A descoberta das células tronco adultas tornou possível a sua aplicação clínica em protocolos de medicina regenerativa e de engenharia de tecidos para a reparação de órgãos danificados ou pouco funcionais. Neste sentido, são conhecidas muitas fontes diferentes de células tronco adultas, entre elas o tecido epitelial, o tecido muscular e a medula óssea. Recentemente, o tecido adiposo adulto foi reconhecido como uma fonte alternativa, acessível e rica em células tronco mesenquimais (MSCs), também denominadas de células tronco derivadas do tecido adiposo (hADSCs). As hADSCs são as células tronco adultas que apresentam a maior plasticidade, e são facilmente isoladas pela característica de aderência a substratos plásticos. Sob condições específicas de cultivo, as hADSCs podem diferenciar-se em células precursoras osteoblásticas. Dentre as proteínas necessárias para a diferenciação das hADSCs, o papel do complexo minichromosome maintenance (MCM) não é muito bem conhecido. A proteína MCM2 é parte do complexo MCM, fazendo parte do complexo pré-replicativo (pre-RC). Em células proliferativas, o gene MCM2 apresenta alta expressão, sendo que o seu produto gênico está relacionado com os mecanismos de reparação de DNA. Sendo assim, analisamos as mudanças na expressão do gene MCM2 durante a osteodiferenciação das hADSCs em diferentes meios de cultura, contendo BMP-4 ou OM. Os genes relacionados com a osteodiferenciação, como osteocalcina (OC), osteopontina (OP) e fosfatase alcalina (ALP) foram analisados por RT-PCR, por PCR em tempo real e citoquímica. Os dados obtidos pelas técnicas citoquímicas e de biologia molecular indicaram uma diminuição da expressão do gene MCM2 durante a osteodiferenciação, que pode estar relacionada com danos ao DNA ou senescência nas hADSCs. / The discovery of adult stem cells is a promise field in regenerative medicine and tissue engineering. There are many sources of adult stem cells among which of whom are the skin, muscle and bone marrow. Currently, the adipose tissue has been an alternative source of mesenchymal stem cells (MSCs), termed human adipose-derived stem cells (hADSCs). The MSCs are the most plastic adult stem cells known until now and are easily isolated by adherence in plastic substrates. Under specifics conditions of culture hADSCs can be differentiated in osteoblast cell precursors. Among proteins needed for hADSCs differentiation, the roles of minichromosome maintenance (MCM) complex remains poorly understood. The protein complex MCM2-7 is part of DNA pre-replicative complex (pre-RC), being abundant in proliferating cells and involved in DNA repair mechanisms. In this sense, the Mcm2 is essential for the activity of the MCM complex. Thus, we analysed MCM2 gene expression changes during osteoinduction by culturing hADSCs in different media containing BMP-4 or in osteogenic medium. Genes related to osteodifferentiation, like osteocalcin (OC), osteopontin (OP) and alkaline phosphatase (ALP) were analysed by molecular and cytochemistry approaches during osteodifferentiation. Interestingly, we observed a decrease in the MCM2 gene level osteoinduction of hADSCs in osteogenic medium, which could be related to an increase in genome damage and senescence in hADSCs.

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O trabalho teve como objetivo avaliar e quantificar o tecido ósseo neoformado, a distribuição e a importância das proteínas não colágenas (osteocalcina, osteopontina e osteonectina) no processo de reparação tecidual do alvéolo dental de ratos Wistar idosos após exodontia. Para sua realização, foram utilizados 80 Rattus Norvegicus albinus, linhagem Wistar, machos. Os animais foram distribuídos em dois grupos: Grupo Controle, correspondente a animais com 60 dias de vida; e Grupo Experimental correspondente aos animais com 2 anos de vida (700 dias em média). Cada grupo foi dividido em 4 subgrupos de 10 animais em cada grupo. Os animais foram submetidos à exodontia do incisivo superior direito e foram sacrificados com 05, 15, 21 e 28 dias de pós-operatório. Após a dissecção, 5 amostras foram submetidas à análise por microscopia convencional com coloração por Hematoxilina e Eosina e análise da imunohistoquímica e 5 amostras para análise por RT-PCR. Os resultados mostraram que o processo de envelhecimento não alterou a cronologia do reparo ósseo alveolar e não promoveu maior remodelação do alvéolo dental. A osteocalcina não apresentou atuação importante nos períodos pós-operatórios estudados. A osteonectina apresentou-se importante no processo de reparo, não sofrendo alterações no início da reparação óssea, apresentando marcação mais intensa durante a maturação óssea entre 21 e 28 dias de pós-operatório no grupo controle e diminuição da marcação no grupo experimental aos 28 dias de pósoperatório. O envelhecimento proporcionou uma diminuição da imunomarcação da osteonectina e demonstrou marcações positivas principalmente em osteoblastos e matriz mineralizada. A osteopontina apresentou-se importante no processo de reparo ósseo durante todos os períodos pós-operatório, apresentando marcações em osteoblastos, matriz osteóide, osteócitos e matriz mineralizada, apresentando maior marcação dos tipos celulares do no grupo experimental aos 28 de pós-operatório. Apesar desses achados, novos estudos são necessários para o melhor entendimento do processo de reparo ósseo alveolar em ratos adultos e idosos. / The aim of the present study was to evaluate and quantify the newly formed bone tissue, as well as the distribution and the importance of non-collagen proteins (osteocalcin, osteopontin and osteonectin) in the process of dental alveolar repair in Wistar aged rats submitted to tooth extraction. To perform that, about 80 male Rattus Norvegicus albinus, Wistar strain, were randomly distributed into two groups: Control Group corresponding to 60 days old rats; and Experimental Group corresponding to 2 years old animals (about 700 days old). Both groups were later subdivided into 4 subgroups consisting of 10 animals each. All animals were submitted to the upright incisive tooth extraction and were euthanized 05, 15, 21 and 28 days after the tooth extraction surgery. After the dissection, five samples from each subgroup underwent conventional microscopy analysis by hematoxylin-eosin stain as well as immunohistochemistry. Bone tissue from other five samples of each groups were subjected to Real Time RT-PCR analysis of non-collagen proteins expression The results obtained suggest that aging process was not able to change either the chronology of alveolar bone repair or the remodeling of dental alveolus. Osteocalcin did not present any important action in the post-operation periods evaluated. On the other hand, osteonectin showed an important role during the repair process, since its expression was increased in the control group and decreased in comparison to the experimental group at 28 days. Osteopontin was important in the bone repair in all times evaluated, since it was present in osteoblasts, osteiod matrix, osteocytes and mineralized matrix, being even more stained at 21 days after the surgery. Finally, besides the results obtained in the present work, other studies are necessary to better understand the alveolar bone repair in adult and aged rats.

