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Introduction : L'hémophilie est une maladie génétique de la coagulation due à un déficit en facteur VIII ou en facteur IX. Ces déficits sont responsables d'un déficit du complexe ténase intrinsèque (VIIIa-IXa). De plus, le complexe ténase extrinsèque (facteur tissulaire - VIIa) est physiologiquement rapidement inhibé par le TFPI lié au facteur Xa. Nous avons évalué la capacité d'une forme tronquée du facteur Xa (GDXa), dépourvue de domaine Gla à se lier au TFPI et à soulager l'inhibition physiologique du complexe ténase extrinsèque. Matériel et Méthodes : Dans une première partie, nous avons évalué la capacité du GDXa à restaurer la génération de thrombine de plasmas d'hémophiles A et B sévères sans et avec inhibiteurs. Nous avons également comparé les profils de génération de thrombine obtenus après addition du GDXa à ceux obtenus en présence d'anticorps neutralisants anti-TFPI ou anti-antithrombine. Enfin, nous avons comparé les cinétiques enzymatiques de neutralisation du facteur Xa et du GDXa par le TFPI et l'antithrombine. Dans une seconde partie, nous avons étudié in silico les interactions entre la chaîne lourde du facteur Xa et le TFPI pour détecter les zones d'interaction défavorables. Cette étude a identifié des acides aminés du facteur Xa qui pourraient être substitués pour optimiser l'interaction avec le TFPI. Les résultats in silico ont orienté nos choix de mutagenèse dirigée pour concevoir différents variants moléculaires du GDXa (R138F, R138G, R138I) où l'arginine 138 est substituée. Ces variants protéiques ont été produits de façon recombinante dans des cellules HEK293E. La capacité des différents variants à restaurer la génération de thrombine de plasmas d'hémophiles a été testée avec les surnageants de culture cellulaires correspondants. Résultats : Dans la première partie, nous avons montré que le GDXa est capable de restaurer la génération de thrombine de plasmas d'hémophiles A et B sans et avec inhibiteurs. Comparativement au facteur Xa, le GDXa montre une affinité moindre pour le TFPI tandis que les affinités du GDXa et du facteur Xa pour l'antithrombine sont identiques. Enfin, malgré une demi-vie courte, l'effet du GDXa sur la génération de thrombine est maintenu pendant au moins une heure. Dans la seconde partie, nous avons produit les différents variants R138F, R138G et R138I en cellules HEK293E et montré que les surnageants de culture cellulaire étaient capables de restaurer la génération de thrombine de plasmas d'hémophiles de façon plus efficace que le GDXa. Conclusion : Comme le GDXa est capable de restaurer la génération de thrombine de plasmas d'hémophiles, nos résultats suggèrent que le GDXa pourrait être une alternative efficace aux thérapeutiques hémostatiques court-circuitantes actuelles chez les hémophiles sans ou avec inhibiteurs. Les résultats obtenus renforcent l'hypothèse que l'activité pro-coagulante du GDXa serait liée à la formation d'un complexe GDXa-TFPI limitant la formation du complexe Xa-TFPI nécessaire à l'inhibition physiologique du complexe ténase extrinsèque. De plus, notre approche rationnelle basée sur une étude in silico visant à augmenter l'affinité du TFPI pour le GDXa a permis de produire différents variants moléculaires du GDXa dont l'activité procoagulante in vitro est augmentée par rapport au GDXa.

