Les systèmes toxine-antitoxines (TA) sont abondants dans la majorité des génomes bactériens séquencés à ce jour. Ces systèmes codent une toxine stable qui inhibe soit la transcription, soit la traduction, et une antitoxine qui contrecarre l’effet de la toxine par formation d’un complexe avec celle-ci. L’antitoxine est instable suite à sa dégradation continue par les protéases ATP-dépendantes. Afin de maintenir un ratio antitoxine : toxine constant en condition normale de croissance, l’expression des systèmes TA est régulée négativement au niveau transcriptionnel par le complexe toxine-antitoxine. Au début de notre travail, cinq systèmes TA étaient identifiés dans le chromosome d’E. coli. Il avait été montré par notre laboratoire que parmi ces systèmes, seul yefM-yoeB était activé en condition de surproduction de la protéase ATP-dépendante Lon. Ce résultat était surprenant puisque Lon était connue pour dégrader également l’antitoxine RelB du système chromosomique relBE. Un des objectifs de notre travail était de comprendre les mécanismes sous-jacents à cette spécificité. Nous avons montré que l’antitoxine YefM était dégradée à la fois par Lon et les protéases ClpAP et ClpXP. Nous avons également montré qu’en condition de surproduction de Lon, YefM était fortement instable (t1/2~ 10 min. vs 60 min en condition normale). Cette instabilité accrue permet donc l’activation du système yefM-yoeB, c’est-à-dire la libération de la toxine YoeB du complexe qu’elle forme avec YefM. Nous avons également avons montré que le t1/2 de RelB n’était pas affecté par la surproduction de Lon, ce qui explique pourquoi le système relBE n’est pas activé dans ces conditions. Notre hypothèse était qu’un cofacteur soit nécessaire à la dégradation de RelB par Lon et que celui-ci serait limitant dans nos conditions expérimentales. Le crible génétique que nous avons réalisé n’a cependant pas permis d’identifier de cofacteur de dégradation ni de régulateur transcriptionnel en trans du système relBE. Un deuxième volet de notre travail de thèse a consisté en l’étude de la fonction des systèmes TA chromosomiques. L’hypothèse prévalente au début de notre travail était que les systèmes TA soient intégrés dans les voies adaptatives de réponses au stress. Cependant, le résultat de leur activation était controversé. L’hypothèse du groupe de Gerdes était que leur activation mène à un état bactériostatique réversible alors que le groupe d’Engelberg-Kulka montrait que le système mazEF était un système de mort programmée. Afin d’éclaircir le rôle des cinq systèmes TA dans la physiologie d’E. coli, nous avons testé l’effet de nombreux stress sur la croissance et la viabilité de souches sauvages et de souches délétées de ces systèmes. Aucune des conditions que nous avons testées n’a entraîné une diminution de la viabilité excluant de manière définitive l’hypothèse de la mort programmée. De plus, l’inhibition de croissance causée par ces différents stress s’est avérée être indépendante des cinq systèmes, de même que la phase de récupération suivant les différents stress. Enfin, nos expériences de compétition ont clairement démontré que les cinq systèmes ne procuraient aucun avantage sélectif aux bactéries dans des conditions de compétition en carence nutritive. Les systèmes TA étudiés dans ce travail ne jouent donc aucun rôle dans l’adaptation aux stress que nous avons testé puisqu’ils n’améliorent ni l’aptitude (fitness), ni la compétitivité des bactéries dans ces conditions.