O ultra-som de baixa intensidade tem demonstrado ser um recurso acelerador do processo de consolidação óssea em fraturas. Este estudo experimental investigou a influência da estimulação ultra-sônica de baixa intensidade no processo de reparo ósseo em fraturas de tíbias tratadas por meio de fixação flexível. O estudo foi desenvolvido no laboratório de Bioengenharia da FMRP da Universidade de São Paulo Campus de Ribeirão Preto, utilizando 20 coelhos machos adolescentes da raça Nova Zelândia, que foram submetidos a uma osteotomia no terço médio da tíbia e tratados com fixador externo unilateral. Após o procedimento cirúrgico os animais foram divididos em três grupos: controle com n = 7 (membro contralateral, não fixado), grupo controle lesão com n = 7 (fixados e mantidos em gaiolas) e grupo ultra-som com n = 7, que recebeu estimulação com equipamento de ultra-som de baixa intensidade (30mW/'CM POT.2') e ciclo de trabalho de 1/5. No final de 20 dias de tratamento suas tíbias foram retiradas e submetidas a ensaio mecânico de torção. Na avaliação das propriedades mecânicas torque máximo e rigidez, não foi observada diferença significativa (p '< OU =' 0,05) entre os grupos estimulados e controle lesão. Estes resultados sugerem que a estimulação ultra-sônica de baixa intensidade aplicada ao reparo de fraturas na presença de fixação flexível não influencia a velocidade e o padrão de consolidação da fratura / The low-intensity ultrasound has demonstrated to be an accelerator device on the process of recovering of bone fractures. This experimental study investigated the influence of the low-intensity ultrasound stimulation on the process of bone repairing of fractures of tibia treated with flexible fixator. The study was developed at the FMRP Bioengineering laboratory, of the University of Sao Paulo, campus of Ribeirao Preto, using 20 teenager male rabbits from the New Zealand breed which were subjected to an osteomy in the median third of the tibia and treated with an unilateral external fixator. After the surgical procedure the animals were divided into three groups: control with n = 7 (paw contralateral, not fixed), group control injury with n = 7 (fixed and kept in cages) and group ultrasound with n = 7, that received stimulation with low-intensity ultrasound equipment (30mW/'CM POT.2') and duty cycle 1/5. At the end of 20 days of treatment, their tibia were removed and subjected to a mechanical twist test. At the evaluation of the mechanical properties: maximum torque and hardness, it was not observed significant differences (p '< OU =' 0,05) among the stimulated groups and the control injury. These outcomes suggest that the low-intensity ultrasound applied for fractures healing in the presence of flexible fixation does not have influence on the velocity nor the standard of the fracture recovering

Fundamento: Fratura é ocorrência frequente em lesados medulares, em virtude da acentuada osteoporose, o que compromete o esqueleto como um todo e a consolidação óssea da fratura, em particular, o que resulta em calo ósseo de má qualidade, ou mesmo surgirem anomalias de consolidação. Assim, são importantes a busca e a avaliação de intervenções terapêuticas que possam melhorar o reparo ósseo nessa população. Objetivo: Avaliar os resultados da administração de alendronato de sódio, paratormônio e ultrassom de baixa intensidade na qualidade do calo ósseo de fraturas diafisárias do fêmur de ratos previamente submetidos à lesão medular. Material e Métodos: 75 ratos machos foram distribuídos em 05 grupos (n=15): (1) CON: ratos normais submetidos à fratura do fêmur; (2) LM: ratos com lesão medular e fratura; (3) LM+ALE: ratos com lesão medular, fratura e tratamento com alendronato de sódio; (4) LM+PTH: ratos com lesão medular, fratura e tratamento com paratormônio e (5) LM+US: ratos com lesão medular, fratura e tratamento com ultrassom. A medula espinhal foi completamente seccionada no nível da décima vértebra torácica (T10). No grupo controle (Sham) a medula foi apenas exposta, mas não seccionada. A fratura do fêmur foi realizada 10 dias após a produção da lesão medular. Sua localização foi na diáfise femoral, seguida de fixação com fio de aço no canal medular. A terapêutica em cada grupo foi aplicada durante as duas semanas seguintes à fratura. A avaliação da qualidade óssea e do calo foi feita por imagens de DEXA, microtomografia computadorizada (?CT), histologia, histomorfometria, imunoistoquímica (OPG, RANK