A calcineurina é uma fosfatase ativada por Ca2+ e calmodulina presente em todos os eucariotos que, em fungos, atua na sinalização de eventos em resposta a estímulos do ambiente e tem papel essencial na patogenicidade de fungos causadores de doenças. O Paracoccidioides brasiliensis é um fungo dimórfico causador da paracoccidioidomicose, uma micose sistêmica profunda de importância para a Saúde Pública no Brasil e no restante da América Latina. Neste e em outros fungos dimórficos patogênicos, a transição dimórfica é necessária para o desenvolvimento de patogenicidade, sendo a calcineurina essencial o dimorfismo. Neste trabalho foram caracterizadas as estruturas gênicas das duas subunidades que compõe o heterodímero de calcineurina e sua expressão durante a transição dimórfica. Foram sugeridos possíveis alvos moleculares de interação com a calcineurina através de bioinformática e os níveis de expressão de três deles foram analisados durante a transição dimórfica. Espera-se que este trabalho contribua para uma melhor compreensão dos mecanismos que regulam a transição dimórfica, virulência e patogenicidade em P. brasiliensis e, dessa forma, auxilie no desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas contra a paracoccidioidomicose. / The calcineurin is a Ca2+/almodulin-dependent phosphatase present in all eukaryotes. In fungi, it acts as a signaling molecule that works in response to environmental stimuli and has key role in pathogen city of diverse disease-causing fungi. Paracoccidioides brasiliensis is a dimorphic fungus and the etiological agent of paracoccidioidomycosis, a systemic mycosis important to public health in Brazil and other Latin Americans countries. As in other dimorphic pathogenic fungi, the dimorphic transition is necessary for the development of pathogenicity, with calcineurin playing an essential role to the process of dimorphism. In this work we characterized the gene structures of two subunits that make up the calcineurin heterodimer as well as its expression during the dimorphic transition. We raised possible targets for molecular interaction with calcineurin by bioinformatics and the levels of expression of three of them were examined during the dimorphic transition. We expect that this work might contribute to a better understanding of the mechanisms that regulate the dimorphic transition, virulence and pathogenicity in P. brasiliensis and thus help in developing of new therapeutic approaches against paracoccidioidomycosis.

Orientadores: Marcelo Menossi Teixeira, Ricardo Aparicio / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T01:59:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fonseca_JosePedro_D.pdf: 3971415 bytes, checksum: b23d47eff6b16f53235b5d581fcd3ae6 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Estresses bióticos e abióticos como a seca, salinidade e ataque por patógenos são responsáveis por perdas significantes em culturas de grãos ao redor do mundo. Diversos genes são regulados em resposta a esses fatores e podem ser ativados ou reprimidos para gerar uma resposta específica na planta de maneira a gerar uma resposta de defesa que atenue os efeitos do estresse e promoção de tolerância pela planta. É importante entendermos o funcionamento desses mecanismos moleculares, e dos genes e proteínas envolvidas nestas vias de sinalização para um melhor conhecimento de como estas vias de transdução operam em plantas, bem como no desenvolvimento de variedades de plantas tolerantes. No capítulo I deste trabalho nós descrevemos a análise funcional de um motivo de ligação do fator TGA localizado na região promotora do gene NIMIN-1 que é altamente induzido por ácido salicílico (SA) durante defesa de plantas (estresse biótico). Fatores TGA desempenham um papel chave na defesa de plantas através da interação com elementos presentes na região promotora de genes de defesa para induzir a sua expressão. O ácido salicílico (SA) é um fito-hormônio que induz a expressão do gene que codifica a proteína NIMIN-1. Essa proteína interage com a proteína NPR1/NIM1, reguladora da resistência