Les systèmes toxine-antitoxine (TA) sont composés de deux gènes organisés en opéron retrouvés chez la quasi-totalité des bactéries ainsi que chez les archées. Ils ont été découverts sur des plasmides, où ils induisent une tuerie post-segregationnelle (PSK). En effet, l’antitoxine est instable car elle est dégradée par une protéase ATP dépendante. Lors de la réplication, si un plasmide portant un système TA n’est pas transmis à la cellule fille, celle-ci recevra tout de même une partie du cytoplasme de la cellule mère qui contenait des protéines de toxine et d’antitoxine. Cette dernière étant instable, et sans synthèse de novo, la toxine va se retrouver libre d’affecter sa cible cellulaire. Un système TA crée donc une addiction au plasmide qui le porte, stabilisant celui-ci. Les systèmes TA se retrouvent également, dans un nombre de copies variable, au sein du chromosome. Dans ce cas, plusieurs hypothèses existent quant à leur fonction, comme la mort cellulaire programmée, la réponse au stress, la stabilisation de régions génomiques non essentielles, ou l’anti-addiction au plasmide. L’origine et l’évolution des systèmes TA restent inconnues, alors qu’ils présentent des aspects intrigants. En effet, les toxines CcdB et MazF ont des séquences et des activités toxiques très différentes, malgré une structure proche ; les toxines RelE et ParE présentent des séquences proches, mais des fonctions différentes. À l’heure actuelle, les deux hypothèses concernant l’origine évolutive des systèmes TA sont soit qu’ils seraient tous issus d’un ancêtre commun, soit qu’ils auraient été réinventés plusieurs fois au cours de l’évolution, à partir d’un nombre limité de gènes. Au cours de cette thèse, nous avons abordé la question de l’origine et l’évolution des systèmes TA de plusieurs manières : par la reconstruction de phylogénies et de séquences ancestrales, et par l’étude d’un système chromosomique particulier au sein de nombreuses souches d’Escherichia coli. Enfin, nous nous avons décidé d’analyser le contexte génomique des systèmes TA chromosomiques. Ces travaux ont notamment permis de mieux comprendre l’évolution des systèmes TA, et de conforter l’hypothèse selon laquelle ils seraient des éléments égoïstes, évoluant au sein des génomes sans gain d’aptitude pour l’hôte.

La bactérie Clostridium difficile est maintenant considérée comme un pathogène majeur responsable d'infections nosocomiales en Amérique du Nord et en Europe. De plus, l'émergence de souches hypervirulentes, telle la souche NAP1/027 responsable de récentes épidémies, est un phénomène inquiétant. Un enjeu crucial au cours des prochaines années sera de mieux comprendre les mécanismes de virulence et d'évolution de C. difficile. Les bactériophages (c.-à-d. des virus bactériens, ou phages) sont des joueurs clés dans l'évolution de la plupart des bactéries, pathogènes ou non. Les données concernant l'impact des phages sur C. difficile sont très limitées. Par contre, deux études récentes démontrent que les phages semblent influencer la virulence de C. difficile en altérant la production de toxines TcdA et TcdB. L'objectif de mes travaux de recherche est donc d'étudier au niveau microbiologique et moléculaire les phages de C. difficile et de démontrer leur impact sur l'évolution et la virulence de ce pathogène. Dans ce contexte, plusieurs phages ont été induits à partir d'isolats cliniques de C. difficile. Dans cette collection, un phage en particulier, le (pCD38-2, a été choisi pour la caractérisation subséquente dû à sa divergence génomique par rapport aux autres phages et à sa capacité d'infecter la grande majorité des souches ayant le ribotype hypervirulent (027). Ces caractéristiques uniques ont justifié le séquençage complet de son génome. Par contre, aucun facteur de virulence évident n'a été identifié. À l'opposé, une analyse bio-informatique a permis l'identification d'une région spécifique comportant plusieurs gènes de conversion lysogénique potentiels. L'impact de ces gènes sur la virulence bactérienne reste à être déterminé. De plus, lorsqu'on introduit le phage cpCD38-2 dans la souche sensible CD274, on observe une accumulation plus rapide et plus grande des toxines après 48h dans le surnageant de la culture. Ce phénomène a été confirmé avec des tests ELISA sur des réplicas biologiques indépendants ainsi que par un immunodosage avec anticorps spécifiques aux deux toxines. Par ailleurs, une étude transcriptionelle par PCR en temps réel a permis de constater que le phage (pCD38-2 influence également l'expression des gènes tcdA et tcdB dans le temps. Par contre, l'effet du phage cpCD38-2 est variable lorsqu'on l'introduit dans d'autres souches de C. difficile. Donc, les résultats de nos travaux indiquent que certains phages auraient un impact sur la virulence de C. difficile en altérant la production et la transcription des gènes de toxines. Nos données laissent toutefois sous-entendre que cet effet peut varier selon les souches de C. difficile. [Symboles non conformes]

