A partir do (-)-epoxilimoneno (127) desenvolveu-se a preparação enantiosseletiva da dienona (5R)-4,8-dimetilbiciclo[3.3.0]octa-1(8),3-dien-2-ona (128), que representa um bloco de construção versátil para a síntese de produtos naturais e não-naturais opticamente ativos. A etapa-chave da síntese corresponde à conversão do aldeído quiral 163 na cianoidrina bicíclica 165, através da alquilação intramolecular da cianoidrina TMS-éter 164, conforme metodologia de Stork-Takahashi. A hidrogenação estereosseletiva da dienona 128 conduziu ao produto monossaturado 20, um intermediário avançado na preparação do ent-kelsoeno. Da mesma forma, a hidrogenação catalítica das duas ligações duplas C=C de 128 produziu o intermediário 129a, que representa a síntese formal do iridóide cis,cis-dihidronepetalactona (13). Além da preparação e funcionalização da dienona 128, investigou-se a cloração alílica de olefinas terminais, através de uma nova metodologia que emprega InCl3 na presença de NaClO. Este novo método de cloração alílica foi aplicado a diferentes substratos e forneceu cloretos alílicos com bons rendimentos. / This work describes the enantioselective preparation of (5R)-4,8-dimethylbicyclo[3.3.0]oct-1(8),3-dien-2-one (128) from (-)-limonene oxide (127). This compound holds the prospect of serving as useful building block or intermediate to prepare a variety of compounds having a bicyclo[3.3.0]octane framework. The key step is the conversion of the chiral aldehyde 163 to bicyclic cyanohydrin 165, through intramolecular alkylation of cyanohydrin TMS eter 164, according to Strok-Takahashi protocol. The stereoselective hydrogenation of dienone 128 led to monosaturated product 20, which is a important intermediate on the ent-kelsoene preparation. Also, catalytic hydrogenation of the two carbon-carbon double bonds of 128, produced 129a, which is a intermediate to formal synthesis of iridoid cis,cis-dihydronepetalactone 13. Further, a new methodology to allylic chlorination of terminal olefins which employ InCl3 in the presence of NaClO was developed. This method was applied to different compounds and furnished allylic chlorides in satisfactory yields.

A partir do (-)-epoxilimoneno (127) desenvolveu-se a preparação enantiosseletiva da dienona (5R)-4,8-dimetilbiciclo[3.3.0]octa-1(8),3-dien-2-ona (128), que representa um bloco de construção versátil para a síntese de produtos naturais e não-naturais opticamente ativos. A etapa-chave da síntese corresponde à conversão do aldeído quiral 163 na cianoidrina bicíclica 165, através da alquilação intramolecular da cianoidrina TMS-éter 164, conforme metodologia de Stork-Takahashi. A hidrogenação estereosseletiva da dienona 128 conduziu ao produto monossaturado 20, um intermediário avançado na preparação do ent-kelsoeno. Da mesma forma, a hidrogenação catalítica das duas ligações duplas C=C de 128 produziu o intermediário 129a, que representa a síntese formal do iridóide cis,cis-dihidronepetalactona (13). Além da preparação e funcionalização da dienona 128, investigou-se a cloração alílica de olefinas terminais, através de uma nova metodologia que emprega InCl3 na presença de NaClO. Este novo método de cloração alílica foi aplicado a diferentes substratos e forneceu cloretos alílicos com bons rendimentos. / This work describes the enantioselective preparation of (5R)-4,8-dimethylbicyclo[3.3.0]oct-1(8),3-dien-2-one (128) from (-)-limonene oxide (127). This compound holds the prospect of serving as useful building block or intermediate to prepare a variety of compounds having a bicyclo[3.3.0]octane framework. The key step is the conversion of the chiral aldehyde 163 to bicyclic cyanohydrin 165, through intramolecular alkylation of cyanohydrin TMS eter 164, according to Strok-Takahashi protocol. The stereoselective hydrogenation of dienone 128 led to monosaturated product 20, which is a important intermediate on the ent-kelsoene preparation. Also, catalytic hydrogenation of the two carbon-carbon double bonds of 128, produced 129a, which is a intermediate to formal synthesis of iridoid cis,cis-dihydronepetalactone 13. Further, a new methodology to allylic chlorination of terminal olefins which employ InCl3 in the presence of NaClO was developed. This method was applied to different compounds and furnished allylic chlorides in satisfactory yields.