Introduction : L'hémophilie est une maladie génétique de la coagulation due à un déficit en facteur VIII ou en facteur IX. Ces déficits sont responsables d'un déficit du complexe ténase intrinsèque (VIIIa-IXa). De plus, le complexe ténase extrinsèque (facteur tissulaire - VIIa) est physiologiquement rapidement inhibé par le TFPI lié au facteur Xa. Nous avons évalué la capacité d'une forme tronquée du facteur Xa (GDXa), dépourvue de domaine Gla à se lier au TFPI et à soulager l'inhibition physiologique du complexe ténase extrinsèque. Matériel et Méthodes : Dans une première partie, nous avons évalué la capacité du GDXa à restaurer la génération de thrombine de plasmas d'hémophiles A et B sévères sans et avec inhibiteurs. Nous avons également comparé les profils de génération de thrombine obtenus après addition du GDXa à ceux obtenus en présence d'anticorps neutralisants anti-TFPI ou anti-antithrombine. Enfin, nous avons comparé les cinétiques enzymatiques de neutralisation du facteur Xa et du GDXa par le TFPI et l'antithrombine. Dans une seconde partie, nous avons étudié in silico les interactions entre la chaîne lourde du facteur Xa et le TFPI pour détecter les zones d'interaction défavorables. Cette étude a identifié des acides aminés du facteur Xa qui pourraient être substitués pour optimiser l'interaction avec le TFPI. Les résultats in silico ont orienté nos choix de mutagenèse dirigée pour concevoir différents variants moléculaires du GDXa (R138F, R138G, R138I) où l'arginine 138 est substituée. Ces variants protéiques ont été produits de façon recombinante dans des cellules HEK293E. La capacité des différents variants à restaurer la génération de thrombine de plasmas d'hémophiles a été testée avec les surnageants de culture cellulaires correspondants. Résultats : Dans la première partie, nous avons montré que le GDXa est capable de restaurer la génération de thrombine de plasmas d'hémophiles A et B sans et avec inhibiteurs. Comparativement au facteur Xa, le GDXa montre une affinité moindre pour le TFPI tandis que les affinités du GDXa et du facteur Xa pour l'antithrombine sont identiques. Enfin, malgré une demi-vie courte, l'effet du GDXa sur la génération de thrombine est maintenu pendant au moins une heure. Dans la seconde partie, nous avons produit les différents variants R138F, R138G et R138I en cellules HEK293E et montré que les surnageants de culture cellulaire étaient capables de restaurer la génération de thrombine de plasmas d'hémophiles de façon plus efficace que le GDXa. Conclusion : Comme le GDXa est capable de restaurer la génération de thrombine de plasmas d'hémophiles, nos résultats suggèrent que le GDXa pourrait être une alternative efficace aux thérapeutiques hémostatiques court-circuitantes actuelles chez les hémophiles sans ou avec inhibiteurs. Les résultats obtenus renforcent l'hypothèse que l'activité pro-coagulante du GDXa serait liée à la formation d'un complexe GDXa-TFPI limitant la formation du complexe Xa-TFPI nécessaire à l'inhibition physiologique du complexe ténase extrinsèque. De plus, notre approche rationnelle basée sur une étude in silico visant à augmenter l'affinité du TFPI pour le GDXa a permis de produire différents variants moléculaires du GDXa dont l'activité procoagulante in vitro est augmentée par rapport au GDXa. / Background: Hemophilia is caused by deficiencies in coagulation factor VIII or IX, resulting in direct blockade of the intrinsic tenase complex and indirect blockade of the extrinsic tenase complex which is rapidly inhibited upon binding of factor Xa to tissue factor pathway inhibitor (TFPI). We evaluated the ability of Gla-domainless factor Xa (GDXa), a truncated form of factor Xa devoid of procoagulant properties, to bind to TFPI and to alleviate the physiological inhibition of the extrinsic tenase. Design and Methods: In the first part of this work, we evaluated the ability of GDXa to restore coagulation in plasmas from hemophilia A and B patients without and with inhibitors, using a thrombin generation assay triggered by a low concentration of tissue factor. We then compared its efficacy to generate thrombin to depletion of antithrombin or TFPI by specific antibodies. Finally, we compared the kinetics of neutralization of factor Xa and GDXa by antithrombin and TFPI. In the second part of this work, we realized an in silico study of the interactions between factor Xa heavy chain and TFPI. The aim was to detect unfavorable interactions and to identify amino-acid candidates for mutagenesis in order to increase affinity for TFPI. Taking into account the results of this in silico study, we produced by genic engienering different molecular variants of GDXa (R138F, R138G, R138I) where Arg138 was substituted by site directed mutagenesis. Proteins were produced in HEK293E cells. We tested dialyzed cell culture supernatants containing each variant to restore thrombin generation in plasmas from severe hemophilia patients. Results: In the first part of this work, we showed that GDXa was able to restore thrombin generation in plasma samples from hemophiliacs. This effect was observed for plasma from hemophilia A patients without or with inhibitors and for plasma from hemophilia B patients. GDXa had a lower affinity than factor Xa for TFPI whereas the affinities of both proteins for antithrombin were similar. Finally, despite a short half-life in plasma, the effect of GDXa on thrombin generation was sustained for at least one hour. In the second part of this work, we produced the different variants R138F, R138G et R138I in HEK293E cells and showed that cell culture supernatants were able to restore thrombin generation in a more efficient way than GDXa. Conclusions: As GDXa was able to restore thrombin generation in plasma from hemophilia patients, our results suggest that it may be an effective alternative to current treatments for hemophilia with or without inhibitors. Results sustained the hypothesis that GDXa coagulant activity is through TFPI binding and competition with factor Xa to bind TFPI resulting in limiting factor Xa-TFPI formation, which is essential for inhibition of extrinsic tenase complex. Furthermore, rational design of GDXa variants based on an in silico study lead to production of proteins whose coagulant activity is increased compared to GDXa."

