L'objectif de cette thèse étudie puis d'implémenter une méthode de reconstruction sur la tomographie aux rayons X qui permette de scanner des gros échantillons avec une bonne résolution qui permettrait de scanner l'intérieur d'un cylindre(tomographie locale) et caractériser des matériaux réels. Notre méthode peut être réalisé pour améliorer la quantitative et la qualitative d'image de fantôme. Dans cette thèse, cet méthode est utilisé sue les matériaux cellulaires. Nous avons réalisé des essais in situ en tomographie aux rayons X sur le mousse ERG et les sphères creuses. Un comparaison entre les résultats d'Élément Finis et des essais réels montre le mécanisme d'endommagement de ces matériaux.

Un des objectifs actuel en tomographie est de réduire la dose injectée au patient. Les nouveaux systèmes d'imagerie, intégrant des détecteurs haute résolution de petites tailles ou des sources fortement collimatées permettent ainsi de réduire la dose. Ces dispositifs mettent en avant le problème de reconstruction d'image à partir d'informations locales. Un moyen d'aborder le problème de tomographie locale est d'introduire une information à priori, afin de lever la non-unicité de la solution. Nous proposons donc de compléter les projections locales haute résolution (provenant de systèmes décrits précédemment) par des projections complètes basse résolution, provenant par exemple d'un examen scanner standard. Nous supposons que la mise en correspondance des données a été effectuée, cette partie ne faisant pas l'objet de notre travail. Nous avons dans un premier temps, adapté des méthodes de reconstruction classiques (ART, Gradient conjugué régularisé et Rétroprojection filtrée) au problème local, en introduisant dans le processus de reconstruction l'information à priori. Puis, dans un second temps, nous abordons les méthodes de reconstruction par ondelettes et nous proposons également une adaptation à notre problème. Dans tous les cas, la double résolution apparait également dans l'image reconstruite, avec une résolution plus fine dans la région d'intérêt. Enfin, étant donné le coût élevé des méthodes mises en oeuvre, nous proposons une parallélisation des algorithmes implémentés.

Le cancer est aujourd’hui la première cause de mortalité en France, devant les pathologies cardio-vasculaires, si bien qu’il constitue un enjeu de santé publique majeur. Parmi les alternatives thérapeutiques actuellement pratiquées en milieu clinique, on compte l’ensemble des techniques de radiothérapie externe. L’hadronthérapie est une technique émergente de radiothérapie, caractérisée par des propriétés balistiques et biologiques compatibles avec la définition de protocoles cliniques et thérapeutiques hautement conformationnels. La précision balistique, c’est à dire la capacité à irradier un volume cible avec précision repose sur un ensemble de paramètres pouvant être entachés d’incertitudes et dont la quantification n’est pas toujours possible. Aussi, la mise en place de procédures de contrôles de l’irradiation devient indispensable à l’utilisation de cette technique de manière raisonnée et pertinente. Le contrôle balistique peut être réalisé par une technique d’imagerie biomédicale, la Tomographie par Emission de Positons (TEP), qui permet de mesurer la distribution de la radioactivité β+ induite par le faisceau primaire. Les premiers résultats obtenus, tant sur le plan de la simulation que sur celui de l’instrumentation, ont permis de poser les jalons d’une méthodologie de mesure et d’analyse des données compatibles avec cette problématique de mesure en ligne. Des mesures réalisées auprès du centre protonthérapie d’Orsay, un des deux centres d’hadronthérapie français, et du grand accélérateur national d’ions lourds (GANIL) de Caen, ont permis de fournir une preuve de concept et d’initier un chantier visant à concevoir un détecteur suffisamment grand, qui sera exploité dans le cadre de protocoles cliniques déterminés. / Cancer remains the main cause of death in France which constitutes a major public heathcare issue. Among all therapeutic alternatives currently used in clinical routine there are all external radiation therapy technics. A new type of highly conformational radiation therapy, called hadrontherapy has been developped over almost 50 years. Balistic accuracy relies on a set of parameters which can be affected by different sources of uncertainties that remain hardly predictable. Therefore, this technic requires the definition of quality assurance (QA) procedures to prevent any deleterious health consequences for the patient. Such QA procedures can be achieved by measuring the induced β+ activity by means of Positron Emission Tomography. The first results obtained by simulations and through different experiments performed on proton and carbon ion beams have lead to define a methodology of data acquisition and analysis compatible with in-beam QA of hadrontherapy treatments. Moreover, experiment performed at GANIL (carbon beam) and CPO Orsay (proton beam) have helped to initiate the construction of a larger detector which could be used within different clinical routine treatments.