e RANKL), resistência mecânica, PCR em tempo real para avaliar a expressão gênica e ELISA (OPG e IGF-1). Resultados: A lesão medular afetou gravemente a qualidade óssea com deterioração da microarquitetura óssea e redução da densidade mineral óssea, além de prejuízo da resistência mecânica. Houve redução da expressão dos genes de formação óssea e aumento da reabsorção, com alteração fenotípica. O processo de consolidação ocorreu predominantemente por ossificação intramembranosa nos animais paraplégicos. No entanto, a qualidade do calo foi pobre, em relação aos animais que não sofrem a lesão. Por outro lado, o uso de recursos terapêuticos como o alendronato de sódio, paratormônio e ultrassom de baixa intensidade foi capaz de recuperar muitas das propriedades microarquiteturais, celulares e mecânicas do osso não fraturado. De forma semelhante, osrecursos farmacológicos e mecânico utilizados neste estudo atuaram positivamente no processo de consolidação uma vez que houve aumento na densidade do calo, melhora da sua microarquitetura, e atividade celular, além do aumento na resistência aos esforços mecânicos. Em resumo, a lesão medular causou grave deterioração do tecido ósseo e modificações no processo de consolidação que, foram amenizadas e até normalizadas pela administração de alendronato de sódio, paratormônio e ultrassom. Conclusão: Os recursos terapêuticos acima citados foram benéficos para a recuperação do tecido ósseo intacto e para melhorar a qualidade do calo ósseo, após a deterioração causada pela lesão medular. / Background: Bone fracture is a frequent event in individuals with spinal cord injury (SCI) as a consequence of the marked reduction in bone mass and quality. SCI-induced bone loss may also induce changes in bone healing, leading to a poor callus formation and even non-unions. Therefore, the search for therapeutic interventions that may improve bone healing in this particular population may have a remarkable clinical importance. Purpose: To evaluate the influence of sodium alendronate, parathyroid hormone and low intensity ultrasound on the quality of fracture bone callus formation in SCI rats. Material and Methods: 75 male Wistar rats were randomly divided into five groups (n=15) (1) CON: control rats subjected to fracture, but not to spinal cord injury; (2) SCI: spinal cord injured rats and femur bone fracture; (3) SCI+ALE: spinal cord injured rats with bone fracture and treatment with sodium alendronate; (4) SCI+PTH: spinal cord injured rats with bone fracture and treatment with parathyroid hormone, and (5) SCI+LIPUS: spinal cord injured rats with bone fracture and treatment with low intensity ultrasound. A complete transection of the spinal cord was performed at the T10 level. In the control group the spinal cord was exposed but not sectioned. At 10 days post-injury (or Sham) a bone fracture was produced at the femoral shaft and fixed with an intramedullary pin. The ALE and PTH treatments began on day 1, and US began on day 3, after fracture and on day 14 all rats were euthanized. Non-fractured tibias and femur bone callus were analyzed by DXA, micro-computed tomography (?CT), histology, histomorphometry, immunohistochemistry (OPG, RANK and RANKL), mechanical test, real time PCR and ELISA (OPG and IGF-1). Results: SCI significantly impaired the bone quality, downregulated the osteoblastic-related gene expression and increased bone resorption, resulting in several phenotypic changes. SCI deteriorated the microarchitecture, reduced bone mass and weakened bone strength. Bone healing in SCI occurred predominantly by intramembranous ossification, leading to a poor callus formation. Conversely, the administration of alendronate, PTH and LIPUS were effective at ameliorating and even fully reestablish the bone microarchitecture, cells activity and mechanical strength. Similarly, both the pharmacological and mechanical therapeutics analyzed in this study were potentially efficient to increase bone callus density, to improve callus microstructure and metabolism, and to increase newly bone strength. In short,we revealed that SCI induced severe bone deterioration and changes in bone healing, which were ameliorated and even fully restored by the administration of alendronate, PTH, LIPUS and passive standing. Conclusions: The therapeutic approaches used in this study had great efficacy in restoring non-fractured bone integrity and with improvement of bone callus in paraplegic rats.