Les pentasaccharides sont des inhibiteurs indirects du facteur Xa ayant des profils pharmacocinétiques très prédictibles. En raison de la liaison de forte affinité des pentasaccharides à l'antithrombine, cette pharmacocinétique peut être prédite mais aussi transférée à d'autres molécules qui leur sont liées de manière covalente. L'EP42675 combine dans une seule molécule, une antithrombine directe réversible peptidomimétique (analogue de l'α-NAPAP), et un pentasaccharide inhibiteur indirect du facteur Xa antithrombine dépendant (analogue du fondaparinux). L'EP217609 est le dérivé biotinylé de l'EP42675. Son action anticoagulante peut être neutralisée par l'avidine qui se lie avec une grande affinité et spécificité à la fraction biotine de l'EP217609. La première indication cible de l'EP217609 et de son antidote l'avidine est la chirurgie cardiaque nécessitant une circulation extracorporelle. La deuxième indication cible est le traitement des syndromes coronariens aigus nécessitant ou non une intervention coronarienne percutanée. Les études précliniques et cliniques de phase I et phase IIa résumées ici démontrent l'intérêt d'un tel concept de couplage avec un pentasaccharide : absence de dissociation entre les deux entités, faible variabilité intra et interindividuelle des paramètres pharmacocinétiques et pharmacodynamiques, et une neutralisation de l'activité anticoagulante de l'EP21609 quasi complète et sans effet rebond. / Pentasaccharides are indirect inhibitors of factor Xa with highly predictable pharmacokinetic profiles. Because of the high affinity binding of pentasaccharides to antithrombin, this pharmacokinetics can be predicted but also transferred to other molecules covalently bound to them. EP42675 combines in a single molecule, a reversible direct antithrombin (α-NAPAP peptidomimetic analog), and a pentasaccharide similar to fondaparinux with an indirect anti-factor Xa activity. EP217609 is the biotinylated derivative of EP42675 whose anticoagulant activity can be neutralized by avidin which binds with high affinity and specificity to the biotin moiety of EP217609.The first target indication of EP217609 and its antidote avidin is cardiac surgery requiring extracorporeal circulation. The second target indication is the treatment of acute coronary syndromes requiring or not a percutaneous coronary intervention.The preclinical and clinical Phase I and IIa studies summarized here demonstrate the value of such a coupling concept to the pentasaccharide: absence of dissociation between the two entities, low intra- and interindividual variability of the pharmacokinetic and pharmacodynamic parameters, and an almost complete neutralization of the EP217609 anticoagulant activity with no rebound effect.

L'objectif du travail de recherche concerne la conception et la réalisation de biocapteurs à base de mesures impédimétriques, pour lesquels la demande est forte dans différents domaines d'intérêt sociétal, en particulier l'environnement, la sécurité alimentaire et le biomédical. Les biocapteurs sont des moyens d'analyse en plein essor à la fois rapides, sélectifs et peu coûteux applicables à des domaines extrêmement variés (environnement, santé, agroalimentaire,…). Dans ce type d'outil, un élément sensible de nature biologique (anticorps, enzyme, microorganisme, ADN…) doté d'un pouvoir de reconnaissance pour un analyte ou un groupe d'analytes est associé à un transducteur pouvant être de type électrochimique, optique ou thermique. Dans la première partie de ce travail, un aptasensor a été développé pour la détection de la thrombine. Deux aptamères different ciblant la thrombine étaient directement immobilisés sur l'électrode en or. L'aptasensor élaboré présente une grande sensibilité, spécificité et stabilité pour la thrombine. Dans la seconde partie, en utilisant la spectroscopie d'impédance électrochimique (EIS), nous avons surveillé l'immobilisation de protéines et sans marquage sur une surface d'or, au moyen d'une stratégie d'électro-adressage, compatible avec la production de biopuces pour multi-détection.Cette fonctionnalisation est réalisée par la cycloaddition alcyne / azoture, mieux connu comme la réaction «clic». Enfin, un biocapteur utilisant des protéines de phage à été développé pour la détection de E.coli / The objective of the research concerns the design and realization of biosensors based impedimetric measures, for which there is strong demand in various societal benefit areas, particularly the environment, food security and biomedical.Biosensors are rapid, selective and inexpensive devices that combine a biological recognition element, the so-called bioreceptor (e.g. enzymes, antibodies, DNA or microorganisms) to a physical transducer (e.g. electrochemical, optical, thermal or piezoelectrical). They can be used to detect one specific analyte or one family of analytes for a wide range of applications (e.g. environment, food, health). In the first part of this work, an aptasensor was developed for thrombin detection. Two different aptamers targeting thrombin were directly immobilized on the gold electrode. The aptasensor exhibits high sensitivity, specificity and stability in the detection of thrombin. In the second part, using electrochemical impedance spectroscopy (EIS), we have, monitored label-free protein immobilization on a gold surface, through a strategy of electroaddressing, compatible with the production of microarrays for multi-detection. This functionalization is achieved via the alkyne/azide cycloaddition, better known as the "click" reaction.Finally, a biosensor using phage proteins was developed for detecting E. coli