La végétation arborée sur les digues ou les barrages en remblai est un facteur de fragilité pouvant favoriser l'apparition de mécanismes de détérioration par érosion. Définir la structure géométrique des systèmes racinaires ainsi que la nature des sols dans lesquels ils croissent, à partir de méthodes géophysiques non destructives, est nécessaire afin d'appréhender les conséquences de leur développement sur la sécurité d'un ouvrage hydraulique. Des expériences en laboratoire ont d'abord permis de déterminer les propriétés acoustiques et électriques intrinsèques d'échantillons racinaires menant à l'identification de signatures indispensables à la discrimination de l'anomalie liée à la racine sur le terrain. Le montage de supports expérimentaux adaptés nous a conduits à progressivement étudier des paramètres d'influences en conditions contrôlées. Des essais en conditions semi-contrôlées sur un dispositif d'arbres plantés dans un sol homogène ont permis d'évaluer la pertinence des différentes méthodologies d'acquisition, tels que l'utilisation de la polarisation provoquée en tomographie de résistivité complexe ou encore la géométrie des capteurs pour la tomographie acoustique. Des traitements innovants tels que l'analyse en ondelettes sont associés afin d'exploiter la richesse des enregistrements. Les résultats obtenus ont été validés par le relevé des positions réelles des racines. Enfin, des campagnes d'auscultation sur un ouvrage réel ont été réalisées et ont permis de mettre en évidence une variabilité spatiale du corps de digue associée à la présence d'arbres. Une méthodologie adaptée au diagnostic géophysique de la végétation sur les ouvrages a été mise en place. / Woody vegetation from earth dikes or dams is a fragility factor which can promote mechanisms of degradation such as erosion. An accurate assessment of root system structure, from geophysical non-destructive methods, of root position into the embankment (depth, extension), and a good knowledge of soil conditions are critical in order to anticipate the consequences of vegetation development for the hydraulic structure’s safety. Laboratory experiments allowed determining intrinsic acoustical and electrical root properties leading to identify relevant signatures and discriminate anomalies related to roots in the field. The establishment of adapted experimental devices led us progressively to assess different parameters (roots mass, water content. . . ) under controlled conditions. Experiments in semi-controlled conditions with trees planted into a homogenous soil, were conducted to assess the relevance of different methodologies, such as the use of temporal induced polarization in complex resistivity tomography or the geometry of sensors for acoustical tomography. Innovative data processing such as wavelet analysis were used to valorize the rich database. The results were validated by the determination of actual root position.Finally, field investigations into an embankment have been performed to highlight a spatial variability of dike structures associated with trees presence. A methodology adapted to the geophysical diagnostic of vegetation roots in embankments was developed.

La tomographie est la discipline qui cherche à reconstruire une donnée physique dans son volume, à partir de l’information indirecte de projections intégrées de l’objet, à différents angles de vue. L’une de ses applications les plus répandues, et qui constitue le cadre de cette thèse, est l’imagerie scanner par rayons X pour le médical. Or, les mouvements inhérents à tout être vivant, typiquement le mouvement respiratoire et les battements cardiaques, posent de sérieux problèmes dans une reconstruction classique. Il est donc impératif d’en tenir compte, i.e. de reconstruire le sujet imagé comme une séquence spatio-temporelle traduisant son “évolution anatomique” au cours du temps : c’est la tomographie dynamique. Élaborer une méthode de reconstruction spécifique à ce problème est un enjeu majeur en radiothérapie, où la localisation précise de la tumeur dans le temps est un prérequis afin d’irradier les cellules cancéreuses en protégeant au mieux les tissus sains environnants. Des méthodes usuelles de reconstruction augmentent le nombre de projections acquises, permettant des reconstructions indépendantes de plusieurs phases de la séquence échantillonnée en temps. D’autres compensent directement le mouvement dans la reconstruction, en modélisant ce dernier comme un champ de déformation, estimé à partir d’un jeu de données d’acquisition antérieur. Nous proposons dans ce travail de thèse une approche nouvelle ; se basant sur la théorie des problèmes inverses, nous affranchissons la reconstruction dynamique du besoin d’accroissement de la quantité de données, ainsi que de la recherche explicite du mouvement, elle aussi consommatrice d’un surplus d’information. Nous reconstruisons la séquence dynamique à partir du seul jeu de projections courant, avec pour seules hypothèses a priori la continuité et la périodicité du mouvement. Le problème inverse est alors traité rigoureusement comme la minimisation d’un terme d’attache aux données et d’une régularisation. Nos contributions portent sur la mise au point d’une méthode de reconstruction adaptée à l’extraction optimale de l’information compte tenu de la parcimonie des données — un aspect typique du problème dynamique — en utilisant notamment la variation totale (TV) comme régularisation. Nous élaborons un nouveau modèle de projection tomographique précis et compétitif en temps de calcul, basé sur des fonctions B-splines séparables, permettant de repousser encore la limite de reconstruction imposée par la parcimonie. Ces développements sont ensuite insérés dans un schéma de reconstruction dynamique cohérent, appliquant notamment une régularisation TV spatio-temporelle efficace. Notre méthode exploite ainsi de façon optimale la seule information courante à disposition ; de plus sa mise en oeuvre fait preuve d’une grande simplicité. Nous faisons premièrement la démonstration de la force de notre approche sur des reconstructions 2-D+t à partir de données simulées numériquement. La faisabilité pratique de notre méthode est ensuite établie sur des reconstructions 2-D et 3-D+t à partir de données physiques “réelles”, acquises sur un fantôme mécanique et sur un patient / Computerized tomography (CT) aims at the retrieval of 3-D information from a set of projections acquired at different angles around the object of interest (OOI). One of its most common applications, which is the framework of this Ph.D. thesis, is X-ray CT medical imaging. This reconstruction can be severely impaired by the patient’s breath (respiratory) motion and cardiac beating. This is a major challenge in radiotherapy, where the precise localization of the tumor is a prerequisite for cancer cells irradiation with preservation of surrounding healthy tissues. The field of methods dealing with the reconstruction of a dynamic sequence of the OOI is called Dynamic CT. Some state-of-the-art methods increase the number of projections, allowing an independent reconstruction of several phases of the time sampled sequence. Other methods use motion compensation in the reconstruction, by a beforehand estimation on a previous data set, getting the explicit motion through a deformation model. Our work takes a different path ; it uses dynamic reconstruction, based on inverse problems theory, without any additional information, nor explicit knowledge of the motion. The dynamic sequence is reconstructed out of a single data set, only assuming the motion’s continuity and periodicity. This inverse problem is considered as a minimization of an error term combined with a regularization. One of the most original features of this Ph.D. thesis, typical of dynamic CT, is the elaboration of a reconstruction method from very sparse data, using Total Variation (TV) as a very efficient regularization term. We also implement a new rigorously defined and computationally efficient tomographic projector, based on B-splines separable functions, outperforming usual reconstruction quality in a data sparsity context. This reconstruction method is then inserted into a coherent dynamic reconstruction scheme, applying an efficient spatio-temporal TV regularization. Our method exploits current data information only, in an optimal way ; moreover, its implementation is rather straightforward. We first demonstrate the strength of our approach on 2-D+t reconstructions from numerically simulated dynamic data. Then the practical feasibility of our method is established on 2-D and 3-D+t reconstructions of a mechanical phantom and real patient data

Um Aussagen über die unterschiedliche Verteilung nikotinischer Acetylcholinrezeptoren im menschlichen Gehirn bei Gesunden und bei Parkinsonpatienten zu erhalten, wird unter anderem der Radioligand 2-[18F]FA-85380 und die Positronen-Emissions-Tomographie genutzt. In dieser Arbeit wurden aufwendige und weniger aufwendige Auswerteverfahren dieser Untersuchung miteinander verglichen. Die an der Universität Leipzig aktuell am häufigsten verwendete Auswertung mittels dem Verteilungsvolumens nach Logan (DVLogan), wurde mit vereinfachten Ansätzen wie dem SUV (Standardized Uptake Value), TTP (Tissue-to-Plasma) und verschiedenen Ratio-Verfahren (Referenzregionen) verglichen. Die statistische Auswertung der Daten zeigte, dass dieses bereits etablierte Verfahren DVLogan, im Vergleich mit vereinfachten Verfahren am besten geeignet ist, die unterschiedliche Verteilung nikotinischer Acetylcholinrezeptoren vom Typ α4β2 in vorher festgelegten Hirnregionen bei Parkinsonpatienten und Probanden einer Kontrollgruppe aufzuzeigen.

Ein Schwerpunkt der Arbeit ist die lokale Phasenanalyse keramischer Systeme mittels EBSD. Insbesondere bei MMC auf der Basis von TRIP-Stahl/Mg-PSZ ist die Ortsauflösung der bisher üblichen XRD-Phasenanalyse nicht ausreichend. Das gilt auch für die Analyse von Grenzflächenreaktionen, wie sie zum Beispiel bei Korrosionsprozessen auftreten. Es wurde eine Methode der Probenpräparation entwickelt und erfolgreich für unterschiedliche keramische Systeme eingesetzt. Ein Ergebnis ist der Nachweis von spannungs-assistierten Phasenumwandlungen in Mg-PSZ. Zweiter Schwerpunkt ist die Entwicklung einer in situ Druckverformungsapparatur für einen Labor-Röntgen-Tomographen. Mit dieser Apparatur können Druckverformungskräfte bis 100 kN erreicht werden. Tomographische Untersuchungen werden unter Druckspannung durchgeführt. Im Rahmen der Arbeit wurde insbesondere das Verformungs- und Schädigungsverhalten von MMC in Form von Schäumen und Wabenkörpern detailliert untersucht.

