Orientador: Anderson Orzari Ribeiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Química, 2013

O objetivo deste estudo foi avaliar o impacto da terapia fotodinâmica (PDT) no tratamento de bolsas residuais de pacientes portadores de periodontite crônica em manutenção periodontal, através da avaliação de parâmetros imunológicos, durante 12 meses de acompanhamento. Foi conduzido um estudo prospectivo intervencional com 28 pacientes com periodontite crônica, que foram submetidos ao tratamento periodontal não-cirúrgico e apresentaram ao menos quatro sítios com bolsas residuais para serem submetidos à PDT. Os pacientes foram pareados em gênero, idade e média de profundidade clínica de sondagem (PCS) dos sítios experimentais, e assim sorteados em grupo teste (PDT) ou grupo controle. A intervenção foi feita no início do estudo, aos três, seis e nove meses e a coleta do fluido gengival foi realizada antes da intervenção, uma semana após, três e 12 meses depois. A avaliação imunólogica, realizada por meio do Luminex, quantificou os níveis de dez citocinas: interleucina (IL) IL-1(alfa), IL-1ß, IL-8, IL-1ra, fator de crescimento de fibroblastos (FGF), fator de crescimento vascular endotelial (VEGF), interferon- ? (IFN- Y), fator de necrose tumoral- (alfa) (TNF-(alfa)), IL-4 e IL-10. Em relação a essa análise, verificou-se que para o FGF, IL-4 e TNF-(alfa) não houve diferença estatística entre os grupos (p>0,05) em qualquer momento do estudo. Os mediadores IL-1(alfa), IL-1ß, IL-8 e VEGF apresentaram diferença significativa (p<0,05) entre os grupos, ao passo que os mediadores IL-1ra e IFN-Y demonstraram diferença estatística (p<0,01) ao longo do tempo em ambos os grupos e a IL-10 apresentou diferença estatística (p<0,01) aos 03 meses para o grupo PDT. Dentro dos parâmetros apresentados, a PDT se mostrou superior na modulação da inflamação. / The objective of this study was to evaluate the impact of photodynamic therapy (PDT) in the treatment of residual pockets of patients with chronic periodontitis in periodontal maintenance, by evaluating immunological parameters during 12 months of follow up. . An interventional prospective study in 28 patients with chronic periodontitis, who underwent non-surgical periodontal treatment and had at least four sites with residual pockets to undergo PDT was conducted. Patients were matched for gender, age and average probing pocket depth (PPD) of the experimental sites, and so drawn in group test (PDT) or control group. The intervention was done at baseline, at three, six, nine and gingival fluid collection was performed before intervention, a week after three and 12 months later. Immunological evaluation performed by the Luminex quantified levels ten cytokines: interleukin (IL) IL-1(alfa), IL-ß, IL-8, IL-1ra, fibroblast growth factor (FGF), vascular growth factor endothelial (VEGF), interferon-Y (IFN-Y), Tumor necrosis factor (alfa) (TNF-(alfa)), IL-4 and IL-10. In relation to this analysis, it was found that FGF, IL-4 and TNF-(alfa) was not different between groups (p> 0.05) at any time of the study. The mediators IL-(alfa), IL-1ß, IL-8 and VEGF showed a significant difference (p <0.05) between the groups, whereas IL-1ra mediators and IFN-Y showed a statistical difference (p <0.01) over time in both groups and IL-10 showed statistically significant difference (p <0.01) at 03 months for PDT group. Within the given parameters, the PDT was superior in the modulation of inflammation

O princípio de terapia fotodinâmica (TFD) foi introduzido por volta de 1900 mas posteriormente investgado como candidato para tratamento de cancer na década de 1970. Desde então, existem diversos trabalhos a respeito do assunto in vitro, in vivo e em estudos clínicos e grandes avanços foram alcançados. Entretanto, alguns desafios ainda não foram superados, como a variabilidade dos resultados. Este trabalho consiste na investigação de suas causas, em que o principal objetivo é avançar o estado da arte em TFD. Para isso foi usado um modelo de distribuição de limiar de dose para avaliar resistência em TFD in vitro. As distribuições de limiar de dose são obtidas pela derivação a curva de dose resposta experimental. Elas são caracterizadas pela sua largura e pela dose que corresponde ao pico, que se relaciona a homogeneidade e resistência intrínseca da população, respectivamente. Na seção 1, é apresentada a avaliação e comparação de dados obtidos de resultados publicados na literatura e, na seção 2, de experimentos realizados pela autora em diferentes linhagens celulares. Da análise da primeira etapa, foi observado que a largura da distribuição é proporcional a dose do pico e foi possível investigar a dependência do resultado da TFD com a linhagem celular, dado um fotossensibilizador (FS). Foi interessante, também, notar que as distribuições de limiar de dose correspondem a curvas de atividade de marcadores celulares de apoptose, como função da dose de luz, para a maior parte das condições analisadas. Dos experimentos realizados pela autora, foi visto que as células normais são as mais resistentes ao dano, seguida das células de câncer resistentes e sua linhagem parental, e que sua resposta foi a mais homogênea. Essas observações foram corroboradas pelas imagens obtidas de microscopia de fluorescência para avaliação da captação de FS, que mostraram que as células tumorais acumulam mais FS que as outras. Portanto, foi mostrado o potencial de se aplicar distribuições de limiar de dose na análise de resultados de TFD in vitro, ela é uma poderosa ferramenta que fornece mais informações que as curvas de dose resposta padrão. / The principle of photodynamic therapy (PDT) was introduced around 1900 but further investigated as a candidate to cancer treatment in the 1970´s. Since then, there are several papers regarding the subject in vitro, in vivo and clinical trials and great advances were achieved. However, some challenges were not yet overcome, such as results variability. This work consists in the investigation of its causes, where the main goal is to advance the state of art of PDT. For that it is being used a threshold dose distribution model to evaluate cell resistance to PDT in vitro. The threshold distributions are obtained by differentiating the experimental dose response curve. They are characterized by its width and the dose that corresponds to the peak which relates to the homogeneity and intrinsic resistance of the population, respectively. In section 1, it is presented the evaluation and comparison of data obtained from published results in literature and, in section 2, of experiments performed by the author in different cell lines. From the analysis in the first part, it was observed that the width of the distribution is proportional to its dose of the peak and it was possible to investigate the dependence of the PDT result with the cell line, given a fixed photosensitizer (PS). It was also interesting to note that the threshold distribution corresponded to the activity curves for apoptotic cell markers as a function of light dose, for most of the conditions analyzed. From the experiments performed by the author, it was seen that the normal cell line was the most resistant one, followed by the resistant cancer cells and its parental cell line, and that its response was more homogeneous. Those finding were supported by the fluorescence microscopy images obtained to evaluate PS uptake, which shown that the tumor cells accumulated more PS than the other ones. Therefore, it was shown the potential of applying the threshold distribution to analyze PDT results in vitro, it is a powerful tool that provides more information than the standard dose response curves.

