[ES] El virus meridional del tomate (Southern tomato virus, STV) es un virus persistente (género Amalgavirus, familia Amalgaviridae) que se ha detectado en diversos países como España e Italia. Inicialmente, fue asociado a síntomas de decoloración y falta de maduración en el fruto de tomate. Sin embargo, la presencia frecuente de virus agudos en las plantas infectadas con el STV y la detección de éste en plantas asintomáticas, ponen en duda su patogenicidad y el impacto que puede tener en el cultivo. En esta tesis doctoral se puso a punto la RT-LAMP y la RT-qPCR para la detección específica y sensible del STV. La RT-LAMP permitió reducir costes y simplificar el procedimiento, siendo útil para la detección en campo. La RT-qPCR nos permitió detectar y cuantificar el STV en distintos tipos de tejidos de tomate, incluyendo semillas individuales. El virus se acumulaba principalmente en las raíces y hojas, y en las semillas se encontraba tanto en cubierta como en embrión, lo que dificulta las tareas de desinfección. La tasa de transmisión por semilla del virus, la incidencia en campo y en viveros era muy elevada, afectando más a variedades comerciales que locales. Los análisis filogenéticos mostraron que el STV tenía una baja diversidad genética con una fuerte presión de selección negativa. Además, no había una correlación entre distancia genética del virus y origen geográfico debido a una rápida dispersión de semillas infectadas y/o una fuerte presión de selección negativa. Se comprobó que el STV en condiciones de infección simple no inducía síntomas, no alteraba la producción, ni afectaba a parámetros fisiológicos como conductividad estomática, fotosíntesis y peso, en condiciones de estrés salino. Tampoco se observaron cambios a nivel tisular ni celular, ni se encontraron partículas virales. Sin embargo, el virus modificaba la expresión de algunos miRNAs con importantes funciones. Se detectaron muy poca cantidad de vsiRNAs derivados del STV, lo cual podría deberse a la supresión del silenciamiento génico de la planta por acción de un supresor codificado por el virus. Los ensayos de expresión transitoria en plantas de N. benthamiana 16C determinaron que la p42 del STV no tenía actividad supresora de silenciamiento génico. Finalmente, estudiamos el efecto del STV en infecciones múltiples con otros virus agudos como el CMV y el PepMV. Se observaron complejas interacciones entre los virus que implicaban variaciones en la severidad de síntomas, en los niveles de acumulación viral y en las poblaciones de siRNAs. El STV y el CMV establecían una interacción sinérgica que producía el adelanto y aumento de la severidad de los síntomas, y de la acumulación del CMV en las primeras fases de la infección. La presencia del STV en plantas infectadas con el PepMV también producía un adelanto de los síntomas sin cambios en la acumulación viral del PepMV. En las plantas coinfectadas con el CMV y PepMV se observó un efecto antagónico que disminuía la concentración del CMV y alteraba los síntomas. El STV era capaz de romper este efecto antagónico restableciendo la concentración del CMV y modificando los síntomas. Los análisis de siRNAs permitieron identificar un total de 78 miRNAs, 47 noveles, que se expresaban diferencialmente en los grupos de plantas infectadas con los diferentes virus respecto a las plantas sin infectar. Estos miRNAs estaban implicados en la regulación de importantes funciones y tanto su número como su nivel de expresión variaba dependiendo de la combinación viral. También se identificaron vsiRNAs de origen viral y se vio que su proporción variaba dependiendo de la combinación viral. La cantidad de vsiRNAs del STV se incrementaba notablemente con la presencia de otros virus. La frecuencia de acumulación de vsiRNAs en los genomas virales no era uniforme y no se veía influenciada por las combinaciones de virus. / [CA] El virus meridional de la tomaca (Southern tomato virus, STV) és un virus persistent (gènere Amalgavirus, família Amalgaviridae) que s'ha detectat en diversos països com Espanya i Itàlia. Inicialment, STV va ser associat a distints símptomes de decoloració i anomalies en la maduració del fruit. Però la presència freqüent de virus aguts en les plantes infectades amb STV i la detecció d'aqueste en plantes asimptomàtiques, posen en dubte la seua patogenicitat i l'impacte que pot tindre en el cultiu. En aquesta tesi doctoral es va realitzar la posada al punt de la RT-LAMP i la RT- qPCR per a la detecció específica i sensible de STV. La RT-LAMP va permetre reduir costos i simplificar el procediment, sent útil per a la detecció del virus en camp. La RT-qPCR és una tècnica molt sensible que ens va permetre detectar i quantificar STV en distints tipus de teixits, incloent-hi llavors individuals. El virus s'acumulava principalment en arrels i fulles, i en les llavors es trobava tant en la coberta com en l'embrió. Es va comprovar que les taxes de transmissió per llavor, la incidència en camp i en vivers era molt elevada, major en les varietats comercials que en les locals. Els estudis filogenètics realitzats van mostrar que el virus tenia una baixa diversitat genètica amb una forta pressió de selecció negativa. No hi havia una correlació entre distància genètica del virus i origen geogràfic, degut per una ràpida dispersió a traves de llavors infectades i/o a la forta pressió de selecció negativa. En aquest treball es van obtindre evidències de què STV en condicions d'infecció simple no induïa símptomes en la planta, no alterava la producció, ni afectava paràmetres fisiològics com a conductivitat estomacal, fotosíntesi i pes en condicions d'estrés salí. Tampoc, es van observar cap presència de partícules virals ni canvis a nivell tissular ni cel·lular. No obstant això, STV era capaç de modificar l'expressió d'alguns miRNAs amb importants funcions. Es van detectar molt poca quantitat de vsiRNAs derivats del STV, podria deure's a la supressió del mecanisme de silenciamient gènic per acció d'un supressor. Els assajos d'expressió transitòria en plantes de N. benthamiana 16C va determinar que la p42 de STV