Les TAS (Telomeric Associated Sequences) sont des régions sub-télomériques répétées non codantes formant un locus hétérochromatique chez Drosophila melanogaster. Il existe deux grandes familles de TAS, les TAS-R et les TAS-L possédant une structure et des propriétés différentes. Durant cette thèse, j'ai montré que les TAS dériveraient d'une séquence commune appelée TLL rapprochant ainsi les TAS-R et les TAS-L. Par ailleurs, une étude des populations de drosophiles récoltées récemment dans la nature a permis de montrer qu'il existe une pression de sélection pour la présence du TAS-X dans ces souches alors que celui peut être perdu quand les drosophiles sont maintenues dans les laboratoires pendant plusieurs générations. Le TAS-X pourrait avoir un rôle différent dans la nature. Par ailleurs, j'ai montré que les locus TAS permettent l'établissement de la répression des séquences qui s'y insèrent par la transmission de ses propriétés épigénétiques. Ce type de mécanisme pourrait être généralisé aux autres locus producteurs de piRNA du génome qui assurerait ainsi la répression d'un nouvel élément qui arriverait dans une " trappe génomique ". / TAS (Telomeric Associated Sequences) are heterochromatic subtelomeric region made of non coding repeated sequences in Drosophila melanogaster. There are two TAS families : TAS-R and TAS-L, with different structures and properties. In this study, we are showing that the TAS could have derived from a common sequence called TLL suggesting that TAS-R and TAS-L are more related than previously thought. Moreover, analysis of drosophila populations recently collected from the wild have shown that there is selection pressure for the presence of TAS-X in those lines, while this locus can be lost when flies are maintened in laboratory conditions for several generations. Thus TAS-X could have a special role in the wild. I have also shown that TAS loci transfer their epigenetic properties to the sequences that land in their loci, thereby establishing their repression. This kind of mechanism could be generalized to the other genomic piRNA producing loci that would ensure the repression of a novel element landing in a « genomic trap ».

La protéine INT6/EIF3E codée par le gène mammalien correspondant au site d’intégration du rétrovirus Mouse Mammary tumor virus (MMTV) n°6 (int-6), a été impliquée dans le cancer du sein chez la souris et l’homme. Malgré qu’INT6 soit une sous-unité du facteur d’initiation de la traduction eIF3, elle n’est pas essentielle pour la traduction générale mais pour l’expression d’ARNm spécifiques tel qu’il a été montré pour la traduction d’ARNm histones. Elle a aussi été impliquée dans la réplication d’ADN en stabilisant le facteur de licence de la réplication MCM7, dans la réponse aux dommages à l’ADN (DDR) et dans la voie du “nonsense-mediated mRNA decay“ (NMD). Par rapport à cette dernière activité j’ai étudié si INT6 pouvait spécifiquement intervenir au niveau de l’homéostasie des télomères en agissant sur les transcrits TERRA. La délétion d’INT6 par une approche d’ARN interférence révèle une augmentation des niveaux des ARN télomériques TERRA qui est dépendante du chromosome et du type cellulaire. Malgré qu’INT6 soit un facteur du NMD, elle n’agit pas sur la demi-vie des TERRA. Les expériences de DNA-FISH ont montré une augmentation des dommages aux télomères (TIF) dans les cellules en absence d’INT6. Les aberrations observées correspondent à des pertes de télomères (TFE) et des signaux multi-télomériques (MTS). Par la technique de digestion de la chromatine à la nucléase micrococcale, nous avons retrouvé une plus rapide accumulation des mono-nucléosomes aux télomères en absence d’INT6, suggérant un rôle dans la conformation de la chromatine télomérique. Ces résultats mettent en évidence INT6 comme un nouveau facteur régulateur de la stabilité des télomères. / The INT6/EIF3E protein encoded by the mammalian integration site 6 (int-6) gene, has been implicated in mouse and human breast carcinogenesis. Although, INT6 is a subunit of the eIF3 translation initiation factor, it is not essential for bulk translation but for specific mRNAs expression as histone mRNA translation. It has also been implicated in DNA replication by stabilizing the DNA replication licensing factor MCM7, in DNA Damage Response (DDR) and in the Nonsense mRNA Decay (NMD) pathway. Relative to the latter activity, I investigated whether INT6 can specifically meddle in telomere homeostasis by acting on TERRA transcripts. Deletion of INT6 by RNA interference approach revealed an increase in the telomeric RNA TERRA levels which is depending on the chromosome and cellular type. Although INT6 is a NMD factor, it doesn’t change TERRA steady-state. DNA-FISH experiments showed an increase in Telomere Induced Foci (TIFs) in INT6 depleted cells. These aberrations correspond to Telomere Free Ends (TFE) and Multi-Telomeric signals (MTS) which implicate INT6 in DDR. By means of Microccocal Nuclease (MNase) mapping assay, we found a rapid accumulation of telomeric mono-nucleosomes in INT6-depleted cells, suggesting a role in telomeric chromatin structure. These findings evidenced that INT6 is a novel key player in telomere stability.

