Os efeitos da administração de anfotericina B a camundongos suscetíveis ao P. brasiliensis foram avaliados. A L-AmB reverte o padrão de suscetibilidade para o de resistência de forma mais eficiente do que a c-AmB, como observado na quantificação de UFC, NO e IgG2b. Porém, os níveis de TNF-a, IL-12, IFN-g, GM-CSF, IgG total, IgM, IgG1, IgG2a e IgA não são significativamente alterados. Neutrófilos e macrófagos peritoneais co-cultivados com Pb e L-AmB tendem a apresentar maior capacidade fungicida, mas não maior síntese de mediadores. O melhor desempenho de L-AmB poderia se dever a sua interação com TLR4. Em TLR4-deficientes ou não, a progressão da doença é similar. A eficácia da terapia, porém, é menor nos deficientes, como observado na quantificação de UFC; os perfis leucocitários e as concentrações de NO, TNF-a, IL-12 e GM-CSF não são significativamente alterados. Logo, a droga é capaz de reverter os parâmetros micológicos, mas não os imunológicos. A interação entre TLR4, P. brasiliensis e L-AmB não parece ser importante para o estabelecimento da imunidade. / Amphotericin B effects in mice susceptible to P. brasiliensis were evaluated. L-AmB reverts the susceptibility pattern to the resistant one with more efficiency than c-AmB, as confirmed by the CFU, NO e IgG2b quantifications. However, TNF-a, IL-12, IFN-g, GM-CSF, total IgG, IgM, IgG1, IgG2a and IgA levels are not significantly altered. Neutrophils and macrophages cocultivated with Pb e L-AmB tend to present higher fungicidal ability, but not enhanced synthesis of mediators. The better performance of L-AmB could be due to its interaction with TLR4. In TLR4-deficient or sufficient mice, progression of the disease is similar. The efficiency of the therapy, however, is lower in deficient animals, as seen on CFU; leukocyte profiles and NO, TNF-a, IL-12 and GM-CSF levels are not significantly altered by L-AmB-TLR4 interaction. Therefore, the drug administration is capable of reverting mycological parameters, but not the immunological ones. Interaction between TLR4, P. brasiliensis and L-AmB does not seem to play a special role in the establishment of immunity.

Orientador: Mario Jose Abdalla Saad / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-13T00:52:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zambon_RenataAlvaresBagarolli_M.pdf: 4989777 bytes, checksum: f40828d6f5cfd74ebf3f3ddc47d0158d (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Atualmente, o DM2 constitui-se como um grande problema de saúde pública mundial devido à sua elevada prevalência, morbimortalidade, além do impacto que apresenta nos custos públicos com a saúde. Os mecanismos fisiopatológicos desta doença têm se tornado cada vez mais evidentes, estando relacionados com o envolvimento exclusivo de células, receptores e mediadores do sistema imune inato. Dentre estes compostos destacam-se o TLR4, um receptor de antígenos deste sistema, responsável por ativar a transcrição de citocinas pró-inflamatórias, e a iNOS, uma enzima cálcio independente, que produz elevadas concentrações de NO. Ambas as proteínas estão envolvidas no desenvolvimento de resistência à insulina. Por esta razão, este presente trabalho investigou se 2 polimorfismos no promotor do gene da iNOS (NOS2) (deleção / inserção AAAT e (CCTTT)n) e 2 polimorfismos na seqüência codificadora do gene do TLR4 (TLR4) (Asp299Gly e Thr399Ile), tanto isolados como em conjunto, possuíam alguma associação com a susceptibilidade de desenvolvimento DM2. Além disso, também foi avaliado se os polimorfismos estavam associados com fatores de risco para a resistência à insulina e características clínicas do DM2. Foram coletadas amostras de sangue de 411 indivíduos, sendo 211 portadores de DM2 e 200 controles (doadores de sangue) saudáveis acima de 50 anos, de ambos os sexos. A glicemia de jejum foi determinada e o DNA de cada sujeito foi extraído para posterior amplificações dos 4 fragmentos desejados por PCR. Para a determinação dos genótipos, os 2 polimorfismos da iNOS - AAAT e (CCTTT)n - foram submetidos à eletroforese em seqüenciador automático e os 2 polimorfismos do TLR4 - Asp299Gly e Thr299Ile - foram submetidos a reação de digestão utilizando-se enzima de restrição. Além das análises estatísticas convencionais, os resultados foram avaliados pelo método MDR (multifactor-dimensionality reduction), que visa verificar interações entre polimorfismos. As freqüências genotípicas para os polimorfismos, considerando ambos os grupos, estão em equilíbrio de Hardy-Weinberg. Para o polimorfismo de deleção / inserção AAAT nós encontramos que a presença da inserção resultou em um aumento de risco para a doença. A inserção também se associou com a história familiar de diabetes em homens diabéticos e fatores de risco para a resistência à insulina. Para o polimorfismo (CCTTT)n notamos que os genótipos que continham apenas as repetições longas (12-16 repetições) do microssatélite estavam associados com uma chance aumentada de desenvolver DM2, além destas mesmas repetições estarem relacionadas com colesterol total e nefropatia diabética. As freqüências dos polimorfismos Asp299Gly e Thr399Ile do TLR4 também foram avaliadas. Para ambas as mutações, os alelos menos prevalentes foram significativamente maior nos controles, mostrando um papel protetor para os alelos que codificam os aminoácidos 299Gly