BEZERRA, J. N. S. Estudo Fitoquímico de Licania rígida Benth (Chrysobalanaceae). 2011. 157 f. Tese (Doutorado em Química) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2011. / Submitted by Daniel Eduardo Alencar da Silva (dealencar.silva@gmail.com) on 2014-11-17T19:37:27Z No. of bitstreams: 1 2011_tese_jnsbezerra.pdf: 13183066 bytes, checksum: 684299f75878718b77bee3d5b08f16af (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2016-01-06T23:31:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_tese_jnsbezerra.pdf: 13183066 bytes, checksum: 684299f75878718b77bee3d5b08f16af (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-06T23:31:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_tese_jnsbezerra.pdf: 13183066 bytes, checksum: 684299f75878718b77bee3d5b08f16af (MD5) Previous issue date: 2011 / This work describes the phytochemical study of Licania rigida (Chrysobalanaceae), popularly known as oiticica. In this study we used the bark and wood of roots, woody stem, leaves and flowers. The extracts were subjected to liquid-liquid partition chromatography, conventional (adsorption and exclusion) and modern, high performance liquid chromatography (HPLC). The chemical investigation of the root of L. rigida resulted in the isolation of compounds: squalene (LR-01), lupeol (LR-02), betulinic acid (LR-03), niruriflavone (LR-11) and the binary mixture of steroids, β-sitosterol and stigmasterol glycoside (LR-06). From stem was isolated the acid licanic (LR-09), while from leaves were isolated the following metabolites: α-tocopherol (LR-07), the binary mixture of α-tocopherol and α-tocotrienol (LR-08), the mixture binary steroid β-sitosterol and stigmasterol (LR-05) and the flavonoids afzelin (LR- 12), myricetin-3-ramnoside (LR-15) and myricetin-3-glucoside (LR-16). From flowers were isolated the followed compounds: kaempferol (LR-10), tiliroside (LR-13), licanolin (LR-14) and the diterpene 1β,16α,17-trihydroxy-ent-kaurane (LR-04). This chemical investigation resulted in the isolation of novel substances for literature, the species and Licania genus. Structure determination of isolated compounds was obtained by analysis of nuclear magnetic resonance spectra of a hydrogen-1 and carbon-13 one and two dimensional, mass spectra obtained by electron impact (MS-IE) and electronSpray ionization (ESI-MS) and Infrared spectra (IR) and by comparison with literature data. / Este trabalho descreve o estudo fitoquímico de Licania rigida (Chrysobalanaceae), conhecida popularmente por oiticica. Neste estudo foram utilizadas as cascas e lenho das raízes, o lenho do caule, folhas e flores. Os extratos obtidos foram submetidos à partição líquido-líquido, cromatografias convencionais (adsorção e exclusão) e modernas Cromatografia Líquida de Alta eficiência (CLAE). A investigação química da raiz de L. rigida resultou no isolamento dos compostos: esqualeno (LR-01), lupeol (LR-02), ácido betulínico (LR-03), niruriflavona (LR-11) e a mistura binária dos esteróides, β-sitosterol e estigmasterol glicosilados (LR-06). Do caule resultou no isolamento do ácido licânico (LR-09), enquanto das folhas isolou-se o α-tocoferol (LR-07), a mistura binária do α-tocoferol e α-tocotrienol (LR-08), a mistura binária dos esteróides β-sitosterol e estigmasterol (LR-05), os flavonóides: afzelina (LR-12), miricetina-3-raminosídeo (LR-15) e o miricetina-3-glicosídeo (LR-16). Das flores foram isolados os compostos: canferol (LR-10), tilirosídeo (LR-13), licanolina (LR-14) e o diterpeno 1β,16α,17-trihidroxi-ent-caurano (LR-04). Esta investigação química resultou no isolamento de substâncias inéditas para a literatura, bem como para a espécie e o gênero. A determinação estrutural dos compostos isolados foi obtida pela análise dos espectros de ressonância magnética nuclear de hidrogênio-1 e carbono-13 uni e bidimensionais, espectros de massa obtidos por Impacto Eletrônico (EM-IE) e Ionização por electronSpray (EM-ESI) e os espectros de infravermelho (IV), bem como através da comparação com os dados da literatura.

A partir do (-)-epoxilimoneno (127) desenvolveu-se a preparação enantiosseletiva da dienona (5R)-4,8-dimetilbiciclo[3.3.0]octa-1(8),3-dien-2-ona (128), que representa um bloco de construção versátil para a síntese de produtos naturais e não-naturais opticamente ativos. A etapa-chave da síntese corresponde à conversão do aldeído quiral 163 na cianoidrina bicíclica 165, através da alquilação intramolecular da cianoidrina TMS-éter 164, conforme metodologia de Stork-Takahashi. A hidrogenação estereosseletiva da dienona 128 conduziu ao produto monossaturado 20, um intermediário avançado na preparação do ent-kelsoeno. Da mesma forma, a hidrogenação catalítica das duas ligações duplas C=C de 128 produziu o intermediário 129a, que representa a síntese formal do iridóide cis,cis-dihidronepetalactona (13). Além da preparação e funcionalização da dienona 128, investigou-se a cloração alílica de olefinas terminais, através de uma nova metodologia que emprega InCl3 na presença de NaClO. Este novo método de cloração alílica foi aplicado a diferentes substratos e forneceu cloretos alílicos com bons rendimentos. / This work describes the enantioselective preparation of (5R)-4,8-dimethylbicyclo[3.3.0]oct-1(8),3-dien-2-one (128) from (-)-limonene oxide (127). This compound holds the prospect of serving as useful building block or intermediate to prepare a variety of compounds having a bicyclo[3.3.0]octane framework. The key step is the conversion of the chiral aldehyde 163 to bicyclic cyanohydrin 165, through intramolecular alkylation of cyanohydrin TMS eter 164, according to Strok-Takahashi protocol. The stereoselective hydrogenation of dienone 128 led to monosaturated product 20, which is a important intermediate on the ent-kelsoene preparation. Also, catalytic hydrogenation of the two carbon-carbon double bonds of 128, produced 129a, which is a intermediate to formal synthesis of iridoid cis,cis-dihydronepetalactone 13. Further, a new methodology to allylic chlorination of terminal olefins which employ InCl3 in the presence of NaClO was developed. This method was applied to different compounds and furnished allylic chlorides in satisfactory yields.