Síntese, aspectos estruturais, propriedades fotoquímicas, fotofísicas e fotoindução para avaliação citotóxica in vitro de derivados de [Ru (Pc)] (PC = ftalocianina) são descritos neste trabalho. O desenvolvimento ftalocianinas utilizando anéis macrocíclicos, substituídos e não substituídos simetricamente, coordenados com o centro metálico de rutênio permitiu a obtenção de diferentes compostos. Coordenação de ligantes derivados de óxido nítrico (NO) na posição axial do rutênio (II) permitiu obter [Ru(NO)(Pc)(NO2)], um complexo liberador de NO quando submetido ao processo de redução. Os complexos foram caracterizados por FTIR, UV-Vis, 1H RMN e espectrometria de massas. As propriedades fotoquímicas de complexos como ftalocianinas de rutênio (II) têm sido investigadas por fotólise a laser em diferentes comprimentos de onda. Na irradiação de luz em 660 nm em solução aquosa aerada, observamos o fotoprocesso com a produção de oxigênio singleto. Pode-se observar a relação do rendimento quântico de oxigênio singleto e dos fotossensibilizadores utilizados para sua produção. O oxigênio singleto para [Ru (Pc-R)] segue a ordem [Ru(Pc)]> [Ru (Pc-DCBz)]> [Ru(Pc-DMX)] com DCBz = ácido 4-(3,4-dicianofenoxi) benzóico e DMX = 4,5-bis (2,5-dimetilfenoxi) ftalonitrilo. Estudos fotobiológicos são destacados com particular enfoque na irradiação de luz em 660 nm com interesse para aplicações de terapia fotodinâmica (TFD). Neste contexto, temos também a avaliação citotóxica em linhagens de células B16F10 do efeito sinérgico entre NO e oxigênio singleto quando comparado ao complexo [Ru(Pc)], um composto que é apenas produtor de oxigênio singleto. O NO parece potencializar a ação de oxigênio singleto uma vez que em ensaios de viabilidade celular, o complexo [Ru(NO)(Pc)(NO2)] é pelo menos 40% mais ativo que [Ru(Pc)], considerando 8,93 J / cm2 como uma potência. Considerando apenas a produção de oxigênio singleto encontramos a espécie [Ru(Pc-DCBz)] mais citotóxica nas linhagens B16F10 e MCF-7, sob irradiação em 660nm. Com base em todos os estudos, concluímos que citotoxicidade é dependente tanto da localização subcelular quanto do rendimento quântico de oxigênio singleto. A citotoxicidade pode ser reforçada pela produção de NO, seguido por irradiação de luz na janela terapêutica. / Synthesis, structural aspects, photochemistry, photophysical and in vitro photoinduced cytotoxic properties of [Ru(Pc)] (pc = phthalocyanine) derivatives are described in this work. Use of an unsubstituted or symmetrically substituted phthalocyanine ring coordinated to the central ruthenium allowed to obtain different compounds. Coordination of nitric oxide (NO) derivative ligands on axial position of ruthenium(II) ion permitted to obtain [Ru(NO)(Pc)(NO2)] a NO deliver agent under reduction process. The complexes were characterized by FTIR, UV-Vis, 1H NMR and mass spectrometry. The photochemical properties of (phthalocyanine)ruthenium(II) like complexes have been investigated by laser photolysis at different wavelengths. At 660 nm light irradiation in aerated aqueous solution we observed photoprocesses with singlet oxygen production. We have addressed the relationship of the singlet oxygen quantum yield and the photosensitizers used in its generation. The singlet oxygen for [Ru(Pc-R)] follows the order [Ru(Pc)] > [Ru(Pc-DCBz)] > [Ru(Pc-DMX)] with DCBz = 4-(3,4-dicianofenoxy)benzoic acid and DMX = 4,5-bis (2,5-dimethylfenoxy)ftalonitrile. Photobiological studies are highlighted with particular focus on light irradiation on 660 nm with interest for photodynamic therapy (PDT) applications. In this way we also have compared the synergism effect of NO and singlet oxygen production with [Ru(Pc)] as a compound producer of singlet oxygen only by means of cytotoxicity in B16F10 cell line. The NO seems to leverage the singlet oxygen action once [Ru(NO)(NO2)(Pc)] cell viability is at least 40 % more active than [Ru(Pc)] considering 8.93 J/cm2 as a potency. Considering only singlet oxygen production we found [Ru(Pc-DCBz)] more cytotoxic specie in B16F10 and MCF7 cell lines, under irradiation in 660 nm. Based on all studies, we have concluded that citotoxycity is dependent on subcellular localization as well singlet oxygen quantum yield. The cytotoxicity could be enhanced by NO production followed by light irradiation on the therapeutic window.