O osso requer que alguns de seus elementos detectem estímulos mecânicos e os transformem em sinais celulares adequados para que o tecido ósseo possa manter a eutrofia e adaptar-se às solicitações mecânicas a que é submetido. Assim, a estrutura óssea pode torna-se mais resistente quando a demanda mecânica aumenta e, da mesma forma, menos resistente em condições de hipoatividade como imobilizações, sequelas motoras, repouso prolongado ou em ambientes de microgravidade como as experimentadas por astronautas. Dessa interação podem resultar ossos com massa diminuída, o que caracteriza situações de osteopenia ou osteoporose. Uma das indicações do exercício de natação é estimular e manter o trofismo do tecido ósseo. No entanto, a relação entre natação e qualidade óssea em pessoas com osteopenia, não foi suficientemente estudada de forma a embasar recomendações clínicas. Assim, o objetivo desta pesquisa foi investigar a eficácia da natação na recuperação da qualidade óssea avaliada em tíbias de ratas com osteopenia induzida por suspensão dos membros posteriores. Foram utilizadas 50 ratas da raça Wistar divididas em cinco grupos experimentais (n=10/grupo); dois controles e três experimentais. Houve um grupo suspenso pela cauda durante 21 dias consecutivos (S) e seu controle que permaneceu em gaiolas comuns pelo mesmo período (CI). No grupo suspenso e treinado os animais permaneceram em suspensão durante 21 dias, e depois foram submetidos a 20 sessões de natação (ST). No grupo suspenso não treinado os animais foram suspensos por 21 dias e soltos em gaiolas comuns por 30 dias (SNT). No grupo controle II as ratas foram observadas em gaiolas comuns por 51 dias, sem intervenção (CII). A avaliação da qualidade óssea foi feita pela densitometria (DXA) e ensaio mecânico realizados na tíbia direita e histomorfometria da região metafisária proximal da tíbia esquerda. Para análise estatística todos os valores foram considerados diferentes significativamente em p<0,05. Os ensaios mecânicos mostraram que, para o grupo S os valores de força máxima (-14,03%, p=0,0003), rigidez (-21,68%, p=0,0055), DMO (-17,62%, p=0,019) e percentual de osso trabecular (-57,2%, p=0,0001), diminuíram significativamente em comparação com o grupo CI. A comparação das propriedades mecânicas simultâneas entre os grupos avaliados após 51 dias (STxCIIxSNT) mostrou diferença estatística significante entre os grupos para força máxima de (p=0,0014), rigidez (p=0,0010), DMO (p= 0,0095) e percentual de osso trabecular (p<0,0001). O grupo ST apresentou aumento significativo na força máxima (+10,23%, p<0,05), rigidez (+21,91%, p<0,001), DMO (+9,46%, p<0,05) e percentual de osso trabecular (+48,82%, p<0,001) em comparação com o grupo SNT. Na comparação dos grupos SNT e CII também houve diminuição significativa (-14,4%, p<0,05) para força máxima, rigidez (-25,21%, p<0,005), DMO (-13,34%, p<0,05) e percentual de osso trabecular (-52,06%, p<0,001). Finalmente, a comparação entre os grupos ST e CII não apresentou diferença estatística significante (p>0,05) para os valores de força máxima, rigidez, DMO e percentual de osso trabecular. Em relação à análise histológica qualitativa o grupo S apresentou ossos com características histológicas condizentes com osteopenia, com trabéculas ósseas bem mais delgadas em quantidade muito menor tanto na epífise quanto na metáfise, quando comparado ao grupo CI. O grupo suspenso apresentou ainda, diminuição na espessura do tecido ósseo compacto e redução significativa na quantidade de tecido esponjoso em sua porção mais interna. A espessura do tecido ósseo compacto se mostrou similar nos diferentes grupos (ST, SNT e CII). Todavia, a espessura e a quantidade de trabéculas do osso esponjoso diferiram expressivamente nos diferentes grupos. O grupo ST apresentou uma aparente maior quantidade de trabéculas ósseas, bastante delgadas, ao passo que o grupo CII apresentou, comparativamente, uma menor quantidade de trabéculas bem mais espessas. Comparado a estes últimos, o grupo SNT apresentou uma menor quantidade de trabéculas com delgada espessura. Com a suspensão por três semanas os parâmetros mostraram que houve deterioração da qualidade óssea expressa pela diminuição da densidade mineral óssea, enfraquecimento mecânico do osso e perda de massa óssea trabecular. A quantidade de osso trabecular na região metafisária foi o parâmetro mais afetado pela hipoatividade, mas também o elemento que apresentou a resposta mais rápida para a atividade motora. A conclusão foi que a natação reverteu mais rapidamente a deterioração osteopênica causada pela hipoatividade, com recuperação completa da qualidade óssea. / The bone is able to detect mechanical stimuli and to transform them into cell response so that the bone tissue can maintain its health and to adapt to different mechanical demands (mechanotransduction). Thus, the bone structure become more resistant when the mechanical solicitations are increased and, conversely, less resistant when in hypoactivity conditions as occurring during immobilizations, in locomotor sequela, prolonged bed rest or in a microgravity environment as experienced by astronauts. In general, hypoactivity leads the bone to develop a decreased and deteriorated mass, thus characterizing conditions of osteopenia or osteoporosis. Thus, physical activity such as swimming is indicated as one of the factors that contribute to the bone health. However, the relation between swimming and bone quality in individuals with osteopenia has not been sufficiently studied to fully support clinical recommendations. So, the aim of this study was to investigate the effectiveness of swimming in recovering bone quality evaluated in osteopenic tibias of rats that spent three weeks in hindlimb suspension. Fifty Wistar rats were used and divided into five groups (n = 10/group); two control and three experimental groups. There was a group suspended by the tail for 21 consecutive days (S) and its control kept in regular cages for the same period (CI). In the suspended and trained group, animals were suspended for 21 consecutive days and then underwent a 20 swimming sessions (ST). In the suspended, not trained group, animals were suspended for 21 days and released in regular cages for 30 days (SNT). In the control group II rats were kept in regular cages for 51 days without intervention (CII). The bone quality was assessed by densitometry (BMD), bending mechanical testing and histomorphometry. Statistical significance was set at p<0.05. Mechanical tests showed that for the suspended group there was a decrease of the maximum force (-14.03%, p = 0.0003), stiffness (-21.68%, p = 0.0055), BMD (-17.62 %, p = 0.019) and the percentage of trabecular bone (-57.2%, p = 0.0001) in comparison with the control group. Comparison among the groups after 51 days (STxCIIxSNT) showed statistically significant differences between groups for maximum force (p = 0.0014), stiffness (p = 0.0010), BMD (p = 0. 