Rtel1 est une hélicase qui a été identifiée comme un facteur essentiel pour maintenir les télomères longs et le génome stable chez la souris. Chez l'homme, des mutations germinales dans RTEL1 ont été trouvées chez les patients atteints du syndrome de Hoyeraal-Hreidarsson (HHS), une forme grave de la dyskératose congénitale. Cependant, le mécanisme selon lequel cette protéine agit dans les cellules humaines reste en grande partie inconnu. Pour étudier la fonction de RTEL1 sur le métabolisme des télomères nous avons réduit l'expression de RTEL1 par ARN interférent dans plusieurs lignées de cellules humaines et analysé la longueur des télomères par quantitative-FISH. Nos résultats montrent que la dérégulation de RTEL1 induit un raccourcissement des télomères uniquement dans les cellules avec de très longs télomères et surexprimant la télomérase. Nous démontrons également que l'absence de RTEL1 provoque une altération du complexe de shelterin au télomères: l'augmentation des niveaux de TRF2 et la diminution de POT1. La surexpression de la portion OB fold de POT1 peut restaurer le raccourcissement des télomères causé par le knockdown de RTEL1. Ceci indique que RTEL1 peut jouer un rôle important dans la stabilité du 3' sortant et l'accessibilité de la télomérase. Nous constatons également un impact de RTEL1 sur le métabolisme de l'ARN non codant télomérique TERRA. En effet, la diminution de RTEL1 réduit la quantité totale de TERRA présente dans le noyau et en particulier de TERRA associé aux télomères. Nous constatons que ce nombre réduit de TERRA est causé par sa dégradation, donc nous proposons que RTEL1 a un rôle dans la stabilisation de TERRA aux télomères. / Rtel1, regulator of telomere elongation helicase 1, was discovered as an essential factor for telomere length maintenance and genomic stability in mice. In humans, germline mutations in RTEL1 have been found in patients with Hoyeraal-Hreidarsson syndrome (HHS), a severe form of dyskeratosis congenita. However, the precise mechanism of action of the protein in human cells remains largely unknown. To investigate the function of RTEL1 in human telomere metabolism we used a knockdown approach by specific siRNAs and quantitative-FISH to measure telomere length after depletion of RTEL1 in different cancer cell lines. Our results show that down-regulation of RTEL1 induces shortening of telomeres only in cells with very long telomeres and high telomerase activity. We also demonstrate that upon depletion of RTEL1 there is a different stochiometry of shelterin proteins at telomeres: increased levels of TRF2 and decreased levels of POT1. Importantly, the overexpression of the POT1 OB fold can rescue the shortening of telomeres caused by the knockdown of RTEL1 indicating that RTEL1 may play an important role in the stability of the overhang and in its accessibility to telomerase. We also find an affect of RTEL1 on Telomeric non-coding RNA (TERRA) metabolism. Indeed, depletion of RTEL1 in human cell lines reduces the total amount of TERRA present in the nucleus and in particular of telomere-associated TERRA. Moreover, we find that this reduced number of UUAGGG repeats is caused by TERRA degradation, therefore we propose that RTEL1 has a role in stabilizing TERRA at telomeres.