O câncer de mama apresenta-se como um dos maiores problemas de saúde pública no mundo por ser, entre as mulheres, o primeiro em incidência e o segundo em número de óbitos. Este tipo de câncer apresenta alto grau de recorrência devido a falha no tratamento do tumor primário e o aparecimento de metástases da doença é a principal causa de mortalidade. As estratégias de tratamento nesse estágio não são específicas e comprometem a qualidade de vida das pacientes. A terapia fotodinâmica (PDT) aparece como uma alternativa terapêutica promissora. No entanto, a eficácia da PDT para o tratamento de tumores da mama, bem como os mecanismos que conduzem à morte celular permanecem obscuros. Para este propósito, neste estudo, nos propusemos a investigar mais profundamente os mecanismos moleculares envolvidos na morte celular induzida MB-PDT. Observou-se que a MB-PDT induz massiva morte celular em células tumorais preferencialmente. As células não-tumorigênicas foram significativamente mais resistentes à terapia em comparação com as células malignas. Análises morfológicas e bioquímicas das células em processo de morte apontou para mecanismos alternativos à apoptose clássica. A autofagia induzida por MB-PDT resultou em citoproteção ou citotoxicidade, dependendo do modelo de célula utilizado. No entanto, o comprometimento de uma destas vias não impediu o destino fatal das células tratadas com MB-PDT. Ao analisar os mecanismos de necrose regulada, observamos que a necroptose desempenhou um papel importante na morte celular induzida por MB-PDT. Adicionalmente, nossos resultados mostraram uma localização preferencial do MB nos lisossomos, o que nos levou a analisar o comprometimento destas organelas. Nós demonstramos por meio da atividade de catepsinas no citosol das células tratadas com MB-PDT, evidências de que a permeabilização da membrana lisossomal é outro mecanismo de necrose regulada responsável pelos efeitos citotóxicos da MB-PDT. Além de resistência à morte celular, as células tumorais também desenvolvem mecanismos de evasão do sistema imune. Neste estudo, também demonstramos que a MB-PDT tem o potencial de aumentar o número de células de linfócitos T CD4+. Por fim, também mostramos a eficácia da terapia em induzir morte celular seletiva às células tumorais em um modelo que recapitula a morfologia do epitélio glandular. Em resumo, demonstramos que vários mecanismos de morte celular são ativados por MB-PDT, uma vez que o comprometimento de uma via de morte celular não impediu o destino fatal das células tratadas com MB-PDT. No geral, os resultados obtidos nesta tese apontam a MB-PDT como uma terapia alternativa e eficaz para o tratamento do câncer de mama, exibindo uma ação de amplo espectro em células com diferentes mecanismos de resistência a vias de morte celular clássica, uma propriedade fundamental para uma terapia contra o câncer. Finalmente, as nossas observações destacam o potencial de MB-PDT como uma estratégia altamente eficaz para tratar o câncer de mama com segurança e possivelmente outros tipos de tumores. / Breast cancer is the main cause of mortality among women presenting high recurrence due to primary treatment failure. Photodynamic therapy (PDT) appears as a promising therapeutic alternative. However, the efficacy of PDT to treat breast tumors as well as the mechanisms that lead to tumorigenic cell death remain unclear. For this purpose, in this study, we set out to deeper investigate the molecular mechanisms involved in MB-PDT induced cell death. We observed that MB-PDT differentially induces massive cell death of tumor cells. Non-malignant cells were significantly more resistant to the therapy compared to malignant cells. Morphological and biochemical analysis of dying cells pointed to alternative mechanisms rather than classical apoptosis. MB-PDT-induced autophagy resulted in either cytoprotection or cytotoxicity depending on the cell model used. However, impairment of one of these pathways did not prevent the fatal destination of MB-PDT treated cells. When analyzing regulated necrosis mechanisms, we observed that necroptosis played an important role in MB-PDT-induced cell death. Additionaly, our results have shown preferential lysosomal MB localization. Furthermore, we have also presented evidences that the lysosome membrane permeabilization is another regulated necrosis mechanism responsible for MB-PDT cytotoxic effects. It is known that in addition to resistance to tumor cell killing therapies, malignant cells develop molecular mechanisms in order to evade the immune system. In this study, we have also been able to show that the MB-PDT has the potential to increase the number of T lymphocytes CD4+. Additionally, when using a physiological 3D culture model that recapitulates relevant features of normal and tumor breast tissue morphology, we found that MB-PDT differential action in killing tumor cell was even higher than what was detected in 2D cultures. In summary, we demonstrated that different cell death mechanisms are being activated upon MB-PDT induction, since impairment of only one cell death pathway did not prevent the fatal destination of MB-PDT treated cells. Overall, our observations point MB-PDT as an alternative and effective therapy for breast cancer treatment, displaying a broad-spectrum action on tumors with different resistance mechanisms to classic cell death pathways, a desired property for improving an anticancer therapy. Finally, our observations underscore the potential of MB-PDT as a highly efficient strategy to safely treat breast cancer and possibly other types of tumors.