Pitanga (Eugenia uniflora L.) é uma árvore arbustiva com frutas semelhantes à cereja, que cresce em diferentes tipos de vegetação e ecossistemas como consequência da sua alta capacidade de adaptação a diferentes condições de solo e clima. Esta espécie é de particular interesse econômico devido às suas propriedades medicinais, que são atribuídas aos metabólitos especializados presentes em suas folhas e frutos. Entre os metabólitos, os terpenóides são os mais abundantes dos óleos essenciais que são encontrados nas folhas. A diversidade de terpenos observada em Myrtaceae é determinada pela atividade de diferentes membros das famílias das terpeno sintases e oxidosqualeno ciclases. Por outro lado, os miRNAs são pequenos RNAs endógenos que desempenham papéis regulatórios essenciais no crescimento das plantas, desenvolvimento e resposta ao estresse. Por esta razão, estudos extensivos de miRNAs foram realizados em plantas modelos e outras plantas de importância econômica nos últimos anos. Portanto, o objetivo deste estudo é gerar recursos genômicos para E. uniflora utilizando sequenciamento de nova geração e ferramentas de bioinformática para a identificação de miRNAs conservados e novos, bem como os genes envolvidos na sínteses dos terpenóides. No capítulo 3, bibliotecas de pequenos RNA e RNA-seq foram construídas a partir de folhas de pitanga para identificar miRNAs maduros e pre-miRNAs, respectivamente. De 14.489.131 leituras limpas de pequenos RNA, foram obtidos 1.852.722 sequências de miRNAs maduros que representam 45 famílias conservadas e que foram identificadas em outras espécies de plantas. Análises posteriores, usando contigs montados a partir do RNA-seq, permitiu a predição das estruturas secundárias de 42 pre-miRNAs: 25 conservados e 17 novos. Alvos potenciais foram previstos para os miRNAs maduros mais abundantes nos pre-miRNAs, identificados com base na homologia de sequências. Além disso, a expressão de 27 pre-miRNAs foi validada utilizando ensaios de RT-PCR em diferentes indivíduos de pitanga. Este estudo é o primeiro de identificação em grande escala de miRNAs e seus alvos potenciais de uma espécie da família Myrtaceae, e proporciona mais informação sobre a conservação evolutiva dos vias regulatórias dos miRNAs em plantas com destaques para os miRNAs específicos da pitanga. No capítulo 4, a biblioteca de RNA-seq sequenciada anteriormente foi utilizada para identificar os genes potencialmente envolvidos na via da biossíntese dos terpenos e diversidade dos terpenóides a partir da montagem de novo e a anotação do transcriptoma de E. uniflora. No total, foram identificados 72.742 unigenes com um comprimento médio de 1.048 pb. Destes, 43.631 e 36.289 unigenes foram anotadas com as bases de dados das proteínas não redundantes do NCBI e Swiss-Prot, respectivamente. A ontologia gênica categorizou as sequências em 53 grupos funcionais. A análise das vias metabólicas com KEGG revelou 8.625 unigenes designados a 141 vias metabólicas e 40 unigenes preditos como associados com a biossíntese de terpenóides. Por outro lado, foram identificados quatro genes putativos de terpeno sintases (TPS), de comprimento completo, envolvidos na biossíntese de monoterpenos e sesquiterpenos, e três genes putativos de oxidosqualeno ciclases (OSC), de comprimente completo, envolvidos na biossíntese de triterpenos. Além disso, a expressão destes genes foi validada em diferentes tecidos de E. uniflora. A futura caracterização bioquímica dos diferentes TPS e OSC descritos aqui determinará especificamente o tipo de terpenóide sintetizado em condições ambientais específicas. Os dados produzidos neste estudo servirão como referência para estudos genéticos sobre os mecanismos moleculares que são responsáveis pela composição química dos óleos essenciais em E. uniflora e os aspectos fisiológicos da capacidade de adaptação desta espécie a diferentes habitats. / Pitanga (Eugenia uniflora L.) is a shrubby tree with edible cherry-like fruits that grows in different vegetation types and ecosystems as a consequence of its high adaptability to different soils and climate conditions. This species is of particular interest due to its medicinal properties that are attributed to specialized metabolites present in their leaves and fruits with potential pharmacological benefits. Among these metabolites, the terpenoids are the most abundant in the essential oils found in the leaves. The terpene diversity observed in Myrtaceae is determined by the activity of different members of the terpene synthase and oxidosqualene cyclase families. Furthermore, miRNAs are endogenous small RNAs that play essential regulatory roles in plant growth, development and stress response. For this reason, extensive studies of miRNAs have been performed in model plants and other plants of economic importance in the last years. Therefore, the aim of this study is to generate genomic resources for E. uniflora using next generation sequencing and bioinformatics tools to identify conserved and new miRNAs, and to identify the genes involved in the synthesis of terpenoids. In chapter 3, small RNA and RNA-seq libraries were constructed from leaves to identify mature miRNAs and pre-miRNAs, respectively. From 14.489.131 small RNA clean reads we obtained 1.852.722 mature miRNA sequences, representing 45 conserved families that have been identified in other plant species. Further analysis using assembled contigs from RNA-seq allowed the prediction of secondary structures of 42 pre-miRNAs: 25 conserved and 17 novel. Potential targets were predicted for the most abundant mature miRNAs, which were identified in pre-miRNAs based on sequence homology. In addition, the expression of 27 identified pre-miRNAs was validated using RTPCR assays in different individuals of pitanga. In chapter 4, the previously sequenced RNA-seq library was de novo assembled followed by annotation of the E. uniflora transcriptome and used to identify the genes potentially involved in the terpene biosynthesis pathway and terpenoid diversity. In total, we identified 72.742 unigenes with a mean length of 1.048 bp. Of these, 43.631 and 36.289 unigenes were annotated with the NCBI non-redundant protein and Swiss-Prot databases, respectively. The gene ontology categorized the sequences into 53 functional groups. A metabolic pathway analysis with KEGG revealed 8.625 unigenes assigned to 141 metabolic pathways and 40 unigenes predicted to be associated with the biosynthesis of terpenoids. Furthermore, we identified four putative full-length terpene synthase (TPS) genes involved in sesquiterpenes and monoterpenes biosynthesis, and three putative full-length oxidosqualene cyclase (OSC) genes involved in the triterpenes biosynthesis. In addition, expression of these genes was validated in different E. uniflora tissues. Future biochemical characterization of the different TPS and OSC described here will determine the type of terpenoid specifically synthesized in specific environmental conditions. The data produced in this study will serve as a reference for genetic studies about the molecular mechanisms behind the chemical composition of the essential oils in E. uniflora and about the physiologic aspects of the capacity of adaptation of this specie to different habitats.