no va tindre capacitat supressora de silenciamient gènic. Per finalitzar, vam estudiar l'efecte que podia tindre STV en infeccions mixtes amb altres virus aguts com CMV i PepMV. Els resultats obtinguts d'un assaig amb diferents combinacions d'infeccions van mostrar interaccions complexes entre els virus que implicaven variacions en la severitat de símptomes, en els nivells d'acumulació viral i en les poblacions de siRNA. STV i CMV establien una interacció sinèrgica que produïa l'avanç i l'increment dels símptomes, i un augment de l'acumulació de CMV. D'altra banda, la presència de STV en plantes infectades amb PepMV també produïa un avanç dels símptomes, però no hi havia variacions en l'acumulació de PepMV. En el grup de plantes co-infectades amb CMV i PepMV es va observar un efecte antagònic que dificultava la replicació de CMV, alterant-se els símptomes de la planta. STV era capaç de trencar aquest efecte antagònic restaurant la concentració de CMV i modificant els símptomes. Els anàlisis de siRNAs van permetre identificar un total de 78 miRNAs, 47 corresponien a miRNAs novells, que s'expressaven de forma diferent als grups de plantes infectades amb els diversos virus, respecte a les plantes control sense infectar. Aquests miRNAs estaven implicats en la regulació d'importants funcions i tant el seu nombre com el seu nivell d'expressió variaven. També es van identificar vsiRNAs d'origen viral i es va observar que la seua proporció variava depenent de la combinació viral. La quantitat de vsiRNAs de STV s'incrementava notablement amb la presència d'altres virus. Les freqüències de vsiRNA en els genomes virals no eren uniformes, no obstant això, els pat / [EN] Southern tomato virus (STV) is a persistent virus (genus Amalgavirus, family Amalgaviridae) which was detected in several countries such Spain and Italy. STV was associated with symptoms of discoloration and maturation of tomato fruit. However, STV was frequently detected in mixed infections with acute viruses and in some asymptomatic tomato plants. For these reasons, it is not clear the STV pathogenic role and its real impact on tomato crops. In this PhD we improved the specific and sensitive detection of the virus by using the RT-LAMP and RT-qPCR. RT-LAMP is very useful for field STV detection since it is a simple and cheap technique. The high RT-qPCR sensitivity enabled this technique to detect and quantify STV from different plant tissues even individual sees. The highest STV concentrations were found in tomato leaves and roots. In the seeds, STV could be detected in both coat and embryo. The virus transmission by seed and the STV incidence in fields and seedlings was very high, being higher in commercial tomato varieties than in local ones. Phylogenetic analysis from different STV isolates showed a low genetic diversity with a high negative selection pressure. Moreover, there was no correlation between genetic diversity and geographic region. This could be explained by a quick dispersion of infected seeds and/or by the high negative selection pressure. It was shown that STV did not induce any apparent plant symptom and did not affect the plant production in single infection conditions. Also, physiological parameters related to stomatic conductivity, photosynthesis, and plant weight were no affected by STV infection in saline stress conditions. Optic and transmission electron microscopy did not reveal viral particles or structural changes in STV tomato tissues. However, the population analysis of miRNAs showed that STV was able to modify the expression of some miRNAs which modulated important plant functions. Low vsiRNAs were detected in STV tomato infected plants. It could be produced by the action of a suppressor which could suppress the gene silencing pathway in the plants. A transient expression assay of p42 in N. benthamiana 16C plants did not show suppressor activity of this STV protein. Finally, we studied the effect of STV in mixed infections with other acute viruses such as CMV and PepMV. The virus mixes infection assay in tomato plants showed complex interactions between viruses that modify the symptoms severity, the viral accumulation and the siRNA population. STV and CMV established a synergistic interaction in co-infected tomato plants producing the advancement of the symptoms and an increase in its severity. STV and CMV co-infection increased the CMV accumulation in the early stages of infection. On the other hand, the presence of STV in plants co-infected with PepMV also produced an advance of symptoms, but with no variation in the PepMV accumulation. In the group of plants co-infected with CMV and PepMV, it was observed an antagonistic effect that delayed the CMV accumulation, altering the symptoms of the plant with respect to the simple infections. STV was able to break this antagonistic effect by increasing the CMV viral concentration and changing the symptomatology. The siRNAs analysis allowed to identify a total of 78 miRNAs, 47 corresponding to novel miRNAs, that were expressed differentially in the plants infected respect to no infected plants. These miRNAs were involved in the regulation of important functions and their number and their level of expression varied depending on the virus combination. vsiRNAs of the different viruses were also identified and it was observed that rates varied depending on the virus combination. The number of vsiRNAs in STV single infected tomato plants was very small, but it increased with the presence of the other viruses. The frequencies of vsiRNAs in the viral genomes were not uniform and these frequencies were not influenced by other viruses in mixed infections. / Elvira González, L. (2021). Detección y caracterización del virus meridional del tomate (STV) [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/165207 / TESIS