e 399Ile, respectivamente. Pelo método MDR também foi observado que existe uma forte interação entre os quatro polimorfismos estudados e que a combinação dos genótipos D/I do polimorfismo de deleção / inserção AAAT no gene NOS2, C/L (formas curtas / formas longas) do polimorfismo (CCTTT)n no gene NOS2 e Asp/Asp ou Thr/Thr dos polimorfismos Asp299Gly ou Thr299Ile, respectivamente, no gene TLR4 apresenta alto risco para o desenvolvimento do DM2. Sendo assim, as variações genéticas no promotor do gene NOS2 e na seqüência codificadora do TLR4, consideradas tanto isoladas como em conjunto, podem levar a efeitos deletérios ou protetores, respectivamente, que são oriundos de funções alteradas do sistema imune inato em pacientes com DM2. / Abstract: Background: The toll-like receptor 4 (TLR4) and inducible nitric oxide synthase (iNOS) are proteins from the innate immune system that, when activated, can induce insulin resistance. Polymorphisms in these genes could affect the immune response, as well as the prevalence of type 2 diabetes (T2DM). Objective: The aims of the present study were: to investigate the contribution, isolated or together, of four polymorphisms (Asp299Gly and Thr399Ile from TLR4; deletion / insertion AAAT and (CCTTT)n from NOS2) to susceptibility to T2DM in a southeast Brazilian population; and to verify if these polymorphisms are associated with risk factors for insulin resistance syndrome and clinical characteristics for T2DM. Design: A total of 211 patients with T2DM and 200 unrelated controls were genotyped for the Asp299Gly and Thr399Ile polymorphisms of the TLR4 gene and for the deletion / insertion AAAT and (CCTTT)n polymorphisms of the NOS2 promoter gene. Besides the conventional statistics analysis, the data was also analyzed for gene-to-gene interactions among the four polymorphic loci using the multifactor-dimensionality reduction (MDR) method. Results: With regard to the NOS2 promoter region, the data showed that the I allele of the deletion / insertion AAAT polymorphism was more prevalent in the T2DM group and also was related with some risk factors for insulin resistance syndrome (body mass index, waist circumference). Similarly, the L/L genotype of (CCTTT)n polymorphism were more frequent in the T2DM group and the L allele was associated with total cholesterol and diabetic nephropathy. In contrast, the 299Gly allele and the 399Ile allele from the Asp299Gly and Thr399Ile TLR4 gene polymorphisms, respectively, were associated with protection of T2DM. The MDR analysis showed a significant gene-to-gene interaction between the four polymorphisms studied. Moreover, the combination of the NOS2 deletion / insertion AAAT heterozygote, the NOS2 (CCTTT)n (stratified in short and long forms) heterozygote and the TLR4 Asp299Gly Asp/Asp or Thr399Ile Thr/Thr, homozygotes was associated with a increased risk of T2DM. Conclusions: Genetic variations in the NOS2 gene promoter and TLR4 coding sequence, when analyzed together or isolated, may lead to deleterious and protective effects, respectively, arising from altered function of the innate immune system in patients with T2DM. / Mestrado / Medicina Experimental / Mestre em Fisiopatologia Médica

Os efeitos da administração de anfotericina B a camundongos suscetíveis ao P. brasiliensis foram avaliados. A L-AmB reverte o padrão de suscetibilidade para o de resistência de forma mais eficiente do que a c-AmB, como observado na quantificação de UFC, NO e IgG2b. Porém, os níveis de TNF-a, IL-12, IFN-g, GM-CSF, IgG total, IgM, IgG1, IgG2a e IgA não são significativamente alterados. Neutrófilos e macrófagos peritoneais co-cultivados com Pb e L-AmB tendem a apresentar maior capacidade fungicida, mas não maior síntese de mediadores. O melhor desempenho de L-AmB poderia se dever a sua interação com TLR4. Em TLR4-deficientes ou não, a progressão da doença é similar. A eficácia da terapia, porém, é menor nos deficientes, como observado na quantificação de UFC; os perfis leucocitários e as concentrações de NO, TNF-a, IL-12 e GM-CSF não são significativamente alterados. Logo, a droga é capaz de reverter os parâmetros micológicos, mas não os imunológicos. A interação entre TLR4, P. brasiliensis e L-AmB não parece ser importante para o estabelecimento da imunidade. / Amphotericin B effects in mice susceptible to P. brasiliensis were evaluated. L-AmB reverts the susceptibility pattern to the resistant one with more efficiency than c-AmB, as confirmed by the CFU, NO e IgG2b quantifications. However, TNF-a, IL-12, IFN-g, GM-CSF, total IgG, IgM, IgG1, IgG2a and IgA levels are not significantly altered. Neutrophils and macrophages cocultivated with Pb e L-AmB tend to present higher fungicidal ability, but not enhanced synthesis of mediators. The better performance of L-AmB could be due to its interaction with TLR4. In TLR4-deficient or sufficient mice, progression of the disease is similar. The efficiency of the therapy, however, is lower in deficient animals, as seen on CFU; leukocyte profiles and NO, TNF-a, IL-12 and GM-CSF levels are not significantly altered by L-AmB-TLR4 interaction. Therefore, the drug administration is capable of reverting mycological parameters, but not the immunological ones. Interaction between TLR4, P. brasiliensis and L-AmB does not seem to play a special role in the establishment of immunity.