Demonstramos que o P. falciparum dentro do eritrócito é capaz de usar a via de sinalização celular dependente do inositol trifosfato (IP3). Investigamos os estoques de Ca2+ intracelular sensíveis ao IP3 neste parasita e a sensibilidade ao IP3 em diferentes estágios no ciclo intraeritrocítico. Demonstramos que o hormônio melatonina é capaz de aumentar a concentração de IP3 neste parasita. Com o uso de uma coluna de afinidade ao IP3 tentamos encontrar proteínas candidatas ao receptor de IP3 em P. falciparum. Este trabalho também estuda a enzima heme oxigenade de P. falciparum (PfHO). Testamos a capacidade desta enzima em converter biliverdina (BV) em bilirubina (BR), a modulação desta atividade na presença de diversas metaloprotoporfirinas e o potencial destes compostos como antimaláricos. Reportamos que a biliverdina é capaz de modular o ciclo intraeritrocítico de P. falciparum e apresentamos a proteína enolase de P. falciparum como candidato ao sensor de BV neste parasita. / We demonstrate that P. falciparum within the erythrocyte is able to use the cellular signaling pathway dependent on inositol triphosphate (IP3). We investigated the intracellular Ca2+ stores sensitive to IP3 and explore parasite sensitivity to IP3 at different stages in the intraerythrocytic cycle. We demonstrate that melatonin hormone is capable of increasing the IP3 concentration on this parasite. Using an IP3 affinity column, we tried to find candidate proteins for IP3 receptor in P. falciparum. This work also studies the enzyme P. falciparum heme oxygenase (PfHO). We tested the ability of this enzyme to convert biliverdin (BV) in bilirubin (BR), the modulation of this activity in the presence of various metalloprotoporphyrins and the potential of these compounds as antimalarials. We reported that biliverdin is capable of modulating the intraerythrocytic cycle of P. falciparum and present P. falciparum enolase as candidate for BV sensor on this parasite.

Crotalfina é um peptídeo sintetizado a partir da sequência de um composto analgésico purificado do veneno de serpentes Crotalus durissus terrificus. Apesar da atividade opióide, ensaios moleculares indicam que esse peptídeo não se liga diretamente aos receptores opióides, sugerindo que a liberação de opióides endógenos sejam os responsáveis pela atividade analgésica. Baseado em dados da literatura que demonstram a estreita relação entre o sistema canabinóide e o sistema opióide, o objetivo deste projeto foi avaliar o possível efeito da crotalfina sobre o sistema canabinóide. Os resultados indicam que receptores canabinóides CB2 estão envolvidos na antinocicepção acarretada pela crotalfina, na vigência de hiperalgesia induzida por PGE2. Ainda, este efeito é dependente de liberação de opióides endógenos, particularmente dinorfina A, agonista endógeno de receptores opióides do tipo kappa, sendo essa liberação dependente da ativação de receptores CB2. / Crotalphine is a peptide synthesized based on the sequence of the analgesic compound purified from the Crotalus durissus terrificus snake venom. Despite the opioid activity, molecular assays indicate that this peptide does not directly bind to opioid receptors, suggesting that the endogenous opioid release could be responsible for analgesic activity. Based on data from literature demonstrating the close relationship between the cannabinoid and the opioid systems, the goal of this project was to evaluate the possible effect of crotalphine on the cannabinoid system. Results demonstrated that CB2 cannabinoid receptors are involved in the antinociception induced by crotalphine during PGE2-induced hyperalgesia. In agreement, this effect is dependent of the release of endogenous opioids, particularly dynorphin A, the endogenous agonist of kappa opioid receptors. This release is dependent of the CB2 receptor activation.