0095) and the percentage of trabecular bone (p<0.0001). The suspended and trained group showed a significant increase in maximum force (+10.23%, p <0.05), stiffness (+21.91%, p<0.001), BMD (+9.46%, p<0.05) and the percentage of trabecular bone (+48.82%, p <0.001) compared to the suspended and not trained group. When the suspended but not trained group was compared to control CII, there was also a significant decrease (- 14.4%, p<0.05) for maximum force, stiffness (-25.21%, p<0.005), BMD (-13.34%, p<0.05) and the percentage of trabecular bone (-52.06%, p<0.001). Finally, the comparison between group suspended and trained ad its control and CII showed no statistically significant difference (p>0.05) for all the parameters. Considering the qualitative histological analysis, suspended group presented bones with histological characteristics consistent with osteopenia, with thinner trabecular bone and in much less quantity both in the epiphysis and in the metaphysis. The suspended and trained group had a higher quantity of trabecular bone, with thinner trabeculae, while the CII group showed a comparatively smaller amount of much thicker trabeculae. Compared to the latter, the suspended and not trained group had an apparent smaller amount of trabeculae with a thinner thickness. In conclusion, the three week suspension caused a marked deterioration of the tibia bone tissue that was completely reverted by swimming and partially reverted with spontaneous cage activities taking in consideration all the parameters analyzed.

A regeneração de defeitos ósseos continua sendo um grande desafio na área de Odontologia e Medicina. É bem estabelecido que células-tronco mesenquimais (CTMs) e osteoblastos (OBs) desempenham um papel crítico na osteogênese, tornando-se candidatos a utilização em procedimentos de terapia celular que visam otimizar o processo de reparação óssea. Porém, pouco se sabe sobre a interação entre CTMs e OBs, e a maioria dos estudos enfatiza o efeito dos OBs sobre CTMs, fazendo com que a influência das CTMs na atividade osteogênica dos OBs continue sendo uma questão desafiadora. Baseados em nossos estudos anteriores, formulamos a hipótese de que a terapia celular que fizesse uso de uma associação de CTMs e OBs poderia ser mais eficaz para o reparo do tecido ósseo do que essas células isoladamente, principalmente como resultado da estimulação de OBs por CTMs. Para tal, foi realizado estudo in vitro para avaliar os efeitos das CTMs sobre os OBs e in vivo para avaliar os efeitos dessas células, isoladamente e combinadas, sobre a reparação óssea. CTMs da medula óssea de rato foram cultivadas em meio de crescimento para manterem-se como CTMs ou em meio osteogênico para diferenciarem-se em OBs. Após alcançar a subconfluência, as células foram cultivadas in vitro em três diferentes condições: (1) co-cultura direta de CTMs e OBs usando três proporções celulares (1:1, 1:2 e 2:1), (2) co-cultura indireta de CTMs e OBs usando insertos e (3) OBs cultivados em meio condicionado por CTMs. Para avaliação das respostas celulares foram realizados ensaios de proliferação celular, atividade de fosfatase alcalina (ALP), formação de matriz mineralizada, expressão gênica de marcadores osteoblásticos, imunolocalização de sialoproteína óssea (BSP) e osteopontina (OPN) e migração celular. Para os experimentos in vivo, as células foram carreadas em esponja de colágeno através de vários ciclos de centrifugação. Após, defeitos ósseos em calvária de rato foram preenchidos com (1) esponja de colágeno sem células, (2) esponja de colágeno com CTMs, (3) esponja de colágeno com OBs e (4) esponja de colágeno com associação de CTMs e OBs. Para avaliação da reparação óssea in vivo após 4 semanas, foram realizadas análises histomorfométricas através de cortes histológicos e microtomografia computadorizada. Os dados foram comparados pelo teste de Kruskal-Wallis e, se necessário pelo teste de Mann-Whitney (p&le;0,05). Foi observado que CTMs têm efeito repressivo sobre a proliferação e as expressões fenotípicas e genotípicas de OBs (P&le;0,05). Em relação ao reparo dos defeitos ósseos, somente naqueles tratados com células observou-se formação óssea predominantemente como ilhotas isoladas e diferenças, principalmente qualitativas, entre os tipos celulares utilizados, com tendência de maior formação óssea em defeitos tratados com OBs em comparação ao uso de CTMs. Com base nos resultados obtidos, pôde-se concluir que as CTMs apresentam efeito inibitório sobre OBs e que a terapia celular com OBs parece ser mais eficaz no reparo do tecido ósseo. / The regeneration of bone defects remains a major challenge in the field of Dentistry and Medicine. It is well known that mesenchymal stem cells (MSCs) and osteoblasts (OBs) play critical roles in osteogenesis, making them promising alternatives to be employed in cell therapy procedures to enhance the process of bone regeneration. Studies about the crosstalk between MSCs and OBs are mainly focused on the effect of OBs on MSCs, thus how MSCs may affect OBs phenotype expression remains a challenging question. Based on our previous studies, we have hypothesized that cell therapy using a combination of MSCs and OBs could be more effective for the bone repair than these cells separately, mainly due to the stimulation of OBs by MSCs. For this, we carried out in vitro experiments to evaluate the effects of MSCs on the OBs and in vivo experiments to assess the effects of these cells