Orientador: Renate Krause Sakate / Banca: Marcelo Agenor Pavan / Banca: Ricardo Gioria / Resumo: A variabilidade genética dos vírus pertencentes ao gênero Begomovirus que infectam o tomateiro (Lycopersicon esculentum) foi avaliada em regiões produtoras do Centro-Oeste paulista. No período de janeiro de 2003 a fevereiro de 2004, 166 amostras de tomate apresentando sintomas típicos de doenças causadas por begomovírus, foram coletadas em propriedades produtoras de tomate. Após a extração do DNA, a infecção viral foi verificada por meio de PCR nessas amostras, utilizando-se oligonucleotídeos universais para o gênero. A presença de begomovírus foi observada em 60% das amostras coletadas. O sequenciamento direto dos produtos de PCR de 17 dessas amostras e comparação com seqüências de nucleotídeos depositadas no GenBank indicou a possível presença do Tomato severe rugose virus (ToSRV), da espécies tentativa Tomato yellow vein streak virus (ToYVSV), do Sida mottle virus (SiMoV) e de uma possível nova espécie. A presença do ToSRV e do SiMoV ainda não havia sido reportada no estado de São Paulo. Estes resultados indicam alta diversidade de espécies de begomovírus infectando tomate, servindo como um alerta para melhoristas que trabalham na busca de fontes de resistência de tomate a este importante grupo de patógenos. / Abstract: The genetic variability of viruses belonging to the Begomovirus genus infecting tomatoes (Lycopersicon esculentum Mill) was evaluated in production areas from mid-western region of São Paulo state. From January 2003 to February 2004, 166 tomato samples with typical symptoms of begomovírus infection were collected from the field. After DNA extraction, the presence of begomoviruses was verified by PCR using universal primers. The presence of begomoviruses was observed on 60% of the collected samples. Direct sequencing of PCR products of 17 selected samples and comparison with nucleotide sequences deposited in GenBank indicated the possible presence of Tomato severe rugose virus (ToSRV), the tentative species Tomato yellow vein streak virus (ToYVSV), Sida mottle virus (SiMoV) and a possible new specie of begomovirus. The presence of ToSRV and SiMoV had not yet been reported in São Paulo state. These results indicate the existence of a high degree of genetic diversity of begomovírus species infecting tomatoes, and serve as an alert for breeders searching for resistance against this important group of pathogens. / Mestre

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:37:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 752482 bytes, checksum: a4ec60bad1c1315d52f2a91132509d98 (MD5) Previous issue date: 2014-03-11 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Pepper yellow mosaic virus (PepYMV) naturally infects sweet pepper and tomato plants, leading to severe losses since its first report in Brazil (Brasília, DF, 2002). Molecular and serological methods can be used to detect the pathogen. Serological methods for viral detection require the use of a high quality antiserum, offering good sensitivity and specificity. Traditionally, purified viral particles are used as immunogens. However, the purification process is very laborious and the final preparation may have unsatisfactory purity and/or concentration. Thus, the aim of this work was to produce a polyclonal antiserum against the recombinant capsid protein (CP) of PepYMV to allow its use both for diagnosis and for studies of the interaction of the PepYMV CP with other viral proteins and host factors. The coding sequence of the capsid protein gene of PepYMV was cloned into an expression vector (pRSET-A) and transformed into Escherichia coli strain BL21::DE3 for in vitro expression. The recombinant protein, fused to a histidine tag, was purified under denaturing conditions by affinity chromatography using a Ni-NTA column. The purified recombinant protein was dialyzed under renaturing conditions. Its integrity and identity were confirmed by polyacrylamide gel electrophoresis and mass spectrometer analyses. New Zealand rabbits were immunized with increasing amounts of the recombinant protein. The sensitivity and specificity of the antisera were analyzed by Western blot and indirect ELISA assays. The antisera raised against the recombinant CP showed good specificity