A enzima Na+, K+-ATPase é uma proteína de membrana altamente conservada em eucariotos, capaz de gerar um gradiente eletroquímico, fundamental para o balanço osmótico das células, o potencial de repouso das membranas e a propriedade excitatória das células musculares e nervosas. Além de seu papel regulatório na homeostasia iônica, desempenha um papel na transdução de sinal e na ativação de transcrição gênica, modulando na presença de ouabaína o crescimento celular, migração e morte celular programada. A Ouabaína (OUA) é um esteróide cardiotônico, produzido no córtex da adrenal e no hipotálamo. Em linhas gerais, a sinalização da Na+, K+-ATPase promovida pela OUA parece ativar vias associadas à modulação de fatores de transcrição como a via da Src, MAPK, Ca2+ e NF-<font face=\"Symbol\">kB. Evidências indicam que o NF-<font face=\"Symbol\">kB exerça algum tipo de modulação na via canônica do WNT, no entanto os mecanismos moleculares ainda são desconhecidos. A via de sinalização WNT desempenha função importante na embriogênese e na homeostase de tecidos adultos. Assim, o objetivo do presente projeto é verificar se a administração intrahipocampal de OUA é capaz de modular a atividade das vias canônicas do NF-<font face=\"Symbol\">kB e da WNT. Estas vias foram estudadas em um decurso temporal imediato (1 -2 horas) e tardio (10, 24 e 48 horas) utilizando técnicas como Western Blotting, RT-PCR e EMSA. Os resultados encontrados mostram que a OUA (10 nM) foi capaz de ativar a via de sinalização NF-<font face=\"Symbol\">kB, após 1 hora, 10, 24 e 48 horas. A OUA também foi capaz de ativar a via canônica do WNT, sendo que após 10 horas ocorreu aumento da proteína pGSK-3<font face=\"Symbol\">b, enquanto que em 24 horas, observamos aumento da translocação nuclear da <font face=\"Symbol\">b-CATENINA. Além disso, pode-se verificar aumento de BDNF ao longo de todo o decurso temporal. / The enzyme Na+,K+-ATPase is an integral membrane protein, highly conserved in eukaryotes, that establishes the electrochemical gradient across the plasma membrane, which is essential to maintain the osmotic balance of cells, the resting membrane potential and the excitatory property of nerve and muscle cells. Besides its role in ion homeostasis, several recent studies suggest that this pump may also act as a signal transducer and transcription activator involved in cell growth, differentiation and programmed cell death. Ouabain (OUA), the ligand of Na+,K+-ATPase, is a steroid derivative that is produced by the adrenal cortex and hypothalamus. After OUA binding, the Na+,K+-ATPase signaling seems to activate pathways such as Src, MAPK, NF-<font face=\"Symbol\">kB and Ca2+. Some evidences indicate a possible crosstalk between the NF-<font face=\"Symbol\">kB signaling pathway and the canonical WNT pathway, however the molecular mechanisms are still unknown. The canonical WNT play important roles during embryogenesis and in adult tissue homeostasis. The aim of this project is to verify if the intrahipocampal administration of OUA is able to modulate the activity of the canonical pathways of NF-<font face=\"Symbol\">kB and WNT. Both pathways were studied after 1 and 2 hours, and after 10, 24 and 48 hours by methods such Western blot, RT-PCR and Electrophoretic mobility shift assays. The results show that the OUA (10 nM) was able to activate the signaling pathway NF-<font face=\"Symbol\">kB after 1, 10, 24 and 48 hours. The OUA was also able to activate the canonical WNT pathway, since after 10 hours there was an increased in pGSK-3<font face=\"Symbol\">b protein, whereas in 24 hours, we observed increased nuclear translocation of <font face=\"Symbol\">b-CATENIN. Moreover, we found increased levels of BDNF throughout the time course.