Les protéines à domaine FIC (Filamentation induced by cAMP) sont très répandues chez les bactéries où elles catalysent l’ajout d’une modification post-traductionnelle contenant un phosphate à une protéine cible, en utilisant différents co-substrats comme l’ATP. Certaines de ces protéines sont des toxines sécrétées par des pathogènes humains, mais la fonction de la plupart d’entre elles reste mystérieuse. Plus d’une dizaine de structures de protéines FIC ont été déterminées récemment, qui ont permis d’élucider leur mécanisme catalytique. L’une des sous-familles de protéines FIC possède un glutamate dans leur site catalytique, dont il a été proposé qu’il aurait une fonction auto-inhibitrice pour la fixation de l’ATP. Durant ma thèse, j’ai étudié la structure et les mécanismes de régulation de deux familles de protéines FIC : les protéines FIC à glutamate inhibiteur, et la toxine AnkX de la bactérie pathogène Legionella pneumophila.La première étude s’est intéressée à la protéine FIC de la bactérie pathogène Enterococcus faecalis (EfFIC), qui fait partie de la sous-famille des protéines FIC possédant un glutamate inhibiteur. J’ai résolu plusieurs structures cristallographique d’EfFIC, qui ont permis de caractériser son site catalytique et comment elle fixe l’AMP et l’ADP. En utilisant une propriété fréquemment observée d’auto-AMPylation (modification par l’AMP), j’ai montré au moyen d’ATP radioactif qu’EfFIC possède une activité basale d’auto-AMPylation, et j’ai identifié une nouvelle activité de dé-AMPylation. En m’inspirant des métaux observés dans mes structures cristallographiques, j’ai montré que l’alternance entre les activités d’AMPylation et de de-AMPylation dépend de la nature du métal fixé dans le site actif et de la présence du glutamate. Ce glutamate régulateur est également présent chez une protéine humaine, HYPE, qui possède une double activité d’AMPylation et dé-AMPylation d’ une chaperone du réticulum endoplasmique. Par un test de fluorescence, j’ai enfin montré que l’activité de HYPE était elle aussi régulée par les métaux comme celle de EfFIC. Ces résultats suggèrent un nouveau modèle de régulation partagé par des protéines FIC de la bactérie à l’homme.La seconde étude a porté sur la toxine AnkX de Legionella pneumophila, qui modifie les petites protéines G de la famille de Rab Rab1 et Rab35 (régulatrices du trafic cellulaire) par une molécule de phosphocholine (PC). En utilisant des liposomes de composition contrôlée, j’ai montré qu’AnkX interagit avec les membranes, et j’ai identifié par mutagenèse son domaine d’interaction avec les membranes. Au moyen de petites GTPases Rab ancrées artificiellement à la surface de liposomes par une queue 6his remplaçant le lipide naturel, j’ai montré que l’activité d’AnkX est stimulée par la présence de membranes. Des résultats préliminaires suggérent que Rab35 est un meilleur substrat que Rab1a, ce qui pourrait renseigner sur la fonction et le compartiment cellulaire où se trouve la toxine. J’ai ensuite mené une étude structurale d’AnkX par diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS), qui permet d’obtenir des informations structurales en solution. AnkX est constitué d’un domaine FIC, de répétitions ankyrine et d’un domaine C-terminal. L’analyse en SAXS montre que ces domaines s’organisent en forme de fer à cheval, suggérant un modèle d’association bi-partite du complexe AnkX/Rab aux membranes. L’ensemble de ces résultats conduit à un modèle dans lequel l’activité d’AnkX est régulée spatialement par les membranes, ce qui pourrait lui permettre de cibler à la fois les petites GTPases Rab cellulaires et le compartiment membranaire. / FIC (Filamentation induced by cAMP ) domain containing proteins are widespread in bacteria where they use different substrate such ATP to modify a target protein