Pitanga (Eugenia uniflora L.) é uma árvore arbustiva com frutas semelhantes à cereja, que cresce em diferentes tipos de vegetação e ecossistemas como consequência da sua alta capacidade de adaptação a diferentes condições de solo e clima. Esta espécie é de particular interesse econômico devido às suas propriedades medicinais, que são atribuídas aos metabólitos especializados presentes em suas folhas e frutos. Entre os metabólitos, os terpenóides são os mais abundantes dos óleos essenciais que são encontrados nas folhas. A diversidade de terpenos observada em Myrtaceae é determinada pela atividade de diferentes membros das famílias das terpeno sintases e oxidosqualeno ciclases. Por outro lado, os miRNAs são pequenos RNAs endógenos que desempenham papéis regulatórios essenciais no crescimento das plantas, desenvolvimento e resposta ao estresse. Por esta razão, estudos extensivos de miRNAs foram realizados em plantas modelos e outras plantas de importância econômica nos últimos anos. Portanto, o objetivo deste estudo é gerar recursos genômicos para E. uniflora utilizando sequenciamento de nova geração e ferramentas de bioinformática para a identificação de miRNAs conservados e novos, bem como os genes envolvidos na sínteses dos terpenóides. No capítulo 3, bibliotecas de pequenos RNA e RNA-seq foram construídas a partir de folhas de pitanga para identificar miRNAs maduros e pre-miRNAs, respectivamente. De 14.489.131 leituras limpas de pequenos RNA, foram obtidos 1.852.722 sequências de miRNAs maduros que representam 45 famílias conservadas e que foram identificadas em outras espécies de plantas. Análises posteriores, usando contigs montados a partir do RNA-seq, permitiu a predição das estruturas secundárias de 42 pre-miRNAs: 25 conservados e 17 novos. Alvos potenciais foram previstos para os miRNAs maduros mais abundantes nos pre-miRNAs, identificados com base na homologia de sequências. Além disso, a expressão de 27 pre-miRNAs foi validada utilizando ensaios de RT-PCR em diferentes indivíduos de pitanga. Este estudo é o primeiro de identificação em grande escala de miRNAs e seus alvos potenciais de uma espécie da família Myrtaceae, e proporciona mais informação sobre a conservação evolutiva dos vias regulatórias dos miRNAs em plantas com destaques para os miRNAs específicos da pitanga. No capítulo 4, a biblioteca de RNA-seq sequenciada anteriormente foi utilizada para identificar os genes potencialmente envolvidos na via da biossíntese dos terpenos e diversidade dos terpenóides a partir da montagem de novo e a anotação do transcriptoma de E. uniflora. No total, foram identificados 72.742 unigenes com um comprimento médio de 1.048 pb. Destes, 43.631 e 36.289 unigenes foram anotadas com as bases de dados das proteínas não redundantes do NCBI e Swiss-Prot, respectivamente. A ontologia gênica categorizou as sequências em 53 grupos funcionais. A análise das vias metabólicas com KEGG revelou 8.625 unigenes designados a 141 vias metabólicas e 40 unigenes preditos como associados com a biossíntese de terpenóides. Por outro lado, foram identificados quatro genes putativos de terpeno sintases (TPS), de comprimento completo, envolvidos na biossíntese de monoterpenos e sesquiterpenos, e três genes putativos de oxidosqualeno ciclases (OSC), de comprimente completo, envolvidos na biossíntese de triterpenos. Além disso, a expressão destes genes foi validada em diferentes tecidos de E. uniflora. A futura caracterização bioquímica dos diferentes TPS e OSC descritos aqui determinará especificamente o tipo de terpenóide sintetizado em condições ambientais específicas. Os dados produzidos neste estudo servirão como referência para estudos genéticos sobre os mecanismos moleculares que são responsáveis pela composição química dos óleos essenciais em E. uniflora e os aspectos fisiológicos da capacidade de adaptação desta espécie a diferentes habitats. / Pitanga (Eugenia uniflora L.) is a shrubby tree with edible cherry-like fruits that grows in different vegetation types and ecosystems as a consequence of its high adaptability to different soils and climate conditions. This species is of particular interest due to its medicinal properties that are attributed to specialized metabolites present in their leaves and fruits with potential pharmacological benefits. Among these metabolites, the terpenoids are the most abundant in the essential oils found in the leaves. The terpene diversity observed in Myrtaceae is determined by the activity of different members of the terpene synthase and oxidosqualene cyclase families. Furthermore, miRNAs are endogenous small RNAs that play essential regulatory roles in plant growth, development and stress response. For this reason, extensive studies of miRNAs have been performed in model plants and other plants of economic importance in the last years. Therefore, the