La sclérose systémique est une maladie autoimmune dont l’une des complications majeures est la fibrose. La DNA topoisomérase I (topo) est l’un des principaux autoantigènes associés à cette maladie. Toutefois, aucun lien n’a encore pu être établi entre la présence des anti-topo et le développement de la fibrose. Les travaux antérieurs du laboratoire d’accueil ont montré une interaction directe de la topo avec la surface des fibroblastes et la matrice extracellulaire. Nous avons voulu caractériser ces interactions du point de vue moléculaire. La topo a donc été exprimée sous forme de 5 fragments, déterminés à partir de ses principaux domaines structuraux et de ses épitopes majeurs, chez E. coli. Les fragments purifiés ont été analysés pour leur interaction avec l’héparine, représentant les héparane sulfates de la surface des fibroblastes, et avec des protéines purifiées de la matrice extracellulaire. Nous avons montré que le fragment topo-N est le principal responsable de l’interaction avec l’héparine, ce qui suggère donc l’implication potentielle de ce domaine dans l’interaction de la topo avec la surface des fibroblastes. Le fragment topo-DIDII est responsable de l’interaction avec la plupart des protéines de la matrice extracellulaire étudiées, alors que le fragment topo-H15 n’interagit qu’avec la vitronectine. Aucune interaction des fragments topo-DIII et topo-C n’a été décelée. Ces résultats pourront maintenant servir à mieux comprendre le rôle potentiel de la topo et des autoanticorps circulants anti-topo dans la fibrose présente chez les personnes atteintes de sclérose systémique en contribuant à l’identification de la cible de la topo sur les fibroblastes. / Systemic sclerosis is an autoimmune disease in which one of the major complications is fibrosis. DNA topoisomerase I (topo) is a major autoantigen associated with this disease. However, no link has yet been established between the presence of anti-topo and the development of fibrosis. Previous work of the host laboratory showed a direct interaction of the topo with the surface of fibroblasts and extracellular matrix. We wanted to characterize these interactions at the molecular level. Topo was expressed in 5 fragments, determined from its main structural domains and its major epitopes, in E. coli. The purified fragments were analyzed for their interaction with heparin, representing heparan sulfates on the surface of fibroblasts, and with purified proteins of the extracellular matrix. We have shown that the topo-N fragment is responsible for interaction with heparin, suggesting hence, potential involvement of this domain in the interaction of topo with the surface of fibroblasts. The topo-DIDII fragment is responsible for the interaction with most proteins of the extracellular matrix studied, whereas the topo-H15 fragment only binds to vitronectin. No interaction of fragments topo-DIII and topo-C was found. These results can now be used to better understand the potential role of topo and circulating anti-topo autoantibodies in the fibrosis present in patients with systemic sclerosis in helping to identify the target of topo on fibroblasts.

La 20(S)-camptothécine (CPT) est un alcaloïde pentacyclique doté d'une activité anticancéreuse remarquable, agissant comme inhibiteur de la topoisomérase I (topo I). Le problème majeur de ce composé (et de la plupart de ses dérivés) est la fragilité de son cycle E qui s'hydrolyse rapidement à pH physiologique pour conduire au carboxylate correspondant inactif. L'une des approches permettant de pallier ce problème d'hydrolyse consiste à modifier le cycle E. Ce travail de thèse porte sur la synthèse totale de deux nouveaux analogues de la CPT modifiés au niveau du cycle E. Chacune de ces synthèses fait appel à une cycloaddition [3+2] afin de préparer l'hydroxypyridone de départ (cycles C et D), à un réarrangement de Claisen permettant de mettre en place le cycle E et à une condensation de Friedländer pour installer le motif quinoléinique (cycles A et B). Le premier analogue synthétisé, la (±) 17 norcamptothécine (17-norCPT), possède une α-hydroxy γ-lactone à la place de l'α-hydroxy δ-lactone de la CPT. Ce composé a été obtenu en neuf étapes avec un rendement de 4,4% à partir de l'hydroxypyridone de départ. Le test d'inhibition de la topo I a été réalisé, mais cette molécule s'est révélée totalement inactive. Cependant, une étude de la cinétique d'hydrolyse de la 17-norCPT, réalisée par spectroscopie de fluorescence, a permis de montrer que cet analogue était très instable en milieu aqueux. Le second composé préparé est en fait un homologue de la 17 norCPT possédant un méthylène entre l'oxygène et le carbonyle de la lactone. Cette molécule, comportant un motif céto éther, est donc un isomère de la CPT. Elle a été obtenue par deux voies de synthèse différant l'une de l'autre par l'ordre des réactions mises en œuvre. Chacune de ces approches permet d'obtenir le composé souhaité en neuf étapes à partir de l'hydroxypyridone de départ, avec un rendement de 16% et 10% respectivement. Les tests biologiques sur le composé final sont actuellement en cours. / 20(S)-Camptothecin (CPT) is a pentacyclic alkaloid endowed with remarkable anticancer activity, acting as an inhibitor of topoisomerase I (topo I). The major problem with this compound (and many of its derivatives) is the fragility of its E-ring, which suffers rapid hydrolysis at physiological pH to yield the inactive corresponding carboxylate. One of the approaches to overcome this problem of hydrolysis consists in modifying the E-ring. This thesis focuses on the total synthesis of two new E-ring modified CPT analogs. Each of the syntheses involves a [3+2] cycloaddition to prepare the starting hydroxypyridone (rings C and D), a Claisen rearrangement to realize the E-ring, and a Friedländer condensation to install the quinoline system (rings A and B). The first analog synthesized, (±) 17 norcamptothecin (17-norCPT), has an α-hydroxy γ-lactone in place of the α-hydroxy δ-lactone of CPT. This compound has been obtained in nine steps with a yield of 4.4% from the starting hydroxypyridone. Unfortunately, though, this molecule has proved to be totally inactive in the topo I assay. A kinetic hydrolysis study of 17-norCPT, carried out by fluorescence spectroscopy, has demonstrated, however, that this analog is, in fact, unstable in aqueous media. The second compound prepared is a homolog of 17-norCPT with a methylene between the lactone oxygen and carbonyl, thus a CPT keto ether isomer. It has been obtained through two synthetic routes that differ from each other in the order of the steps. Each of the approaches yields the desired compound in nine steps from the starting hydroxypyridone, with yields of 16% and 10% for the two syntheses. Biological tests on the final compound are currently underway.