A colina quinase, 1ª enzima de uma via que forma 45% da membrana de P. falciparum foi clonada, expressa e purificada, e um anticorpo policlonal desenvolvido. Estudos de transporte da enzima demonstraram que a PfChok é transportada para o citossol por uma via independente do inibidor Brefeldina A. Obteve-se informação da estrutura secundária e uma modelagem da estrutura terciária da proteína, tendo sido localizados sítios de fosforilação para proteínas quinases. Através de uma nova abordagem em genômica funcional de Plasmodium, o gene da proteína adaptadora PfRACK foi códon otimizado e inserido em células de mamíferos. Estudos de dinâmica de Ca2+ em microscopia confocal indicaram que sua sinalização nas células estudadas é inibida na presença de PfRACK, dependente da interação direta com receptores de IP3. A enzima localiza-se distintivamente em relação à RACK1 endógena. Nossos resultados abrem a possibilidade de novos estudos, ao estabelecer a transfecção de genes do parasita para estudos de mecanismos de transdução de sinal na interação Plasmodium-hospedeiro. / Choline Kinase, the first enzyme of a pathway responsible for up to 45% of Plasmodium falciparum parasite membrane, was cloned, expressed and purified, and a policlonal antibody was developed to follow its localization along the intraerythrocytic cycle. The enzyme is transported to parasite´s cytosol, through a pathway independent of the Endoplasmic Reticulum to Golgi apparatus. Information about the secondary structure was obtained, as well a model of the tertiary structure, where several kinases phosphorylation sites were identified. The PfRACK gene was codon-optimized and transfected in mammalian cells. Dynamic Ca2+ studies by confocal microscope have revealed that Ca2+ signaling of the transfected cells was inhibited by PfRACK, dependent on direct interaction with InsP3 receptors. The protein co-localizes distinctly of the endogenous RACK1. Our results open new possibilities of malaria functional genomics, by establishing the transfection of parasites genes into mammalian cells with the aim to study transduction signals mechanisms of the Plasmodium-host interaction.

Crotalfina é um peptídeo sintetizado a partir da sequência de um composto analgésico purificado do veneno de serpentes Crotalus durissus terrificus. Apesar da atividade opióide, ensaios moleculares indicam que esse peptídeo não se liga diretamente aos receptores opióides, sugerindo que a liberação de opióides endógenos sejam os responsáveis pela atividade analgésica. Baseado em dados da literatura que demonstram a estreita relação entre o sistema canabinóide e o sistema opióide, o objetivo deste projeto foi avaliar o possível efeito da crotalfina sobre o sistema canabinóide. Os resultados indicam que receptores canabinóides CB2 estão envolvidos na antinocicepção acarretada pela crotalfina, na vigência de hiperalgesia induzida por PGE2. Ainda, este efeito é dependente de liberação de opióides endógenos, particularmente dinorfina A, agonista endógeno de receptores opióides do tipo kappa, sendo essa liberação dependente da ativação de receptores CB2. / Crotalphine is a peptide synthesized based on the sequence of the analgesic compound purified from the Crotalus durissus terrificus snake venom. Despite the opioid activity, molecular assays indicate that this peptide does not directly bind to opioid receptors, suggesting that the endogenous opioid release could be responsible for analgesic activity. Based on data from literature demonstrating the close relationship between the cannabinoid and the opioid systems, the goal of this project was to evaluate the possible effect of crotalphine on the cannabinoid system. Results demonstrated that CB2 cannabinoid receptors are involved in the antinociception induced by crotalphine during PGE2-induced hyperalgesia. In agreement, this effect is dependent of the release of endogenous opioids, particularly dynorphin A, the endogenous agonist of kappa opioid receptors. This release is dependent of the CB2 receptor activation.