either isolated or combined on bone repair. Rat bone marrow MSCs were cultured either in growth medium to keep MSCs features or in osteogenic medium to differentiate into OBs. After reaching subconfluence, cells were grown in vitro in three different conditions: (1) direct coculture of MSCs and OBs using three cell proportions (1:1, 1:2 and 2:1), (2) indirect coculture of MSCs and OBs using transwell porous filters and (3) OBs cultured in MSCs conditioned medium. Cell responses were evaluated by assaying cell proliferation, alkaline phosphatase activity (ALP), mineralized matrix formation, gene expression of osteoblast markers, immunolocalization of bone sialoprotein (BSP) and osteopontin (OPN), and cell migration. For in vivo experiments, cells were seeded into collagen sponge by a centrifugation method. After, calvarial defects were implanted with (1) collagen sponge without cells, (2) collagen sponge with MSCs, (3) collagen sponge with OBs, and (4) collagen sponge and association of MSCs with OBs. To evaluate bone repair at the end of 4 weeks, histomorphometric analyzes were carried out using histological slides and micro-computed tomography. Data were compared by Kruskal-Wallis test and, if appropriated, by Mann-Whtiney test (p&le;0.05). It was observed that MSCs repressed proliferation, phenotypic and genotypic expressions of OBs (P&le;0.05). Bone formation was observed only in cell treated defects as isolated islets and qualitative differences were noticed among cell types, with a tendency of more bone formation in OBs treated defects compared with MSCs ones. Based on these results, we can conclude that MSCs exhibited inhibitory effect on OBs and that cell therapy with OBs seemed to be more effective for bone repair.

A Pseudoartrose Congênita da Tíbia (PCT) é uma das doenças mais desafiantes da ortopedia pediátrica pela dificuldade em obter a união óssea e, quando esta ocorre, em mantê-la. É uma doença muito rara, difícil de tratar devido à sua falta de conhecimento sobre a patogênese. As Células estromais mesenquimais multipotentes (CMM) podem desempenhar um papel na patogênese do PCT, possivelmente devido à falha da diferenciação osteogênica. O estudo das CMM pode ajudar a compreender a patogênese da doença e desenvolver novas estratégias terapêuticas baseados no uso desta célula no futuro próximo. Frente ao exposto, este trabalho teve como objetivo a análise das características biológicas das CMM isoladas de diferentes regiões anatômicas de medula óssea de pacientes com PCT. Para isto, amostras de medula óssea foram coletas a partir de locais afetados e não afetadas pela doença: Crista ilíaca do membro não afetada (CINA), crista ilíaca do membro afetada (CIA), tíbia não afetada (TNA), e tíbia afetada (TA). O numero de pacientes incluídos no estudo foi três: PCT1, PCT2 e PCT3. Os resultados mostraram que todas as células isoladas de pacientes com PCT apresentavam características compatíveis com as CMM. A taxa de formação de unidades formadoras de colônias das células da TA tanto no PCT2 quanto no PCT3 foi significativamente menor em relação às células da TNA e CINA respectivamente (p<0.05). A quantidade de células positivas para o marcador CD146 foi menor nas células da TA do PCT1 e PCT2, A análise estatística mostrou que não há uma diferença significativa. Este marcador esta relacionado com a capacidade multipotente e formação óssea in vivo. No PCT1 observou-se que formação de matriz mineralizada das CMM isoladas da CIA foi significativamente maior em relação a TA. Além disso, as células da TA do PCT1 observou-se um uma secreção significativa de alguns citocinas envolvidas no processo de formação óssea, como CCL2, CCL3, CCL4, TNA-alfa, PDGF-BB, e GM-CSF. A alteração destas citocinas pode levar a situações complicadas como o caso de não consolidação óssea. Com os resultados obtidos, se há demonstrado que as CMM da tíbia afetada tenta formar osso, mas no local da lesão é insuficiente, por tal motivo é preciso realizar estudos focados no mecanismo molecular. / Congenital pseudoarthrosis of the tibia (CPT) is one of the most challenging orthopedic diseases because of the difficulty in obtaining bone union and, when it happens, in maintaining it. It is a rare disease, difficult-to-treat due to the lack of knowledge about to pathogenesis. Multipotent mesenchymal stromal cells (MSC) may play a role in the pathogenesis of PCT, possibly due to a failure in the osteogenic differentiation. Studying these cells can help to better understand the pathogenesis of the disease and develop new therapeutic strategies based on the use of MSC in the near future. In view of the above, this work had the objective of analyzing the biological characteristics of CMM isolated from different anatomic regions of bone marrow of patients with PCT. For this, bone marrow samples were collected from sites affected and unaffected by the disease: unaffected limb iliac crest (CINA), affected limb iliac crest (CIA), unaffected tibia (TNA), and affected tibia (TA). The number of patients included in the study was three: PCT1, PCT2 and PCT3. The results showed that all cells isolated from PCT patients had characteristics compatible with CMM. The rate of formation of colonyforming units of TA cells in both PCT2 and PCT3 was significantly lower in TNA and CINA cells respectively (p <0.05). The amount of cells positive for the CD146 marker was lower in the TA cells of PCT1 and PCT2. Statistical analysis showed no significant difference. This marker is related to the multipotent capacity and bone formation in vivo. In PCT1 it was observed that the formation of mineralized matrix of CMCs isolated from CIA was significantly higher in relation to AT. In addition, PCT1 TA cells showed a significant secretion of some cytokines involved in the bone formation process, such as CCL2, CCL3, CCL4, TNA-alpha, PDGF-BB, and GM-CSF. The alteration of these cytokines can lead to complicated situations such as the case of non-consolidation of bone. With the results obtained, if the CMM of the affected tibia has been shown to try to form bone, but at the site of the lesion is insufficient, it is necessary to carry out studies focused on the molecular mechanism.