sistêmica adquirida (SAR). Neste trabalho foi investigado se um motivo de ligação do fator TGA2 "TGACG", localizado na região promotora imediatamente anterior ao sítio de iniciação da transcrição de NIMIN-1, é necessário a indução de NIMIN-1 por ácido salicílico. Uma versão mutagenizada do promotor do gene NIMIN-1 foi gerada por mutação sítio-dirigida. Nós geramos construções T-DNA nas quais tanto a região promotora nativa quanto a mutagenizada foram fusionadas aos repórteres proteína verde fluorescente (GFP) e beta-glucuronidase (GUS). Foram geradas plantas transgênicas e a expressão de GFP sob o controle da região promotora de NIMIN-1 foi observada em raízes, no pecíolo e folhas de Arabidopsis. A atividade dirigida pelo promotor mutagenizado e o selvagem foi quantificada por PCR quantitativo em tempo real. Tanto a construção contendo o promotor de NIMIN-1 como a cópia endógena de NIMIN-1 foram induzidas por SA. Em contraste, a construção promotora mutagenizada foi bem menos sensível a SA que o promotor nativo de NIMIN-1. Esse dado indica que o motivo de ligação do fator TGA2 analisado está diretamente envolvido na modulação da expressão de NIMIN-1 induzida por SA em Arabidopsis. No capítulo II nós descrevemos a caracterização da proteína ScCBL1 de cana-de-çúcar que apresenta elevada identidade com membros da família de proteínas sensoras de cálcio do tipo calcineurina B (CBL) em plantas. Experimentos de duplo-híbrido realizados em nosso grupo mostram que a proteína ScCBL1 interage com uma proteína quinase (ScCIPK8). Trabalhos prévios também desenvolvidos em nosso laboratório demonstraram que ScCIPK8 está envolvida no metabolismo do carboidrato e é diferencialmente expressa em resposta a ABA. O gene ScCBL1 foi clonado e a proteína codificada expressa e purificada a partir do extrato solúvel por cromatografia de afinidade usando resina Ni-NTA e a proteína eluída foi usada para estudos estruturais. Análises por espectrometria por dicroísmo circular (CD) mostraram que a proteína ScCBL1 é composta predominantemente por ?-hélices, em concordância com programas de predição da sequência de aminoácido desta proteína. Experimentos de espalhamento de raio-x a baixos ângulos (SAXS) indicaram que as amostras obtidas da ScCBL1 estavam homogêneas e monodispersas em solução e que ocorre uma mudança em seu estado oligomérico quando adicionado o agente redutor DTT, ocorrendo uma diminuição na intensidade de espalhamento (I(0)) a uma ordem de 1,56 para a mesma concentração, acompanhado de uma diminuição de 10 Å em seu raio de giro. As analises por SAXS indicaram que a proteína ScCBL1 é pentamérica em seu estado nativo e um trímero quando adicionado DTT. Análises por SAXS também indicaram que a proteína ScCBL1 está enovelada em solução, apresentando estrutura terciária estável. A modelagem de baixa resolução ab initio, juntamente com a função de distribuição das distâncias P(r) indicaram que a proteína possui um formato alongado (prolato). Ensaios iniciais de cristalização a partir de amostras monodispersas da proteína ScCBL1, confirmadas por DLS, foram feitas e um monocristal simétrico de aproximadamente 0.05 mm de diâmetro obtido além de outros sinais promissores para um refinamento das condições de cristalização de ScCBL1 para determinação de sua estrutura tridimensional a uma alta resolução. Esses dados contribuem para uma caracterização inicial da estrutura da proteína ScCBL1 / Abstract: Many biotic and abiotic stresses such as drought, salinity and pathogen attack are responsible for major crop losses around the world. Several genes are regulated in response to these factors to counteract the stress effects and promote plant tolerance. Understanding the molecular mechanisms as well as the roles of genes and proteins involved in stress signaling pathways is key to a better understanding of plant tolerance. We report in chapter I the functional analysis of a TGA biding factor located in the promoter region of NIMIN-1 that is highly induced by SA during plant defense against pathogen attack (biotic stress). TGA factors play a key role in plant defense by binding to the promoter region of defense genes, inducing their expression. Salicylic acid (SA) induces the expression of the gene encoding NIMIN-1, which interacts with NPR1/NIM1, a key regulator of systemic acquired resistance. In this work we investigated whether the TGA2-binding motif TGACG located upstream of the NIMIN-1 gene is necessary for SA induction of NIMIN-1 expression. A mutated version of the NIMIN-1 promoter was created by site-directed mutagenesis. We generated T-DNA constructs in which native NIMIN-1 and mutated promoters were fused to green fluorescent protein and ?