EINLEITUNG Das maligne Melanom stellt aufgrund seiner frühen Metastasierung und der Resistenz gegenüber den bisher bekannten Therapieansätzen eine der aggressivsten Tumorentitäten dar. Allerdings handelt es sich beim Melanom um einen antigenen und immunogenen Tumor. Dies schürt die Hoffnung, dass durch das bessere Verständnis der Mechanismen, die der Metastasierung, aber auch der Dysregulation des Immunsystems zugrunde liegen, Rückschlüsse auf neue Therapieansätze, beispielsweise unter Einbeziehung der Immunabwehr, gezogen werden können. Darüber hinaus würde die Entwicklung von Radiotracern, die eine frühzeitige Diagnose und möglicherweise auch die Auswahl von Patienten für eine personalisierte Tumortherapie ermöglichen, die Heilungschancen des malignen Melanoms wesentlich verbessern. Das Eph-Ephrin-System wiederum stellt ein vielfältiges Zellkommunikations-System dar, das sowohl in lebenswichtige als auch in pathologische Prozesse involviert ist. Beispielsweise nehmen Eph-Rezeptoren und Ephrine Einfluss auf die gerichtete Bewegung von neuronalen, endothelialen und inflammatorischen Zellen. Zudem beeinflussen sie die Bewegung von Tumorzellen und tragen so zur Tumorprogression bei. Ausgehend von diesem Hintergrund wurde die Hypothese formuliert, dass die Eph-Ephrin-vermittelte Interaktion von Melanomzellen und Tumor-assoziierten inflammatorischen Zellen die Progression und Metastasierung des malignen Melanoms beeinflusst. Im Speziellen sollte im Rahmen der vorliegenden Arbeit geprüft werden, ob die Rezeptor-Tyrosinkinase EphB4 im Zusammenspiel mit seinem Liganden EphrinB2 die Progression und Metastasierung des malignen Melanoms fördert. Darüber hinaus sollte getestet werden, ob der Rezeptor EphB6, der ebenfalls zur Bindung von EphrinB2 fähig ist, aber über eine mutierte und damit funktionsunfähige Kinasedomäne verfügt, eine regulative Rolle übernimmt und antitumorigen wirkt. Aufbauend auf den Erkenntnissen zur Bedeutung von EphB4, EphB6 und EphrinB2 beim malignen Melanom sollten zudem verschiedene Ansätze zur Bildgebung der oben genannten Eph-Rezeptoren und Ephrine mittels PET etabliert und geprüft werden. ERGEBNISSE UND DISKUSSION Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde erstmalig gezeigt, dass die Membranproteine EphB4, EphB6 und EphrinB2 bei den ausgewählten humanen Melanomzellen und den inflammatorischen Zellen exprimiert werden und somit potentielle Interaktionsmöglichkeiten dieser Zellen darstellen. Infolge der Kokultur mit HL-60(M)-Zellen, die als Modell für Tumor-assoziierte Makrophagen dienten, kam es zu einer verminderten Adhäsion und/oder Migration der Melanomzellen sowie im Falle der A375- und A2058-Melanomzellen zu einer verstärkten Sekretion des proinflammatorischen Zytokins IL-6. Aufgrund der breiten Wirkung von IL-6 ergeben sich daraus vielfältige Einflussmöglichkeiten auf das Tumormikromilieu. Diese wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit jedoch nicht näher charakterisiert, da erste Ergebnisse eine Beteiligung des Eph-Ephrin-Systems ausschlossen. Während die Überexpression von EphB6 keinen Einfluss auf die Metastasierungs-relevanten Eigenschaften der A375-Melanomzellen hatte, führte die erhöhte Proteinbiosynthese von EphB4 zu einer verminderten Migration der Zellen im intakten Zellverband. Des Weiteren bewirkte EphB4 eine verstärkte Adhäsion der A375-Zellen an das Extrazellularmatrix-Protein Fibronektin, wodurch die Migration dieser Melanomzellen, im Sinne einer Metastasierung, zusätzlich beeinträchtigt wird. Die erhöhte mRNA-Expression des Liganden EphrinB2 in den A375-Melanomzellen führte zu einer verminderten chemotaktischen Migration der Zellen. Um den Einfluss von EphB4 auf die Tumorprogression und Tumorangiogenese beim malignen Melanom in vivo untersuchen zu können, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein murines Xenograft-Modell mit subkutanen A375 pIRES- bzw. A375 EphB4-Tumoren etabliert. Die Auswertung der Tumorvolumina sowie der [18F]FDG-, [18F]FMISO- und