La résistance acquise aux traitements anticancéreux représente un problème clinique majeur. Les voies de réparation de l'ADN fournissent un mécanisme de résistance, mais celle-ci peut aussi résulter de mutations ou d'une expression réduite de la protéine ciblée. La surexpression ou la localisation nucléaire de la Y-Box binding (YB-1) protéine est considérée comme un marqueur pronostique de chimiorésistance de la tumeur. YB-1 interagit avec plusieurs partenaires ; dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur son interaction avec l'enzyme de réparation de l'ADN NTH1 (hNTH1) et l'ADN topoisomérase I (hTopoI), deux enzymes stimulées par YB-1. L'abondance du complexe hNTH1/YB-1 est accrue dans les cellules tumorales résistantes au cisplatine. La TopoI humaine est une enzyme essentielle impliquée dans la régulation cellulaire du surenroulement de l'ADN et est la cible de plusieurs agents anticancéreux. YB-1 augmente la sensibilité à l'inhibiteur de TopoI, la camptothécine, dans les tumeurs. Nous avons caractérisé les complexes YB-1/hNTH1 et YB-1/hTopoI in vitro et in vivo en utilisant des mesures de transfert d'énergie par résonance en fluorescence (ou FRET) pour identifier et développer de nouvelles stratégies pour le traitement de tumeurs chimio-résistantes. Nous avons développé et optimisé un biosenseur original basé sur le FRET pour cribler deux chimiothèques de taille moyenne afin d’identifier des inhibiteurs potentiels du complexe hNTH1/YB-1. Plusieurs «hits» ont été identifiés qui réduisent de façon significative le niveau de FRET de notre biosenseur. Pour certains de ces composés, nous avons reproduit ces résultats à partir de poudres, effectué des courbes dose-réponse et validé leurs actions en tant qu'inhibiteurs de l'interface hNTH1/YB-1 en utilisant d'autres tests d’interactions. Ensemble nos résultats démontrent que YB-1 interagit directement et stimule des enzymes de la réparation de l'ADN et du relaxation de l’ADN, et que cibler l’interface YB-1/hNTH1 représente une nouvelle stratégie intéressante pour le développement de traitements anticancéreux. / Acquired resistance to anti-cancer therapy is common and is a major clinical issue. Functional DNA repair pathways provide a common mechanism for drug resistance, but it can also result from mutations or reduced expression of the targeted protein. The overexpression or nuclear localisation of the multifunctional Y-box binding protein (YB-1) is considered as a prognostic marker for drug resistance in tumours. YB-1 has several interaction partners in cells; in this study, we have focused on its interaction with the human DNA repair enzyme NTH1 (hNTH1) and human DNA topoisomerase I (hTopoI), two enzymes that have been shown to be stimulated by YB-1. The abundance of the hNTH1/YB-1 complex was shown to increase in cisplatin-resistant tumour cells. Human TopoI is an essential enzyme involved in cellular regulation of DNA supercoiling and is the target of several anti-cancer agents. YB-1 enhances the activity of hTopoI and its sensitivity to hTopoI inhibitor, camptothecin in tumour cells. We have characterised the YB-1/hNTH1 and YB-1/hTopoI complexes in vitro and in vivo using Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) measurements to identify and develop new strategies for the treatment of drug-resistant tumours. We also designed and optimised an original FRET-based biosensor to screen two medium-sized chemical libraries in order to find potential inhibitors of the hNTH1/YB-1 complex. Several “hits” were identified that significantly reduced the FRET level of our biosensor. For some of these compounds, we have reproduced these results starting from powders, have performed dose-response curves and have validated their actions as inhibitors of the hNTH1/YB-1 interface using alternative binding assays. Taken together, our results demonstrate that YB-1 directly interacts and stimulates a DNA repair and a DNA relaxing enzyme and targeting the YB-1/hNTH1 interface represents an interesting new strategy for the development of anti-cancer drugs.

La sclérose systémique (ScS) est une maladie auto-immune d’origine inconnue qui est caractérisée par des atteintes vasculaires, des dérèglements cellulaire et immunitaire. La majorité des patients atteints de ScS possède des auto-anticorps dirigés contre des protéines nucléaires. Ces auto-anticorps sont associés à des manifestations cliniques spécifiques favorisant la classification et le diagnostic de la ScS. Les anti-ADN topoisomérase I (antitopo) sont l’un des principaux auto-anticorps retrouvés dans la ScS. Ils sont associés à la forme la plus grave de la maladie, soit la forme diffuse. Celle-ci se caractérise par une importante fibrose progressant vers une atteinte viscérale. La fibrose résulte d’une production excessive et dérégulée de matrice extracellulaire par les fibroblastes. Bien que les anti-topo soient associés à un très mauvais pronostic et qu’ils corrèlent avec l’activité et la sévérité de la maladie, leur rôle dans la pathogenèse de la ScS n’est pas élucidé. Toutefois, depuis que certains auto-antigènes ont démontré des fonctions additionnelles lorsque retrouvés dans le milieu extracellulaire, leur contribution suscite un intérêt marqué. En effet, ces auto-antigènes, dits bifonctionnels, influencent la physiologie de certaines cellules en se liant à leur surface. Ainsi, la détermination du rôle de ces autoantigènes ouvre la voie pour l’exploration du rôle potentiellement pathogène de leurs autoanticorps. Tout d’abord, nous avons démontré que l’auto-antigène topo, ciblée par les antitopo, pouvait influencer la physiologie du fibroblaste suite à l’activation de voies de signalisations intracellulaires stimulant la migration cellulaire. Nos résultats suggèrent fortement que la topo stimule le fibroblaste suite à son interaction avec le CCR7, un récepteur de chimiokine, présent à sa surface. Nous avons également démontré que la topo utilisait les protéoglycans à chaînes d’héparanes sulfates (HSPG) à titre de corécepteurs. Il avait été démontré que la topo liée à la surface des fibroblastes entraînait le recrutement d’anti-topo, l’adhésion et l’activation monocytaires. Nous avons ici démontré que la présence d’anticorps anti-topo entraîne l’amplification de la liaison de la topo au niveau des HSPG. De ce fait, le complexe immun à la surface des fibroblastes pourrait contribuer à l’initiation d’une cascade inflammatoire propice au développement d’une fibrose, caractéristique de la ScS. En dernier lieu, nos résultats nous ont permis de suggérer l’utilisation de l’héparine et des héparines de bas poids moléculaires comme approche thérapeutique pour la ScS puisqu’elles permettent autant de prévenir la liaison du complexe immun topo/anti-topo au niveau des HSPG que de le dissocier une fois lié. En résumé, notre étude soutient d’abord le rôle actif de l’auto-antigène dans la physiologie des fibroblastes mais également le rôle pathogène des anti-topo en présence de la topo dans la ScS. Finalement, les résultats de notre étude permettent de proposer une approche thérapeutique potentielle pour inhiber le développement d’une cascade inflammatoire et pro-fibrotique. / Systemic sclerosis (SSc) is an autoimmune disease of unknown etiology characterized by vascular damage, cellular and immunological disorders. The vast majority of patient sera are characterized by the presence of autoantibodies directed against nuclear proteins. The autoantibodies are associated with specific clinical manifestations and thus useful for diagnostic and classification of the disease. One of the major autoantibody groups are the anti-DNA topoisomerase I (anti-topo). They are associated with the diffuse form of the disease which is characterized by extensive cutaneous and visceral fibrosis. Increased extracellular matrix synthesis and deposition by fibroblast result in the development of fibrosis. Although anti-topo are associated with the worst form of the disease, correlated with the activity and the severity of SSc, their exact role in the pathogenesis of SSc is controversial and still unravelled. On the other hand, there is now strong evidence for active contribution of autoantigens, targeted by autoantibodies, in autoimmune diseases. Indeed, numerous cells have been shown to be influenced by the interaction of autoantigens with their cognate receptors present on their surface. These autoantigens display cytokine-like effects toward their target cell and are called bifunctional autoantigen. Hence, determination of the exact role of these autoantigens and characterization of their interaction with their target cell may open up research perspectives for the elucidation of the potential pathogenic role of their autoantibodies. In our study, we demonstrated that topo activates intracellular signaling pathways leading to the stimulation of fibroblast migration. We undertook experiments to characterize the interaction of the autoantigen topo with fibroblasts responsible of these cellular effects. Our results strongly suggest a direct interaction of topo with CCR7, a chemokine receptor, present on the surface of fibroblasts. Heparan sulfate proteoglycans (HSPG), abundantly present on fibroblast surfaces, were found to act as coreceptors for topo binding. Previous work has demonstrated that once bound to fibroblast surfaces, topo recruits anti-topo autoantibodies, which subsequently lead to adhesion and activation of monocytes. Here, we demonstrated that anti-topo autoantibodies from SSc sera lead to the amplification of topo binding to HSPG on fibroblast surfaces. The binding of topo/anti-topo IC could mediate the initiation and maintenance of an inflammatory cascade and further fibrosis development. Hence, perturbing the binding of topo/anti-topo immune complexes to HSPG became an interesting therapeutic approach. Heparin and low molecular weight heparins were found to prevent the binding of topo and topo/anti-topo immune complexes to the fibroblast surfaces. Moreover, topo/anti-topo immune complexes could be dissociated from fibroblast surfaces by these molecules. Hence, the prevention of topo/anti-topo immune complexes binding to HS chains could result in the absence of the inflammatory cascade initiation. Overall, our results support an active role for topo as a bifunctional autoantigen toward fibroblasts and a pathogenic role for anti-topo autoantibodies in SSc. Finally, a potential therapeutic approach is proposed which could target inflammatory and fibrotic development characteristic of SSc.