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Deux souches parmi 338 rhizobactéries isolées à partir d'un substrat de bagasse de sisal, un résidu dérivé de l'extraction de la fibre des feuilles de sisal (une plante textile), ont été capables de réduire les dommages causés par le virus de la mosaïque du tabac (TMV) et le virus de la mosaïque de la tomate (ToMV) en favorisant la croissance de la partie aérienne chez les plants infectés de tabac et de la tomate cultivés en serre. Les racines des plants de tabac et tomate inoculés avec un mélange de Bacillus benzoevorans 17B2BAC101 et Ralstonia sp. 18B2BAC101 ont augmenté de 11 à 19 % le poids de la matière sèche de la partie aérienne (MSPA) des plants un mois après l'inoculation. Le traitement a augmenté aussi le contenu du tissu végétal en N, P, K, Ca et Mg dans l'essai en serre. Le test DASELISA (Double Antibody Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) pratiqué un mois après l'inoculation du virus chez la tomate a montré que le mouvement systémique du virus se produisait chez les plantes inoculées ou non inoculées avec des bactéries, ce qui a exclu la possibilité d'une induction de résistance systémique (1RS) comme étant le mécanisme qui favorise la croissance des plantes. Chez la tomate saine (sans virus) l'inoculation avec B. benzoevorans a augmenté de 36% le rendement de la matière sèche de la partie aérienne (MSPA) dans un essai en pot. En sachets de croissance, l'augmentation de la matière fraîche de la partie aérienne (MFPA) des plants variait de 48 à 86% lors des deux essais effectués. Dans l'essai en pot (sans virus), le contenu en K, Ca et Fe du tissu végétal a augmenté significativement en présence de B. benzoevorans. Le traitement avec Ralstonia sp. a augmenté aussi de 32% la MSPA dans l'essai en pots et de 96 et 7% la MFPA dans les essais en sachets. Lorsque ces deux bactéries ont été mélangées et inoculées sur la tomate en absence de virus, la biomasse aérienne a diminué par rapport au traitement avec B. benzoevorans. Des études microscopiques du système racinaire ont permis observer une augmentation de 24 et 70% de la densité et de la longueur des poils racinaires respectivement, des plantes traitées avec B. benzoevorans et avec un mélange de cette bactérie et de Ralstonia sp. Cette dernière bactérie inoculée a augmenté de 10% la densité des poils absorbants, mais ce résultat n'a pas été significatif. Bacillus benzoevorans produit de l'acide indole-acétique (AIA) et de l'isopentenyladenosine (IPA) in vitro aux concentrations de 3,92 ug mL-1 et 5 picomoles mL-1 respectivement. Ralstonia sp. produit 0,52 ug mL"1 et 3,5 picomoles mL"1 des mêmes phytohormones, respectivement Ces régulateurs de croissance végétale produits par les bactéries dans la rhizosphère ont probablement favorisé la croissance des plantes traitées avec ces microorganismes. L'AIA aurait vraisemblablement favorisé le développement des poils racinaires, en augmentant de cette manière l'absorption d'eau et de nutriments par les plantes. En général, B. benzoevorans favorise davantage que Ralstonia sp. la croissance des plantes probablement à cause de sa capacité à produire plus des phytohormones. Les densités d'inoculation les plus favorables à la plante étaient de 106 - 107 cfu mL"1 chez B. benzoevorans et de 107 - 108 cfu mL pour Ralstonia sp. Une autre rhizobactérie isolée à partir du même type de sol, Rhizobium sp. 12B4PEN78 a produit 15,34 \xg mL"1 d'AIA en favorisant la croissance de la tomate lorsque la densité de l'inoculum est de 107 - 108 cfu mL"1 . / Two strains among 338 rhizobacteria isolated from a substrate originated from sisal bagasse, a by-product of the extraction process of the fibre from leaves of sisal (Agave fourcroydes), a textile plant, reduced damages caused by tobacco mosaic virus (TMV) and tomato mosaic virus (ToMV) by enhancing plant growth in greenhouse pot cultures. Bacillus benzoevorans 17B2BAC101 and Ralstonia sp. 18B2BAC101 inoculated as a mixture increased shoot dry weight (SDW) between 11 and 19% one month after virus inoculation. They also increased tomato plant tissue content in N, P, K, Ca and Mg. DASELISA tests performed one month after virus inoculation on tomato, showed systemic movement of ToMV in the plant, ruling out induced systemic resistance (ISR) as the mechanism by which these bacteria enhance plant growth. When applied individually and in the absence of the virus, B. benzoevorans increased SDW by 36% in a pot assay and shoot fresh weight (SFW) by 48 and 86% in two growth pouch assays. This rhizobacterium also increased the K, Ca and Fe content in plant tissue in the pot assay without virus. Ralstonia sp. increased SDW by 32% in the pot assay, and 96 and 7% SFW in the growth pouch assays. When these two rhizobacteria were co-inoculated in absence of the virus in a growth pouch assay, the shoot biomass decreased when compared with plants inoculated with only B. benzoevorans. Microscopic studies of the root Systems showed an increase of 24 and 70% in the root hair density and root length respectively, on tomato plants treated either with B. benzoevorans or with a mixture of B. benzoevorans and Ralstonia sp. This last bacterium inoculated alone increased the root hair density by only 10% (which was not statistically significant). B. benzoevorans produced indole-acetic acid (IAA) and isopentenyl adenosine (IPA) in vitro at concentrations of 3.92 \ag mL"1 and 5 picomoles mL"1 respectively. Ralstonia sp. produced 0.52 ug mL"1 and 3.5 picomoles mL"1 of these two plant growth regulators. It is possible that bacterial phytohormones are responsible for the enhanced plant growth observed in our experiments. It is also likely that IAA in the rhizosphere has stimulated root hair development, thus increasing the uptake of water and nutrients by the plants. In general, B. benzoevorans enhanced plant growth to a greater extent than Ralstonia sp. which correlated with the observed higher levels of phytohormones production by the former strain. The better plant growth stimulation effects were observed at inoculum densities of 106 - 107 cfu mL"1 for B. benzoevorans and 107 - 108 cfu mL for Ralstonia sp. Another bacterium isolated from the same type of soil, Rhizobium sp. 12B4PEN78 produced 15.34 ^ig mL"1 of IAA and increased shoot growth on tomato when inoculated at 107 - 108 cfu mL.