aim of this study is to generate genomic resources for E. uniflora using next generation sequencing and bioinformatics tools to identify conserved and new miRNAs, and to identify the genes involved in the synthesis of terpenoids. In chapter 3, small RNA and RNA-seq libraries were constructed from leaves to identify mature miRNAs and pre-miRNAs, respectively. From 14.489.131 small RNA clean reads we obtained 1.852.722 mature miRNA sequences, representing 45 conserved families that have been identified in other plant species. Further analysis using assembled contigs from RNA-seq allowed the prediction of secondary structures of 42 pre-miRNAs: 25 conserved and 17 novel. Potential targets were predicted for the most abundant mature miRNAs, which were identified in pre-miRNAs based on sequence homology. In addition, the expression of 27 identified pre-miRNAs was validated using RTPCR assays in different individuals of pitanga. In chapter 4, the previously sequenced RNA-seq library was de novo assembled followed by annotation of the E. uniflora transcriptome and used to identify the genes potentially involved in the terpene biosynthesis pathway and terpenoid diversity. In total, we identified 72.742 unigenes with a mean length of 1.048 bp. Of these, 43.631 and 36.289 unigenes were annotated with the NCBI non-redundant protein and Swiss-Prot databases, respectively. The gene ontology categorized the sequences into 53 functional groups. A metabolic pathway analysis with KEGG revealed 8.625 unigenes assigned to 141 metabolic pathways and 40 unigenes predicted to be associated with the biosynthesis of terpenoids. Furthermore, we identified four putative full-length terpene synthase (TPS) genes involved in sesquiterpenes and monoterpenes biosynthesis, and three putative full-length oxidosqualene cyclase (OSC) genes involved in the triterpenes biosynthesis. In addition, expression of these genes was validated in different E. uniflora tissues. Future biochemical characterization of the different TPS and OSC described here will determine the type of terpenoid specifically synthesized in specific environmental conditions. The data produced in this study will serve as a reference for genetic studies about the molecular mechanisms behind the chemical composition of the essential oils in E. uniflora and about the physiologic aspects of the capacity of adaptation of this specie to different habitats.

Pitanga (Eugenia uniflora L.) é uma árvore arbustiva com frutas semelhantes à cereja, que cresce em diferentes tipos de vegetação e ecossistemas como consequência da sua alta capacidade de adaptação a diferentes condições de solo e clima. Esta espécie é de particular interesse econômico devido às suas propriedades medicinais, que são atribuídas aos metabólitos especializados presentes em suas folhas e frutos. Entre os metabólitos, os terpenóides são os mais abundantes dos óleos essenciais que são encontrados nas folhas. A diversidade de terpenos observada em Myrtaceae é determinada pela atividade de diferentes membros das famílias das terpeno sintases e oxidosqualeno ciclases. Por outro lado, os miRNAs são pequenos RNAs endógenos que desempenham papéis regulatórios essenciais no crescimento das plantas, desenvolvimento e resposta ao estresse. Por esta razão, estudos extensivos de miRNAs foram realizados em plantas modelos e outras plantas de importância econômica nos últimos anos. Portanto, o objetivo deste estudo é gerar recursos genômicos para E. uniflora utilizando sequenciamento de nova geração e ferramentas de bioinformática para a identificação de miRNAs conservados e novos, bem como os genes envolvidos na sínteses dos terpenóides. No capítulo 3, bibliotecas de pequenos RNA e RNA-seq foram construídas a partir de folhas de pitanga para identificar miRNAs maduros e pre-miRNAs, respectivamente. De 14.489.131 leituras limpas de pequenos RNA, foram obtidos 1.852.722 sequências de miRNAs maduros que representam 45 famílias conservadas e que foram identificadas em outras espécies de plantas. Análises posteriores, usando contigs montados a partir do RNA-seq, permitiu a predição das estruturas secundárias de 42 pre-miRNAs: 25 conservados e 17 novos. Alvos potenciais foram previstos para os miRNAs maduros mais abundantes nos pre-miRNAs, identificados com base na homologia de sequências. Além disso, a expressão de 27 pre-miRNAs foi validada utilizando ensaios de RT-PCR em diferentes indivíduos de pitanga. Este estudo é o primeiro de identificação em grande escala de miRNAs e seus alvos potenciais de uma espécie da família Myrtaceae, e proporciona mais informação sobre a conservação evolutiva dos vias regulatórias dos miRNAs em plantas com destaques para os miRNAs específicos da pitanga. No capítulo 4, a biblioteca de RNA-seq sequenciada anteriormente foi utilizada para identificar os genes