and sensibility, proving to be a reliable tool for the detection of PepYMV. / O Pepper yellow mosaic virus (PepYMV), agente causal do mosaico amarelo do pimentão e do tomateiro, desde seu primeiro relato no Brasil no ano de 2002 em Brasília, DF, vem se disseminando em regiões produtoras de pimentão e tomate causando perdas substanciais ao produtores dessas culturas. Para identificação dessa enfermidade algumas ferramentas são utilizadas, dentre elas, podemos destacar os métodos moleculares e sorológicos, sendo estes últimos mais utilizados por apresentarem alta especificidade e sensibilidade, além de possuir um custo relativamente baixo. Para a produção de anti-soro, tradicionalmente, utilizam-se partículas virais concentradas como imunógenos. No entanto, o processo de purificação é muito trabalhoso e pode apresentar pureza e concentrações insatisfatórias. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi produzir um anti-soro policlonal, a partir da proteína capsidial recombinante do PepYMV, que permita sua utilização tanto para diagnose quanto para estudos de interação da proteína capsidial do PepYMV com outras proteínas virais e fatores do hospedeiro. A sequência do gene da proteína capsidial do PepYMV foi clonada em vetor de expressão (pRSET-A) e transformada em Escherichia coli, linhagem BL21::DE3, para expressão in vitro. A proteína expressa fusionada a uma cauda de histidina foi purificada sob condições desnaturantes por cromatografia de afinidade em coluna de resina Ni-NTA. Em seguida a proteína purificada foi dialisada sob condições renaturantes e sua integridade e identidade foram confirmadas por gel de poliacrilamida a 12% e análise de espectrometria de massa. Dois coelhos da raça Nova Zelândia foram imunizados com quantidades crescentes da proteína recombinante dialisada adicionados do adjuvante de Freud incompleto na proporção 1:1. A sensibilidade e a especificidade do anti-soro foram testados por Western blot e ELISA indireto. O anti-soro produzido apresentou boa especificidade e sensibilidade, provando ser uma ferramenta confiável para a diagnose do PepYMV.

Made available in DSpace on 2014-07-29T14:52:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 abadia tese.pdf: 6055071 bytes, checksum: 41810223bb4492258f77c027a3385652 (MD5) Previous issue date: 2009-02-17 / The search of alternative products for tomato bacterial spot has been promoting by the lack of effectiveness registered by the traditional products available. The objective of this work was to evaluate a range of chemical products by in vitro tests, in experiments seedlings and field experiments. The products studied were: acibenzolar-S-methyl; benzalkonium chloride; phosphite; copper hydroxide, copper oxicloreto; metiram + pyraclostrobin and famoxadone + mancozebe. The in vitro tests were carried out at Embrapa Hortaliça, Brasília-DF, in July of 2007. The bactericide action was evaluated on Xanthomonas perforans and X. gardneri. The trial was in a complete randomized block design with four replications and plot was constituted by a Petri plate impregnated with solidified bacterial suspension. The halo of inhibition formed was evaluated. The experiments with seedlings were carried out with the hybrid Heinz 9553 at the commercial nursery VIVATI in Rio Verde, Goiás, in August to September and November to December of 2008. There were three trials in a complete randomized block design with three replications. The products were sprayed by using CO2 portable sprayer. The inoculation occurred 29 days after sowing, with an isolated of X. gardneri. Disease severity was evaluated on 15 leaflets per plot at 14 and 16 days after inoculation of the first and second experiment, respectively. Data was expressed as percentage of leaf affected by program Quant. It was also suggested a possible interaction between the regulator of growth paclobutrazol and the behavior of certain products in the reduction of the severity of the disease. Two field trials were carried out at the experimental farm of Unilever Bestfoods, in Goiânia-GO, from February to June of 2007 and April to August of 2008. The first was with the hybrid Heinz 9992 in a complete randomized block design, with 15 treatments and three replications, and inoculated with X. perforans. The second was in a split