El ácido salicílico (SA) juega un papel fundamental en la respuesta defensiva de las plantas. Este compuesto se acumula en las mismas como consecuencia de infecciones patogénicas de tipo incompatible, y su aplicación exógena induce resistencia. Asimismo, plantas transgénicas incapaces de acumularlo presentan una mayor susceptibilidad a patógenos de distinta naturaleza. Por otra parte, el ácido gentísico (GA, ácido 2,5-dihidroxibenzoico) se acumula en plantas en infecciones compatibles no necrotizantes. La aplicación exógena de GA induce un conjunto de proteínas de defensa PR (Pathogenesis related) distintas a las que induce el SA, por lo que podría tener un papel complementario en la señalización frente a patógenos en plantas. Ambos compuestos se acumulan en plantas en forma de glicósidos, es decir, conjugados a una o más moléculas de azúcar. Estas reacciones de conjugación son catalizadas por proteínas denominadas glicosiltransferasas. En plantas de tomate el SA se acumula como SA 2-O-ß-glucósido, unido a una molécula de glucosa, mientras el GA lo hace en forma de GA 5-O-ß-xilósido, unido a xilosa. GAGT (Gentisic Acid Glycosyl Transferase) ha sido descrita como la proteína que conjuga GA en tomate. Dado que la glicosilación de metabolitos es una forma rápida de inactivarlos, la existencia de esta proteína con actividad conjugadora de GA refuerza la idea del ácido gentísico (GA) como molécula señal complementaria al SA en la interacción planta-patógeno. Por otra parte, la proteína Twi1 (Tomato wound inducible), descrita en tomate como una posible glicosiltransferasa debido a sus características comunes con este grupo de proteínas, presenta inducción por SA y otros compuestos de naturaleza fenólica, además de herida e interacciones de tipo incompatible. Trabajos en los que se ha llevado a cabo la sobreexpresión o el silenciamiento de una GT han puesto de manifiesto cómo ello conlleva la aparición de resistencia o susceptibilidad frente a una infección patogénica. Por tanto, las GTs tienen un papel fundamental en la respuesta defensiva de la planta, modulando los niveles de moléculas que intervienen en dicha respuesta. Por otra parte, se han realizado estudios dirigidos a elucidar la implicación de compuestos del metabolismo secundario en la interacción de plantas de tomate con distintos patógenos. Ello ha permitido detectar cambios concretos de los niveles de un número determinado de metabolitos a lo largo de las infecciones, como son cuatro amidas derivadas del ácido hidroxicinámico (HCAAs) que se acumulan en plantas de tomate infectadas con la bacteria Pseudomonas syringae pv. tomato. Las HCAAs son un conjunto de metabolitos, pertenecientes al grupo de los fenilpropanoides, de bajo peso molecular y que se caracterizan por la presencia de nitrógeno en su estructura. En su ruta de biosíntesis participan diversos enzimas tales como la fenilalanina amonio liasa (PAL), la tirosina descarboxilasa (TYDC) o la tiramina hidroxicinamoil transferasa (THT). La acumulación en tomate de las cuatro amidas como consecuencia de la infección bacteriana va acompañada de la inducción del isoenzima THT1-3. La obtención de plantas transgénicas que sobreexpresen o silencien las proteínas GAGT, Twi1 y THT1-3 permitirá llevar a cabo ensayos de resistencia frente a infecciones patogénicas que contribuyan al conocimiento del sistema defensivo de las plantas, tanto en sus aspectos de señalización como en los referidos a componentes de la respuesta final de la planta. Al mismo tiempo, esta estrategia puede constituir, en sí misma, un medio de obtención de plantas más resistentes frente a ataques patogénicos de diversa naturaleza. / Campos Beneyto, L. (2014). Metabolitos secundarios de naturaleza fenólica: papel en la respuesta defensiva de plantas de tomate [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/44236 / TESIS

La tomate (Solanum lycopersicum) est l’espèce modèle pour l’étude du développement des fruits charnus. Il a notamment été montré que la signalisation hormonale était un élément central d’un réseau complexe de régulations gouvernant ce processus. Le but de ce travail de thèse était de réaliser la validation fonctionnelle de nouveaux gènes candidats potentiellement impliqués dans la régulation du développement du fruit. Pour cela, le travail s’est découpé autour de trois axes : 1) la validation de l’utilisation de quatre promoteurs de tomate et d’un promoteur d’Arabidopsis thaliana dans des constructions permettant la surexpression ou le silencing de gènes dans le fruit de tomate, à des phases particulières de son développement ou dans des tissus spécifiques du fruit, 2) l’analyse fonctionnelle de gènes codant pour des protéines à F-Box chez la tomate et 3) l’analyse fonctionnelle du gène SlGEM1.Le premier axe de ce travail a porté sur la caractérisation des promoteurs des gènes de tomate IMA (INHIBITOR OF MERISTEM ACTIVITY), TPRP (TOMATO PROLIN-RICH PROTEIN), PPC2 (PHOSPHOENOLPYRUVATE CARBOXYLASE 2) et PG (POLYGALACTURONASE), ainsi que du promoteur du gène CRC (CRABS-CLAW) d’Arabidopsis thaliana. Des plantes transgéniques ont été générées permettant d’exprimer, sous le contrôle de ces différents promoteurs, le gène rapporteur GUS seul ou fusionné à la GFP (Green fluorescent protein) et à un signal d’adressage au noyau (NLS). L’étude de ces plantes a permis de mettre en évidence la spécificité spatio-temporelle de l’expression de ces différents promoteurs lors du développement du fruit. Dans le cas du promoteur LePPC2, la fusion transcriptionnelle avec la GFP et un signal NLS a permis de montrer une activité spécifique dans les cellules du péricarpe des fruits de tomate en phase d’expansion cellulaire. Cette partie du travail de thèse a validé l’utilisation de ces différents promoteurs pour de futures analyses fonctionnelles de gènes régulateurs du développement du fruit chez la tomate.Le deuxième axe de ce travail a porté sur l’identification de protéines à F-Box impliquées dans la régulation du développement du fruit chez la tomate. En effet, il a été montré que ces protéines à F-Box jouent un rôle particulièrement important dans les processus de régulation chez les plantes grâce à leur fonction de reconnaissance de protéines régulatrices cibles par les complexes SCF (SKP1-Cullin-F-Box), qui sont alors marquées par ubiquitinylation, pour leur dégradation par le protéasome 26S. Parmi les 95 séquences de protéines à F-Box disponibles dans les bases de données d’EST au début de ce travail, quatre gènes candidats ont été retenus pour leur expression tissu-spécifique lors du développement précoce du fruit. Des plantes transgéniques (RNAi et sur-expression) ont été générées pour chacun de ces gènes candidats et leur analyse préliminaire a permis de proposer un rôle dans le développement chez la tomate pour une d’entre elles.Le troisième axe de ce travail a porté sur la caractérisation fonctionnelle du gène SlGEM1, l’orthologue du gène AtGEM (GLABRA2-EXPRESSION MODULATOR), dont le niveau