O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da terapia fotodinâmica antimicrobiana (TFDa), utilizando laser de baixa potência, em duas densidades de energia, associado ao azul de toluidina em biofilme de S. mutans. Biofilmes de S. mutans UA159 foram crescidos por 5 dias em discos de resina acrílica (3 mm de diâmetro x 2 mm de altura) a 37&ordm;C 5 % de CO2;. Os espécimes foram divididos aleatoriamente em 4 grupos de tratamento (n=3): Digluconato de clorexidina 0,12% (CHX, controle positivo); Solução salina a 0,89% (NaCl, controle negativo); Terapia fotodinâmica antimicrobiana com azul de toluidina e laser de baixa potência (densidade de energia 320 J/cm&sup2;) (TFDa 320); Terapia fotodinâmica antimicrobiana com azul de toluidina e laser de baixa potência (densidade de energia 640 J/cm&sup2;) (TFDa 640). Os tratamentos foram realizados 2x/dia durante 3 dias. Ao final dos 5 dias, os biofilmes foram coletados e número de bactérias viáveis e a concentração de polissacarídeos extracelulares insolúveis (PECI) e intracelulares (PIC) foram determinadas e analisadas estatisticamente (ANOVA e teste de Tukey, p < 0,05). O tratamento com a TFDa (320 e 640 J/cm&sup2;) reduziu o número de bactérias viáveis em biofilmes de S. mutans, de uma maneira dose-dependente (p < 0,05). Além disso, a TFDa 640 J/cm&sup2;, reduziu a viabilidade bacteriana de forma tão eficaz quanto a CHX (p > 0,05). Em relação a PECI e PIC, os grupos TFDa (320 e 640 J/cm&sup2;) não foram significativamente diferentes de CHX (p > 0,05). Os resultados mostraram que a terapia fotodinâmica antimicrobiana, mediada pelo azul de toluidina e laser de diodo (640 J/cm&sup2;), pode ser uma abordagem utilizada no controle do biofilme dental cariogênico. / The aim of this study was to evaluate the effect of antimicrobial photodynamic therapy (aPDT), using low-power laser, with two energy densities, associated with toluidine blue in S. mutans biofilm. S. mutans UA159 biofilms were grown for 5 days on acrylic resin discs (3 mm diameter x 2 mm height) a 37&ordm;C, 5 % de CO2. The specimens were randomly divided into 4 treatment groups (n = 3): 0.12% chlorhexidine digluconate (CHX, positive control); 0,89% Saline (NaCl, negative control); Antimicrobial photodynamic therapy with toluidine blue and low power laser (energy density of 320 J/cm&sup2;) (aPDT 320); Antimicrobial photodynamic therapy with toluidine blue and low power laser (energy density of 640 J/cm&sup2;) (aPDT 640). Treatments were performed 2x/day for 3 days. At the end of 5 days, the biofilms were collected and the number of viable bacteria and the concentration of insoluble extracellular (IEPS) and intracellular polysaccharides (IPS) were determined and analyzed statistically (ANOVA and Tukey\'s test, p<0.05). Treatment with aPDT (320 and 640 J/cm&sup2;) reduced the number of viable bacteria of S. mutans biofilms in a dose-dependent manner (p<0.05). Furthermore, the aPDT 640 group reduced the bacterial viability as effectively as CHX group (p>0.05). For IEPS and IPS, the aPDT groups (320 and 640 J/cm&sup2;) were not significantly different CHX (p>0.05). The results showed that the antimicrobial photodynamic therapy mediated by toluidine blue and diode laser (640 J/cm&sup2;) may be an approach used to control the cariogenic dental biofilm.