Eines der charakteristischen Merkmale des Neuroblastoms stellt seine einzigartige biologische Heterogenität dar, die eine genaue Ausage des weiteren klinischen Verlaufes stark erschwert. Bestimmte prognostisch wirksame klinische, molekularbiologische und genetische Faktoren, wie zum Beispiel Alter bei Erstdiagnose, Tumorstadium, MYCN-Amplifikation und 1p Deletion, werden seit längerem zur Risikostratifizierung genutzt. Bereits in anderen Tumorerkrankungen konnte nun der Einfluß einer Telomerlängenveränderung auf das Gesamtüberleben von Patienten nachgewiesen werden. Telomere sichern die genomische Integrität und bestimmen maßgeblich die proliferative Kapazität jeder somatischen Zelle. Aktuelle Forschungsergebnisse legen die Vermutung nahe, dass Veränderungen der Telomerlänge auch in Neuroblastomen einen prognostischen Effekt auf das Gesamtüberleben haben. In diesem Kontext untersucht die vorliegende Arbeit den Zusammenhang zwischen Telomerlänge und Gesamtüberleben in 420 MYCN nicht-amplifizierten primären Neuroblastomen mit Erstdiagnosen von 1983-2001. Hierfür wurden die relativen Telomerlängen mithilfe einer neu etablierten monochromen multiplex q-RT-PCR ermittelt. Anschließend wurden diese sowohl mit ausgesuchten klinischen Variablen (Alter bei Erstdiagnose, Tumorstadium, Primärlokalisation des Tumors, Histologie, Geschlecht und Rezidivauftreten) korreliert als auch auf ihren Einfluß auf das Gesamt- und ereignisfreie Überleben untersucht. In Korrelation mit den klinischen Parametern konnte zwischen Alter bei Erstdiagnose und Telomerlänge ein eindeutiger Zusammenhang nachgewiesen werden. Je älter die Patienten bei Erstdiagnose, desto höher war sowohl der Anteil verlängerter Telomere als auch der extremer Telomerlängenveränderungen. Neuroblastome mit verlängerten Telomeren zeigten in der gleichen Altersgruppe ein verringertes Gesamtüberleben der betroffenen Patienten verglichen mit Neuroblastomen mit verkürzten Telomeren. Somit könnte eine Telomerlängenveränderung, insbesondere verlängerte Telomere, im klinischen Alltag als Hinweis auf einen prognostisch ungünstigen Verlauf genutzt werden.