d’expression semblait corrélé à la taille des cellules dans le fruit de tomate. En effet, les données disponibles sur AtGEM montrant son implication dans la coordination de la prolifération et la différenciation des cellules en faisaient un candidat intéressant au contrôle de la taille et du développement du fruit. Des plantes transgéniques (RNAi et sur-expression) SlGEM1 ont été générées, et des mutants de ce gène ont été identifiés par TILLING dans la banque de mutants EMS de la variété Microtom de tomate disponible au laboratoire. Le phénotypage de ces plantes a permis de mettre en évidence une potentielle implication de SlGEM1 dans le développement des fleurs et dans la fertilité des grains de pollen. / Tomato (Solanum lycopersicum) is a model species for studying fleshy fruit development. It has been shown that hormone signaling plays a crucial role in the complex regulatory network governing this developmental process. The aim of this thesis was to perform the functional validation of new candidate genes potentially involved in the regulation of fruit development. For this, the work was divided into three parts: 1) validate the use of four tomato promoters and one promoter of Arabidopsis thaliana in recombinant vectors for the overexpression or silencing of genes in tomato fruit at particular phases of development or in specific fruit tissues, 2) functional analysis of genes encoding F-Box proteins in tomato and 3) functional analysis of SlGEM1 gene.The first part of this work has focused on the characterization of tomato promoters from IMA (INHIBITOR ACTIVITY OF MERISTEM), TPRP (TOMATO Proline-Rich Protein), PPC2 (PHOSPHOENOLPYRUVATE CARBOXYLASE 2) and PG (polygalacturonase), as well as the promoter of Arabidopsis thaliana CRC gene (CRABS-CLAW). Transgenic plants were generated to express the GUS reporter gene alone or fused to GFP and a NLS signal for nucleus targeting, under the control of the different promoters. The study of these transgenic plants highlighted the specific spatio-temporal expression of these promoters during fruit development. In the case of LePPC2 promoter, the transcriptional fusion with NLS-GFP revealed a specific activity in the large cells of tomato fruit pericarp. This part of the thesis work validated the use of the five different promoters for future functional analysis of genes regulating fruit development in tomato.The second part of this work focused on the identification of F-Box proteins involved in the regulation of tomato fruit development. In plants, it has been shown that F-Box proteins play an important role in regulating processes, due to their specific interaction with regulatory proteins targeted by the SCF complex (SKP1-Cullin-F-Box), leading to their ubiquitination and degradation by the 26S proteasome. Among the 95 sequences of F-Box proteins available in tomato databases at the beginning of this work, four candidate genes were selected for their tissue-specific expression during tomato fruit early development. Transgenic plants (RNAi and over-expression) were generated for each of these candidate genes and their preliminary analysis allowed to propose a role in tomato vegetative development for one of them.The third part of this work focused on the functional characterization of SlGEM1, orthologous to AtGEM (GLABRA2-EXPRESSION MODULATOR). Indeed, a previous work revealed that the expression level of SlGEM1 was correlated with tomato fruit cell size. Available data on AtGEM showing its involvement in the coordination of cell proliferation and differentiation made it an attractive candidate to the control of fruit size and development. Transgenic plants (SlGEM1 RNAi and over-expression) were generated, and mutants of this gene were identified by TILLING in the Microtom mutant collection available in the laboratory. Phenotyping of these plants suggested the involvement of SlGEM1 in flower development and in the fertility of pollen grains.

La tomate, fruit largement consommé frais mais aussi sous forme transformée, est reconnue pour ses qualités nutritionnelles. Riche en microconstituants, tels les caroténoïdes (le lycopène en particulier), les composés phénoliques et la vitamine C, sa consommation régulière permettrait de réduire les risques de maladies cardiovasculaires et de certains cancers. Cependant, les traitements thermiques appliqués lors de la préparation industrielle de produits à base de tomate peuvent être à l'origine de réactions chimiques entraînant la dégradation de ces antioxydants. D'autre part, l'ajout d'huile végétale, pour la préparation de la sauce tomate notamment, met en jeu des réactions d'oxydation des lipides pouvant contribuer à l'instabilité de ces microconstituants. L’objectif principal de cette thèse est la détermination des cinétiques réactionnelles impliquées dans l’évolution des microconstituants de la tomate lors des procédés industriels de transformation.Dans un premier temps, une étude qualitative et quantitative sur plusieurs produits industriels (concentrés, pulpe, sauces) à base de tomate a été menée afin de déterminer les microconstituants marqueurs de la qualité nutritionnelle : (E)-lycopène et (E)-β-carotène pour les caroténoïdes, rutine, 7-O-glucosyl-naringénine et acide chlorogénique pour les composés phénoliques ainsi que les vitamines C et E ont été retenus. Cette première étude a permis de déterminer l’impact de procédés industriels sur les teneurs en microconstituants pour des produits collectés en entrée et en sortie de process pour deux usines de la région PACA.Par la suite, la stabilité des 7 marqueurs sélectionnés a été étudiée dans trois systèmes modèles modélisant la sauce tomate à des températures simulant des conditions de cold et hot breaks. Ces systèmes modèles comprennent un milieu aqueux acide (pH 3,8) contenant de l’amidon, un milieu lipidique constitué d'huile et de phospholipides végétaux et une émulsion H/E (huile dans eau) intégrant ces divers constituants. L’oxydation des lipides et son éventuelle protection par les microconstituants ont été évaluées par détermination de l'évolution des teneurs en diènes conjugués et trilinoléine. Parmi tous les antioxydants, la vitamine C s'est avérée être le moins stable en émulsion comme en milieu aqueux; sa vitesse d'oxydation est influencée par la teneur en oxygène dans le milieu. Les teneurs en composés phénoliques sont peu affectées, même à haute température (95 °C) tandis que les caroténoïdes s'isomérisent rapidement quelles que soient les conditions appliquées. Dans l'émulsion modèle, l'oxydation lipidique est nettement accélérée quand la température s'élève et tous les marqueurs se dégradent plus rapidement qu'en milieu aqueux ou lipidique.La détermination des constantes de vitesses a été réalisée, soit individuellement pour chaque cinétique, soit par desapproches globales (modèle oxydation lipidique et modèle stoechio-cinétique). Ce dernier modèle a pour but de proposer des conditions limitant l’oxydation lipidique