Hoechst 33342-Anreicherung in den Tumoren ergab, dass die erhöhte EphB4-Proteinbiosynthese zu tendenziell kleineren Tumoren führte. Diese waren zudem signifikant schwächer perfundiert und wiesen im Inneren größere hypoxische Areale auf als die A375 pIRES-Tumoren. Somit zeigte EphB4 neben seiner antimetastasischen Wirkung in vitro auch eine antitumorigene Wirkung in vivo, wobei letztere möglicherweise auf eine Störung der Gefäßbildung zurückzuführen ist. Da eine adäquate Blutversorgung der Tumoren für die Metastasierung von Tumorzellen von Bedeutung ist, könnte dies auch auf eine antimetastatische Wirkung in vivo hinweisen. Des Weiteren wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein neuer, 18F-markierter EphB4 Kinaseinhibitor (Verbindung [18F]2) getestet. Dieser zeigte im A375-pIRES/EphB4-Tumor-Xenograft-Modell eine geringe Tumoranreicherung, die von der EphB4-Proteinbiosynthese in den Tumoren unabhängig war. Darüber hinaus kam es zur schnellen hepatobiliären Ausscheidung von Verbindung [18F]2, was deren radiopharmazeutischer Anwendung im Wege steht. SCHLUSSFOLGERUNG UND AUSBLICK Insbesondere die erhöhte Proteinbiosynthese von EphB4 hatte im Falle der untersuchten A375-Melanomzellen zu einer verminderten Migration und zu einer erhöhten Adhäsion der Zellen geführt. Somit konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass EphB4 die Metastasierungs-relevanten Eigenschaften dieser Zellen in vitro beeinträchtigt. Darüber hinaus deuteten Untersuchungen am A375-pIRES/EphB4-Tumor-Xenograft-Modell auf eine antitumorigene Wirkung des EphB4-Rezeptors in vivo hin. Aufgrund dessen muss der anfänglich formulierten Hypothese, dass EphB4 im Zusammenspiel mit seinem Liganden EphrinB2 die Progression und Metastasierung des malignen Melanoms fördert, widersprochen werden. Eine regulative Beteiligung des Kinase-defizienten Rezeptors EphB6, der ebenfalls zur Bindung von EphrinB2 fähig ist, konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht sicher nachgewiesen werden. Allerdings ergeben sich aufgrund der Expression der Rezeptoren EphB4 und EphB6 sowie deren Ligand EphrinB2 sowohl auf den untersuchten Melanomzellen als auch auf den verschiedenen Tumor-assoziierten inflammatorischen Zellen interessante Interaktionsmöglichkeiten dieser Zellen. Deren Einfluss auf die Progression und Metastasierung des malignen Melanoms sollte in weiterführenden Experimenten untersucht werden. Das im Rahmen der vorliegenden Arbeit etablierte A375-pIRES/EphB4-Tumor-Xenograft-Modell ermöglicht die In vivo-Charakterisierung von Radiotracer, die gegen Rezeptor-Tyrosinkinasen im Allgemeinen oder aber selektiv gegen EphB4 gerichtet sind. Da Verbindung [18F]2 eine ungünstige Pharmakokinetik zeigte, was wahrscheinlich auf die hohe Lipophilie des Radiotracers zurückzuführen ist, sollten sich zukünftige Untersuchungen mit der chemischen Modifikation dieser Verbindung beschäftigen, mit dem Ziel die Lipophilie und damit die biologische Halbwertszeit des Radiotracers zu verbessern. Zusätzlich sollte die Entwicklung von Radiotracern auf der Basis von löslichen Eph-Rezeptoren und Ephrinen (sEph bzw. sEphrin) weiter vorangetrieben werden.:1 EINLEITUNG 1.1 Die Bedeutung des Tumor-Mikromilieus bei der Entstehung des malignen Melanoms 1.2 Die Metastasierung des malignen Melanoms als limitierender Einflussfaktor auf die Tumortherapie 1.3 Die Rolle des Eph-Ephrin-Systems bei der Tumorprogression und Metastasierung 1.4 Zielstellung 2 MATERIAL UND METHODEN 2.1 Material 2.1.1 Eukaryotische Zellen 2.1.2 Prokaryotische Zellen 2.1.3 Versuchstiere 2.1.4 Plasmide 2.1.5 Kits 2.1.6 Antikörper 2.1.7 Verbrauchsmaterialien 2.1.8 Chemikalien, Medien und Enzyme 2.1.9 Puffer und Lösungen 2.1.10 Geräte 2.2 Molekularbiologische Methoden 2.2.1 RNA-Isolierung aus Zellen 2.2.2 DNase-Behandlung 2.2.3 Quantitative Echtzeit RT-PCR (qRT-PCR) 2.2.4 Klonierung von humanem EphB4, EphB6 und EphrinB2 in den eukaryotischen Expressionsvektor pIRES2-AcGFP1 2.2.4.1 Prinzip 2.2.4.2 Restriktionshydrolyse 