La sclérose systémique (ScS) est une maladie auto-immune d’origine inconnue qui est caractérisée par des atteintes vasculaires, des dérèglements cellulaire et immunitaire. La majorité des patients atteints de ScS possède des auto-anticorps dirigés contre des protéines nucléaires. Ces auto-anticorps sont associés à des manifestations cliniques spécifiques favorisant la classification et le diagnostic de la ScS. Les anti-ADN topoisomérase I (antitopo) sont l’un des principaux auto-anticorps retrouvés dans la ScS. Ils sont associés à la forme la plus grave de la maladie, soit la forme diffuse. Celle-ci se caractérise par une importante fibrose progressant vers une atteinte viscérale. La fibrose résulte d’une production excessive et dérégulée de matrice extracellulaire par les fibroblastes. Bien que les anti-topo soient associés à un très mauvais pronostic et qu’ils corrèlent avec l’activité et la sévérité de la maladie, leur rôle dans la pathogenèse de la ScS n’est pas élucidé. Toutefois, depuis que certains auto-antigènes ont démontré des fonctions additionnelles lorsque retrouvés dans le milieu extracellulaire, leur contribution suscite un intérêt marqué. En effet, ces auto-antigènes, dits bifonctionnels, influencent la physiologie de certaines cellules en se liant à leur surface. Ainsi, la détermination du rôle de ces autoantigènes ouvre la voie pour l’exploration du rôle potentiellement pathogène de leurs autoanticorps. Tout d’abord, nous avons démontré que l’auto-antigène topo, ciblée par les antitopo, pouvait influencer la physiologie du fibroblaste suite à l’activation de voies de signalisations intracellulaires stimulant la migration cellulaire. Nos résultats suggèrent fortement que la topo stimule le fibroblaste suite à son interaction avec le CCR7, un récepteur de chimiokine, présent à sa surface. Nous avons également démontré que la topo utilisait les protéoglycans à chaînes d’héparanes sulfates (HSPG) à titre de corécepteurs. Il avait été démontré que la topo liée à la surface des fibroblastes entraînait le recrutement d’anti-topo, l’adhésion et l’activation monocytaires. Nous avons ici démontré que la présence d’anticorps anti-topo entraîne l’amplification de la liaison de la topo au niveau des HSPG. De ce fait, le complexe immun à la surface des fibroblastes pourrait contribuer à l’initiation d’une cascade inflammatoire propice au développement d’une fibrose, caractéristique de la ScS. En dernier lieu, nos résultats nous ont permis de suggérer l’utilisation de l’héparine et des héparines de bas poids moléculaires comme approche thérapeutique pour la ScS puisqu’elles permettent autant de prévenir la liaison du complexe immun topo/anti-topo au niveau des HSPG que de le dissocier une fois lié. En résumé, notre étude soutient d’abord le rôle actif de l’auto-antigène dans la physiologie des fibroblastes mais également le rôle pathogène des anti-topo en présence de la topo dans la ScS. Finalement, les résultats de notre étude permettent de proposer une approche thérapeutique potentielle pour inhiber le développement d’une cascade inflammatoire et pro-fibrotique. / Systemic sclerosis (SSc) is an autoimmune disease of unknown etiology characterized by vascular damage, cellular and immunological disorders. The vast majority of patient sera are characterized by the presence of autoantibodies directed against nuclear proteins. The autoantibodies are associated with specific clinical manifestations and thus useful for diagnostic and classification of the disease. One of the major autoantibody groups are the anti-DNA topoisomerase I (anti-topo). They are associated with the diffuse form of the disease which is characterized by extensive cutaneous and visceral fibrosis. Increased extracellular matrix synthesis and deposition by fibroblast result in the development of fibrosis. Although anti-topo are associated with the worst form of the disease, correlated with the activity and the severity of SSc, their exact role in the pathogenesis of SSc is controversial and still unravelled. On the other hand, there is now strong evidence for active contribution of autoantigens, targeted by autoantibodies, in autoimmune diseases. Indeed, numerous cells have been shown to be influenced by the interaction of autoantigens with their cognate receptors present on their surface. These autoantigens display cytokine-like effects toward their target cell and are called bifunctional autoantigen. Hence, determination of the exact role of these autoantigens and characterization of their interaction with their target cell may open up research perspectives for the elucidation of the potential pathogenic role of their autoantibodies. In our study, we demonstrated that topo activates intracellular signaling pathways leading to the stimulation of fibroblast migration. We undertook experiments to characterize the interaction of the autoantigen topo with fibroblasts responsible of these cellular effects. Our results strongly suggest a direct interaction of topo with CCR7, a chemokine receptor, present on the surface of fibroblasts. Heparan sulfate proteoglycans (HSPG), abundantly present on fibroblast surfaces, were found to act as coreceptors for topo binding. Previous work has demonstrated that once bound to fibroblast surfaces, topo recruits anti-topo autoantibodies, which subsequently lead to adhesion and activation of monocytes. Here, we demonstrated that anti-topo autoantibodies from SSc sera lead to the amplification of topo binding to HSPG on fibroblast surfaces. The binding of topo/anti-topo IC could mediate the initiation and maintenance of an inflammatory cascade and further fibrosis development. Hence, perturbing the binding of topo/anti-topo immune complexes to HSPG became an interesting therapeutic approach. Heparin and low molecular weight heparins were found to prevent the binding of topo and topo/anti-topo immune complexes to the fibroblast surfaces. Moreover, topo/anti-topo immune complexes could be dissociated from fibroblast surfaces by these molecules. Hence, the prevention of topo/anti-topo immune complexes binding to HS chains could result in the absence of the inflammatory cascade initiation. Overall, our results support an active role for topo as a bifunctional autoantigen toward fibroblasts and a pathogenic role for anti-topo autoantibodies in SSc. Finally, a potential therapeutic approach is proposed which could target inflammatory and fibrotic development characteristic of SSc.