et la dégradation des microconstituants de la tomate au cours des procédés / Tomato is a fruit widely consumed either fresh or processed possessing recognized nutritional qualities. Rich in microconstituents like carotenoids (such as lycopene), phenolic compounds and vitamin C, its regular consumption could reduce risks of cardio-vascular diseases and cancers. However, thermal treatments applied during industrial preparation of tomato products may involve various chemical reactions leading to the degradation of these antioxidants. Besides, addition of vegetable oil for the preparation of tomato sauce may lead to lipid oxidation contributing to the microconstituent instability.The main objective of this thesis is the determination of reaction kinetics for tomato microconstituents during industrial processing.First, a qualitative and quantitative study on several industrial tomato products (pastes, pulp, sauces) was carried out in order to select markers of the nutritional quality: (E)-lycopene and (E)-β-carotene for carotenoids, rutin, naringenin 7-O-glucoside and chlorogenic acid for phenolics as well as vitamins C and E. Additionally, an impact of processing was determined for industrial products collected before and after processing in two different plants in the PACA Region. Then, the stability of the selected markers was studied in model systems mimicking tomato sauce at hot and cold break temperatures. For this purpose, three model systems were developed: an aqueous model containing starch, a lipidic model consisting of vegetable oil and phospholipids and an O/W (oil-in-water) emulsion integrating all these constituents. Lipid oxidation and its possible protection by antioxidants were evaluated by the follow-up of conjugated dienes and trilinolein. Among all the antioxidants, vitamin C proved to be the least stable in both the emulsion and aqueous models. Its oxidation rate was found to be oxygen dependent. Phenolic compounds were little affected, even at high temperature (95 °C) whereas carotenoids rapidly isomerised whatever the conditions applied. In the emulsion model, lipid oxidation is clearly accelerated when the temperature increases and all markers are more rapidly degraded than in the aqueous or lipidic model. Rate constants were determined, either individually for each kinetics, either using global approaches (lipid oxidationmodel and stoichio-kinetic model). This last model aims at giving process conditions limiting lipid oxidation and microconstituent degradation

Les fruits et légumes constituent la principale source de vitamine C dans l’alimentation humaine, mais leur concentration en vitamine C varie fortement en fonction de la saison et des conditions de culture. Au cours de cette thèse, nous avons testé successivement différentes hypothèses afin de mettre en évidence le rôle de la lumière dans ces variations, en prenant comme modèle le fruit de tomate. Nous avons supposé i) un effet direct du rayonnement intercepté par les fruits sur le métabolisme de la vitamine C (synthèse, recyclage, dégradation), ou ii) un effet du rayonnement sur les feuilles augmentant le transport de molécules (sucres, vitamine C, …) favorisant l’accumulation de vitamine C dans le fruit. Nos résultats ont souligné la complexité de la régulation de la teneur en vitamine C dans les fruits par la lumière, qui dépend principalement du microclimat radiatif du fruit et dans une moindre mesure du rayonnement intercepté par les feuilles, en interaction avec le stade de développement du fruit. L’étude de la relation sucres/vitamine C dans les fruits a montré que les sucres n’étaient pas limitants pour la synthèse de vitamine C. L’impact du rayonnement sur le métabolisme de la vitamine C a été étudié, en interaction avec la température, sur fruits détachés. Le rayonnement augmente les teneurs en vitamine C des fruits pour les températures inférieures ou égales à 23°C en liaison avec l’augmentation des expressions des gènes de la voie de biosynthèse et des activités des enzymes de recyclage, particulièrement à 12°C. À forte température (31°C), la lumière ne modifie pas la teneur en vitamine C du fruit malgré l’augmentation de l’expression de certains gènes de la voie de synthèse, mais on observe une diminution du recyclage de la vitamine C (DHAR) et une augmentation d’un produit de dégradation de la vitamine C (thréonate). Les données recueillies ont permis d’initier un modèle d’accumulation de la vitamine C au cours du développement du fruit qui dans le futur prendra en compte les facteurs de l’environnement / Fruits and vegetables are the major source of vitamin C in human diet; however, their vitamin C content varies with environmental conditions and agricultural practices. In this work, we successively tested different hypotheses concerning light impact on these variations, using tomato fruit as model. We hypothesized that i) light reaching fruit could have a direct impact on vitamin C metabolism (synthesis, recycling and degradation) or that ii) light reaching leaves could increase the transport of molecules triggering vitamin C accumulation in fruit (sugars, vitamin C…). Our results showed that vitamin C variations with light are complex and depend mostly on light reaching the fruit and to a lesser extent on light reaching leaves,according to fruit developmental stage. The study of vitamin C/sugars relationship in fruit showed that sugars were not determinant in explaining variations in vitamin C. Light impact on vitamin C metabolism were studied, in interaction with temperature, on off-vine fruit ripening. Light increased fruit vitamin C content for temperature lower or equal to 23°C byincreasing transcripts of vitamin C biosynthetic pathway and activity of vitamin C recycling enzyme, particularly at low temperature (12°C). At high temperature (31°C), light did not increase fruit vitamin C content but it decreased DHAR activity and increased threonate content likely produced from vitamin C degradation. The data obtained were used to initiate the building of a model describing vitamin C content during fruit development that will integrate environmental factors in the future