Dans ce travail nous nous sommes intéressés à caractériser les modulateurs génétiques et environnementaux de la génération de thrombine (ETP).Nous avons montré que le taux d’antithrombine (AT) peut être considéré comme un facteur continu de risque de thrombose. L’ETP, le plus élevé, est observé chez les porteurs d’un déficit quantitatif en AT. Les porteurs de la mutation AT Cambridge II présentent également une augmentation de l’ETP. Parallèlement à l’AT, nous avons confirmé l’effet positif de l’allèle PT 20210A sur la génération de thrombine d’autant plus qu’il existe des antécédents personnels de thrombose veineuse (TV). A côté de ces contributions, nous avons confirmé le rôle des taux plasmatiques de fibrinogène et de facteur II, du groupe sanguin et de la prise de contraceptifs oraux sur l’ETP.Nos résultats montrent également que chez le rat, un régime riche en graisses a un effet sur la génération de thrombine. Le régime gras maintient des taux élevés d’ETP après le sevrage, alors qu’une alimentation standard le diminue. Cet effet est partiellement expliqué par l’élévation des taux de facteur VII coagulant et ne suit pas l’évolution des modifications classiques du métabolisme glucidolipidique. Les niveaux élevés d’ETP observés pendant une alimentation riche en graisses se normalisent quatre semaines après le retour à une alimentation standard.En conclusion nos données suggèrent que l’ETP peut être considéré comme un indicateur de l’état prothrombotique des patients, mais son utilisation à l’échelle individuelle dans la prédiction du risque de thrombose veineuse reste à approfondir. La mesure de la génération de thrombine peut être un outil utile pour évaluer les conséquences des modifications du régime alimentaire ou des médicaments pour traiter l’obésité sur le potentiel procoagulant circulant / In this work, we studied genetic and environmental modulators of thrombin generation by endogenous thrombin potential (ETP).We showed that plasma levels of antithrombin (AT) can be considered as risk factors for thrombosis. ETP levels are higher in patients presenting a quantitative defect of AT. In addition, mutation AT Cambridge II is also associated with an increase of ETP. Besides the AT, we confirmed a positive effect of the prothrombin 20210A allele on thrombin generation, especially in presence of venous thrombosis antecedents. These contributions, we have confirmed the role of plasma fibrinogen and factor II, blood group and oral contraceptives on thrombin generation.In addition, our results also showed an effect of high fat diet on thrombin generation in rats. Conversely to the standard fat diet, high fat diet maintened high levels of ETP after weaning. High fat diet-induced effects persisted four weeks after switching to standard fat diet. This effect could be partially explained by higher rates of coagulation factors VII and did not follow classical changes in glucidolipidic metabolism.In conclusion our data suggest that ETP can be considered as an indicator of the prothrombotic state in patients, but require more explanation to predict a risk of venous thrombosis. The measurement of thrombin generation may be a useful tool for assessing the impact of changes in diet or medication to treat obesity on circulating procoagulant potential.

Les tests de coagulation actuellement disponibles en médecine vétérinaire ne parviennent pas à détecter l’état hypercoagulable de manière fiable. Les tests usuels de l’hémostase (ex : PT, PTT, antithrombine, D-dimères, etc.) n’évaluent malheureusement qu’une infime portion de la coagulation sanguine. Les tests globaux de l’hémostase, incluant la thromboélastographie et la génération de thrombine, permettent une évaluation plus complète de l’hémostase, incluant l’équilibre entre les facteurs procoagulants et anticoagulants. Ceux-ci comportent cependant encore certaines lacunes quant à leur performance diagnostique. L’étude présentée dans ce mémoire propose des modifications à la génération de thrombine conventionnelle dans le but d’identifier un état hypercoagulable chez des chiens malades. Plus précisément, nous avons comparé les effets in vitro de la thrombomoduline et de daltéparine sur la génération de thrombine réalisée chez des chiens sains et des chiens malades, pour démontrer une déficience en anticoagulants endogènes (i.e. protéine C et antithrombine) chez ces derniers. Pour se faire, 10 chiens sains et 10 chiens malades ont été sélectionnés en fonction de leur historique, examen physique et analyses sanguines. Du plasma pauvre en plaquettes a été obtenu