We report the use of thin film poly(dimethylsiloxane) (PDMS) prints for the arrayed mass production of highly uniform 3-D human HT29 colon carcinoma spheroids. The spheroids have an organotypic density and, as determined by 3-axis imaging, were genuinely spherical. Critically, the array density impacts growth kinetics and can be tuned to produce spheroids ranging in diameter from 200 to 550 µm. The diffusive limit of competition for media occurred with a pitch of ≥1250 µm and was used for the optimal array-based culture of large, viable spheroids. During sustained culture mass transfer gradients surrounding and within the spheroids are established, and lead to growth cessation, altered expression patterns and the formation of a central secondary necrosis. These features reflect the microenvironment of avascularised tumours, making the array format well suited for the production of model tumours with defined sizes and thus defined spatio-temporal pathophysiological gradients. Experimental windows, before and after the onset of hypoxia, were identified and used with an enzyme activity-based viability assay to measure the chemosensitivity towards irinotecan. Compared to monolayer cultures, a marked reduction in the drug efficacy towards the different spheroid culture states was observed and attributed to cell cycle arrest, the 3-D character, scale and/or hypoxia factors. In summary, spheroid culture using the array format has great potential to support drug discovery and development, as well as tumour biology research. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Le surenroulement de l’ADN est important pour tous les processus cellulaires qui requièrent la séparation des brins de l’ADN. Il est régulé par l’activité enzymatique des topoisomérases. La gyrase (gyrA et gyrB) utilise l’ATP pour introduire des supertours négatifs dans l’ADN, alors que la topoisomérase I (topA) et la topoisomérase IV (parC et parE) les éliminent. Les cellules déficientes pour la topoisomérase I sont viables si elles ont des mutations compensatoires dans un des gènes codant pour une sous-unité de la gyrase. Ces mutations réduisent le niveau de surenroulement négatif du chromosome et permettent la croissance bactérienne. Une de ces mutations engendre la production d'une gyrase thermosensible. L’activité de surenroulement de la gyrase en absence de la topoisomérase I cause l’accumulation d’ADN hyper-surenroulé négativement à cause de la formation de R-loops. La surproduction de la RNase HI (rnhA), une enzyme qui dégrade l’ARN des R-loops, permet de prévenir l’accumulation d’un excès de surenroulement négatif. En absence de RNase HI, des R-loops sont aussi formés et peuvent être utilisés pour déclencher la réplication de l’ADN indépendamment du système normal oriC/DnaA, un phénomène connu sous le nom de « constitutive stable DNA replication » (cSDR). Pour mieux comprendre le lien entre la formation de R-loops et l’excès de surenroulement négatif, nous avons construit un mutant conditionnel topA rnhA gyrB(Ts) avec l’expression inductible de la RNase HI à partir d’un plasmide. Nous avons trouvé que l’ADN des cellules de ce mutant était excessivement relâché au lieu d'être hypersurenroulé négativement en conditions de pénurie de RNase HI. La relaxation de l’ADN a été montrée comme étant indépendante de l'activité de la topoisomérase IV. Les cellules du triple mutant topA rnhA gyrB(Ts) forment de très longs filaments remplis d’ADN, montrant ainsi un défaut de ségrégation des chromosomes. La surproduction de la topoisomérase III (topB), une enzyme qui peut effectuer la décaténation de l’ADN, a corrigé les problèmes de ségrégation sans toutefois restaurer le niveau de surenroulement de l’ADN. Nous avons constaté que des extraits protéiques du mutant topA rnhA gyrB(Ts) pouvaient inhiber l’activité de surenroulement négatif de la gyrase dans des extraits d’une souche sauvage, suggérant ainsi que la pénurie de RNase HI avait déclenché une réponse cellulaire d’inhibition de cette activité de la gyrase. De plus, des expériences in vivo et in vitro ont montré qu’en absence de RNase HI, l’activité ATP-dépendante de surenroulement négatif de la gyrase était inhibée, alors que l’activité ATP-indépendante de cette enzyme demeurait intacte. Des suppresseurs extragéniques du défaut de croissance du triple mutant topA rnhA gyrB(Ts) qui corrigent également les problèmes de surenroulement et de ségrégation des chromosomes ont pour la plupart été cartographiés dans des gènes impliqués dans la réplication de l’ADN, le métabolisme des R-loops, ou la formation de fimbriae. La deuxième partie de ce projet avait pour but de comprendre les rôles des topoisomérases de type IA (topoisomérase I et topoisomérase III) dans la ségrégation et la stabilité du génome de Escherichia coli. Pour étudier ces rôles, nous avons utilisé des approches de génétique combinées avec la cytométrie en flux, l’analyse de type Western blot et la microscopie. Nous avons constaté que le phénotype Par- et les défauts de ségrégation des chromosomes d’un mutant gyrB(Ts) avaient été corrigés en inactivant topA, mais uniquement en présence du gène topB. En outre, nous avons démontré que la surproduction de la topoisomérase III pouvait corriger le phénotype Par- du mutant gyrB(Ts) sans toutefois corriger les défauts de croissance de ce dernier. La surproduction de topoisomérase IV, enzyme responsable de la décaténation des chromosomes chez E. coli, ne pouvait pas remplacer la topoisomérase III. Nos résultats suggèrent que les topoisomérases de type IA jouent un rôle important dans la ségrégation des chromosomes lorsque la gyrase est inefficace. Pour étudier le rôle des topoisomérases de type IA dans la stabilité du génome, la troisième partie du projet, nous avons utilisé des approches génétiques combinées avec des tests de « spot » et la microscopie. Nous avons constaté que les cellules déficientes en topoisomérase I avaient des défauts de ségrégation de chromosomes et de croissance liés à un excès de surenroulement négatif, et que ces défauts pouvaient être corrigés en inactivant recQ, recA ou par la surproduction de la topoisomérase III. Le suppresseur extragénique oriC15::aph isolé dans la première partie du projet pouvait également corriger ces problèmes. Les cellules déficientes en topoisomérases de type IA formaient des très longs filaments remplis d’ADN d’apparence diffuse et réparti inégalement dans la cellule. Ces