L'acide ascorbique (AsA, vitamine C) est l'un des composés parmi les plus importants chez les eucaryotes. En raison de son potentiel antioxydant élevé, l'AsA représente un trait important de la qualité nutritionnelle des végétaux. Au-delà de sa valeur bénéfique pour la santé, une augmentation de la teneur en AsA des fruits bénéficierait probablement à la qualité post-récolte et à la résistance aux pathogènes. Pour mieux comprendre ces régulations chez les plantes et leurs impacts sur la qualité des fruits, une collection de tomates EMS hautement mutée (cv. Micro-Tom) a été criblée pour identifier des mutants dont les fruits sont enrichis en AsA. Cette stratégie de génétique directe associant le criblage à une approche de cartographie par séquençage devait permettre d’identifier de nouveaux gènes liés au caractère AsA+. L'un des mutants, noté P21H6, présentait un enrichissement en AsA de 2 à 4 fois supérieur à celui du WT, et fut le premier à être génétiquement caractérisé. Cette étude a permis de mettre en évidence une nouvelle classe de photorécepteurs impliqués dans la détection de la lumière bleue, appelée SlPLP, en tant que régulateur négatif de l'accumulation d'AsA dans la tomate. Le rôle de PLP dans le phénotype AsA+ du fruit a été confirmé par une stratégie de mutagenèse dirigée, avant d’entreprendre sa caractérisation fonctionnelle. Nous avons démontré que SlPLP interagit avec SlGGP (GDP-L-galactose phosphorylase), une enzyme clé de la voie du L-Galactose, sous contrôle de la lumière bleue et que cette interaction a lieu dans le cytoplasme et le noyau. Nos résultats renforcent le rôle central du GGP dans la biosynthèse de l'AsA et suggèrent un nouveau mécanisme de régulation par la lumière bleue de la fonction du GGP, en plus de son activité métabolique. Parallèlement, nous avons entrepris la caractérisation d’un autre mutant, le P17C5-3, qui présentait le plus fort taux d'AsA (jusqu'à 10 fois le WT). Outre le phénotype AsA+, le mutant P17C5 présentait de fortes altérations morphologiques, notamment l’absence de graines, rendant la mise en place de la stratégie de cartographie difficile. Grâce à un croisement avec la variété commerciale M82, la mutation causale pu être identifiée dans un ORF cis-régulateur en amont de GGP. Ce résultat confirme le rôle clé de GGP dans la voie L-Galactose. Des études préliminaires liées au phénotype parthénocarpique suggèrent un problème de stérilité mâle associé aux processus de développement du pollen. Enfin, dans l’étude de la qualité des fruits après la récolte, des expériences de stress froid effectuées avec les fruits P21H6 semblent démontrer que l’augmentation de la teneur en AsA améliore la durée de conservation et la capacité de maturation des fruits. Dans l'ensemble, nos résultats confirment la position clé de la protéine GGP dans la voie de biosynthèse de l'AsA, et fournissent des outils et du matériel végétal précieux pour décortiquer la régulation de l'AsA et son rôle physiologique dans la qualité des fruits et les caractères post-récolte. / Ascorbic acid (AsA, vitamin C) is one of the most important biochemical in living organisms. Due to its high antioxidant potential, AsA represents an important trait of nutritional quality in fruits and vegetables. In addition to its beneficial health value in fruit consumption, increasing fruit AsA content would likely affect postharvest quality and resistance to pathogens. Thus, understanding the regulation of AsA accumulation in order to improve crop species of agronomical interest is an important issue in plant breeding for many fleshy fruit species. To get a better understanding of the regulation of AsA level in plants and its impact on fruit quality, a highly mutagenized EMS tomato collection (cv. Micro-Tom) was screened for AsA+ fruit mutants. This forward genetic strategy combined with a mapping-by-sequencing approach, had allowed identifying new genes related to the AsA+ trait. One of the mutant line named P21H6, displayed an AsA-enrichment 2 to 4 fold that of the WT, and was the first to be genetically characterized. It allowed highlighting a new class of photoreceptor involved in blue light sensing named SlPLP as a negative regulator of AsA accumulation in tomato. We confirmed the role of the PLP in the fruit AsA+ phenotype using a directed mutagenesis strategy, undertaking its functional characterization. We demonstrate that PLP interacts with GGP (GDP-L-galactose phosphorylase), a key enzyme of the L-Galactose pathway, under blue light control and that this interaction takes place in the cytoplasm and the nucleus. Our results strengthen the central role of GGP in the AsA biosynthesis and suggest a new regulation mechanism by blue light of the GGP function in addition to its metabolic activity. Besides we started the characterization another mutant, the P17C5-3, which displayed the highest level of AsA (up to 10 times the WT). Beyond its AsA+ content, the P17C5 mutant showed strong morphological alterations including a seedless phenotype making the mapping difficult at first. Thanks to the crossing with the commercial M82 tomato cultivar, the causal mutation was identified in a cis-acting ORF, upstream of the GGP gene. This result confirmed the key role of GGP in the L-Galactose pathway. Preliminary studies related to the parthenocarpic phenotype suggest a problem of male sterility associated with pollen development processes. Finally, in the study of the post-harvest fruit quality, chilling stress experiments carried out with the P21H6 fruits seem to demonstrate that increasing AsA content improve the fruit shelf life and its maturation capacity. Taken as a whole, our results confirmed the key position of the GGP protein in the AsA biosynthesis pathway and they provided precious tools and plant material for deciphering the regulation of AsA and its physiological role in fruit quality and post-harvest traits.

A protease FtsH pertence à superfamília das proteínas AAA (ATPases Associadas à diversas Atividades celulares) cujos membros estão amplamente distribuídos entre procariotos e eucariotos. Nas plantas superiores, elas são codificadas por genes nucleares e sintetizadas por ribossomos citosólicos com uma seqüência de direcionamento na extremidade amino-terminal responsável pela translocação da pré-proteína para o interior das organelas, notadamente mitocôndrias e cloroplastos. Com o objetivo de caracterizar o processo de translocação da proteína aos tilacóides e sua regulação gênica em plantas, isolou-se um cDNA de frutos de tomate (Lycopersicon esculentum Mill. cv. MicroTom), cuja seqüência de aminoácidos revela a presença de todos os motivos clássicos pertencentes a uma protease do tipo FtsH-p1. A caracterização inicial da proteína indicou a presença de um típico peptídeo de trânsito cloroplástico em sua extremidade amino-terminal. A fim de definir qual região da proteína madura está envolvida no direcionamento da protease às membranas, foram realizadas construções gênicas contendo diferentes comprimentos da região amino-terminal da FtsH-p1 de tomate fusionados ao gene repórter GFP (green fluorescent protein). Estudos realizados a partir de frações enriquecidas de cloroplastos, estroma e tilacóide, provenientes de plantas transgênicas expressando estavelmente estas construções, revelaram que todas as proteínas de fusão acumularam-se no estroma sendo, portanto incapazes de associarem-se aos tilacóides. Estes dados indicam que a inserção da FtsH-p1 de tomate nas membranas dos tilacóides dependem de informação presente na proteína madura, necessária para a interação com as membranas ou mesmo com um fator adicional desconhecido. Alem disso, foi mostrado que membros da família das proteases do tipo das FtsHs em plantas não apresentam o clássico motivo RRXFLK, previamente