A terapia fotodinâmica (TFD) é uma modalidade de tratamento para o câncer baseado na interação da luz com um agente fotossensibilizador (FS) e o oxigênio molecular presente na célula alvo. A TFD apresenta vantagens sobre os métodos tradicionais de tratamentos como o dano seletivo às células neoplásicas, ausência de intervenção cirúrgica, possibilidade de repetição do procedimento e efeitos colaterais controlados. Uma das limitações da técnica é a profundidade de pouca penetração da luz no tecido biológico e consequentemente o volume tecidual tratado. Uma alternativa para superar esta limitação é o emprego de fonte de luz pulsada que comparativamente a irradiação com luz contínua (CW), apresenta maior potência de pico levando a uma maior profundidade de penetração e maior formação de espécies reativas de oxigênio. O objetivo deste trabalho é a avaliação da TFD utilizando fonte de luz pulsada no regime de femtossegundos através de ensaios in vitro da fotodegradação de dois tipos de FSs e da necrose induzida em fígado sadio de ratos (estudos in vivo). Nos estudos in vitro foram avaliadas a fotodegradação do Photogem (PG - 8&mu;g/mL) e do Photodithazine (PDZ - 6&mu;g/mL), para as irradiâncias de 280, 340 e 400 mW/cm2 com PG, e 15, 56 e 112 mW/cm2 para o PDZ. Nos estudos in vivo foram avaliados o perfil de necrose induzida com as fontes de luz CW e pulsado em modelo animal, que receberam PG e PDZ nas concentrações de 1,5 mg/kg e 1,0 mg/kg, respectivamente. Foram irradiados com 74 mW/cm2 (PG) e 102 mW/cm2(PDZ) e dose total de energia de 150 J/cm2. Posteriormente foi avaliada a dependência de profundidade de necrose com a irradiância (60, 80, 107, 127, 138, 188 e 229 mW/cm2) utilizando PG e com dose total entregue de 150 J/cm2. As fontes de luz empregadas foram um laser de diodo 630 nm (PG), um laser de diodo emitindo em 660 nm (PDZ) e um laser de Ti:Safira, taxa de repetição de 1 kHz, comprimento de onda 800 nm e largura de pulso de 75 fs em associação com amplificador paramétrico óptico (APO) para conversão de comprimentos de onda na região de 400 - 1150 nm. Os experimentos in vitro mostraram que taxa de fotodegradação para o PG foi maior utilizando o laser pulsado do que para o laser CW. Quando utilizado o PDZ, o laser CW promoveu uma taxa de fotodegradação maior do que o pulsado. Nos estudos in vivo, foi observada a necrose induzida com laser pulsado cerca de duas vezes mais profunda do que a induzida pelo laser CW, enquanto necrose induzida pelo laser pulsado com PDZ foi maior do que a do laser CW. No estudo da dependência da profundidade de necrose em função da irradiância, o laser pulsado induziu profundidade de necrose maior do que o laser CW para irradiâncias abaixo de 80 mW/cm2, acima desta irradiância, o laser CW e o pulsado não mostraram diferença significativa. Estes resultados mostram que a combinação da fonte de luz pulsada e PG podem ser consideradas como alternativa para aumentar o volume tecidual tratado, porém, devem-se observar os parâmetros empregados para se obter o maior volume tecidual tratado. O mesmo resultado não foi observado para o PDZ como fotossensibilizador, o que indica uma forte dependência dos mecanismos da TFD com o FS e o regime de iluminação empregado. / Photodynamic therapy (PDT) is a therapeutic modality for cancer based on light, a photosensitizer agent (PS) and molecular oxygen into the target cells. PDT has advantages over traditional treatments, such as, selective damage to tumor cells, absence of surgical intervention, possibility of repeated procedures and controlled side effects. One of the limitations of PDT is the low light penetration in biological tissues and hence the treated tissue volume. An alternative to overcome this limitation is the use of pulsed light sources that compared to continuous (CW) irradiation, present higher peak power leading to a greater penetration depth and enhancing the reactive oxygen species production. The aim of this study is to evaluate PDT using pulsed light source at femtosecond regime through in vitro photodegradation of two PSs types and in vivo induced necrosis in healthy rat liver. In the in vitro study we evaluated the photodegradation of Photogem (PG - 8&mu;g/mL) and Photodithazine (PDZ - 6&mu;g/mL), at different irradiances (280, 340, and 400 mW/cm2 for PG and 15, 56 and 112 mW/cm2 for PDZ). In the in vivo studies the induced necrosis profile with CW laser and Pulsed Laser were evaluated in animal model which received PG (1,5 mg/kg) and PDZ (1,0 mg/kg) and were irradiated with 74 mW/cm2 and 102 mW/cm2, respectively, and the fluence was 150 J/cm2. After that, the dependence of depth of necrosis with irradiance (60, 80, 107, 127, 138, 188 and 229 mW/cm2) with PG and 150 J/cm2 of fluence was evaluated. The light source used in those studies were a 630 and 660 nm diode laser (PG and PDZ excitation light, respectively) and a Ti:Sapphire Regenerative Amplifier laser, 1 kHz repetition rate, 800 nm wavelength and 75 fs pulse width in association with an optical parametric amplifier (OPA) to convert 400-1150 wavelengths. The in vitro results showed that the PG photodegratation rates were greater to pulsed laser when compared with CW laser. When PDZ was used, the photodegradarion rates with pulsed laser were lower than CW laser. In the in vivo studies, the induced necrosis with pulsed laser was twice the induced by CW laser with PG as photosensitizer. When PDZ was used, the induced necrosis was greater for CW laser than for pulsed laser. For different irradiances, the depth of necrosis induced by CW laser was greater than for pulsed laser below 80 mW/cm2, above this, the pulsed and CW laser did not show difference. These results demonstrated that pulsed light and PG can be considered an alternative to enhance the treated tissue volume. The same was not observed to PDZ, which indicate the strong dependence of PDT mechanisms with PS and the light regime applied.

