaryopoiesis, MK maturation was significantly stimulated by stem cell factor (SCF), interleukin (IL)-6 and IL-9, whereas Flt-3 ligand (FL) had a positive effect only on the expansion of immature MK. Moreover, erythropoietin (EPO) was an inhibitor of MK maturation. Importantly, a reduction of the concentration of IL-6, IL-9 and especially TPO seems favorable for polyploidy. A dose-response surface methodology was then used to find the optimal concentrations of the selected cytokines (TPO, SCF, IL-6 and IL-9). The new cytokine cocktail developed (BS1) maximizes MK expansion and maturation, and gives a very high MK purity (-90%). Another optimum was also found at a higher SCF concentration, which further improves mature MK and platelet production, but reduces MK purity. These statistical methods provide an efficient tool to analyze complex Systems of cytokines and to develop promising ex-vivo MK culture Systems for clinical applications.

Le compoundage par polymérisation est une nouvelle approche qui a été appliquée avec succès sur différents types de renforts classiques afin de préparer des matériaux composites. Cette technique consiste à greffer un composé identique à la phase continue (matrice) sur la surface du substrat solide utilisé comme renfort pour améliorer sa dispersion dans la phase continue. Dans la présente étude, nous avons essayé d'étendre son application sur des renforts de dimensions nanométriques tels que les nanoplaquettes d'argile utilisées pour élaborer des nanocomposites à matrice polyéthylène à haute densité (HDPE). Deux types d'argile ont été utilisés, d'une part la montmorillonite sodique (CNa+ ) et d'autre part la montmorillonite intercalée par un ammonium quaternaire (C30B). Le greffage s'effectue sur des nanoplaquettes des deux montmorillonites qui, par la suite seront utilisées pour préparer des nanocomposites à matrice polyéthylène. Des analyses thermogravimétrique (TGA), de diffraction de rayon X (XRD) et de microscopie électronique à transmission (TEM) montrent que seule la (C30B) greffée donne des nancomposites intercalés/partiellement exfoliés. Suite à cela, les propriétés mécaniques et rhéologiques de ces nanocomposites ont été envisagées afin d'étudier l'influence du greffage sur leurs comportements vis-à-vis des différentes déformations subites.

Ce projet a pour objectif d'étudier la possibilité de déminéralisation par voie physique d'un noir de carbone issu de la pyrolyse sous vide des pneus usagés. Une déminéralisation est nécessaire pour produire un noir de carbone pur et de composition constante en vue de sa commercialisation. Dans un premier temps, la caractérisation minéralogique du noir de carbone pyrolytique, par divers outils analytiques, a permis d'identifier trois composés inorganiques : la sphalérite (ZnS), la zincite (ZnO) et la silice (SiO2) plus minoritaire. Des analyses microscopiques ont permis de mettre en évidence une très faible libération de cette matière inorganique du noir de carbone. La séparation gravimétrique a été testée pour séparer les composés zinciques du noir de carbone, mais n'a pas été concluante à cause de la faible libération. Des tests de flottation ont été réalisés, ils ont permis l'étude statistique des paramètres opératoires ainsi que l'obtention d'une récupération maximale de 67% de noir de carbone et d'une teneur minimale de 11.6 % en matière inorganique.

Combiner les avantages des nanoparticules d'argile et celles d'une phase élastomère dispersée peut conduire à de meilleures propriétés mécaniques. L'amélioration à la fois des propriétés mécaniques en traction (module, contrainte et déformation à la rupture) et des propriétés au choc (résistance et énergie de rupture) peut conduire à de nouvelles applications industrielles. Cependant, le renforcement d'une matrice polymère ductile par des charges minérales classiques se traduit de manière quasi-systématique par une fragilisation importante de celle-ci. Les nanocomposites utilisant comme renforts des microplaquettes d'argile permettent une approche originale de ce problème de la fragilité du fait de la taille des renforts, de leur dispersion, de leur surface spécifique élevée et des possibilités de fonctionnalisation des surfaces. Les nanocomposites à matrice polypropylène renforcés par un type de nanoparticules d'argile sont mis en œuvre à l'état fondu dans un mélangeur interne. L'ajout d'oligomères fonctionnalisés favorise la dispersion de l'argile dans le polypropylène. Une exfoliation partielle est ainsi obtenue par cisaillement intense d'un milieu hautement visqueux. Grâce à leur facteur de forme (longueur sur épaisseur) très élevé (>100), des fractions volumiques de particules inorganiques aussi basses que 2-3% suffisent pour engendrer un réseau de particules percolant conférant au nanocomposite final des propriétés mécaniques comparables aux composites classiques chargés par 30 à 50% de fibres de verres, sans altérer grandement la densité et la transparence de la matrice. Par ailleurs, même si on augmente le module et éventuellement la contrainte à la rupture, les propriétés au choc et la déformation à la rupture se trouvent diminuées. En revanche, dans le domaine des polymères, l'ajout d'une phase élastomère améliore les propriétés au choc et augmente la déformation à la rupture. Cette amélioration se fait au détriment du module qui diminue en fonction de la teneur en phase élastomère. La dispersion est analysée par diffraction des rayons X et microscopie. Les matériaux sont soumis à des essais mécaniques en traction et au choc.