plot completely randobized block design with three replications. Variety (Hypeel 108 and U2006) was ascertained for factor A and the 10 treatments for factor B. Xanthomonas perforans and X. gardneri were inoculated in different moments. In both trials foliage severity, number of fruits with symptoms and yield were evaluated. In the second trial fruits with sun scald was also taken. In the in vitro test, the products to which X. perforans and X. gardneri were sensitive in the recommended dose were the benzalkonium chloride and famoxadone + mancozeb. Methiram + pyraclostrobin had action in the dosage recommended only for X. gardneri. Xanthomonas perforans was sensitive to this product only starting from ten times more. The products of copper base did not have action in the bacteria at the recommended dose, being sensitive only at a hundred time more. For the trials of seedlings it was noticed that metiram + pyraclostrobin, copper oxicloreto, famoxadone + mancozebe, phosphite and copper hydroxide reduced the severity under certain conditions. In the field trials, in generally, acibenzolar-S-methyl and famoxadone + mancozeb lead to the better results. / A pouca disponibilidade de produtos eficazes tem propiciado a busca por alternativas de controle da mancha bacteriana do tomateiro. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo avaliar uma gama de produtos químicos em testes in vitro, experimentos com mudas e em experimentos de campo. Foram estudados: acibenzolar-S-metil; cloretos de benzalcônio; fosfitos; hidróxido de cobre, oxicloreto de cobre; metiram + piraclostrobina e famoxadona + mancozebe. Os testes in vitro foram conduzidos na Embrapa Hortaliças, Brasília-DF, em julho de 2007. A ação bactericida dos produtos foi avaliada sobre Xanthomonas perforans e X. gardneri. O ensaio foi em blocos casualizados com quatro repetições e a parcela foi constituída por uma placa de Petri impregnada com suspensão bacteriana solidificada. Avaliou-se o halo de inibição formado. Os experimentos de mudas foram conduzidos com o híbrido Heinz 9553 no viveiro comercial VIVATI em Rio Verde GO, de agosto a setembro e de novembro a dezembro de 2008. Foram três ensaios inteiramente casualizados com três repetições. Os tratamentos (produtos) foram pulverizados na parte aérea utilizando pulverizador costal de barra. A inoculação foi aos 29 dias após a semeadura, com um isolado de X. gardneri. Avaliou-se a severidade da doença em 15 folíolos por parcela aos 14 e 16 dias após a inoculação do primeiro e segundo experimento, respectivamente. Esta foi expressa em porcentagem de área foliar atacada processada pelo programa Quant. É sugerido uma possível interação entre o regulador de crescimento paclobutrazol e o comportamento de certos produtos na redução da severidade da doença. Dois ensaios de campo foram conduzidos na área experimental da Unilever Bestfoods, em Goiânia-GO, de fevereiro a junho de 2007 e de abril a agosto de 2008. O primeiro foi com o híbrido Heinz 9992 em delineamento experimental blocos casualizados, com 15 tratamentos e três repetições. Inoculou-se X. perforans. Já o segundo ensaio foi fatorial em parcelas subdivididas em blocos ao acaso e três repetições. O fator A foi hídrido (Hypeel 108 e U2006) e o fator B (tratamentos). Inoculou-se X. perforans e X. gardneri em momentos distintos. Em ambos ensaios foram avaliados severidade foliar, número de frutos com sintomas e produtividade. No segundo ensaio tomou-se também número de frutos com escaldadura. No teste in vitro os produtos aos quais X. perforans e X. gardneri foram sensíveis na dose recomendada foram os cloretos de benzalcônio e a famoxadona + mancozebe. Metiram + piraclostrobina tiveram ação na dosagem recomendada somente para X. gardneri. Xanthomonas perforans foi sensível ao produto somente a partir de dez vezes maior a dosagem recomendada. Os produtos à base de cobre não tiveram ação nas bactérias na dosagem recomendada, sendo sensíveis apenas na dose cem vezes maior a dosagem recomendada. Em mudas metiram + piraclostrobina, oxicloreto de cobre, famoxadona + mancozebe, fosfito e hidróxido de cobre reduziram a severidade em mudas no ensaio realizado em agosto. Em campo, notou-se que, de maneira geral acibenzolar-S-metil e famozadona + mancozebe estão entre os melhores resultados.