with a phosphate containing post-translational modification. Some of those proteins are secreted toxins from pathogens but the function of the majority stay unknown. Some recently resolved structures explain the catalytic mechanism. A subfamily of FIC proteins was proposed to be auto-inhibited for ATP binding by a glutamate in their active site. In my thesis, I lead a structural and biochemical study of two FIC proteins family: the auto-inhibited by a glutamate FIC proteins and the Legionella pneumophila toxin AnkX.For the first study, I focused on the pathogenic bacteria Enterococcus faecalis protein EfFIC that is an auto-inhibited FIC protein. I solved several crystallographic structures to characterize the active site and the AMP and ADP binding. Using the classic auto-AMPylation (modification with an AMP molecule) mechanism and radioactive ATP, I showed that EfFIC is active and I identified a new de-AMPylation activity. Using metals found in my crystallographic structures, I showed that the AMPylation and de-AMPylation switch is controlled by the nature of the metal bound in the active site and that this switch is inhibitory glutamate-dependent. This glutamate is found in human HYPE that shows a double AMPyaltion and de-AMPylation activity of the ER chaperone BIP. Using fluorescence assays, I showed that those two activities are alors regulated by metals as in EfFIC. Those results point on a new regulation model shared between FIC proteins from bacteria to human.The second study focused on Legionella pneumophila toxin AnkX that modifies small GTPases Rab1 and Rab35 with a phosphocholine (PC) molecule. Using controlled composition liposomes, I showed that AnkX interact with membranes and mapped the interaction domain by mutagenesis. With artificially anchored to nickel containing liposomes surface Rab GTPases, I demonstrated the stimulation of AnkX activity by the membranes. Preliminary results also suggest that Rab35 is a better substrate than Rab1a, giving information on AnkX function and localization during infection. I lead a small angle X-ray scattering (SAXS) study on AnkX that gave low-resolution structural information on AnkX in solution. The analyses of SAXS results show that AnkX is horseshoe shaped, suggesting an association with the membrane and Rab of AnkX model. In this model, membranes spatially regulate AnkX, allowing a targeting of Rab and cellular compartment targeting.

Clostridium difficile est la principale cause de diarrhées nosocomiales liées à la prise d'antibiotiques. La souche hypervirulente NAP1/027 est apparue récemment et a causé de nombreuses épidémies en Amérique du Nord et en Europe. On considère généralement que cette souche produit plus de toxines, sporule davantage, provoque des infections plus sévères menant à des complications et est souvent associée aux cas de récurrence. Toutefois, des études récentes ont montré des données contradictoires à ce sujet. L'objectif de mes travaux de recherche est donc de déterminer si l'issue clinique des infections à C. difficile (ICD) peut être prédite en fonction du génotype et de certains phénotypes bactériens associés à la virulence, comme la production de toxines et la sporulation. Pour ce faire, 21 isolats cliniques associés à des ICD de sévérité différente (légère à modérée, sévère, compliquée) ont été caractérisés par des méthodes de typage courantes, incluant le ribotypage par PCR, le typage des répétitions en tandem, l'analyse de loci multiples de répétitions en tandem polymorphe, la détection des toxines A, B et CDT, ainsi que le séquençage du gène tcdC. Les taux de sporulation et la production des toxines A et B ont aussi été évalués in vitro, de même que la résistance des isolats à certains antibiotiques. La mobilité, la sensibilité des isolats à certains bactériophages et leur contenu en prophages ont aussi été étudiés. Les résultats de mes travaux démontrent que les méthodes de typage utilisées ne permettent pas de prévoir avec certitude le phénotype bactérien ni de prédire la sévérité des ICD. En effet, les souches NAP1/027 peuvent autant provoquer des ICD non-sévères que mener à des complications. Le phénotype n'est pas non plus nécessairement un indice de la sévérité. Les souches NAP1/027 produisent généralement plus de toxines, mais ne possèdent pas forcément la capacité de sporulation qu'on leur attribue généralement. Par conséquent, les généralisations à propos des souches NAP1/027 devraient être évitées.