potencialmente envolvidos na via da biossíntese dos terpenos e diversidade dos terpenóides a partir da montagem de novo e a anotação do transcriptoma de E. uniflora. No total, foram identificados 72.742 unigenes com um comprimento médio de 1.048 pb. Destes, 43.631 e 36.289 unigenes foram anotadas com as bases de dados das proteínas não redundantes do NCBI e Swiss-Prot, respectivamente. A ontologia gênica categorizou as sequências em 53 grupos funcionais. A análise das vias metabólicas com KEGG revelou 8.625 unigenes designados a 141 vias metabólicas e 40 unigenes preditos como associados com a biossíntese de terpenóides. Por outro lado, foram identificados quatro genes putativos de terpeno sintases (TPS), de comprimento completo, envolvidos na biossíntese de monoterpenos e sesquiterpenos, e três genes putativos de oxidosqualeno ciclases (OSC), de comprimente completo, envolvidos na biossíntese de triterpenos. Além disso, a expressão destes genes foi validada em diferentes tecidos de E. uniflora. A futura caracterização bioquímica dos diferentes TPS e OSC descritos aqui determinará especificamente o tipo de terpenóide sintetizado em condições ambientais específicas. Os dados produzidos neste estudo servirão como referência para estudos genéticos sobre os mecanismos moleculares que são responsáveis pela composição química dos óleos essenciais em E. uniflora e os aspectos fisiológicos da capacidade de adaptação desta espécie a diferentes habitats. / Pitanga (Eugenia uniflora L.) is a shrubby tree with edible cherry-like fruits that grows in different vegetation types and ecosystems as a consequence of its high adaptability to different soils and climate conditions. This species is of particular interest due to its medicinal properties that are attributed to specialized metabolites present in their leaves and fruits with potential pharmacological benefits. Among these metabolites, the terpenoids are the most abundant in the essential oils found in the leaves. The terpene diversity observed in Myrtaceae is determined by the activity of different members of the terpene synthase and oxidosqualene cyclase families. Furthermore, miRNAs are endogenous small RNAs that play essential regulatory roles in plant growth, development and stress response. For this reason, extensive studies of miRNAs have been performed in model plants and other plants of economic importance in the last years. Therefore, the aim of this study is to generate genomic resources for E. uniflora using next generation sequencing and bioinformatics tools to identify conserved and new miRNAs, and to identify the genes involved in the synthesis of terpenoids. In chapter 3, small RNA and RNA-seq libraries were constructed from leaves to identify mature miRNAs and pre-miRNAs, respectively. From 14.489.131 small RNA clean reads we obtained 1.852.722 mature miRNA sequences, representing 45 conserved families that have been identified in other plant species. Further analysis using assembled contigs from RNA-seq allowed the prediction of secondary structures of 42 pre-miRNAs: 25 conserved and 17 novel. Potential targets were predicted for the most abundant mature miRNAs, which were identified in pre-miRNAs based on sequence homology. In addition, the expression of 27 identified pre-miRNAs was validated using RTPCR assays in different individuals of pitanga. In chapter 4, the previously sequenced RNA-seq library was de novo assembled followed by annotation of the E. uniflora transcriptome and used to identify the genes potentially involved in the terpene biosynthesis pathway and terpenoid diversity. In total, we identified 72.742 unigenes with a mean length of 1.048 bp. Of these, 43.631 and 36.289 unigenes were annotated with the NCBI non-redundant protein and Swiss-Prot databases, respectively. The gene ontology categorized the sequences into 53 functional groups. A metabolic pathway analysis with KEGG revealed 8.625 unigenes assigned to 141 metabolic pathways and 40 unigenes predicted to be associated with the biosynthesis of terpenoids. Furthermore, we identified four putative full-length terpene synthase (TPS) genes involved in sesquiterpenes and monoterpenes biosynthesis, and three putative full-length oxidosqualene cyclase (OSC) genes involved in the triterpenes biosynthesis. In addition, expression of these genes was validated in different E. uniflora tissues. Future biochemical characterization of the different TPS and OSC described here will determine the type of terpenoid specifically synthesized in specific environmental conditions. The data produced in this study will serve as a reference for genetic studies about the molecular mechanisms behind the chemical composition of the essential oils in E. uniflora and about the physiologic aspects of the capacity of adaptation of this specie to different habitats.