pour chaque chien à partir de sang total citraté, aliquoté et congelé à -80 ̊Celsius pendant moins de 18 mois. La génération de thrombine a été mesurée sur le plasma décongelé à l'aide de la méthode Calibrated Automated Thrombogram. Les mesures ont d’abord été réalisées sans anticoagulant, puis avec l’addition de thrombomoduline et de trois concentrations de daltéparine (0,2, 0,4 et 0,6 U/ml). Le potentiel de thrombine endogène (ETP), le temps d’initiation (Lag time), le temps pour l’atteinte du pic (TTPeak) et le pic (Peak) ont été obtenus et analysés à l'aide d'un modèle linéaire mixte (p < 0,05). Aucune différence n’était observée entre les groupes avant l’ajout d’anticoagulants. L’ajout de thrombomoduline et de daltéparine entraînait une diminution significative de l'ETP et du Peak dans les deux groupes. Cependant, l’effet de ces deux anticoagulants étaient significativement moins marqué dans le groupe malade par rapport au groupe sain, à l'exception du Peak aux concentrations de daltéparine les plus élevées (0,4 U/ml et 0,6 U/ml). Cette modification de la génération de thrombine conventionnelle permet donc de mettre en évidence un déficit en anticoagulant endogène chez les chiens malades, chez lesquels la génération de thrombine est moins affectée par l’ajout in vitro de substances anticoagulantes. Par conséquent, effectuer la génération de thrombine avec et sans l'ajout d'anticoagulants exogènes pourrait être bénéfique pour la détection des états d'hypercoagulables chez le chien. / Current coagulation testing in veterinary medicine fails to reliably and consistently identify hypercoagulable states. Traditional coagulation assays (e.g. PT, PTT, antithrombin, D-dimers, etc.) only assess a small portion of the process of coagulation. Global coagulation assays, including thromboelastography and thrombin generation, allow a more complete evaluation of hemostasis, including the balance of procoagulant versus anticoagulant blood components. However, these tests still have shortcomings in terms of their diagnostic utility. The study presented in this thesis investigates modifications to conventional thrombin generation techniques as an attempt to better identify hypercoagulable states in sick dogs. More specifically, we aimed to compare the in vitro effects of thrombomodulin and dalteparin on thrombin generation performed in healthy dogs and dogs presented with illnesses associated with hypercoagulable states. We hypothesized that addition of these agents would demonstrate endogenous anticoagulant deficiencies (i.e. protein C and antithrombin) in sick dogs. Ten healthy dogs and ten sick dogs were selected based on history, physical examination and complete blood work. Platelet-poor plasma was obtained from citrated whole blood, aliquoted and frozen at -80 ̊Celsius for less than 18 months. Thrombin generation was measured on thawed plasma using a Calibrated Automated Thrombogram assay. Measurements were performed without anticoagulant and with the addition of thrombomodulin and dalteparin at three dilutions (0.2, 0.4 and 0.6 U/ml). Endogenous thrombin potential (ETP), lag time (Lag time), time to peak (TTPeak) and peak thrombin generation (Peak) were recorded and analyzed using a mixed linear model (p < 0.05). No difference was observed between the groups before the addition of anticoagulants. The addition of thrombomodulin and dalteparin significantly decreased ETP and Peak thrombin generation in both groups. However, the effects of both anticoagulants were significantly less in the diseased group compared to the healthy group, except for Peak at the highest dalteparin concentrations (0.4 U/ ml and 0.6 U/ml). The addition of thrombomodulin and dalteparin to plasma in vitro highlights an endogenous anticoagulant deficiency in this population of sick dogs, by failing to reduce thrombin generation to the same extent as in healthy dogs. Therefore, performing thrombin generation with and without the addition of exogenous anticoagulants might be beneficial for the detection of hypercoagulable states in the dog.

La drépanocytose est associée à un état d’hypercoagulabilité qui se manifeste sur le plan clinique par un risque augmenté de thromboses artérielles et veineuses. L’exploration de la coagulation chez les patients drépanocytaires montrait surtout une activation de la coagulation et des altérations des acteurs pro- et anticoagulants du système hémostatique. Les tests de coagulation globale de routine tels que l’aPTT et le PT sont peu sensibles aux états d’hypercoagulabilité. La fonction hémostatique globale des patients drépanocytaires était donc peu connue. Le test de génération de thrombine est un test de coagulation globale, sensible aux états d’hypo- et d’hypercoagulabilité, facile à réaliser de nos jours avec une bonne reproductibilité. Nous l’avons utilisé pour démontrer que la coagulation globale des enfants drépanocytaires était caractérisée par une accélération des réactions de formation de la thrombine et par une augmentation du potentiel de thrombine endogène. Nous avons par la suite montré que les taux élevés de