Orientador: Kleber Gomes Franchini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T19:13:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cardoso_AlissonCampos_M.pdf: 1504948 bytes, checksum: 1996e50c40d74c7a53a5058831fb03ab (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Estudos anteriores demonstraram que em miócitos cardíacos submetidos a estímulos mecânicos ocorre pronta fosforilação e ativação da FAK. Resultados de estudos recentes, realizados em corações de ratos indicaram que em resposta a estímulos mecânicos, a FAK, além de ser ativada, localiza-se no núcleo dos miócitos cardíaco. Estudos conduzidos em corações de ratos Wistar adultos, utilizando a técnica de Imunoprecipitação de cromatina (ChIP) com anticorpo anti- FAK, identificaram uma seqüência intrônica de 182pb do gene fosfolambam (plnil), contendo sítio para a ligação do fator de transcrição MEF2. Portanto, no presente estudo, investigamos se a região intrônica do gene que codifica o fosfolamban tem função regulatória transcricional. Utilizando técnicas de EMSA (Ensaio de retardamento da mobilidade eletroforética), ensaios de Precipitação e de gene reporter, avaliamos a interação entre a FAK e plnil além da função regulatória transcricional dessa seqüência. Como resultado, demonstramos que ocorre pronta ativação da FAK e seu acúmulo no núcleo de miócitos cardíacos de ventrículo esquerdo de ratos submetidos a coarctação da aorta. Através de ensaios de EMSA, demonstramos que proteínas nucleares de ventrículo esquerdo de ratos submetidos a sobrecarga pressórica, apresentaram um aumento na interação com a sonda plni1 em relação aqueles de ratos controles. Também, ensaios de EMSA indicaram uma interação entre MEF2 e a sonda plnil, mas não entre a FAK ou seus domínios (FERM e Cterminal) com a sonda plnil. Ensaios de precipitação com fragmentos recombinantes da FAK (GST-FERM e GSTCterminal) com extratos nucleares de coração de ratos coarctados indicaram uma associação entre FAK e MEF2. Ensaios adicionais demonstraram que a interação entre FAK e MEF2 é dependente do domínio Cterminal e do estado fosforilado da FAK. Estudos de transfecção com gene reporter, utilizando plasmídeo contendo a seqüência plnil, em cultura de miócitos cardíacos submetidos ao estiramento, demonstraram que a região intrônica plnil possui função regulatória transcricional e esse papel é dependente da ligação do fator de transcrição MEF2 ao seu sítio específico no DNA. Portanto, esses dados indicam que FAK e MEF2 podem estar envolvidos na regulação da expressão do gene pln através de regulação mediado pela região intrônica plnil. / Abstract: Previous studies have shown that mechanical stress induces phosphorylation and activation of FAK in cardiac myocytes. Recent studies carried out in rat overloaded hearts indicated that FAK re-locates in the nucleus of the cardiac myocytes. By assays in the nuclei of overloaded cardiac myocytes with chromatin immunoprecipitation (ChIP) approach with anti-FAK antibody, we identified an intronic sequence of phospholamban gene (plnil), containing a MEF2 consensus site. In the present study, we investigated whether Plnil has any regulatory function in the pln. To accomplish this, we combinated techniques such as EMSA (Electrophoreses Mobility Shift Assay), reporter gene and pulldown assays. FAK was shown to be rapidly activated and to accumulate in the nuclei of cardiac myocytes taken from overloaded left ventricle. Using EMSA assays, we demonstrated that nuclear extracts of left ventricle rats overloaded, interacted with the plnil probe. EMSA assays, also indicated an interaction between MEF2 and the plnil probe, but no interaction was found between FAK or its domains (FERM and Cterminal) with the plni1. Pulldown assays with FAK recombinant fragments (GST-FERM and GST-Cterminal) and nuclear extracts from left ventricle overloaded indicated that FAK and MEF2 physically interact through FAK Cterminal domain. Reporter gene assays, using a construction of plnil coupled luciferase transfected to cardiac myocytes culture underwent stretching, had demonstrated that the intronic region has transcriptional regulatory function and this role is dependent of the transcription factor MEF2 binding site in the DNA. Therefore, these data indicate that FAK and MEF2 interact in the nuclei of cardiac myocytes and that FAK/MEF2 complex may regulate phospholamban gene expression through the plnil. / Mestrado / Medicina Experimental / Mestre em Fisiopatologia Médica