A Terapia Fotodinâmica (TFD) é uma técnica que provoca dano celular pela ação de um fotossensibilizador (FS), com seletividade de localização em tecido tumoral; a luz que, absorvida pelo FS, leva-o a um estado tripleto metaestável; e oxigênio molecular, o qual recebe a energia absorvida pelo FS, passando a um estado singleto de alta capacidade oxidativa. A técnica é bem sucedida no tratamento de lesões como câncer, mas enfrenta, entretanto, dificuldades para a determinação de sua dosimetria. Uma delas é a quantificação da distribuição do FS no tecido tratado. Este trabalho tem três objetivos: a obtenção de informação quantitativa por espectros de fluorescência de fluoróforos em meios turvos; a demonstração da distribuição do FS Photogem&reg; em fígados sadios de ratos Wistar e suas implicações na dosimetria; e a melhoria de um dos modelos existentes para previsão da profundidade de necrose (Ynec), importante parâmetro no estudo da TFD. Realizaram-se os experimentos em três fases: na primeira, tentou-se reconstruir o espectro do fígado sadio a partir de uma composição de espectros isolados de fluoróforos endógenos do fígado. Na segunda, realizaram-se estudos com corantes alimentícios Coralim-Mix&reg; nas cores azul, verde e vermelho e com corantes Exciton&reg; (Coumarin-480 e LDS-722) in vitro e in vivo, visando identificar os espectros dos corantes em misturas com meios turvos e entre eles. Na terceira, aplicou-se Photogem&reg; em ratos Wistar e se coletou a fluorescência do FS nos fígados, relacionando-se a variação na intensidade de fluorescência com a concentração de FS presente e com perfis de necrose obtidos por TFD. Aplicou-se, por fim, os resultados obtidos na melhoria do modelo para previsão da Ynec. A reconstrução dos espectros não foi bem sucedida, tal qual a recuperação dos espectros dos corantes. Os resultados mostraram que muitos fatores contribuem para a distorção da fluorescência coletada, e que a informação obtida é prejudicada se estes forem ignorados. Verificou-se que a distribuição do FS não é homogênea num órgão fotossensibilizado. Obteve-se uma função para distribuição do FS no tecido e, através dela, foi possível melhorar o modelo para a previsão da Ynec. Observou-se que a turbidez do meio afeta de maneira complexa a coleta de fluorescência, criando obstáculos para a quantificação direta de fluoróforos nele inseridos. Fica evidente a necessidade do aprofundamento dos estudos sobre a interação da luz com as partículas dos meios turvos para remover as distorções geradas por estas. Demonstrou-se ainda a importância do mapeamento da distribuição do FS num tecido fotossensibilizado como parte da dosimetria da TFD, e que a espectroscopia de fluorescência é forte candidata à técnica mais apropriada para este mapeamento, desde que dominados os obstáculos à coleta de fluorescência. / Photodynamic Therapy (PDT) is a technique that implies in cell damage by the action of a photosensitizer (PS) with tumor tissue localization selectivity; light at PS absorption spectrum wavelengths, which leads the PS to a metastable triplet state; and molecular oxygen, which earns the energy absorbed by the PS, reaching a high oxidative potential singlet state. The technique has found sucess on the treatment of lesions as cancer. However, it finds difficulties for its dosimetry stablishment, like the quantification of PS distribuition in a photosensitized tissue. This work has three purposes: obtainance of fluorophores quantitative information into turbid media through fluorescence spectroscopy; to show the distribution of the PS Photogem® in healthy Wistar rats’ livers and its consequences on dosimetry; and the upgrade of an existing model for depth of necrosis (Ynec) forecast. There were three experimental stages: the first one was an attemp to rebuild a healthy liver spectrum from a composition using mathematical weights for isolate liver endogenous fluorophores spectra. On the second stage, in vitro and in vivo studies were performed using Coralim-Mix&reg; blue, green and red food dyes and the Exciton&reg; dyes Coumarin-480 and LDS-722, aiming to recover dyes spectra from dyes in turbid solutions and dyes mixtures. On the third one, Photogem&reg; was administered to Wistar rats and fluorescence was collected on rats’ livers, and a relationship was stablished between the changes on fluorescence intensity, PS concentration in the tissue and necrosis profiles obtained via PDT. Results were applied to the upgrade of the Ynec forecast model. Spectra rebuilding, as well as dyes spectra recovering, were not completely reached. Results showed that a great deal of factors contribute to distortions at the collected fluorescence. It was verified that PS distribution is inhomogeneous in a photosensitized organ. It was found a function for the PS tissue distribution and it made possible to upgrade the Ynec forecast model. It was showed that medium turbidity affects in a complex manner the collected fluorescence, making difficult to quantify directly fluorophores in such medium. A need to go deeper into the investigation of light interactions with turbid media so that we may remove distortions they introduce into fluorescence spectra became evident. It was also showed how important is to track PS distribuition in a photosensitized tissue as a part of PDT dosimetry, and how fluorescence spectroscopy seems to be appropriate to perform such tracking, as long as the difficulties on fluorescence collection are overcome.