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Ce travail de thèse a été réalisé au Laboratoire d'Optique et Biosciences (LOB, Ecole polytechnique) sous la direction d'Antigoni Alexandrou. Une des thématiques de ce laboratoire est le developpement et l'application dans le domaine de la biologie d'un nouveau type de sondes fluorescentes de taille nanométrique. Ces nanoparticules (NPs) constituées d'une matrice de vanadate d'Yttrium dopée par des ions Europium (Y1−xEuxVO4) sont détectables individuellement en microscopie optique par le biais de la fluorescence qu'elles émettent. Ces NPs peuvent de plus être fonctionnalisées afin d'être couplées à une biomolécule dont on cherche à déterminer l'activité, la localisation ou même la dynamique. Elles s'inscrivent dans une longue lignée de sondes fluorescentes dont nous allons brièvement décrire les différentes évolutions. Ce travail a profité de la collaboration avec l'équipe de Thierry Gacoin et Jean-Pierre Boilot du Laboratoire de Physique de la Matière Condensée (LPMC, Ecole polytechnique) pour la synthèse et la fonctionnalisation des NPs, avec l'équipe de Michel Robert Popoff de l'unité Bactéries Anaérobies et Toxines (BAT, Institut Pasteur) pour le suivi de la toxine ε et avec celle de Pierre-Louis Tharaux du Centre de Recherche Cardiovasculaire Inserm-Lariboisière pour l'étude de la signalisation vasculaire de l'endothéline-1.

Reproduction de : Thèse d'exercice : Médecine : Nancy 1 : 2005. / Titre provenant de l'écran-titre.

Les systèmes Toxine Antitoxine (TA) sont présents chez la plupart des génomes bactériens. Nous rapportons dans cette étude la présence de tels systèmes chez la bactérie pathogène Helicobacter pylori. Ce nouveau système TA de type I, de la même manière que les autres systèmes de type I décrits, est composé d’une toxine peptidique membranaire (AapA) dont la traduction est inhibée par un ARNnc (IsoA) suivant une interaction côté 5’ non traduit de l’ARNm. La structuration particuliere de l’ARNm a permit l’identification d’orthologue de ce système dans les chromosomes des genres Helicobacter et Campylobacter mais aussi sur leur patrimoine génétique mobiles, tels les plasmides. Ceci impliquant leur potentielle acquisition dans le génome par transfert génétique horizontal. La deuxième partie de l’étude se focalise sur la résolution par RMN du liquide de la structure atomique de la toxine AapA1 dans un environnement pseudo-membranaire. Une approche par mutation révèle les determinants structuraux de la toxicité, pointant la présence d’une empreinte de charge dans la partie helicoidale transmenbranaire de la toxine présente aussi chez d’autres toxines de Type I. La dernière partie de l’étude se centre sur l’expression et la purification de la toxine afin d’en étudier la structure en environnement membranaire complexe par RMN du solide. Les résultats prometteurs ouvrent la voie à une caractérisation de la toxine par l’expérience de PISEMA. / Toxin-antitoxin (TA) systems are present in almost all bacterial genomes. Here we report that the genome of the major human gastric pathogen, Helicobacter pylori, is hosting several copies of a new family of type I TA systems. Similarly to other type I TA systems, the toxin (AapA) is a small membrane protein whose expression is controlled by a small antisense RNA (IsoA, antitoxin) that binds to the 5’ untranslated region (UTR) of the mRNA. In addition we used the strong conservation of the mRNA folding to identify homologs of this TA system not only in other Helicobacter and Campylobacter chromosomes but also on plasmids, indicating that this new TA system might have been spread over different genomes via horizontal gene transfer.The second part of the study take account of the AapA toxin itself. We acutely determine the structure of AapA1 by liquid state NMR in membrane mimicking environment. We then probe first structural insight on atomic structural determinants of its toxicity following a mutation studies.These results reveal a particular charge pattern on the transmembrane α helix domain of AapA toxin similary to other Type I toxin. A third part of the studies is based on expression and purification of the toxin in order to determine the structure in complex membrane environment by solid state NMR. The promosisng result open the way to characterize the toxin by PISEMA experiment.