O gênero Salvia L. (Lamiaceae), constituido de aproximadamente 900 espécies, possui 60 representantes no Brasil. Dentre suas propriedades medicinais destacam-se as atividades antitumoral, anti-inflamatória, cicatrizante e antibacteriana. Óleos essenciais e diterpenos de núcleos abietano, clerodano, primarano estão entre os principais constituintes químicos relatados para as espécies. O objetivo deste trabalho foi a caracterização química dos óleos essenciais obtidos por hidrodestilação de seis espécies de Salvia nativas da região Sul do Brasil (S. guaranitica, da Seção Coerulae; S. ovalifolia, S. cordata e S. borjensis, da Seção Rudes e S. procurrens e S. uliginosa, da Seção Uliginosae), utilizando cromatografia à gás/espectrometria de massas. A análise química dos óleos essenciais mostrou que todas as espécies apresentaram apenas sesquiterpenos, além de compostos alifáticos como aldeidos e ácidos graxos de cadeia longa. Entre estes últimos, nonadecanal estava presente em todas as espécies, sendo abundante (13% a 56%) em S. procurrens, S. ovalifolia e S. borjensis. Em relação à composição dos sesquiterpenos, observou-se que espatulenol estava presente em quantidades relativamente grandes (10% - 40%) nas espécies S. cordata, S. borjensis e S. ovalifolia. Estas espécies também apresentaram β-cariofileno, sesquiterpeno encontrado, ainda, em S. guaranitica. S. cordata apresentou o sesquiterpeno epi-globulol (32,3%) e 2E, 6Z-farnesol (11,4%). O óleo essencial de S. uliginosa apresentou ácido hexadecanóico (30,1%), n-nonadecano (17,5%) e nonadecanal (4,5%) como componentes majoritários. Os óleos essenciais e os extratos diclorometano das espécies da Seção Uliginosae (S. uliginosa e S. procurrens) mostraram atividade contra Staphylococcus aureus, quando testados pelo método de bioautografia. As analises preliminares sugerem a presença de diterpenos de núcleo abietano-quinona nos extratos orgânicos destas espécies. Os extratos diclorometano dessas duas espécies foram também avaliados quanto à atividade amebicida contra amebas de vida livre Acanthamoeba polyphaga. Entre estes, apenas o de S. uliginosa foi ativo, apresentando 100% de atividade nas concentrações de 7,5 e 5 mg/mL. / The genus Salvia L. (Lamiaceae) has about 900 species, 60 of them found in Brazil. Among the medicinal properties it is possible to highlight anti-tumor, anti-inflammatory, antioxidant and antibacterial activities. Essential oils and diterpenes with abietane, clerodane and primarane skeletons are the main componentes of these plants. In this sense, the purpose of this study was to characterize the essential oils obtained by hydrodistillation from Salvia species native to southern Brazil (S. guaranitica, Section Coerula; S. ovalifolia, S. cordata and S. borjensis, Section Rudes and S. procurrens and S. uliginosa, Section Uliginosae), using gas chromatography coupled to mass spectrometry. Chemical analysis of the essential oils showed that all species had only sesquiterpenes, and aliphatic compounds such as aldehydes and long chain fatty acids. Among the latter, nonadecanal was present in all species, being abundant (13% to 56%) in S. procurrens, S. borjensis and S. ovalifolia. Regarding the composition of the sesquiterpenes, it was observed that spathulenol was present in relatively large amounts (10% - 40%) in S. cordata, S. borjensis and S. ovalifolia oils. These species also showed β-caryophyllene, a sesquiterpene also found in S. guaranitica. S. cordata showed the sesquiterpene epi-globulol (32.3%) and 2E, 6Z-farnesol (11.4%). S. uliginosa essential oil presented hexadecanoic acid (30.1%), n-nonadecane (17.5%) and nonadecanal (4.5%) as the main compound. The essential oils and the dichloromethane extracts of of the species from the Section Uliginosae (S. uliginosa and S. procurrens) demonstrated antimicrobial activity against Staphylococcus aureus when investigated by the bioautography method. Preliminary analyses indicated theat the main compounds present in the organic extracts are diterpenes with the abietane type-diterpene quinone nucleous. The dichloromethane extracts of these two species were also evaluated for the activity against Acanthamoeba polyphaga. Only the extract of S. uliginosa was active, with 100% activity at concentrations of 7.5 and 5 mg/mL.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:36:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5703.pdf: 9636340 bytes, checksum: f0c2d44d2cef3dc3b41ae4d5b56d8d1c (MD5) Previous issue date: 2011-08-05 / Universidade Federal de Sao Carlos / In the present work, the lanostane triterpenes Lanosta-8,24-diene-3β,23-diol and Lanosta-8,23-diene-3β,25-diol were isolated from the basidiomycete Scleroderma sp., an extremely rich source of triterpenes and not yet reported as having it. The molecular structures were completely determined by 1D and 2D NMR and mass spectrometry (MS) analyses with fragmentation mechanisms being also suggested. These and other substrates were considered for terpenoids metabolism study in Xylaria sp., a micro-organism known from previous projects, at the research group LaBioMMi, by living in mutuality with Sapindus saponaria, a saponins producer plant, known for its antifungal metabolites. Different substrates were considered for fungal experiments, including oleanolic acid, isolated from clove and identified by 1H NMR, stevioside, obtained from commercial source, avenacosides A and B from oats, used in its natural way (known for being rich in these glycosides) and the previously isolated lanosterols from Scleroderma sp. As in their habitat, Xylaria fungus has proved to have great glycosides affinity, promoting deglycosylations reactions or even combining them with different sugar patterns. Oleanolic acid was completely consumed by the micro-organism, while lanosterol were fully incorporated into the fungus mycelium. Using high-resolution LC/MS analysis with Q-TOF hybrid analyzer, the metabolites were accurately identified so as some biotransformation products. / No presente trabalho foram isolados os triterpenos lanostanos Lanosta-8,24-diene-3ß,23-diol e Lanosta-8,23-diene-3ß,25-diol do basidiomiceto Scleroderma sp., uma fonte rica em triterpenos e ainda não reportada como produtora destes metabólitos. As estruturas moleculares foram completamente determinadas por RMN 1D e 2D e análises de espectrometria de massas, tendo ainda as fragmentações propostas. Esses e outros substratos foram considerados para o estudo do metabolismo de terpenóides em Xylaria sp., um micro-organismo conhecido de pesquisas anteriores do grupo LaBioMMi por viver em mutualismo com Sapindus saponaria, uma planta rica em saponinas, que são metabólitos conhecidos pelo potencial antifúngico. Diferentes substratos foram utilizados nos experimentos com o fungo, dentre eles o ácido oleanólico isolado do cravo da Índia (com sua estrutura determinada por RMN 1H), steviosídeo, proveniente de fonte comercial, avenacosídeos A e B, utilizados sem isolamento prévio a partir da aveia (a qual é uma fonte rica nesses glicosídeos) e os lanosteróis isolados de Scleroderma sp. Assim como em seu habitat, a Xylaria mostrou grande afinidade pelos glicosídeos, promovendo reações de desglicosilações ou mesmo acumulando-os com diferentes padrões de glicosilação. O ácido oleanólico foi completamente consumido pelo micro-organismo, enquanto que os lanosteróis foram totalmente incorporados ao micélio do fungo. Através de análise em LC/MS de alta resolução com analisador híbrido Q-TOF foi possível determinar com precisão a identidade dos metabólitos utilizados, assim como alguns produtos de biotransformação.