For several decades, Photodynamic Therapy (PDT) has been the focus of research and development to facilitate medical field application. However, PDT is still much less known than conventional treatments (e.g. chemotherapy, radiotherapy, surgery). Despite advantages of PDT for a variety of applications, it has not achieved an equally prominent position in clinical practice. A critical aspect during PDT treatments is the PDT efficacy and the determination of accurate treatment protocols. Three main strategies are highlighted in this thesis, to elucidate mechanisms at the molecular level to enhance the PDT efficiency and furthermore facilitate more accurate and reliable PDT protocols: (i) optimization of the photosensitizer (PS) interaction with membranes, (ii) specificity of PS to intracellular targets and (iii) bioavailability of photosensitizers in a monomeric form by using a nanocarrier. A series of amphiphilic photosensitizers (PpNetNI, CisDiMPyP, TPPS2a, AlPcS2a) were evaluated in terms of photophysical and photochemical properties, membrane interaction and membrane photodamage. Data indicated that the different peripheral groups do not significantly affect the photophysical properties of the porphyrins. However, these groups directly impact the membrane interaction. CisDiMPyP exhibits a higher binding to membranes than PpNetNI (both are positively-charged amphiphilic porphyrins with similar photophysical properties), probably because the phenyl peripheral hydrophobic groups provide a steric barrier, avoiding &#960;-&#960; stacking and also increasing the hydrophobic interaction with the membrane. Although TPPS2a contains two negatively charged groups, it has a larger interaction with negatively charged membranes than PpNetNI indicating that both, hydrophobic and dipolar, interactions play an important role for the affinity of these molecules to membranes. The smaller incorporation of AlPcS2a into membranes was attributed to the higher rigidity of this molecule and larger polarity in the center of chromophore due to the metal. Within the series of four amphiphilic photosensitizers studied in membranes, it was selected two porphyrins (CisDiMPyP and TPPS2a) with the best membrane interaction and membrane photodamage to further investigations in eukaryotic cells. While the structure and the photophysical properties ofCisDiMPyP and TPPS2a are similar, these PS have opposite charges. As a consequence of the opposite charges, each photosensitizer aims at different organelle. In case of the positively-charged porphyrin (CisDiMPyP), it localizes mainly in mitochondria and triggersapoptotic death. On the other hand, the negatively-charged porphyrin (TPPS2a) are directed to lysosomes, impairing the autophagy pro-survival functions and resulting in autophagy-associated cell death. The lysosomal photodamage and induction of autophagy-associated cell death caused by TPPS2a showed to be more effective to inhibit cell proliferation, even though the cellular uptake and the membrane binding efficiency of TPPS2a is lower. This goes against some paradigms in literature which describe a relationship between stronger phototoxicity and larger interaction with membranes and defend mitochondria as key intracellular target. Tyrosine-derived nanospheres were used as nanocarriers for porphyrins (CisDiMPyP and TPPS2a) aiming at an increased bioavailability of the PS. The choice of this copolymers is due its biodegrability, biocompatibility, high loading capacity, high micellization yield and extremely stable micelles. Although porphyrins provide no changes to nanospheres properties (e.g. size, superficial charge, stability), Tyrospheres are able to improve photophysical and photochemical properties with better 1O2 generation and lifetimes. Moreover, Tyrospheres enhance phototoxicity of porphyrins without alter subcellular localization and cell death mechanism. / Terapia fotodinâmica (TFD) tem sido foco substancial de investigação e desenvolvimento para aplicação na área da medicina por várias décadas. Entretanto, TFD é ainda muito menos conhecido que tratamentos já bem consolidados (quimioterapia, radioterapia, cirurgia) e não tem alcançado uma posição proeminente na prática clínica. Na expectativa de levantar alguns pontos sobre estratégias a nível molecular para aumentar a eficácia da TFD tornando os protocolos de TFD mais preciso e confiável, três principais estratégias são destacadas nesta tese: (i) otimização da interação do fotossensibilizador (FS) com membranas, (ii) especificidade do fotossensibilizador em alvos intracelulares e (iii) biodisponibilidade do fotossensibilizador na forma monomérica através do uso de um nanocarreador. Uma série de fotossensibilizadores anfifílicos (PpNetNI, CisDiMPyP, TPPS2a, AlPcS2a) foram avaliados em termos de propriedades fotofísica e fotoquímica, interação com membranas e fotodano em membranas. Os dados indicaram que os diferentes grupos periféricos não afetam significativamente as propriedades fotofísicas das porfirinas, entretanto isso impacta diretamente na interação FS-membrana. CisDiMPyP exibe maior ligação em membranas do que PpNetNI (ambos são porfirinas anfifílicas positivamente carregadas e com propriedades fotofísicas similares), provavelmente porque os grupos periféricos fenil fornecem impedimento estérico evitando empilhamento &#960;-&#960; e também aumentando as interações hidrofóbicas com a membrana. Embora TPPS2a contém dois grupos com cargas negativas, este tem maior interação com membranas negativamente carregadas do que PpNetNI indicando que interações hidrofóbicas e dipolares desempenham um papel importante na definição da afinidade destas moléculas em membranas. A menor incorporação da AlPcS2a em membranas foi atribuída à maior rigidez da molécula e maior polaridade no centro de seu cromóforo devido ao metal. Dentro desta série de quatro compostos anfifílicos estudados em membranas, foram selecionadas as duas porfirinas com maiores interações e fotodano em membrana (CisDiMPyP and TPPS2a) para maiores investigações em células eucarióticas. Apesar da similaridade de estrutura e propriedades fotofísicas, CisDiMPyP e TPPS2a dispõem de cargas opostas. Como consequências destas cargas opostas, cada fotossensibilizador é direcionado para uma organela específica. No caso de porfirina carregada positivamente (CisDiMPyP), esta se localiza principalmente em mitocôndrias e desencadeia a morte apoptótica. Por outro lado, a porfirina carregada negativamente (TPPS2a) é direcionada para os lisossomos prejudicando as funções pró-sobrevivência da autofagia e resultando em morte celular associada a autofagia. O fotodano em lisossomos e a indução da morte celular associada à autofagia causada por TPPS2a mostraram ser mais eficazes para inibir a proliferação celular, mesmo que a incorporação celular e a eficiência de ligação em membrana da TPPS2a sejam mais baixas. Isso vai contra alguns paradigmas da literatura que descrevem que a relação entre a maior fototoxicidade e maior interação com membranas e ressalta a mitocôndria como alvo intracelular chave. Nanoesferas derivadas da tirosina foram utilizadas como nanocarreadores das porfirinas CisDiMPyP and TPPS2a com o objetivo de aumentar a biodisponibilidade do FS. A escolha deste copolímero foi devida sua biodegradabilidade, biocompatibilidade, boa capacidade de encapsulamento, fácil micelização e extrema estabilidade das micelas. Embora as porfirinas não alteram as propriedades das nanoesferas (ex. tamanho, carga superficial, estabilidade), as nanoesferas são capazes de melhorar as propriedades fotoquímicas e fotofísicas fornecendo melhor geração e tempo de vida do 1O2. Além disso, estas nanopartículas aumentar a fototoxicidade de porfirinas sem alterar a localização intracelular e o mecanismo de morte celular.