-glucuronidase reporters. We produced transgenic Arabidopsis plants and observed NIMIN-1 promoter-driven green fluorescent protein expression in the roots, petiole and leaves. Constructs were also agroinfiltrated into the leaves to evaluate gene expression of mutagenized and native promoters driving expression of GUS using quantitative real-time RT-PCR. We characterized the normal gene response to SA and compared it to the response of the mutant version of the NIMIN-1 promoter. Both the native NIMIN-1 construct and an endogenous copy of NIMIN-1 were induced by SA. However, the mutated promoter construct was much less sensitive to SA than the native NIMIN-1 promoter, indicating that this TGA2-binding motif is directly involved in the modulation of SA-induced NIMIN-1 expression in Arabidopsis. In chapter II we describe the characterization of a sugarcane ScCBL1 protein which displays high sequence identity to the calcium binding protein family calcineurin B-like (CBL) from plants. Using the two-hybrid system our group has shown that ScCBL1 binds to a protein kinase (ScCIPK8). Previous work done in our laboratory also showed that ScCIPK8 is involved in carbohydrate metabolism and that it is differentially expressed in response to ABA. ScCBL1 was cloned, expressed and purified by one round of affinity chromatography using a Ni-NTA resin and the purified eluted protein was used for structural analysis. Spectroscopic analysis by circular dichroism (CD) showed that ScCBL1 is mainly composed of ?-helices agreeing with secondary structure prediction by PredictProtein server. Small Angle X-Ray Scattering (SAXS) analysis showed that ScCBL1 sample is homogeneous and monodisperse in solution and that the protein undergoes an oligomeric change when DTT is added, with a decrease in scattering intensity (I(0)) by a factor of 1,56 for samples with the same concentration, together with a decrease in the radius of gyration of 10 Å. SAXS experiments also showed that ScCBL1 is pentameric in its native state and the protein undergoes a change in its oligomeric state to a trimer when DTT is added. SAXS experiments also showed the protein is folded in solution and ab initio modeling of ScCBL1 protein envelope together with the pair-distribution function P(r) indicates that the protein has a rod-like, elongated shape. An initial crystallization screening with ScCBL1 monodisperse samples (confirmed by DLS experiments) was carried out and some crystallization signals were obtained, including a single crystal of around 0.05 mm in length. These data shed light on the structural features of ScCBL1 / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

O gene SLC2A4 codifica a proteína GLUT4, fundamental na homeostasia glicêmica. OBJETIVO: Investigar o efeito do diabetes na expressão do GLUT4 pela atividade contrátil. MÉTODOS: Músculos sóleos de ratos não diabéticos (ND) e diabéticos tratados com insulina (DI) ou salina (DS) foram incubados e contraídos. A expressão de GLUT4, pAMPK e CAMKII foram analisados por PCR e Western blotting, e a atividade de MEF2D, GEF, HIF-1<font face=\"Symbol\">a e TR<font face=\"Symbol\">a1 por gel shift. Células C2C12 transfectadas com plasmídeos contendo os sítios de ligação para MEF2, HIF, e TR foram tratadas com AICAR ou cafeína. RESULTADOS: Em animais ND e DI, a contração aumentou o conteúdo de GLUT4, mas não nos DS. Em animais ND, a contração aumentou a atividade da AMPK e dos fatores MEF2D, GEF e TR<font face=\"Symbol\">a1, mas