microparticules pro-coagulantes et du facteur VIII chez les enfants drépanocytaires seraient les facteurs déterminant l’accélération des réactions de formation de thrombine tandis que la réduction de l’activité anticoagulante du système protéine C / protéine S serait le facteur déterminant l’augmentation du potentiel de thrombine endogène. Les marqueurs de l’hémolyse corrélaient significativement avec ces facteurs ainsi qu’avec les paramètres de génération de thrombine, suggérant que l’hémolyse serait le mécanisme pathologique à la base de l’augmentation du potentiel de génération de thrombine chez les enfants drépanocytaires. Les paramètres de génération de thrombine n’étaient pas significativement différents entre l’état de stabilité clinique et l’état de crise vaso-occlusive. Chez les enfants hétérozygotes composites, ces paramètres avaient des valeurs intermédiaires entre celles des enfants contrôles et celles des enfants drépanocytaires homozygotes. Près de 40 % des enfants drépanocytaires homozygotes avaient un potentiel hémostatique supérieur à la moyenne + 2DS des enfants contrôles du même âge. Ces enfants présentant une génération de thrombine élevée se distinguaient des autres par leur plus jeune âge, une plus grande intensité de l’hémolyse, une plus courte durée de traitement par l’hydroxyurée et des vélocités du flux sanguin au doppler transcrânien plus élevées. Ces données suggèrent davantage un lien entre le potentiel de génération de thrombine et la vasculopathie cérébrale chez les enfants drépanocytaires. L’analyse de 4 enfants ayant reçu une greffe de cellules souches hématopoïétiques montrait une tendance à la réduction du potentiel de génération de thrombine et des autres altérations de la coagulation trois mois après la greffe. Le test de génération de thrombine permet une meilleure exploration de la coagulation globale des enfants drépanocytaires. Sa réalisation sur sang total permettrait une analyse plus globale en intégrant la participation des éléments figurés du sang particulièrement les globules rouges./<p>Sickle cell disease is associated with a hypercoagulable state that express clinically by an increased risk of arterial and venous thrombosis. The exploration of coagulation in sickle cell patients showed mainly activation of coagulation and alterations pro-and anticoagulants actors of the hemostatic system. Routine global testing of coagulation such as the prothrombin time and the activated partial thromboplastin time are insensitive to hypercoagulable states. The overall hemostatic function in sickle cell disease was so little known. The thrombin generation test is a test of overall coagulation. It is sensitive to both hypo- and hypercoagulable states. It is easy to perform nowadays with good reproducibility. We used it to demonstrate that the overall coagulation of sickle cell disease children was characterized by an acceleration of the reactions of thrombin formation and an increase of the endogenous thrombin potential. We have subsequently shown that high levels of procoagulant microparticles and high levels of factor VIII in children with sickle cell disease are the factors determining the acceleration of reactions leading to thrombin formation. Our results also showed that the reduced activity of the protein C / S anticoagulant pathway is a determining factor of the increased endogenous thrombin potential in sickle cell children. Markers of hemolysis correlated significantly with these factors as well as the parameters of thrombin generation, suggesting that hemolysis is probably the pathological mechanism underlying the increased potential for thrombin generation in children with sickle cell disease. Nearly 40% of children with homozygous sickle cell disease had their hemostatic potential above the mean + 2SD that of controls children of the same age. These children with high thrombin generation differed from others by their younger age, greater intensity of hemolysis, a shorter duration of treatment with hydroxyurea. They also had higher velocity of blood flow using transcranial Doppler. These data further suggest a potential link between thrombin generation and cerebral vasculopathy in children with sickle cell disease. Analysis of four children who received hematopoietic stem cells transplantation showed a tendency towards a reversibility of thrombin generation and other alterations of coagulation three months after the transplant. Thrombin generation assay allows a better exploration of the global coagulation of sickle cell disease children. Its realization on whole blood would be a more comprehensive analysis as it would integrate the participation of blood cells particularly red blood cells. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Connue pour son rôle dans la cascade de coagulation, la thrombine, une protéase à sérine, peut également agir par l’intermédiaire de PAR1, un récepteur activé par protéase et couplé aux protéines G liant le GTP (GPCR). La thrombine se lie et clive l’extrémité N-terminale du PAR1 entre l’Arg41 et la Ser42, exposant une nouvelle extrémité terminale qui agit elle-même comme un ligand. La thrombine et une séquence peptidique de cinq acides aminés, composée des résidus Ser42 à Arg46, nommée PAR1-AP, déclenchent dans diverses cellules de mammifères une réponse intracellulaire comportant une composante calcique. Dans cette étude, le système d’expression par baculovirus dans les cellules Sf9 d'insecte nous a permis d'exprimer le récepteur PAR1 du rat à la surface de ces cellules et de réaliser son couplage fonctionnel à leur signalisation intracellulaire (modèle rPAR1-Sf9). La composante calcique de celle-ci, en réponse au PAR1-AP, a ensuite été étudiée en détail à l’aide de la sonde fluorescente Fura-2 et de plusieurs inhibiteurs agissant sur les canaux calciques ou d'autres éléments de la cascade de signalisation du calcium intracellulaire. Lorsque le milieu extracellulaire contient du calcium (Ca2+), la thrombine ou PAR1-AP déclenchent un signal calcique qui consiste en une augmentation rapide de [Ca2+]i suivi d’un plateau relativement soutenu, puis d'un retour lent vers le niveau de base initial. En l'absence de Ca2+ dans le milieu extracellulaire, l'augmentation initiale rapide de [Ca2+]i est suivie d'un retour rapide vers le [Ca2+]i de base. À l’aide d’inhibiteurs de canaux calciques, tels que le lanthane, la nifédipine et le D-600, l'entrée du calcium du milieu extracellulaire dans les cellules est inhibée, abolissant le plateau soutenu de [Ca2+]i. L’inhibition de la pompe Ca2+-ATPase par la thapsigargine supprime la réponse au PAR1-AP après épuisement des sites de stockage de Ca2+intracellulaire. Le TMB-8 agit de façon discordante quant à l’inhibition de la libération de Ca2+ des sites de stockage intracellulaires. La réponse à PAR1-AP n’est pas affectée par le D-609, un inhibiteur de la phospholipase β. L’inhibition de la protéine kinase C (PKC) par le bisindolylmaléimide induit des oscillations en présence de Ca2+ extracellulaire et atténue fortement le signal calcique en absence de Ca2+ extracellulaire. En présence de Ca2+ extracellulaire, l’activation de la PKC par le PBDu tronque le flux de [Ca2+]i tandis que la réponse calcique est abolie en absence de Ca2+ dans le milieu extracellulaire. Le H-89, un inhibiteur de la protéine kinase A (PKA), cause une prolongation de la durée du plateau de [Ca2+]i dans un milieu riche en calcium et la suppression de la réponse à PAR1-AP lorsque le milieu extracellulaire est dépourvu de Ca2+. Les résultats obtenus nous permettent de conclure que la PKC et possiblement la PKA jouent un rôle critique dans la mobilisation du Ca2+ induite par le PAR1-AP dans le modèle rPAR1-Sf9. / Thrombin’s serine protease activity allows for it to have a role in both the coagulation cascade as well as through a GTP- binding protein coupled receptor (GPCR) known as the protease-activated receptor-1 (PAR1). Thrombin binds to PAR1 at the N-terminal, cleaving between Arg41 and Ser42, and unmasking a new N-terminal which acts as a tethered ligand. Thrombin and a five amino acid peptide composed of the sequence of residues Ser42 to Arg46, known as PAR 1-AP, has been shown to mediate a number of signalling mechanisms in mammalian cells, including a calcium signalling pathway. In the present study, the Sf9-baculovirus system allowed us to express the rat PAR1 (rPAR1-Sf9) on the cell surface and study its intracellular signalling. The calcium (Ca2+) signal was studied using the fluorescent probe Fura-2, and several Ca2+ channel inhibitors and calcium signal modulators were used to study the signal induced by PAR1-AP. In the presence of extracellular calcium [Ca2+]e, thrombin and PAR1-AP produced a Ca2+ signal which consisted of an initial spike in [Ca2+]i followed by a relatively maintained plateau and a slow return towards baseline. In the absence of Ca2+ in the extracellular space, the initial Ca2+ increase is followed by a quick return to baseline [Ca2+]i. Ca2+ channel inhibitors, lanthanum, nifedipine and D-600, inhibited the entry of Ca2+ from the extracellular space and abolished the plateau phase of the response to PAR1-AP. Inhibition of the Ca2+-ATPase with thapsigargin abolished the response to PAR1-AP after having depleted the Ca2+ stores involved in the initial spike in [Ca2+]i. TMB-8, expected to inhibit the release of Ca2+ from internal stores, inconsistently inhibited the [Ca2+]i response to PAR1-AP. The response elicited by PAR1-AP was not affected by D-609, an inhibitor of phospholipase Cβ. Inhibition of protein kinase C (PKC) with bisindolylmaleimide induced oscillations in the [Ca2+]i levels in the presence of extracellular Ca2+ while it significantly blunted the response in the absence of extracellular Ca2+. PDBu activation of PKC truncated the [Ca2+]i surge in Ca2+-rich conditions while abolishing it altogether in the absence of extracellular Ca2+. H-89 inhibition of protein kinase A (PKA) prolonged the plateau duration in Ca2+-rich medium while inhibiting the response to PAR1-AP in a Ca2+-deficient environment. Taken together, our results suggest that PKC and possibly PKA play a critical role in the mobilisation of Ca2+ in rPAR1-Sf9 by PAR1-AP.