Telomeres are repeated sequences at the ends of eukaryotic chromosomes that play prominent role in normal aging and disease development. They are dynamic structures that normally shorten over the lifespan of a cell, but can be elongated in cells with high proliferative capacity. Telomere elongation in stem cells is an advantageous mechanism that allows them to maintain the regenerative capacity of tissues, however, it also allows for survival of cancer cells, thus leading to development of malignancies. Numerous studies have been conducted to explore the role of telomeres in health and disease. However, the majority of these studies have focused on consequences of extreme shortening of telomeres that lead to telomere dysfunction, replicative arrest or chromosomal instability. Very few studies have addressed the regulatory roles of telomeres, and the association of genomic, transcriptomic and epigenomic characteristics of a cell with telomere length dynamics. Scarcity of such studies is partially conditioned by the low-throughput nature of experimental approaches for telomere length measurement and the fact that they do not easily integrate with currently available high-throughput data. In this thesis, we have attempted to build algorithms, in silico pipelines and software packages to utilize high-throughput –omics data for telomere biology research. First, we have developed a software package Computel, to compute telomere length from whole genome next generation sequencing data. We show that it can be used to integrate telomere length dynamics into systems biology research. Using Computel, we have studied the association of telomere length with genomic variations in a healthy human population, as well as with transcriptomic and epigenomic features of lung cancers. Another aim of our study was to develop in silico models to assess the activity of telomere maintenance machanisms (TMM) based on gene expression data. There are two main TMMs: one based on the catalytic activity of ribonucleoprotein complex telomerase, and the other based on recombination events between telomeric sequences. Which type of TMM gets activated in a cancer cell determines the aggressiveness of the tumor and the outcome of the disease. Investigation into TMM mechanisms is valuable not only for basic research, but also for applied medicine, since many anticancer therapies attempt to inhibit the TMM in cancer cells to stop their growth. Therefore, studying the activation mechanisms and regulators of TMMs is of paramount importance for understanding cancer pathomechanisms and for treatment. Many studies have addressed this topic, however many aspects of TMM activation and realization still remain elusive. Additionally, current data-mining pipelines and functional annotation approaches of phenotype-associated genes are not adapted for identification of TMMs. To overcome these limitations, we have constructed pathway networks for the two TMMs based on literature, and have developed a methodology for assessment of TMM pathway activities from gene expression data. We have described the accuracy of our TMM-based approach on a set of cancer samples with experimentally validated TMMs. We have also applied it to explore TMM activity states in lung adenocarcinoma cell lines. In summary, recent developments of high-throughput technologies allow for production of data on multiple levels of cellular organization – from genomic and transcriptiomic to epigenomic. This has allowed for rapid development of various directions in molecular and cellular biology. In contrast, telomere research, although at the heart of stem cell and cancer studies, is still conducted with low-throughput experimental approaches. Here, we have attempted to utilize the huge amount of currently accumulated multi-omics data to foster telomere research and to bring it to systems biology scale.

CD4 T cell death or survival following initial HIV infection is crucial for the development of viral reservoirs and latent infection, making its evaluation critical in devising strategies for HIV cure. Here we infected primary CD4 T cells with a wild-type HIV-1 and investigated the death and survival mechanisms in productively infected and bystander cells during early HIV infection. We found that HIV-infected cells exhibited increased programmed cell death, such as apoptosis, pyroptosis, and ferroptosis, than uninfected cells. However, productively infected (p24+) cells and bystander (p24-) cells displayed different patterns of cell death due to differential expression of pro-/anti-apoptotic proteins and signaling molecules. Cell death was triggered by an aberrant DNA damage response (DDR), as evidenced by increases in γH2AX levels, which inversely correlated with telomere length and telomerase levels during HIV infection. Mechanistically, HIV-infected cells exhibited a gradual shortening of telomeres following infection. Notably, p24+ cells had longer telomeres compared to p24- cells, and telomere length positively correlated with the telomerase, pAKT, and pATM expressions in HIV-infected CD4 T cells. Importantly, blockade of viral entry attenuated the HIV-induced inhibition of telomerase, pAKT, and pATM as well as the associated telomere erosion and cell death. Moreover, ATM inhibition promoted survival of HIV-infected CD4 T cells, especially p24+ cells, and rescued telomerase and AKT activities by inhibiting cell activation, HIV infection, and DDR. These results indicate that productively infected and bystander CD4 T cells employ different mechanisms for their survival and death, suggesting a possible pro-survival, pro-reservoir mechanism during early HIV infection.