A terapia fotodinâmica (TFD) tem sido utilizada no tratamento de lesões neoplásicas e não-neoplásicas. Sua base é a combinação de três elementos-chave: fotossensibilizador, oxigênio molecular e luz em comprimento de onda que excite o fotossensibilizador, levando-o a gerar espécies reativas de oxigênio que causam danos à estrutura celular. Portanto, a iluminação é um dos fatores essenciais para a indução da resposta adequada. Nos casos de lesões superficiais, a iluminação é facilmente obtida através da irradiação da superfície da mesma. Contudo, no tratamento de tumores sólidos ou invasivos, é preciso recorrer à TFD intersticial, na qual fibras ópticas são inseridas no tumor. No entanto, as diferenças no perfil de emissão de luz a partir das fibras difusoras, dependem do modo de fabricação, tamanho e propriedades, o que dificulta o estabelecimento de uma dosimetria de luz apropriada. Com este estudo, buscou-se contribuir no entendimento de como a luz, emitida por uma fibra difusora, se comporta no meio túrbido, assim como no tecido biológico. Dessa forma, buscou-se prever como a luz se propaga no meio e, assim, poder estimar a dose adequada de luz que se deve entregar ao tecido para que toda uma região seja irradiada. Para isto, foi utilizada uma fibra óptica com um difusor cilíndrico de 20 mm de comprimento emissor, acoplada a um laser de diodo em 630 nm e uma fibra óptica isotrópica de coleta, para medir a intensidade de luz emitida pelo difusor em várias posições. As medidas permitiram obter uma caracterização do perfil de emissão da fibra, sendo o ar o único meio de propagação da luz nesse caso. Posteriormente à obtenção do perfil, uma solução lipídica foi utilizada como phantom de tecido biológico. As fibras foram encapadas de modo a expor somente uma seção de 1 mm de comprimento delas. Com as fibras submersas na solução do phantom, foram realizadas medidas do campo de luz gerado por este elemento de 1 mm de comprimento do difusor. A partir da caracterização da emissão do elemento, foi possível recuperar a distribuição de luz gerada por todo o difusor utilizando composições ponderadas feitas a partir deste elemento. Estas composições apresentaram melhores resultados quando foi considerada a uma prévia caracterização da fibra na ponderação da reconstrução. A TFD foi realizada em fígado de ratos sadios para a análise de uma resposta real e, com o auxílio de ferramentas computacionais, foi possível reconstruir a necrose constituída pela irradiação da fibra toda, a partir da necrose gerada por um elemento difusor de 2 mm da fibra (obtido da mesma forma que o elemento de 1 mm), com resultados também otimizados com o uso da caracterização da fibra como base para a soma ponderada. Os resultados demonstraram que, através da caracterização do perfil de iluminação da fibra difusora e da distribuição de luz em meio túrbido, foi possível definir teoricamente um padrão de necrose semelhante ao observado no modelo animal. Portanto, a reconstituição do perfil obtida possui potencial para permitir melhorias no entendimento e na dosimetria de aplicações intersticiais de luz para TFD. / Photodynamic therapy (PDT) has been used for treatment of several tumor types, and presents best results for surface lesion. Light penetration on biological tissue is one limiting factor in PDT, interfering with the treatment of invasive or solid tumors. In those cases, a possible solution is to use interstitial PDT, in which optical fibers are inserted into the tumor. Cylindrical diffusers have been used for the application of interstitial PDT. However, differences in the diffuser light emission depend on the manufacturing process, size and optical properties of the fiber, which make it difficult to establish light dosimeter. This study aims to determine the distribution of light generated by a cylindrical diffuser in a turbid medium. A solution of lipid emulsion was used as an optical phantom. An optical fiber with a cylindrical diffuser of 2 cm in length was connected to a diode laser 630 nm, and the spatial distribution of light generated by the diffuser was measured by scanning a collector optical fiber. From the measurement of the light field generated by an element (1 mm long) of a 20 mm-long cylindrical diffuser, recovery of the distribution of light generated by the entire diffuser is expected. The results obtained so far show that it is possible to reconstruct the light field of a 20 mm-long cylindrical element diffuser by measuring the light emitted simultaneously by 20 elements of 1 mm. Then, the PDT was done in rat liver to analyze a real response and, with help of computational tools, a necrosis generated by irradiation of all fiber was reconstructed, using a necrosis produced by an element 2 mm long (likewise the element 1mm long). The results showed that knowing the illumination profile of a cylindrical diffuser and the light distribution in turbid medium, it was possible to redefine a shape of necrosis from as animal model theoretically. Therefore, the reconstruction of the profile obtained has potential to improve understanding and the light dosimeter in interstitial PDT.