não nos DS. Em animais ND, os inibidores de AMPK e CAMKII aboliram o aumento do GLUT4 e da atividade de MEF2D e GEF. Em células C2C12 a cafeína e a AMPK ativaram os 3 sítios. CONCLUSÃO: O diabetes abole o aumento da expressão do GLUT4 sob a atividade contrátil devido a redução da atividade de MEF2D, GEF e TR<font face=\"Symbol\">a1 e AMPK. / The SLC2A4 gene encodes the GLUT4 protein, which is essential in glucose homeostasis. OBJECTIVE: To investigate the diabetes effect on muscle contraction-induced in SLC2A4 gene expression. METHODS: Soleus muscles of Non diabetic rats (ND) and diabetic treated with insulin (DI) or saline (DS) were incubated and contracted. The GLUT4, pAMPK and CAMKII expressions were analyzed by PCR and Western blotting, and the MEF2D, GEF, HIF-1<font face=\"Symbol\">a and TR<font face=\"Symbol\">a1 activity by gel shift. C2C12 cells transfected with plasmids containing the binding sites for MEF2, HIF, and TR were treated with AICAR or caffeine. RESULTS: Contraction increased the GLUT4 amount in animals ND and DI, but not in DS. In ND animals, contraction increased AMPK, MEF2D, GEF and TR<font face=\"Symbol\">a1 activity, but not in DS. In ND animals, AMPK and CAMKII inhibitors abolished the GLUT4 increase as like MEF2D and GEF activity. In C2C12 cells AMPK and caffeine activated the 3 sites. CONCLUSION: Diabetes abolishes the muscle contraction-induced GLUT4 increase due to reduced of MEF2D, GEF, TR<font face=\"Symbol\">a1 and AMPK activity.

Orientador: Hugo Enrique Hernandez Figueroa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação / Made available in DSpace on 2018-08-22T03:58:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moraes_MuriloOliveirade_M.pdf: 26552033 bytes, checksum: 9a9022f8aa6d5e4e72047f0798ad57da (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A complexidade dos sistemas eletrônicos atuais cria a demanda por mais componentes num mesmo sistema, ao mesmo tempo em que exige sistemas mais compactos. Esta dissertação apresenta o desenvolvimento, fabricação e testes de uma antena GSM quadribanda, integrada a um módulo rastreador automotivo produzido no mercado nacional. A antena opera dentro das faixas de freqüências correspondentes _as bandas GSM 850/900/1800/1900, com desempenho adequado para uso no sistema de comunicação GSM, estando em conformidade com testes de TRP, sendo o produto final homologado pela ANATEL e agências reguladoras de outros países. A antena é um monopolo com dobras especiais para ajuste de ressonância. O casamento da antena com o sistema _e realizado via um toco em curto dobrado, não trivial, otimizado para um casamento banda-larga ao longo do espectro GSM ocupado / Abstract: The complexity of today's electronic systems creates demand for more quantity and less cost of components in a system, at the same time that the system must be made smaller. This dissertation presents the design and tests of a quadband GSM antenna, embedded into an existing automotive tracking module produced in Brazil. The antenna operates within the GSM 850/900/1800/1900 bands, with performance suitable for its use in the GSM system, being in conformance with TRP tests. The final product is approved by Brazil's regulatory agency ANATEL and by other countries' agencies. The antenna is a monopole with special bandings for resonance adjustment. The antenna matching is achieved with a shorted bent stub, non-trivial, optimized for a broadband matching over the occupied GSM spectrum / Mestrado / Telecomunicações e Telemática / Mestre em Engenharia Elétrica