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Un lien étroit existe entre l’intégrité du génome et l’architecture nucléaire. Les lamines, composants majeurs de l’enveloppe nucléaire sont impliquées dans de nombreux processus nucléaires, tels que la réplication, la transcription et le maintien de l’architecture nucléaire. Il a notamment été rapporté que les lamines de type A sont impliquées dans la réparation des cassures double brin de l’ADN et la stabilité des télomères. Toutefois, peu d’études ont été réalisées sur les lamines de type B. Fait intéressant, il a été observé que l’accumulation de la lamine B1 est retrouvée dans différentes tumeurs. Cependant, les conséquences d’une dérégulation de cette lamine sur la stabilité du génome restent peu documentées.Au cours de ma thèse, je me suis intéressée à l’impact d’une dérégulation de la lamine B1 sur le maintien de la stabilité du génome, notamment sur la réparation des cassures double brin de l’ADN et la stabilité des télomères. Nous avons pu mettre en évidence que la surexpression de lamine B1 conduit à un défaut de réparation par NHEJ, associé à une diminution de recrutement de 53BP1 aux dommages radio-induits. Nous avons également démontré que la lamine B1 interagit directement avec 53BP1, protéine impliquée dans le choix de la voie de réparation, et que cette interaction est régulée en cas de dommages à l’ADN. En effet, la liaison entre ces deux protéines est rompue après dommages en condition endogène, ce qui n’est pas le cas après surexpression de la lamine B1. Ce défaut de recrutement de 53BP1 aux dommages pourrait rendre compte de la diminution de l’efficacité du NHEJ. De plus, j’ai pu identifier les domaines protéiques impliqués dans cette interaction. Il est intéressant de noter que la surexpression du domaine de la lamine B1 impliquée dans l’interaction mime la surexpression de la lamine B1 entière. Au contraire, la lamine B1 délétée de ce domaine n’a aucun impact sur le recrutement de 53BP1 et la persistance des dommages. Ces différentes données confortent notre hypothèse quant à la séquestration de 53BP1 après surexpression de lamine B1.En parallèle, nous avons pu démontrer que la surexpression de la lamine B1 entraine l’apparition de diplochromosomes concomitants à une sénescence accrue. Ce phénomène d’endoréplication peut être induit par des défauts télomériques, tels que des télomères dysfonctionnels ou déprotégés. De façon intéressante, mes données montrent que la surexpression de la lamine B1 entrainent des dommages télomériques. Nous avons également établit que la lamine B1 interagit avec TRF2, protéine du complexe « shelterin » permettant la protection des télomères contre la signalisation des dommages à l’ADN. La rétention putative de TRF2 par la lamine B1 pourrait être à l’origine des défauts télomériques observés après la surexpression de cette dernièreCette étude démontre de nouveaux rôles de la lamine B1 dans le maintien de la stabilité du génome, notamment à travers ses interactions avec deux protéines clefs dans la réparation des cassures double brin et la stabilité des télomères. Cela nous ouvre de nouvelles pistes de recherche qui permettront une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la tumorigenèse et en particulier sur le lien existant entre l’intégrité de l’architecture nucléaire et la stabilité du génome. / A close link exists between genome stability and nuclear architecture. Lamins, major component of the nuclear envelope, are involved in many nuclear processes, such as replication, transcription and nuclear architecture. It has been reported than lamins A/C are involved in double strand break repair and telomere stability. However, few studies have been conducted on B-type lamins. Interestingly, it was observed that the accumulation of lamin B1 is found in different tumors. Nevertheless, consequences of its deregulation on genome stability remain poorly documented.During my PhD, I analysed the impact of deregulation of lamin B1 on genome maintenance, including double-strand breaks repair and telomere stability. We were able to demonstrate that overexpression of lamin B1 leads to defect of NHEJ, associated with decrease of the 53BP1 recruitment to DNA damage. We have also shown that lamin B1 interacts directly with 53BP1, a protein involved in the choice of the repair pathway, and that this interaction is regulated upon DNA damage. Indeed, the association between these two proteins is disrupted after damage, in endogenous condition, in contrast this dissociation is not observed after lamin B1 overexpression. The defect of 53BP1 recruitment to DNA damage could account for the decrease in the NHEJ efficiency. Moreover, I have identify the protein domains involved in this interaction. It is interesting to note that overexpression of the interaction domain mimics the overexpression of the full lamin B1. Instead, lamin B1 deleted from this domain has no impact on 53BP1 recruitment and on DNA damage persistence. These data support our hypothesis about the sequestration 53BP1 after overexpression of lamin B1.In parallel, we have demonstrated that the lamin B1 overexpression causes the appearance of diplochromosomes concurrent to an increase of senescence. This phenomenon of endoreduplication can be induced by telomere defects such as dysfunctional or deprotected telomeres. Interestingly, I have observed that lamin B1 overexpression leads telomere damages. We also established that lamin B1 interacts with TRF2, a protein of "shelterin" complex involved in the protection against the DNA damage signaling at telomere. The putative retention TRF2 by lamin B1 could cause telomere defects observed after overexpression of the latter.This study identifies new roles of lamin B1 in maintaining genome stability, including through its interactions with two key proteins in the repair of double-strand breaks and stability of telomeres. This opens up new ways of research that will enable a better understanding of the molecular mechanisms involved in tumorigenesis and in particular on the relationship between the integrity of the nuclear architecture and genome stability.