2.2.4.3 Dephosphorylierung und Glättung der cDNA mittels Alkalischer Phosphatase und Klenow-Fragment 2.2.4.4 Agarose-Gelelektrophorese 2.2.4.5 Gelextraktion 2.2.4.6 Ligation 2.2.4.7 Herstellung Transformations-kompetenter E. coli 2.2.4.8 Transformation kompetenter E. coli 2.2.4.9 Plasmid-Isolierung 2.2.5 Klonierung von humanem sEphB4, sEphB6 und sEphrinB2 in den eukaryotischen Expressionsvektor pSecTag2B 2.2.5.1 Prinzip 2.2.5.2 PCR zur Gewinnung der cDNA für sEphrinB2, sEphB4 und sEphB6 2.2.5.3 Agarose-Gelelektrophorese und Gelextraktion 2.2.5.4 TOPO-TA-Klonierung, Transformation und Plasmid-Isolierung 2.2.5.5 Restriktionshydrolyse, Ligation, Transformation und Plasmid-Isolierung 2.3 Zellbiologische Methoden 2.3.1 Kultivierung eukaryotischer Zellen 2.3.2 Kontrolle von Zellkulturen auf Mykoplasmen-Kontamination 2.3.3 Kryokonservierung und Rekultivierung von Zellen 2.3.4 Transfektion und Antibiotikaselektion von COS-7-Zellen 2.3.5 Transfektion und Antibiotika-Selektion von A375-Zellen 2.3.6 Fluoreszenz-aktivierte Zellanalyse und -sortierung (FACS) von transfizierten A375-Zellen 2.3.7 Fluoreszenzmikroskopie von transfizierten A375-Zellen 2.3.8 Bestimmung der Zellproliferation und Zellvitalität mittels Wachstumskurve 2.3.9 Differenzierung humaner THP-1-Leukämiezellen zu Makrophagen-artigen Zellen (THP-1(M)) 2.3.10 Differenzierung humaner HL-60-Leukämiezellen zu Makrophagen-artigen (HL-60(M)) und Granulozyten-artigen (HL-60(G)) Zellen 2.3.11 Kokultivierung humaner Melanomzellen mit HL-60(M) und anschließende Trennung mittels Magnet-aktivierter Zell Separierung (MACS) 2.3.12 Adhäsionsassay 2.3.12.1 Adhäsion an Fibronektin 2.3.12.2 Adhäsion an HL-60(M)-Zellen 2.3.13 Migrationsassay 2.3.13.1 Boyden-Kammer-Assay 2.3.13.2 Wundheilungsassay 2.4 Proteinbiochemische Methoden 2.4.1 Proteinisolierung aus Zellkulturen 2.4.2 Proteinisolierung aus Gewebeproben 2.4.3 Proteinbestimmung 2.4.4 SDS-PAGE 2.4.5 Western Blotting und Immundetektion 2.4.6 Enzym-gekoppelter Immunadsorptionsassay (ELISA) 2.4.6.1 IL-6-ELISA 2.4.6.2 pEphB4-ELISA 2.4.7 Gewinnung und Reinigung der rekombinanten, löslichen Eph Rezeptoren sEphB4 und sEphB6 2.4.7.1 Gewinnung von COS-7-Zellkulturüberständen 2.4.7.2 Reinigung von sEphB4 und sEphB6 aus den COS-7-Zellkulturüberständen mittels Ni2+-Affinitätschromatographie 2.4.7.3 Regeneration der Ni2+-NTA-Agarose 2.4.7.4 Entfernung von Salzen und Imidazol mittels Schneller Protein-Flüssigkeitschromatographie (FPLC) 2.4.7.5 Entfernung von Salzen und Imidazol mit Hilfe von Zentrifugalkonzentratoren 2.4.7.6 Gefriertrocknung 2.5 Tierexperimentelle Arbeiten 2.5.1 Etablierung eines murinen Tumor-Xenograft-Modells mit subkutanen A375-pIRES/EphB4-Tumoren 2.5.2 Fluoreszenz-Bildgebung 2.5.3 Magnet-Resonanz-Tomographie 2.5.4 Untersuchung der Tumorperfusion mittels Hoechst 33342 2.6 Radiochemische und Radiopharmakologische Methoden 2.6.1 Darstellung und Radiomarkierung von EphB4-Kinaseinhibitoren 2.6.2 Untersuchung des Einflusses der Verbindungen 2 auf die Zellproliferation und Zellvitalität mittels MTT-Test 2.6.3 Untersuchung der zellulären Bindung und Aufnahme der Verbindung [18F]2 2.6.4 Kleintier-Positronen-Emissions-Tomographie 2.6.5 Bioverteilung 2.6.6 Metabolitenanalyse 2.6.7 Autoradiographie 2.7 Histologische Methoden 2.7.1 Anfertigung von Gefrierschnitten 2.7.2 Nachweis von Hoechst 33342 in Gefrierschnitten 2.7.3 Anfertigung von Paraffinschnitten 2.7.4 Nachweis von EphB4 in Paraffinschnitten 2.8 Statistische Auswertung 3 ERGEBNISSE 3.1 Genexpression von EphB4, EphB6 und EphrinB2 bei humanen Leukämie- und Melanomzellen 3.2 Proteinbiosynthese von EphB4, EphB6 und EphrinB2 bei humanen Leukämie- und Melanomzellen 3.3 Kokultivierung humaner Melanomzellen mit HL-60(M) 3.3.1 Etablierung eines Kokultur-Modells mit anschließender Trennung der humanen Melanomzellen von den HL 60(M)-Zellen 3.3.2 Einfluss der Kokultur auf das Adhäsions- und Migrationsverhalten der humanen Melanomzellen 3.3.2.1 Adhäsionsassay 3.3.2.2 Migrationsassay 3.3.3 Einfluss