phénotypes pouvaient être partiellement corrigés par la surproduction de la RNase HI ou en inactivant recA, ou encore par des suppresseurs isolés dans la première partie du projet et impliques dans le cSDR (dnaT18::aph et rne59::aph). Donc, dans E. coli, les topoisomérases de type IA jouent un rôle dans la stabilité du génome en inhibant la réplication inappropriée à partir de oriC et de R-loops, et en empêchant les défauts de ségrégation liés à la recombinaison RecA-dépendante, par leur action avec RecQ. Les travaux rapportés ici révèlent que la réplication inappropriée et dérégulée est une source majeure de l’instabilité génomique. Empêcher la réplication inappropriée permet la ségrégation des chromosomes et le maintien d’un génome stable. La RNase HI et les topoisomérases de type IA jouent un rôle majeur dans la prévention de la réplication inappropriée. La RNase HI réalise cette tâche en modulant l’activité de surenroulement ATP-dependante de la gyrase, et en empêchant la réplication à partir des R-loops. Les topoisomérases de type IA assurent le maintien de la stabilité du génome en empêchant la réplication inappropriée à partir de oriC et des R-loops et en agissant avec RecQ pour résoudre des intermédiaires de recombinaison RecA-dépendants afin de permettre la ségrégation des chromosomes. / DNA supercoiling is important for all cellular processes that require strand separation and is regulated by the opposing enzymatic effects of DNA topoisomerases. Gyrase uses ATP to introduce negative supercoils while topoisomerase I (topA) and topoisomerase IV relax negative supercoils. Cells lacking topoisomerase I are only viable if they have compensatory mutations in gyrase genes that reduce the negative supercoiling level of the chromosome to allow bacterial growth. One such mutation leads to the production of a thermosensitive gyrase (gyrB(Ts)). Gyrase driven supercoiling during transcription in the absence of topoisomerase I causes the accumulation of hypernegatively supercoiled plasmid DNAs due to the formation of R-loops. Overproducing RNase HI (rnhA), an enzyme that degrades the RNA moiety of R-loops, prevents the accumulation of hypernegative supercoils. In the absence of RNase HI alone, R-loops are equally formed and can be used to prime DNA replication independently of oriC/DnaA, a phenomenon known as constitutive stable DNA replication (cSDR). To better understand the link between R-loop formation and hypernegative supercoiling, we constructed a conditional topA rnhA gyrB(Ts) mutant with RNase HI being conditionally expressed from a plasmid borne gene. We found that the DNA of topA rnhA gyrB(Ts) cells was extensively relaxed instead of being hypernegatively supercoiled following the depletion of RNase HI. Relaxation was found to be unrelated to the activity of topoisomerase IV. Cells of topA rnhA gyrB(Ts) formed long filaments full of DNA, consistent with segregation defect. Overproducing topoisomerase III (topB), an enzyme that can perform decatenation, corrected the segregation problems without restoring supercoiling. We found that extracts of topA rnhA gyrB(Ts) cells inhibited gyrase supercoiling activity of wild type cells extracts in vitro, suggesting that the depletion of RNase HI triggered a cell response that inhibited the supercoiling activity of gyrase. Gyrase supercoiling assays in vivo as well as in crude cell extracts revealed that the ATP dependent supercoiling reaction of gyrase was inhibited while the ATP independent relaxation reaction was unaffected. Genetic suppressors of a triple topA rnhA gyrB(Ts) strain that restored supercoiling and corrected the chromosome segregation defects mostly mapped to genes that affected DNA replication, R-loop metabolism and fimbriae formation. The second part of this project aimed at understanding the roles of type IA DNA topoisomerases (topoisomerase I and topoisomerase III) in chromosome segregation and genome maintenance in E. coli. To investigate the role of type IA DNA topoisomerases in chromosome segregation we employed genetic approaches combined with flow cytometry, Western blot analysis and microscopy (for the examination of cell morphology). We found that the Par- phenotypes (formation of large unsegregated nucleoid in midcell) and chromosome segregation defects of a gyrB(Ts) mutant at the nonpermissive temperature were corrected by deleting topA only in the presence of topB. Moreover, overproducing topoisomerase III was shown to correct the Par- phenotype without correcting the growth defect, but overproducing topoisomerase IV, the major cellular decatenase, failed to correct the defects. Our results suggest that type IA topoisomerases play a role in chromosome segregation when gyrase is inefficient. To investigate the role of type IA DNA topoisomerases in genome maintenance, in the third part of the project, we employed genetic approaches combined with suppressor screens, spot assays and microscopy. We found that cells lacking topoisomerase I suffered from supercoiling-dependent growth defects and chromosome segregation defects that could be corrected by deleting recQ, recA or overproducing topoisomerase III and by an oriC15::aph suppressor mutation isolated in the first part of the project. Cells lacking both type 1A topoisomerases formed very long filaments packed with diffuse and unsegregated DNA. Such phenotypes could be partially corrected by overproducing RNase HI or deleting recA, or by suppressor mutations isolated in the first part of the project, that affected cSDR (dnaT18::aph and rne59::aph). Thus, in E. coli, type IA DNA topoisomerases play a role in genome maintenance by inhibiting inappropriate replication from oriC and R-loops and by preventing RecA-dependent chromosome segregation defect through their action with RecQ. The work reported here reveals that inappropriate and unregulated replication is a major source of genome instability. Preventing such replication will ensures proper chromosome segregation leading to a stable genome. RNase HI and type IA DNA topoisomerases play a leading role in preventing unregulated replication. RNase HI achieves this role by modulating ATP dependent gyrase activity and by preventing replication from R-loops (cSDR). Type IA DNA topoisomerases ensure the maintenance of a stable genome by preventing inappropriate replication from oriC and R-loops and by acting with RecQ to prevent RecA dependent-chromosome segregation defects.