Le développement de bioprocédés pour la culture des cellules animales est d'une grande importance pour la biotechnologie, dû aux nombreuses applications biomédicales de ces cellules. Dans ce travail, la mise au point d'un système de contrôle ainsi que la conception, la caractérisation et l'utilisation de minibioréacteurs à échelle réduite (30-100 mL), entièrement équipés et automatisés pour la culture cellulaire, sont présentées. Les paramètres des contrôleurs ont de plus été optimisés pour des bioréacteurs de différentes tailles (500 mL et 15 L) avec différents volumes de travail (0,3, 0,5, 5, 10 et 15 L). Les temps de réponse de chaque sonde ainsi que le kLa dans les bioréacteurs ont aussi été évalués. Un système de contrôle en langage LABVIEW National Instruments, incluant une interface-usager numérique a été finalisé. Ce programme est capable de saisir, contrôler et surveiller les paramètres d'opération (pH, DO, pCO2, T) de huit bioréacteurs de façon simultanée et indépendante par le biais des modules de conversion Numériques/Analogues Field Point National Instruments. Finalement, le système a été testé par trois cultures de cellules HEK 293S dans les minibioréacteurs (100 et 300 mL). Les résultats ont été comparés à une culture statique dans un T-Flask de 25 cm2 . On a ainsi démontré que le système développé est robuste, précis et efficace.

Presently, fuel cell technology is one of the most exciting fields in the area of new energy development with high scientific and technological challenges. Progress made up to now in the field of Proton Exchange Membrane Fuel Cell, PEMFC, technology offers large perspectives of applications. The interest in this environmentally benign technology has grown during the last years due to the Kyoto protocol requirements. However, a drastic decrease in PEMFC cost is needed prior to the widespread acceptance of PEMFC as automotive power Systems. The main objective of this study was to develop a new concept of high performance and low-cost porous electrode gas diffusion layer for PEMFC. Novel and industrially viable processing techniques based on twin-screw extrusion, post-extrusion film stretching or selective dissolution treatment were used. Conventional materials presently used for PEMFC electrodes were replaced in this project by new formulations based on highly filled thermoplastic polymers. To create the porous structure of the gas diffusion layer, two different techniques were used. For the first technique, a thin film was made from low viscosity polypropylene, PP, filled with high specific surface area carbon black and synthetic flake graphite. Conductive blends were first prepared in a co-rotating twin-screw extruder and subsequently extruded through a sheet die to obtain films of around 500 microns in thickness. These films were then stretched in two successive steps to generate a film (100-200 microns) of controlled porous structure. However, for the second technique, the thin film was made from two immiscible polymers filled with a mixture of electronic conductive additives via twin-screw extrusion followed by selective extraction of one of the two polymers. The two polymers were a low viscosity PP and polystyrene, PS, and the conductive additives were the same as those used in the first technique. Conductive blends were first compounded in a co-rotating twin-screw extruder and subsequently extruded through a flexible film die to obtain a 500 microns film of high electronic conductivity. The PS phase was then extracted with tetrahydrofuran, THF, solvent and a film of controlled porosity was generated. The morphology of the porous structures was then analyzed by scanning electron microscopy, SEM, and by BET surface area measurements. The effects of PS concentration and extraction time with THF on film conductivity and porosity were also studied. / Actuellement, la technologie des piles à combustible représente l'un des champs les plus passionnants avec des défis scientifiques et technologiques élevés. Les progrès réalisé jusqu'à date dans le domaine des piles à combustibles à membrane échangeuse de proton, PEMFC, offre de grandes perspectives d'applications. L'intérêt pour cette technologie non polluante a fortement grandit durant les dernières années à cause des conditions exigeantes du protocole de Kyoto. Cependant, l'optimisation des coûts de production des piles de type PEMFC est nécessaire avant leur intégration en tant que systèmes d'alimentation des véhicules à moteur. L'objectif principal de cette étude était de mettre au point un nouveau design non coûteux de couche poreuse de diffusion de gaz pour électrodes de piles PEMFC. Des techniques pouvant être intégrées à l'échelle industrielle qui sont basées sur l'extrusion bi-vis, l'étirage postextrusion de film mince ou la dissolution sélective ont été utilisés. Les matériaux conventionnels présentement utilises pour fabriquer les électrodes ont été remplacés dans le cadre de ce projet par des nouvelles formulations basées sur les polymères thermoplastiques fortement chargés avec des additifs à conductivité électronique élevée. Pour créer la structure poreuse de la couche de diffusion de gaz, deux techniques différentes ont été employées. Pour la première technique, un film a été développé à partir d'une matrice en polypropylène, PP, de faible viscosité, chargé d'un grade spécial de noir de carbone possédant une surface spécifique élevée et de graphite synthétique en forme de feuillets. Les mélanges conducteurs ont d'abord été préparés dans une extrudeuse co-rotative bi-vis puis poussés à travers une filière plate. Cela a permis d'obtenir des films d'environ 500 microns d'épaisseur. Ces films ont ensuite été étirés en deux étapes successives afin de produire des films (de 100 à 200 microns) à structure poreuse contrôlée. En ce qui concerne la seconde technique, le film fin a été obtenu en mélangeant deux polymères immiscibles puis en y additionnant un mélange de charges électriquement conductrices. Cette opération a été menée en extrusion bi-vis. Elle a ensuite été suivie d'une extraction sélective de l'un des deux polymères. Les deux polymères dont il s'agit sont le PP à basse viscosité et le polystyrène, PS. Les charges conductrices sont les mêmes que celles utilisées à la première technique. Ces mélanges conducteurs ont été composés dans une extrudeuse co-rotative bi-vis puis poussés à travers une filière plate flexible afin d'obtenir un film de 500 microns à grande conductivité électrique. Le phase PS a été extraite par la suite grâce à un solvant : le tétrahydrofurane, THF. Des films à porosité contrôlée ont ainsi été générés. Les morphologies des structures poreuses ont été analysées par microscopie électronique à balayage, SEM, ainsi que par des mesures de surfaces spécifiques BET. Les effets de la concentration du PS et du temps d'extraction sélective par THF sur la conductivité et la porosité des films ont également été étudiés.