O gênero Salvia L. (Lamiaceae), constituido de aproximadamente 900 espécies, possui 60 representantes no Brasil. Dentre suas propriedades medicinais destacam-se as atividades antitumoral, anti-inflamatória, cicatrizante e antibacteriana. Óleos essenciais e diterpenos de núcleos abietano, clerodano, primarano estão entre os principais constituintes químicos relatados para as espécies. O objetivo deste trabalho foi a caracterização química dos óleos essenciais obtidos por hidrodestilação de seis espécies de Salvia nativas da região Sul do Brasil (S. guaranitica, da Seção Coerulae; S. ovalifolia, S. cordata e S. borjensis, da Seção Rudes e S. procurrens e S. uliginosa, da Seção Uliginosae), utilizando cromatografia à gás/espectrometria de massas. A análise química dos óleos essenciais mostrou que todas as espécies apresentaram apenas sesquiterpenos, além de compostos alifáticos como aldeidos e ácidos graxos de cadeia longa. Entre estes últimos, nonadecanal estava presente em todas as espécies, sendo abundante (13% a 56%) em S. procurrens, S. ovalifolia e S. borjensis. Em relação à composição dos sesquiterpenos, observou-se que espatulenol estava presente em quantidades relativamente grandes (10% - 40%) nas espécies S. cordata, S. borjensis e S. ovalifolia. Estas espécies também apresentaram β-cariofileno, sesquiterpeno encontrado, ainda, em S. guaranitica. S. cordata apresentou o sesquiterpeno epi-globulol (32,3%) e 2E, 6Z-farnesol (11,4%). O óleo essencial de S. uliginosa apresentou ácido hexadecanóico (30,1%), n-nonadecano (17,5%) e nonadecanal (4,5%) como componentes majoritários. Os óleos essenciais e os extratos diclorometano das espécies da Seção Uliginosae (S. uliginosa e S. procurrens) mostraram atividade contra Staphylococcus aureus, quando testados pelo método de bioautografia. As analises preliminares sugerem a presença de diterpenos de núcleo abietano-quinona nos extratos orgânicos destas espécies. Os extratos diclorometano dessas duas espécies foram também avaliados quanto à atividade amebicida contra amebas de vida livre Acanthamoeba polyphaga. Entre estes, apenas o de S. uliginosa foi ativo, apresentando 100% de atividade nas concentrações de 7,5 e 5 mg/mL. / The genus Salvia L. (Lamiaceae) has about 900 species, 60 of them found in Brazil. Among the medicinal properties it is possible to highlight anti-tumor, anti-inflammatory, antioxidant and antibacterial activities. Essential oils and diterpenes with abietane, clerodane and primarane skeletons are the main componentes of these plants. In this sense, the purpose of this study was to characterize the essential oils obtained by hydrodistillation from Salvia species native to southern Brazil (S. guaranitica, Section Coerula; S. ovalifolia, S. cordata and S. borjensis, Section Rudes and S. procurrens and S. uliginosa, Section Uliginosae), using gas chromatography coupled to mass spectrometry. Chemical analysis of the essential oils showed that all species had only sesquiterpenes, and aliphatic compounds such as aldehydes and long chain fatty acids. Among the latter, nonadecanal was present in all species, being abundant (13% to 56%) in S. procurrens, S. borjensis and S. ovalifolia. Regarding the composition of the sesquiterpenes, it was observed that spathulenol was present in relatively large amounts (10% - 40%) in S. cordata, S. borjensis and S. ovalifolia oils. These species also showed β-caryophyllene, a sesquiterpene also found in S. guaranitica. S. cordata showed the sesquiterpene epi-globulol (32.3%) and 2E, 6Z-farnesol (11.4%). S. uliginosa essential oil presented hexadecanoic acid (30.1%), n-nonadecane (17.5%) and nonadecanal (4.5%) as the main compound. The essential oils and the dichloromethane extracts of of the species from the Section Uliginosae (S. uliginosa and S. procurrens) demonstrated antimicrobial activity against Staphylococcus aureus when investigated by the bioautography method. Preliminary analyses indicated theat the main compounds present in the organic extracts are diterpenes with the abietane type-diterpene quinone nucleous. The dichloromethane extracts of these two species were also evaluated for the activity against Acanthamoeba polyphaga. Only the extract of S. uliginosa was active, with 100% activity at concentrations of 7.5 and 5 mg/mL.