La sclérodermie (SSc) est une maladie rare affectant les personnes génétiquement prédisposées d’une réponse immunitaire défectueuse. Malgré les derniers avancements et développements dans le domaine, l’étiologie et la pathogénèse de la maladie demeurent peu comprises. Par ailleurs, il y a un ralentissement dans la compréhension de cette maladie à cause du manque de modèle animal représentatif de la SSc humaine. Malgré plusieurs lacunes, les souris traitées avec la bléomycine ou portant des modifications génétiques (TSK-1) sont très utilisées dans les études précliniques de la SSc mais elles ne présentent pas toutes les caractéristiques de cette maladie. Pour contribuer à la recherche sur la SSc, la stagiaire postdoctorale Dre Heena Mehta a développé dans le laboratoire du Dre Sarfati en collaboration avec le Dr Senécal, un modèle de souris expérimental induit par l’immunisation de cellules dendritiques (DCs) chargées de peptides de la protéine topoisomérase I (TOPOIA et TOPOIB). Dans le but de caractériser ce modèle murin et d’établir un profil immunitaire, j’ai concentré mes analyses principalement sur les caractéristiques de la SSc telles que la fibrose, l’inflammation, l’hyper-γ-globulinémie polyclonale, la vasculopathie ainsi que de l’expression de cytokines. Brièvement, l’immunisation de souris avec les DCs chargées avec la topoisomérase I (TOPOI) a induit l’inflammation pulmonaire et cutanée, en plus de la fibrose sous forme diffuse (dcSSc). Les souris présentaient également des symptômes de la vasculopathie ainsi que des taux élevés d’anticorps polyclonaux. Les résultats démontraient que les peptides TOPOIA étaient efficaces dans l’induction de la fibrose et de la réponse inflammatoire alors que les peptides TOPOIB étaient surtout impliqués dans la fibrose cutanée. En plus de nos résultats, les observations préliminaires sur le profil de cytokines tissulaires suggéraient que ce modèle pourrait remplacer ou complémenter les autres modèles animaux de SSc. / Systemic sclerosis (SSc) is a rare disease of unknown etiology that affects people that have a genetic predisposition to autoimmunity. Despite the latest advancement and development in the field, the mechanisms underlying disease development remain poorly understood. The lack of animal model that encompasses the cardinal features of human systemic sclerosis is a major cause of the slowdown in the understanding of this disease. In fact, some mouse models such as the bleomycin induced-SSc and TSK-1 mouse are widely used in preclinical studies of scleroderma. However, these models have several shortcomings since these mice do not display all the cardinal features of the disease found in humans. To contribute to the research of SSc, postdoctoral fellow Dre Heena Mehta has developed in Dre Sarfati’s laboratory in collaboration with Dr Senécal, an experimental murine model of SSc induced by dendritic cells loaded with topoisomerase I peptide. In order to characterise the model and establish an immune profile of our experimental mice, my analysis focused mainly on the cardinal features of scleroderma such as fibrosis, inflammation and polyclonal hyper-γ-globulinemia, vasculopathy and cytokines gene expression. Hence, immunization with dendritic cells loaded topoisomerase I peptides (TOPOIA and TOPOIB) induced pulmonary and dermal inflammation together with diffuse form of fibrosis. The mice also showed symptoms of vasculopathy and high levels of polyclonal antibodies. These results showed that TOPOIA peptides are effective in inducing fibrosis and inflammatory response while TOPOIB peptides are involved in skin fibrosis. Together with the results, the preliminary data on cytokine profile in tissue suggested that our mouse model could possibly replace/complement other current animal models of scleroderma.

Des variations importantes du surenroulement de l’ADN peuvent être générées durant la phase d’élongation de la transcription selon le modèle du « twin supercoiled domain ». Selon ce modèle, le déplacement du complexe de transcription génère du surenroulement positif à l’avant, et du surenroulement négatif à l’arrière de l’ARN polymérase. Le rôle essentiel de la topoisomérase I chez Escherichia coli est de prévenir l’accumulation de ce surenroulement négatif générée durant la transcription. En absence de topoisomérase I, l’accumulation de ce surenroulement négatif favorise la formation de R-loops qui ont pour conséquence d’inhiber la croissance bactérienne. Les R-loops sont des hybrides ARN-ADN qui se forment entre l’ARN nouvellement synthétisé et le simple brin d’ADN complémentaire. Dans les cellules déficientes en topoisomérase I, des mutations compensatoires s’accumulent dans les gènes qui codent pour la gyrase, réduisant le niveau de surenroulement négatif du chromosome et favorisant la croissance. Une des ces mutations est une gyrase thermosensible qui s’exprime à 37 °C. La RNase HI, une enzyme qui dégrade la partie ARN d’un R-loop, peut aussi restaurer la croissance en absence de topoisomérase I lorsqu’elle est produite en très grande quantité par rapport à sa concentration physiologique. En présence de topoisomérase I, des R-loops peuvent aussi se former lorsque la RNase HI est inactive. Dans ces souches mutantes, les R-loops induisent la réponse SOS et la réplication constitutive de l’ADN (cSDR). Dans notre étude, nous montrons comment les R-loops formés en absence de topoisomérase I ou RNase HI peuvent affecter négativement la croissance des cellules. Lorsque la topoisomérase I est inactivée, l’accumulation d’hypersurenroulement négatif conduit à la formation de nombreux R-loops, ce qui déclenche la dégradation de l’ARN synthétisé. Issus de la dégradation de l’ARNm de pleine longueur, des ARNm incomplets et traductibles s’accumulent et causent l’inhibition de la synthèse protéique et de la croissance. Le processus par lequel l’ARN est dégradé n’est pas encore complètement élucidé, mais nos résultats soutiennent fortement que la RNase HI présente en concentration physiologique est responsable de ce phénotype. Chose importante, la RNase E qui est l’endoribonuclease majeure de la cellule n’est pas impliquée dans ce processus, et la dégradation de l’ARN survient avant son action. Nous montrons aussi qu’une corrélation parfaite existe entre la concentration de RNase HI, l’accumulation d’hypersurenroulement négatif et l’inhibition de la croissance bactérienne. Lorsque la RNase HI est en excès, l’accumulation de surenroulement négatif est inhibée et la croissance n’est pas affectée. L’inverse se produit Lorsque la RNase HI est en concentration physiologique. En limitant l’accumulation d’hypersurenroulement négatif, la surproduction de la RNase HI prévient alors la dégradation de l’ARN et permet la croissance. Quand la RNase HI est inactivée en présence de topoisomérase I, les R-loops réduisent le niveau d’expression de nombreux gènes, incluant des gènes de résistance aux stress comme rpoH et grpE. Cette inhibition de l’expression génique n’est pas accompagnée de la dégradation de l’ARN contrairement à ce qui se produit en absence de topoisomérase I. Dans le mutant déficient en RNase HI, la diminution de l’expression génique réduit la concentration cellulaire de différentes protéines, ce qui altère négativement le taux de croissance et affecte dramatiquement la survie des cellules exposées aux stress de hautes températures et oxydatifs. Une inactivation de RecA, le facteur essentiel qui déclenche la réponse SOS et le cSDR, ne restaure pas l’expression génique. Ceci démontre que la réponse SOS et le cSDR ne sont pas impliqués dans l’inhibition de l’expression génique en absence de RNase HI. La croissance bactérienne qui est inhibée en absence de topoisomérase I, reprend lorsque l’excès de surenroulement négatif est éliminé. En absence de RNase HI et de topoisomérase I, le surenroulement négatif est très relaxé. Il semble que la réponse cellulaire suite à la formation de R-loops, soit la relaxation du surenroulement négatif. Selon le