L'inhibiteur de la Voie du Facteur Tissulaire (TFPI) est une protéine régulatrice de la coagulation plasmatique intervenant à la phase initiale de la cascade. Il inhibe en présence de la protéine S (PS) le facteur Xa et ce complexe TFPI-Xa inactive ensuite le complexe FT-VIIa. Nous avons recherché une résistance à l'activité anticoagulante du TFPI. La sensibilité du plasma à une quantité fixe de TFPI a été évaluée sur la base d'un temps de thromboplastine diluée (TTD) réalisé avec et sans TFPI : - chez des patients ayant présenté une thrombose veineuse profonde inexpliquée ; cette résistance suspectée sur une 1ère étude n'a pas été confirmée sur la 2ème. - chez des patientes enceintes ; une résistance au TFPI acquise a été montrée et rapportée au déficit acquis en PS ; cependant le degré de résistance au TFPI ne peut pas être utilisé comme marqueur de risque de pathologie vasculaire placentaire. Chez des patients obèses l'effet inhibiteur des taux élevés de Lp(a) sur l'activité TFPI décrit in vitro n'a pas été retrouvé in vivo pas plus que l'effet de l'aspirine sur la normalisation des taux de Lp(a). Le TFPI joue un rôle dans les manifestations hémorragiques des hémophiles. Nous avons montré que les hémophiles B ont comparativement aux A des taux moindres de TFPI ce qui pourrait expliquer leur différence en terme de manifestations hémorragiques. Les taux de TFPI libre sont bien corrélés aux paramètres de la génération de thrombine surtout au temps de latence. En présence d’un anti TFPI humain la génération de thrombine est corrigée chez l'hémophile. Cette correction dépend de la concentration d'anti TFPI, est saturable et doit être étudiée sur du plasma riche en plaquettes / TFPI is a multivalent Kunitz-type proteinase inhibitor that directly inhibits FXa and produces FXa-dependent feedback inhibition of the FVIIa–TF complex. It was recently demonstrated that Protein S (PS) plays the role of TFPI cofactor by enhancing the TFPI inhibition of factor Xa in vivo. Approximately 80% of plasma TFPI circulates as a complex with plasma lipoproteins, about 5–20% circulating as free TFPI. Under quiescent conditions, approximately 50–80% of intravascular TFPI is stored in association with the endothelium. Full-length TFPI α carried in platelets constitutes 8-10% of the total amount of TFPI in the blood, corresponding to a quantity comparable to that of soluble full-length TFPI α in the plasma. We searched for resistance to TFPI activity in patients who presented idiopathic venous thrombosis at a young age. Plasma sensitivity to TFPI was evaluated on the basis of diluted prothrombin time (dPT) measured in patients and in control plasma in the presence (W) and absence (Wo) of exogenous TFPI. At the same time, dPT was measured on a reference plasma to establish a normalized ratio termed TFPI NR and defined as (dPT wTFPI/ dPT Wo TFPI) patient or control / (dPT wTFPI/ dPT Wo TFPI) reference plasma. In an initial study, we found that TFPI resistance could be considered as a new coagulation abnormality that could be related to unexplained thrombosis. In a second study, we failed to demonstrate a role of TFPI resistance in patients with venous thrombosis, abnormal TFPI NR being more likely related to the non-respect of preanalytical conditions rather than to an inherited trait. However, in another study, we showed that inherited or acquired PS deficiency was responsible for a TFPI resistance, providing an ex vivo demonstration that PS is the cofactor of TFPI activity. We showed that this TFPI resistance existed throughout pregnancy and that it disappeared when PS returned to normal values after delivery. We evaluated this TFPI resistance as a possible marker of the risk of a gestational vascular complication (GVC) in 72 patients at risk of developing a GVC. TFPI NR did not differ between GVC+ patients (n =15) and GVC– patients (n = 57). High levels of Lipoprotein(a) (Lp(a) have been shown to be an independent risk factor for cardiovascular disease, lowering of these levels not being achievable by any treatment except possibly aspirin. An in vitro study showed that TFPI activity could be inhibited by Lp(a). We did not confirm this TFPI inhibition in vivo in 20 obese patients with coronary insufficiency who had either normal Lp(a) levels (≤ 0.3 g/L; n = 15) or high Lp(a) levels (≥ 0.3 g/L; n = 5) . Moreover, we found no effect of aspirin treatment on Lp(a) whatever the initial level of Lp(a). Haemophilia B patients bleed less than haemophilia A patients. We showed that this difference in bleeding profile could be explained by lower free TFPI levels in haemophilia B patients compared to haemophilia A patients. In an ongoing study, we showed that in haemophilia A patients there was a strong correlation between the different parameters of thrombin generation (TG) and free TFPI. We also showed, in a TG assay performed in platelet-rich plasma (PRP) with a low TF concentration, that LT was sensitive to free TFPI levels whatever the type of haemophilia and whatever theseverity of the disease. We demonstrated that blocking TFPI by an anti-TFPI Antibody (Ab) allows complete correction of the TG profile in PRP. We showed that it is of major importance to perform a TG assay in PRP in order to evaluate the efficacy of anti-TFPI Ab in correcting TG parameters in haemophilia patients