der Kokultur auf die Sekretion von Interleukin-6 durch die humanen Leukämie- und Melanomzellen 3.4 Überexpression von EphB4, EphB6 und EphrinB2 bei A375 Melanomzellen 3.4.1 Fluoreszenzmikroskopie und FACS 3.4.2 mRNA-Expression von EphB4, EphB6 und EphrinB2 3.4.3 Proteinbiosynthese von EphB4, EphB6 und EphrinB2 3.4.4 Proliferationsverhalten 3.5 Einfluss von EphB4, EphB6 und EphrinB2 auf das Adhäsions- und Migrationsverhalten von A375-Melanomzellen 3.5.1 Einfluss auf die Adhäsion 3.5.1.1 Adhäsion an Fibronektin 3.5.1.2 Adhäsion an HL-60(M)-Zellen 3.5.2 Einfluss auf die Migration 3.5.2.1 Boyden-Kammer-Assay 3.5.2.2 Wundheilungsassay 3.5.3 Einfluss der Kokultur mit HL-60(M)-Zellen auf das Adhäsions- und Migrationsverhalten der A375-Melanomzellen 3.6 Einfluss von EphB4, EphB6 und EphrinB2 auf das inflammatorische Potential von A375-Melanomzellen und HL 60(M)-Zellen 3.7 Charakterisierung eines murinen Tumor-Xenograft-Modells mit subkutanen A375-pIRES/EphB4-Tumoren 3.7.1 Charakterisierung des Tumorwachstums 3.7.2 Nachweis der EphB4-Proteinbiosynthese 3.7.3 Charakterisierung des Tumormetabolismus und der Tumorperfusion mit [18F]FDG 3.7.4 Charakterisierung der Tumorperfusion mit Hoechst 33342 3.7.5 Charakterisierung der CD31-Proteinbiosynthese 3.7.6 Charakterisierung hypoxischer Areale mit [18F]FMISO 3.8 Charakterisierung eines neuen, 18F-radiomarkierten EphB4-Kinaseinhibitors als Radiotracer zur Bildgebung von EphB4 mittels Kleintier-PET 3.8.1 Einfluss von Verbindung 2 auf die Zellproliferation und Zellvitalität 3.8.2 Einfluss von Verbindung 2 auf die EphB4-Phosphorylierung 3.8.3 Charakterisierung der Zellaufnahme von Verbindung [18F]2 3.8.4 Charakterisierung des In-vivo-Metabolismus von Verbindung [18F]2 im A375-pIRES/EphB4-Tumor-Xenograft-Modell 3.8.4.1 Kleintier-Positronen-Emissions-Tomographie 3.8.4.2 Autoradiographie 3.8.4.3 Bioverteilung 3.8.4.4 Metabolitenanalyse 3.9 Reinigung und Charakterisierung rekombinanter, löslicher Eph-Rezeptoren 3.9.1 Proteinbiosynthese und Sekretion von sEphB4 und sEphB6 3.9.2 Reinigung von rekombinantem sEphB4 und sEphB6 aus COS-7-Zellkulturüberständen 4 DISKUSSION 4.1 Therapiemöglichkeiten und Bedeutung von Tumor-assoziierten inflammatorischen Zellen beim malignen Melanom 4.2 Vorkommen von EphB4, EphB6 und EphrinB2 bei humanen Melanomzellen und inflammatorischen Zellen 4.3 Einfluss der Kokultur von Melanomzellen mit HL-60(M) auf die metastatischen und inflammatorischen Eigenschaften der Zellen 4.4 Einfluss von EphB4 auf das Wachstum und die Vaskularisierung von A375-Tumoren in vivo 4.5 Kinaseinhibitoren als potentielle Radiotracer für die In vivo-Bildgebung von Eph-Rezeptoren 4.6 Entwicklung löslicher Eph-Rezeptoren und Ephrin-Liganden als Grundlage für die In vivo-Bildgebung des Eph-Ephrin-Systems 5 SCHLUSSFOLGERUNGEN UND AUSBLICK 6 ZUSAMMENFASSUNG 7 LITERATURVERZEICHNIS 8 DANKSAGUNG 9 VERÖFFENTLICHUNGEN UND KONFERENZBEITRÄGE

In den westlichen Industrieländern ist Brustkrebs die häufigste krebsbedingte Todesursache bei Frauen. Bei der Diagnose von Brustkrebs ist für bestimmte Fragestellungen die Positronen-Emissions-Tomographie (PET) eine wichtige Ergänzung zur Mammographie und Sonographie. Die derzeit eingesetzten PET-Tracer 2-[18F]Fluor-2-desoxy-D-Glucose (FDG) und 16a-[18F]Fluor-17b-estra--diol (FES) können Mammakarzinome bzw. deren Metastasen nicht mit 100%iger Sicherheit nachweisen. Aus diesem Grund wurde eine [18F]-markierte Verbin-dung entwickelt, die möglicherweise die diagnostische Sicherheit bei Brustkrebs erhöhen kann: [18F]16a-Fluorestradiol-3,17b-disulfamat ([18F]FESDS). [18F]FESDS sollt dabei an Estronsulfatase binden, die in Mammakarzinomen signifikant höher exprimiert wird. Es wurde geprüft, ob [18F]FESDS für die Positronen-Emissions-Tomographie eignet ist. Die Ergebnisse zeigten, dass die Estronsulfatase nicht das alleinige Target von [18F]FESDS darstellt. Auch die Carboanhydrase hat eine sehr hohe Affinität zu dem potentiellen Tracer. Durch selektive Hemmung der Carboanhydrase mit Azetazolamid konnte jedoch in vitro die Estronsulfatase dargestellt werden. In vivo ist es nicht gelungen, mit [18F]FESDS die Estronsulfatase bei vorliegender Carboanhydrase-Hemmung besser darzustellen. Die Daten deuten darauf hin, dass eine Darstellung der Estronsulfatase mit der PET weder mit dem Radiotracer [18F]FESDS allein noch bei Koinjektion von [18F]FESDS mit Azetazolamid (zur CA-Hemmung) möglich ist.