descrito como essencial para a translocação dependente de uma dupla arginina (Tat). Devido ao envolvimento de ortólogos desta proteína em processos fisiológicos importantes nas plantas, abriu-se a possibilidade de estudar a regulação da FtsH-p1 de tomate via clonagem e caracterização da sua região promotora. Uma vez clonada, 4 deleções à partir da extremidade 5’ nesta região foram realizadas e fusionadas de forma a dirigirem a expressão do gene repórter uidA (GUS). Estas construções foram expressas estavelmente em plantas de tabaco, a fim de estudar sua regulação em diferentes tecidos, estádios de desenvolvimento e em resposta a estímulos ambientais ou situações de estresse. Os resultados preliminares mostraram que a seqüência regulatória clonada é responsível tanto à fatores ambientais, como luz, quanto aos hormônios auxina, citocinina e giberelina. Além disso, foi observada uma regulação negativa na presença de peróxido de hidrogênio. Entretanto, tratamentos envolvendo estresse salino, bem como variações na temperatura não geram nenhum efeito na atividade da enzima GUS. O mesmo ocorre quando as plantas são colocadas em presença de ácido abscísico (ABA). Os resultados deste estudo contribuem significativamente para um melhor entendimento dos mecanismos de regulação envolvidos no controle da expressão gênica da FtsH-p1 de tomate, bem como sugerem novas perspectivas no direcionamento de proteínas às membranas. / The FtsH protease belongs to the AAA family (ATPases associated with different cellular activities) whose members are widely distributed in prokaryotes and eukaryotes. In higher plants, these proteins are nuclear-encoded and synthesized by cytosolic ribosomes as larger molecular weight precursors. These molecules carry at the N-terminal extension a specific targeting sequence that directs translocation of the preproteins to the envelope membranes of mitochondria and chloroplasts. In the present work, a tomato (Lycopersicon esculentum Mill. cv. MicroTom) fruit cDNA encoding a plastid FtsH-p1 has been isolated, cloned and characterized. In order to define the protein domains involved on thylakoid targeting, several gene constructions were prepared carrying increasing lengths of the N-terminal region of tomato FtsH fused to the gfp (green fluorescent protein) reporter gene. In vivo expression studies based on onion cells or stable expression in transgenic tobacco plants showed that the chimeric proteins were translocated to plastids. In addition, sub-organellar fractionation indicated that GFP accumulated in the stromal fraction, instead of being translocated to the thylakoid membrane. These data suggest that membrane insertion of tomato FtsH-p1 requires information present in the mature protein. One remarkable finding was that members of the FtsH family do not present the classical RRXFLK motif, that has been shown to be essential for the Tat-dependent pathway. The FtsH-family members are involved in important physiological processes in plant cells. Therefore, this study opened up the possibility of studying the FtsH-p1 gene regulation by characterization of its regulatory region. After cloning a 1700 bp fragment corresponding to 5’ upstream region of the tomato FtsH coding sequence, four deletions of the promoter region were performed and the resulting fragments were fused to the uidA (GUS) reporter gene. These gene constructs were stable expressed in tobacco plants and further characterized. The results showed that the promoter region is positively regulated by light and the phytohormones auxin, cytokine and gibberelin. Besides, the promoter was down regulated by hydrogen peroxide. However, GUS activity was not affected by salt stress, variations on the temperature and abcisic acid treatment. The results presented here expand the current understanding of factors involved on FtsH gene regulation as well as bring new insights on the protein targeting to membranes.

O presente trabalho teve por objetivo avaliar o potencial de parasitismo e eficiência de E. formosa sobre B. tabaci biótipo B em couve, tomate e soja. O tempo de desenvolvimento de ovo a adulto e o número de ninfas de B. tabaci biótipo B foram avaliados em soja, tomate e couve. O número de ninfas parasitadas diariamente e o número total de ninfas parasitadas por fêmeas de E. formosa até sua morte foram avaliados para determinar a capacidade de parasitismo do parasitóide. Foram realizadas liberações de números variáveis de E. formosa para um número fixo de ninfas de B. tabaci biótipo B para avaliar o número ideal de parasitóides por planta. Através dos resultados obtidos, observou-se que a duração de ovo a adulto de B. tabaci biótipo B em tomate (22,03 dias) foi estatisticamente superior a de soja (21,17 dias) e esta última significativamente superior que em couve (19,8 dias) sob as mesmas condições ambientais. O parasitóide E. formosa apresentou preferência por ovipositar no terceiro e quarto ínstares de seus hospedeiros. Comparando-se as três culturas avaliadas verifica-se que a couve apresentou número médio total de ninfas parasitadas superior aos valores obtidos para soja e tomate, que por sua vez não apresentaram diferença entre si. O parasitóide não apresentou diferença em relação à longevidade quando foram oferecidas ninfas de terceiro ou quarto ínstares nas culturas estudadas. Entretanto, verificou-se que para os dois estádios ninfais houve diferença significativa entre as culturas avaliadas. Na couve, a densidade de oito parasitóides por planta resultou em bom controle da praga. / The potencial of parasitism and the efficiency of Encarsia formosa on Bemisia tabaci were evaluated on collard green, tomato and soybean plants. The period of developmentof B. tabaci biotype B from egg to adult and the number of nymphs were evaluated on those plants. The ability of parasitism was evaluated by the number of daily parasitized nymphs and the total number of parasitized nymphs per female of E. formosa. The ideal number of parasitoids per plant was evaluated by releasing variable numbers of E. formosa on a fixed number of B. tabaci biotype B nymphs. The results were as follows: the duration of the egg to adult period of B. tabaci biotype B on tomato (22,03 days) was statistically superior to that on soybean (21,17 days), while this last one was significantly superior to that on collard green (19,8 days), under the same environmental conditions; the parasitoid showed preference to oviposit on the third and fourth instars of B. tabaci biotype B nymphs; the number of parasitized nymphs on collard green was higher than those observed on soybean and tomato, whereas the numbers on these last one did not differ; no difference was observed as to the parasitoid longevity when third and fourth instar nymphs were offered on the tested plants; however one observe a significant difference in the mean number of parasitized nymphs; on collard green plants eight parasitoids per plant resulted in a good control of this insect pest.