Le but de ce travail est de faire l'étude des mécanismes de calcination sous air et de dégradation sous atmosphère inerte d'un copolymère à trois blocs de type EOxPOyEOx (x = 20, y = 70) dans un matériau mésostructuré de type SBA-15. Les matériaux de type SBA-15 ont été synthétisés selon la méthode de Zhao et al. à une température hydrothermique de 80 °C [2]. Deux différentes extractions dans l'éthanol et l'éthanol acidifié ont été effectuées afin d'obtenir des matériaux ayant des teneurs en agent tensioactif résiduel différentes. Les propriétés physicochimiques des matériaux ont été obtenues par volumétrie d'azote à 77 K, analyse élémentaire du carbone, spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier et par résonnance magnétique nucléaire du 13C. Les différentes étapes de dégradation de l'agent tensioactif ont été déterminées à l'aide de l'analyse thermogravimétrique et de la combustion en température programmée identifiée par spectrométrie de masse. Les résultats démontrent que sous les deux types de courants gazeux, l'élimination de la phase organique s'effectue par une fragmentation du polymère libérant successivement les mésopores primaires et les micropores. Par contre, sous atmosphère inerte, cette libération successive des différents types de porosité peut être facilement identifiée par spectrométrie de masse, ce qui en fait un outil de caractérisation prometteur pour les matériaux à paroi poreuse.

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique dégénérative des muscles qui touche un garçon sur 3500. L'absence de la protéine à l'origine de la maladie, la dystrophine, entraîne une fragilité musculaire ce qui engendre une dégradation prématurée des muscles. Parmi les différentes thérapies à l'étude, on retrouve la greffe de myoblastes sains qui permet de rétablir en partie l'expression de la protéine. Cependant, la migration et la survie limitées des myoblastes ainsi que l'induction du système immunitaire restent des problèmes importants rencontrés par ce traitement. Les cellules souches isolées du muscle (MDSC) pourraient offrir un bon potentiel thérapeutique. Par exemple, il a été démontré qu'elles possèdent la capacité de migrer des vaisseaux sanguins vers les fibres musculaires pour régénérer l'expression de la dystrophine dans les muscles de souris mdx (modèle de la DMD). Toutefois, il existe plusieurs techniques d'isolement de ces cellules et les caractéristiques des différentes sous-populations sont encore mal connues. De plus, les MDSC sont très rares à l'intérieur du muscle, il faut donc utiliser des techniques permettant d'isoler un nombre maximal de cellules et des milieux soutenant une meilleure prolifération des MDSC. À cet effet, nous utilisons avec succès un milieu de culture sans sérum décrit précédemment dans la littérature pour la croissance des cellules souches de la peau. Dans ce milieu, nous avons identifié que les MDSC forment des sphéroïdes et augmentent leur population de quatre fois en dix jours. Le volume des sphéroïdes augmente aussi tout au long de la culture jusqu'à atteindre un plateau après dix jours. Dans ce travail, nous avons déterminé que la formation des sphéroïdes est un processus obligatoire dans l'expansion des MDSC. Étant donné que la plupart des protocoles nécessitent l'obtention de cellules dissociées, nous avons donc développé des techniques de dissociation enzymatique minimisant le dommage fait aux cellules et aux récepteurs cellulaires tout en maximisant le bris des sphères. L'effet du milieu de culture sur la croissance des différentes sous-populations a également été mesuré. Nous avons également déterminé que les cellules exprimant le récepteur Seal, caractéristique des cellules souches de souris, pouvait proliférer dans le milieu. Par contre, l'expression de CD34, un autre marqueur de cellules souches hématopoïétiques, chute rapidement après la mise en culture. Comme la prolifération des MDSC est faible, différents paramètres de culture ont été variés afin de voir leur influence sur la croissance. Nous avons observé que les hautes densités cellulaires initiales (2 xl0E5 cellules/ml) et les plus grands volumes de culture utilisés (plaque 6-12 puits) ont une influence positive sur l'expansion des cellules.