La tomodensitométrie (TDM) est une modalité d'imagerie médicale anatomique extrêmement utile en imagerie moléculaire. Elle permet de localiser de façon précise les sources d'émissions détectées en tomographie d'émission par positrons (TEP) relativement à des repères anatomiques facilement identifiables dans les images à haute résolution de la TDM. La localisation s'effectue par superposition des images issues de la TDM et de la TEP, cette dernière étant susceptible de ne contenir que peu de repères anatomiques selon le radiotraceur utilisé. Classiquement, la TDM et la TEP se jumellent en juxtaposant axialement un scanner de chaque modalité de sorte que le sujet traverse successivement chaque appareil pour effectuer les deux acquisitions indépendamment. Cette translation diminue la qualité de la fusion des images, puisque les organes du sujet peuvent se déplacer légèrement, ce qui rend l'alignement difficile après la reconstruction. De plus, dans un grand nombre d'études en imagerie moléculaire, il s'est avéré que la dose de radiations X transmise au sujet lors de l'acquisition TDM peut influencer les résultats quantitatifs obtenus en TEP, ce qui rend ces études difficilement répétables. Les tomodensitomètres actuels mesurent exclusivement le flux de radiation traversant le sujet en intégrant la charge créée par les photons X lors de leur interaction photoélectrique dans un dispositif de conversion de lumière en électrons. Ce mode d'acquisition dit"d'intégration" filtre bien le bruit à haute fréquence mais accumule toutefois le courant de fuite du photodétecteur. Pour obtenir un rapport signal à bruit (S/B) adéquat en TDM, il est nécessaire d'augmenter la dose de radiations transmise de façon significative. Cette technique ne se prête pas bien à l'imagerie moléculaire où la dose injectée joue un rôle limitatif sur le diagnostic et d'autres solutions doivent être apportées. Un mode de mesure du flux de radiation novateur, qui compte individuellement chacun des photons à l'aide d'une électronique de traitement rapide, constitue une alternative au problème d'intégration et permet d'éliminer partiellement le bruit électronique. La bande passante du préamplificateur doit cependant être élevée pour permettre la détection de plusieurs millions de photons par secondes par canal d'acquisition, afin de réduire le temps total d'acquisition nécessaire. Une telle électronique a été développée à Sherbrooke et jumelée à de puissants processeurs de traitement numériques [i.e. numérique]. Cette chaîne d'acquisition double modalité (TEP/TDM), la chaîne LabPETTM, sert déjà à la mesure de TEP dans un scanner commercial pour petits animaux. Le développement d'algorithmes de traitement numériques adaptés au comptage de photons en tomodensitométrie permettrait à cette chaîne d'effectuer une mesure moins bruitée et nécessitant donc une dose substantiellement réduite. De plus, la technologie LabPETTM pourra, à partir d'un même anneau de détection, effectuer une acquisition bimodale TEP/TDM qui s'avérera moins coûteuse, occupera moins d'espace et facilitera la fusion des images TEP/TDM. Les travaux de ce mémoire ont permis d'obtenir une méthode de traitement numérique capable de supporter le comptage des photons à un débit de plusieurs millions d'événements par secondes par détecteur avec une chaîne LabPETTM. La méthode fonctionne par prédiction du signal et se base sur la réponse impulsionnelle de la chaîne placée en mode de préamplification TDM. Cette méthode ouvre la porte au développement du LabPET/TDM, un appareil bimodal intégré de faible dose.