même principe, des mutations compensatoires dans la gyrase apparaissent en absence de topoisomérase I et réduisent l’accumulation de surenroulement négatif. Ceci supporte fortement l’idée que le surenroulement négatif joue un rôle primordial dans la formation de R-loop. La régulation du surenroulement négatif de l’ADN est donc une tâche essentielle pour la cellule. Elle favorise notamment l’expression génique optimale durant la croissance et l’exposition aux stress, en limitant la formation de R-loops. La topoisomérase I et la RNase HI jouent un rôle important et complémentaire dans ce processus. / Important fluctuations of DNA supercoiling occur during transcription in the frame of the “twin supercoiled domain” model. In this model, transcription elongation generates negative and positive supercoiling respectively, upstream and downstream of the moving RNA polymerase. The major role of bacterial topoisomerase I is to prevent the accumulation of transcription-induced negative supercoiling. In its absence, the accumulation of negative supercoiling triggers R-loop formation which inhibits bacterial growth. R-loops are DNA/RNA hybrids formed during transcription when the nascent RNA hybridizes with the template strand thus, leaving the non-template strand single stranded. In cells lacking DNA topoisomerase I, a constant and selective pressure for the acquisition of compensatory mutations in gyrase genes reduces the negative supercoiling level of the chromosome and allows growth. One of these mutations is a thermosensitive gyrase expressed at 37 °C. The overexpression of RNase HI, an enzyme that degrades the RNA moiety of an R-loop, is also able to correct growth inhibition in absence of topoisomerase I. In the presence of topoisomerase I, R-loops can also form when RNase HI is lacking. In these mutants, R-loop formation induces SOS and constitutive stable DNA replication (cSDR). In our study, we show how R-loops formed in cells lacking topoisomerase I or RNase HI can affect bacterial growth. When topoisomerase I is inactivated, the accumulation of hypernegative supercoiling inhibits growth by causing extensive R-loop formation which, in turn, can lead to RNA degradation. As a result of RNA degradation, the accumulation of truncated and functional mRNA instead of full length ones, is responsible for protein synthesis inhibition that alters bacterial growth. The mechanism by which RNA is degraded is not completely clear but our results strongly suggest that RNase HI is involved in this process. More importantly, the major endoribonuclease, RNase E, is not involved in RNA degradation because RNA is degraded before its action. We show also that there is a perfect correlation between RNase HI concentration, the accumulation of hypernegative supercoiling and bacterial growth inhibition. When RNase HI is in excess, no accumulation of hypernegative supercoiling and growth inhibition are observed. The opposite is true when RNase HI is at its wild type level. By preventing the accumulation of hypernegative supercoiling, the overproduction of RNase HI inhibits extensive R-loop formation and RNA degradation, thus, allowing growth. In absence of RNase HI (rnhA) and in presence of topoisomerase I, R-loops are also responsible for an inhibition in gene expression, including stress genes such as rpoH and grpE. The inhibition of gene expression is not related to RNA degradation as seen in absence of topoisomerase I but it is rather related to a reduction in gene expression. In absence of RNase HI, the diminution of genes expression is responsible for a reduction in the cellular level of proteins, which negatively affects bacterial growth and bacterial survival to heat shock and oxydative stress. Additional mutations in RecA, the protein that activates SOS and cSDR after R-loop formation in rnhA, do not correct this phenotype in rnhA. Thus, SOS and cSDR are not directly involved in the inhibition of gene expression in the absence of RNase HI. In absence of topoisomerase I, growth inhibition resumes when hypernegative supercoiling is reduced. When compared to wild type strains, DNA is very relaxed in absence of RNase HI and topoisomerase I. It seems that R-loop formation induces the relaxation of negatively supercoiled DNA. All this strongly supports the idea that negative supercoiling plays an important role in R-loop formation. Finally, our work shows how essential negative supercoiling regulation is for cell physiology. By preventing R-loop formation, regulation of negative supercoiling allows optimal gene expression, which is crucial for cellular growth and for stress survival. Both topoisomerase I and RNase HI play an important and complementary role in this process.

Le surenroulement de l’ADN est important pour tous les processus cellulaires qui requièrent la séparation des brins de l’ADN. Il est régulé par l’activité enzymatique des topoisomérases. La gyrase (gyrA et gyrB) utilise l’ATP pour introduire des supertours négatifs dans l’ADN, alors que la topoisomérase I (topA) et la topoisomérase IV (parC et parE) les éliminent. Les cellules déficientes pour la topoisomérase I sont viables si elles ont des mutations compensatoires dans un des gènes codant pour une sous-unité de la gyrase. Ces mutations réduisent le niveau de surenroulement négatif du chromosome et permettent la croissance bactérienne. Une de ces mutations engendre la production d'une gyrase thermosensible. L’activité de surenroulement de la gyrase en absence de la topoisomérase I cause l’accumulation d’ADN hyper-surenroulé négativement à cause de la formation de R-loops. La surproduction de la RNase HI (rnhA), une enzyme qui dégrade l’ARN des R-loops, permet de prévenir l’accumulation d’un excès de surenroulement négatif. En absence de RNase HI, des R-loops sont aussi formés et peuvent être utilisés pour déclencher la réplication de l’ADN indépendamment du système normal oriC/DnaA, un phénomène connu sous le nom de « constitutive stable DNA replication » (cSDR). Pour mieux comprendre le lien entre la formation de R-loops et l’excès de surenroulement négatif, nous avons construit un mutant conditionnel topA rnhA gyrB(Ts) avec l’expression inductible de la RNase HI à partir d’un plasmide. Nous avons trouvé que l’ADN des cellules de ce mutant était excessivement relâché au lieu d'être hypersurenroulé négativement en conditions de pénurie de RNase HI. La relaxation de l’ADN a été montrée comme étant indépendante de l'activité de la topoisomérase IV. Les cellules du triple mutant topA rnhA gyrB(Ts) forment de très longs filaments remplis d’ADN, montrant ainsi un défaut de ségrégation des chromosomes. La surproduction de la topoisomérase III (topB), une enzyme qui peut effectuer la décaténation de l’ADN, a corrigé les problèmes de ségrégation sans toutefois restaurer le niveau de surenroulement de l’ADN. Nous avons constaté que des extraits protéiques du mutant topA rnhA gyrB(Ts) pouvaient inhiber l’activité de surenroulement négatif de la gyrase dans des extraits d’une souche sauvage, suggérant ainsi que la pénurie de RNase HI avait déclenché une réponse cellulaire d’inhibition de cette activité de la gyrase. De plus, des expériences in vivo et in vitro ont montré qu’en absence de RNase HI, l’activité ATP-dépendante de surenroulement négatif de la gyrase était inhibée, alors que l’activité ATP-indépendante de cette enzyme demeurait intacte. Des suppresseurs extragéniques du défaut de croissance du triple mutant topA rnhA gyrB(Ts) qui corrigent également les problèmes de surenroulement et de ségrégation des chromosomes ont pour la plupart été cartographiés dans des gènes impliqués dans la réplication de l’ADN, le métabolisme des R-loops, ou la formation de fimbriae. La deuxième partie de ce projet avait pour but de comprendre les rôles des topoisomérases de type IA (topoisomérase I et topoisomérase III) dans la ségrégation et la stabilité du génome de Escherichia coli. Pour étudier ces rôles, nous avons utilisé des approches de génétique