A literatura atual aponta o exercício físico como uma das estratégias nãofarmacológicas mais utilizadas no tratamento e prevenção de condições que acometem o tecido ósseo. Ademais, estudos indicam que a suplementação de creatina pode exercer efeitos positivos sobre o ganho de massa óssea. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi investigar os efeitos preventivos do exercício físico associado à suplementação de creatina na perda de massa óssea em ratas ovariectomizadas. Diante disso, sessenta e cinco ratas da linhagem Wistar foram pareadas pelo peso corporal e dividas aleatoriamente em cinco grupos, sendo eles: 1) ratas falso-operadas (SHAM); 2) ratas ovariectomizadas (OVX), sedentárias e suplementadas com placebo (PL); 3) ratas OVX, sedentárias e suplementadas com creatina (CR); 4) ratas OVX, treinadas e suplementadas com placebo (PL+TR) e 5) ratas OVX, treinadas e suplementadas com creatina (CR+TR). Os animais foram submetidos a um protocolo de treinamento físico em declive em esteira rolante e suplementados com creatina diariamente por meio de gavagem esofágica. Foi realizada a avaliação de densitometria óssea para a obtenção dos parâmetros ósseos de conteúdo mineral ósseo (CMO) e densidade mineral óssea (DMO) de corpo total e regional, assim como a composição corporal nos períodos pré e pósintervenção. Além disso, foi removido o fêmur direito para a análise biomecânica. Após a intervenção, o grupo PL+TR apresentou maiores valores de CMO e DMO em comparação ao grupo PL (p=0,004 e p=0,020, respectivamente), ao passo que o grupo CR+TR experimentou maiores incrementos para o CMO e tendência ao aumento da DMO em comparação ao grupo CR (p=0,011 e p=0,064). A análise biomecânica do fêmur demonstrou que ambos os grupos treinados (PL+TR e CR+TR) apresentaram valores de força máxima significantemente maiores em relação aos grupos SHAM (p=0,024 e p=0,020, respectivamente), PL (p<0,001 e p<0,001) e CR (p=0,002 e p=0,002). Com relação à rigidez do fêmur, observou-se que o grupo SHAM não apresentou diferença significante quando comparado à ambos os grupos treinados (p=0,973 vs. PL+TR e p=0,998 vs. CR+TR), entretanto, apresentou diferença significante em relação aos grupos sedentários (p=0,048 vs. PL e p=0,024 vs. CR), ainda para esse parâmetro, o grupo PL apresentou diferença significante em relação ao grupo PL+TR (p=0,009), assim como o grupo CR foi significantemente diferente em relação ao grupo CR+TR (p=0,043). Não houve diferenças significantes entre os grupos PL e CR e entre os grupos PL+TR e CR+TR ao longo do estudo. Dessa forma, concluímos que a suplementação de creatina não apresentou efeitos isolados, nem aditivos, quando combinada ao treinamento físico, porém, o exercício físico promoveu efeitos positivos sobre o tecido ósseo, enfatizando, portanto, o seu papel terapêutico ímpar em atenuar a perda de massa óssea / The current literature indicates exercise training as one of the most used nonpharmacological strategies in the treatment and prevention of conditions that affect the bone tissue. Moreover, studies indicate that creatine supplementation may exert positive effects on bone mass gain. Thus, the aim of this study was to investigate the preventive effects of exercise training associated with creatine supplementation on bone loss in ovariectomized rats. Thus, sixty-five female Wistar rats were matched by body weight and randomly assigned into five experimental groups, as follows: 1) shammed (SHAM); 2) ovariectomized (OVX), sedentary and placebo-supplemented rats (PL); 3) OVX, sedentary and creatine-supplemented rats (CR); 4) OVX, trained and placebo-supplemented rats (PL+TR) and 5) OVX rats, trained and creatinesupplemented rats (CR+TR). The animals were submitted to a downhill running training protocol performed on a treadmill and supplemented with creatine on daily basis via gavage. Bone density were evaluated pre and post-intervention to obtain bone mineral content (BMC) and bone mineral density (BMD) from whole body and regional area, as well as body composition. Right femur was removed to biomechanical assessment. After the intervention, PL+TR group had higher BMC and BMD compared to the PL group (p=0.004 and p=0.020, respectively), while the CR+TR group experienced greater increases in BMC and tended to increase BMD compared to the CR group (p=0.011 and p=0.064, respectively). Biomechanical assessment demonstrated significantly higher femur maximum strength of both trained groups (PL+TR and CR+TR) compared to SHAM group (p=0.024 and p=0.020, respectively), PL group (p<0.001 and p<0.001) and CR group (p=0.002 and p=0.002). With respect to femur stiffness, no significant difference was observed from the SHAM group compared to both trained groups (p=0.973 vs. PL+TR and p=0.998 vs. CR+TR), however, significant difference was observed when compared to sedentary groups (p=0.048 vs. PL and p=0.024 vs. CR), moreover, significant difference was observed when the PL group was compared to PL+TR group (p=0.009), as well as the CR group was significantly different compared to the CR+TR group (p=0.043). There were no significant differences between PL and CR groups and between PL+TR and CR+TR groups along the study. Thus, we conclude that creatine supplementation showed no isolated, nor additive effects when combined with exercise training, however, exercise training promoted positive effects on bone tissue, thus emphasizing its unique therapeutic role in attenuating the loss of bone mass