Alternative lengthening of telomeres (ALT) is a telomerase-independent mechanism utilized by a subset of cancers to promote replicative immortality. The ALT mechanism is driven by increased replication stress and persistent DNA damage response signaling that leads to a homology-directed repair mechanism called break-induced telomere synthesis (BITS). In particular, ALT cells are hypersensitive to inhibition of ataxia telangiectasia Rad3-related (ATR), a DNA damage response kinase implicated in telomere mobility and recruitment of repair proteins for telomere elongation in ALT. However, little is known about what regulates ATR activity at ALT telomeres. Given the importance of ATR in the ALT mechanism, we hypothesized that known ATR activators, ETAA1 and TopBP1, regulate ALT activity and telomere synthesis. Here, we show that ETAA1 and TopBP1 localize to ALT telomeres at sites of ALT activity and telomeric damage. Furthermore, depletion of ETAA1 and TopBP1 leads to defects in ATR signaling, a decrease in BITS and compensatory engagement of telomeric MiDAS (spontaneous mitotic telomere synthesis) for replication stress resolution. Taken together, our findings show that both ETAA1 and TopBP1 are important for mediating BITS at ALT telomeres and may better inform our efforts in targeting the ATR signaling pathway in ALT-positive cancers.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Ends of linear chromosomes are maintained by specialized structures known as telomeres. These structures are protected by a number of essential protein complexes including the shelterin complex and CST (CTC1 – STN1 – TEN1) complex. CST is an RPA-like ssDNA binding protein that is vital for telomere length maintenance via inhibition of telomerase and stimulation of DNA polymerase α -primase during C-strand fill-in synthesis. CST is also known to possess additional genome-wide roles in regulating DNA replication and repair including helping facilitate replication re-start at stalled forks, activating checkpoint signaling at double-strand breaks, and promoting replication origin firing. Proper and efficient repair of DNA is critical in order to protect the integrity of the genome and prevent extreme mutagenesis. Telomeres have a strong predisposition to oxidative DNA damage in the form of 8-oxoguanine caused by exposure to reactive oxygen species and free radicals. These oxidative lesions are repaired by the base-excision repair (BER) pathway. Previous work has implicated telomeric proteins such as the shelterin complex in mediating BER. Here we show for the first time that the CST complex and individual subunits robustly stimulate a myriad of proteins involved in the BER pathway including Pol β, APE1, FEN1, and LIGI. CST’s ability to augment these BER-associated proteins could be instrumental in promoting efficient DNA repair. Additionally, we find that CTC1 and STN1 are able to significantly enhance the polymerase activity of Pol δ and Pol α on both random-sequence and telomeric-sequence DNA substrates in vitro. What is more, we establish the ability of CST to resolve G4 structure and promote Pol δ synthesis, which we predict is a key feature of CST’s involvement in DNA replication at telomeres, which are known to form replication-inhibiting G4’s. Our results define important mechanistic insight into CST’s role in DNA replication and repair, and provide a strong foundation for future studies relating defective telomere maintenance to aging disorders and cancers which impact human health.