MicroRNAs são pequenos RNAs não codificadores de proteínas envolvidos na regulação pós-transcricional da expressão gênica. Análises de expressão em larga escala identificaram aumento da expressão de miR-146b-5p no carcinoma papilífero (PTC), o subtipo mais prevalente do câncer de tiróide. Uma análise in silico apontou SMAD4, um membro da via de sinalização de TGFbeta, como potencial alvo de miR-146b-5p. A via de TGFbeta é uma via inibitória da proliferação da célula folicular, contudo o mecanismo de escape do sinal inibitório de TGFbeta pela célula tumoral tiroideana permanence não esclarecido. A expressão de miR-146b-5p em linhagem normal PCCL3 diminuiu os níveis de SMAD4, conferindo resistência ao sinal anti-proliferativo de TGFbeta e aumentando a proliferação celular. A inibição de miR-146b-5p em linhagens de PTC aumentou os níveis de SMAD4, restaurou a resposta ao sinal anti-proliferativo de TGFbeta, diminuindo a proliferação celular. Os dados obtidos neste trabalho revelam o papel oncogênico de miR-146b-5p como um regulador negativo da via de TGFbeta. / MicroRNAs are small non-coding RNAs involved in post-transcriptional gene regulation. Large-scale analyses revealed that miR-146b-5p is overexpressed in papillary carcinomas (PTC), the most prevalent form of thyroid cancer. A computational analysis indicated SMAD4, an important member of the TGF-<font face=\"Symbol\">b signaling pathway, as a putative target of miR-146b-5p. The TGFbeta pathway is a negative regulator of thyroid follicular cell growth, and the mechanism by which thyroid cancer cells evade its inhibitory signal remains unclear. The overexpression of miR-146b-5p in normal follicular PCCL3 cells decreased SMAD4 levels, conferred resistance to TGFbeta anti-proliferative signal and increased cell proliferation. The specific inhibition of miR-146b-5p in papillary carcinoma cell lines significantly increased SMAD4 levels, restored the TGFbeta signal transduction and decreased cell growth. Altogether, our data confirm the oncogenic role of miR-146b-5p in thyroid follicular cells as a negative regulator of TGFbeta signaling pathway.

A calcineurina é uma fosfatase ativada por Ca2+ e calmodulina presente em todos os eucariotos que, em fungos, atua na sinalização de eventos em resposta a estímulos do ambiente e tem papel essencial na patogenicidade de fungos causadores de doenças. O Paracoccidioides brasiliensis é um fungo dimórfico causador da paracoccidioidomicose, uma micose sistêmica profunda de importância para a Saúde Pública no Brasil e no restante da América Latina. Neste e em outros fungos dimórficos patogênicos, a transição dimórfica é necessária para o desenvolvimento de patogenicidade, sendo a calcineurina essencial o dimorfismo. Neste trabalho foram caracterizadas as estruturas gênicas das duas subunidades que compõe o heterodímero de calcineurina e sua expressão durante a transição dimórfica. Foram sugeridos possíveis alvos moleculares de interação com a calcineurina através de bioinformática e os níveis de expressão de três deles foram analisados durante a transição dimórfica. Espera-se que este trabalho contribua para uma melhor compreensão dos mecanismos que regulam a transição dimórfica, virulência e patogenicidade em P. brasiliensis e, dessa forma, auxilie no desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas contra a paracoccidioidomicose. / The calcineurin is a Ca2+/almodulin-dependent phosphatase present in all eukaryotes. In fungi, it acts as a signaling molecule that works in response to environmental stimuli and has key role in pathogen city of diverse disease-causing fungi. Paracoccidioides brasiliensis is a dimorphic fungus and the etiological agent of paracoccidioidomycosis, a systemic mycosis important to public health in Brazil and other Latin Americans countries. As in other dimorphic pathogenic fungi, the dimorphic transition is necessary for the development of pathogenicity, with calcineurin playing an essential role to the process of dimorphism. In this work we characterized the gene structures of two subunits that make up the calcineurin heterodimer as well as its expression during the dimorphic transition. We raised possible targets for molecular interaction with calcineurin by bioinformatics and the levels of expression of three of them were examined during the dimorphic transition. We expect that this work might contribute to a better understanding of the mechanisms that regulate the dimorphic transition, virulence and pathogenicity in P. brasiliensis and thus help in developing of new therapeutic approaches against paracoccidioidomycosis.