A Pseudoartrose Congênita da Tíbia (PCT) é uma das doenças mais desafiantes da ortopedia pediátrica pela dificuldade em obter a união óssea e, quando esta ocorre, em mantê-la. É uma doença muito rara, difícil de tratar devido à sua falta de conhecimento sobre a patogênese. As Células estromais mesenquimais multipotentes (CMM) podem desempenhar um papel na patogênese do PCT, possivelmente devido à falha da diferenciação osteogênica. O estudo das CMM pode ajudar a compreender a patogênese da doença e desenvolver novas estratégias terapêuticas baseados no uso desta célula no futuro próximo. Frente ao exposto, este trabalho teve como objetivo a análise das características biológicas das CMM isoladas de diferentes regiões anatômicas de medula óssea de pacientes com PCT. Para isto, amostras de medula óssea foram coletas a partir de locais afetados e não afetadas pela doença: Crista ilíaca do membro não afetada (CINA), crista ilíaca do membro afetada (CIA), tíbia não afetada (TNA), e tíbia afetada (TA). O numero de pacientes incluídos no estudo foi três: PCT1, PCT2 e PCT3. Os resultados mostraram que todas as células isoladas de pacientes com PCT apresentavam características compatíveis com as CMM. A taxa de formação de unidades formadoras de colônias das células da TA tanto no PCT2 quanto no PCT3 foi significativamente menor em relação às células da TNA e CINA respectivamente (p<0.05). A quantidade de células positivas para o marcador CD146 foi menor nas células da TA do PCT1 e PCT2, A análise estatística mostrou que não há uma diferença significativa. Este marcador esta relacionado com a capacidade multipotente e formação óssea in vivo. No PCT1 observou-se que formação de matriz mineralizada das CMM isoladas da CIA foi significativamente maior em relação a TA. Além disso, as células da TA do PCT1 observou-se um uma secreção significativa de alguns citocinas envolvidas no processo de formação óssea, como CCL2, CCL3, CCL4, TNA-alfa, PDGF-BB, e GM-CSF. A alteração destas citocinas pode levar a situações complicadas como o caso de não consolidação óssea. Com os resultados obtidos, se há demonstrado que as CMM da tíbia afetada tenta formar osso, mas no local da lesão é insuficiente, por tal motivo é preciso realizar estudos focados no mecanismo molecular. / Congenital pseudoarthrosis of the tibia (CPT) is one of the most challenging orthopedic diseases because of the difficulty in obtaining bone union and, when it happens, in maintaining it. It is a rare disease, difficult-to-treat due to the lack of knowledge about to pathogenesis. Multipotent mesenchymal stromal cells (MSC) may play a role in the pathogenesis of PCT, possibly due to a failure in the osteogenic differentiation. Studying these cells can help to better understand the pathogenesis of the disease and develop new therapeutic strategies based on the use of MSC in the near future. In view of the above, this work had the objective of analyzing the biological characteristics of CMM isolated from different anatomic regions of bone marrow of patients with PCT. For this, bone marrow samples were collected from sites affected and unaffected by the disease: unaffected limb iliac crest (CINA), affected limb iliac crest (CIA), unaffected tibia (TNA), and affected tibia (TA). The number of patients included in the study was three: PCT1, PCT2 and PCT3. The results showed that all cells isolated from PCT patients had characteristics compatible with CMM. The rate of formation of colonyforming units of TA cells in both PCT2 and PCT3 was significantly lower in TNA and CINA cells respectively (p <0.05). The amount of cells positive for the CD146 marker was lower in the TA cells of PCT1 and PCT2. Statistical analysis showed no significant difference. This marker is related to the multipotent capacity and bone formation in vivo. In PCT1 it was observed that the formation of mineralized matrix of CMCs isolated from CIA was significantly higher in relation to AT. In addition, PCT1 TA cells showed a significant secretion of some cytokines involved in the bone formation process, such as CCL2, CCL3, CCL4, TNA-alpha, PDGF-BB, and GM-CSF. The alteration of these cytokines can lead to complicated situations such as the case of non-consolidation of bone. With the results obtained, if the CMM of the affected tibia has been shown to try to form bone, but at the site of the lesion is insufficient, it is necessary to carry out studies focused on the molecular mechanism.