combinées avec la cytométrie en flux, l’analyse de type Western blot et la microscopie. Nous avons constaté que le phénotype Par- et les défauts de ségrégation des chromosomes d’un mutant gyrB(Ts) avaient été corrigés en inactivant topA, mais uniquement en présence du gène topB. En outre, nous avons démontré que la surproduction de la topoisomérase III pouvait corriger le phénotype Par- du mutant gyrB(Ts) sans toutefois corriger les défauts de croissance de ce dernier. La surproduction de topoisomérase IV, enzyme responsable de la décaténation des chromosomes chez E. coli, ne pouvait pas remplacer la topoisomérase III. Nos résultats suggèrent que les topoisomérases de type IA jouent un rôle important dans la ségrégation des chromosomes lorsque la gyrase est inefficace. Pour étudier le rôle des topoisomérases de type IA dans la stabilité du génome, la troisième partie du projet, nous avons utilisé des approches génétiques combinées avec des tests de « spot » et la microscopie. Nous avons constaté que les cellules déficientes en topoisomérase I avaient des défauts de ségrégation de chromosomes et de croissance liés à un excès de surenroulement négatif, et que ces défauts pouvaient être corrigés en inactivant recQ, recA ou par la surproduction de la topoisomérase III. Le suppresseur extragénique oriC15::aph isolé dans la première partie du projet pouvait également corriger ces problèmes. Les cellules déficientes en topoisomérases de type IA formaient des très longs filaments remplis d’ADN d’apparence diffuse et réparti inégalement dans la cellule. Ces phénotypes pouvaient être partiellement corrigés par la surproduction de la RNase HI ou en inactivant recA, ou encore par des suppresseurs isolés dans la première partie du projet et impliques dans le cSDR (dnaT18::aph et rne59::aph). Donc, dans E. coli, les topoisomérases de type IA jouent un rôle dans la stabilité du génome en inhibant la réplication inappropriée à partir de oriC et de R-loops, et en empêchant les défauts de ségrégation liés à la recombinaison RecA-dépendante, par leur action avec RecQ. Les travaux rapportés ici révèlent que la réplication inappropriée et dérégulée est une source majeure de l’instabilité génomique. Empêcher la réplication inappropriée permet la ségrégation des chromosomes et le maintien d’un génome stable. La RNase HI et les topoisomérases de type IA jouent un rôle majeur dans la prévention de la réplication inappropriée. La RNase HI réalise cette tâche en modulant l’activité de surenroulement ATP-dependante de la gyrase, et en empêchant la réplication à partir des R-loops. Les topoisomérases de type IA assurent le maintien de la stabilité du génome en empêchant la réplication inappropriée à partir de oriC et des R-loops et en agissant avec RecQ pour résoudre des intermédiaires de recombinaison RecA-dépendants afin de permettre la ségrégation des chromosomes. / DNA supercoiling is important for all cellular processes that require strand separation and is regulated by the opposing enzymatic effects of DNA topoisomerases. Gyrase uses ATP to introduce negative supercoils while topoisomerase I (topA) and topoisomerase IV relax negative supercoils. Cells lacking topoisomerase I are only viable if they have compensatory mutations in gyrase genes that reduce the negative supercoiling level of the chromosome to allow bacterial growth. One such mutation leads to the production of a thermosensitive gyrase (gyrB(Ts)). Gyrase driven supercoiling during transcription in the absence of topoisomerase I causes the accumulation of hypernegatively supercoiled plasmid DNAs due to the formation of R-loops. Overproducing RNase HI (rnhA), an enzyme that degrades the RNA moiety of R-loops, prevents the accumulation of hypernegative supercoils. In the absence of RNase HI alone, R-loops are equally formed and can be used to prime DNA replication independently of oriC/DnaA, a phenomenon known as constitutive stable DNA replication (cSDR). To better understand the link between R-loop formation and hypernegative supercoiling, we constructed a conditional topA rnhA gyrB(Ts) mutant with RNase HI being conditionally expressed from a plasmid borne gene. We found that the DNA of topA rnhA gyrB(Ts) cells was extensively relaxed instead of being hypernegatively supercoiled following the depletion of RNase HI. Relaxation was found to be unrelated to the activity of topoisomerase IV. Cells of topA rnhA gyrB(Ts) formed long filaments full of DNA, consistent with segregation defect. Overproducing topoisomerase III (topB), an enzyme that can perform decatenation, corrected the segregation problems without restoring supercoiling. We found that extracts of topA rnhA gyrB(Ts) cells inhibited gyrase supercoiling activity of wild type cells extracts in vitro, suggesting that the depletion of RNase HI triggered a cell response that inhibited the supercoiling activity of gyrase. Gyrase supercoiling assays in vivo as well as in crude cell extracts revealed that the ATP dependent supercoiling reaction of gyrase was inhibited while the ATP independent relaxation reaction was unaffected. Genetic suppressors of a triple topA rnhA gyrB(Ts) strain that restored supercoiling and corrected the chromosome segregation defects mostly mapped to genes that affected DNA replication, R-loop metabolism and fimbriae formation. The second part of this project aimed at understanding the roles of type IA DNA topoisomerases (topoisomerase I and topoisomerase III) in chromosome segregation and genome maintenance in E. coli. To investigate the role of type IA DNA topoisomerases in chromosome segregation we employed genetic approaches combined with flow cytometry, Western blot analysis and microscopy (for the examination of cell morphology). We found that the Par- phenotypes (formation of large unsegregated nucleoid in midcell) and chromosome segregation defects of a gyrB(Ts) mutant at the nonpermissive temperature were corrected by deleting topA only in the presence of topB. Moreover, overproducing topoisomerase III was shown to correct the Par- phenotype without correcting the growth defect, but overproducing topoisomerase IV, the major cellular decatenase, failed to correct the defects. Our results suggest that type IA topoisomerases play a role in chromosome segregation when gyrase is inefficient. To investigate the role of type IA DNA topoisomerases in genome maintenance, in the third part of the project, we employed genetic approaches combined with suppressor screens, spot assays and microscopy. We found that cells lacking topoisomerase I suffered from supercoiling-dependent growth defects and chromosome segregation defects that could be corrected by deleting recQ, recA or overproducing topoisomerase III and by an oriC15::aph suppressor mutation isolated in the first part of the project. Cells lacking both type 1A topoisomerases formed very long filaments packed with diffuse and unsegregated DNA. Such phenotypes could be partially corrected by overproducing RNase HI or deleting recA, or by suppressor mutations isolated in the first part of the project, that affected cSDR (dnaT18::aph and rne59::aph). Thus, in E. coli, type IA DNA topoisomerases play a role in genome maintenance by inhibiting inappropriate replication from oriC and R-loops and by preventing RecA-dependent chromosome segregation defect through their action with RecQ. The work reported here reveals that inappropriate and unregulated replication is a major source of genome instability. Preventing such replication will ensures proper chromosome segregation leading to a stable genome. RNase HI and type IA DNA topoisomerases play a leading role in preventing unregulated replication. RNase HI achieves this role by modulating ATP dependent gyrase activity and by preventing replication from R-loops (cSDR). Type IA DNA topoisomerases ensure the maintenance of a stable genome by preventing inappropriate replication from oriC and R-loops and by acting with RecQ to prevent RecA dependent-chromosome segregation defects.