A enzima Na+, K+-ATPase é uma proteína de membrana altamente conservada em eucariotos, capaz de gerar um gradiente eletroquímico, fundamental para o balanço osmótico das células, o potencial de repouso das membranas e a propriedade excitatória das células musculares e nervosas. Além de seu papel regulatório na homeostasia iônica, desempenha um papel na transdução de sinal e na ativação de transcrição gênica, modulando na presença de ouabaína o crescimento celular, migração e morte celular programada. A Ouabaína (OUA) é um esteróide cardiotônico, produzido no córtex da adrenal e no hipotálamo. Em linhas gerais, a sinalização da Na+, K+-ATPase promovida pela OUA parece ativar vias associadas à modulação de fatores de transcrição como a via da Src, MAPK, Ca2+ e NF-<font face=\"Symbol\">kB. Evidências indicam que o NF-<font face=\"Symbol\">kB exerça algum tipo de modulação na via canônica do WNT, no entanto os mecanismos moleculares ainda são desconhecidos. A via de sinalização WNT desempenha função importante na embriogênese e na homeostase de tecidos adultos. Assim, o objetivo do presente projeto é verificar se a administração intrahipocampal de OUA é capaz de modular a atividade das vias canônicas do NF-<font face=\"Symbol\">kB e da WNT. Estas vias foram estudadas em um decurso temporal imediato (1 -2 horas) e tardio (10, 24 e 48 horas) utilizando técnicas como Western Blotting, RT-PCR e EMSA. Os resultados encontrados mostram que a OUA (10 nM) foi capaz de ativar a via de sinalização NF-<font face=\"Symbol\">kB, após 1 hora, 10, 24 e 48 horas. A OUA também foi capaz de ativar a via canônica do WNT, sendo que após 10 horas ocorreu aumento da proteína pGSK-3<font face=\"Symbol\">b, enquanto que em 24 horas, observamos aumento da translocação nuclear da <font face=\"Symbol\">b-CATENINA. Além disso, pode-se verificar aumento de BDNF ao longo de todo o decurso temporal. / The enzyme Na+,K+-ATPase is an integral membrane protein, highly conserved in eukaryotes, that establishes the electrochemical gradient across the plasma membrane, which is essential to maintain the osmotic balance of cells, the resting membrane potential and the excitatory property of nerve and muscle cells. Besides its role in ion homeostasis, several recent studies suggest that this pump may also act as a signal transducer and transcription activator involved in cell growth, differentiation and programmed cell death. Ouabain (OUA), the ligand of Na+,K+-ATPase, is a steroid derivative that is produced by the adrenal cortex and hypothalamus. After OUA binding, the Na+,K+-ATPase signaling seems to activate pathways such as Src, MAPK, NF-<font face=\"Symbol\">kB and Ca2+. Some evidences indicate a possible crosstalk between the NF-<font face=\"Symbol\">kB signaling pathway and the canonical WNT pathway, however the molecular mechanisms are still unknown. The canonical WNT play important roles during embryogenesis and in adult tissue homeostasis. The aim of this project is to verify if the intrahipocampal administration of OUA is able to modulate the activity of the canonical pathways of NF-<font face=\"Symbol\">kB and WNT. Both pathways were studied after 1 and 2 hours, and after 10, 24 and 48 hours by methods such Western blot, RT-PCR and Electrophoretic mobility shift assays. The results show that the OUA (10 nM) was able to activate the signaling pathway NF-<font face=\"Symbol\">kB after 1, 10, 24 and 48 hours. The OUA was also able to activate the canonical WNT pathway, since after 10 hours there was an increased in pGSK-3<font face=\"Symbol\">b protein, whereas in 24 hours, we observed increased nuclear translocation of <font face=\"Symbol\">b-CATENIN. Moreover, we found increased levels of BDNF throughout the time course.

Demonstramos que o P. falciparum dentro do eritrócito é capaz de usar a via de sinalização celular dependente do inositol trifosfato (IP3). Investigamos os estoques de Ca2+ intracelular sensíveis ao IP3 neste parasita e a sensibilidade ao IP3 em diferentes estágios no ciclo intraeritrocítico. Demonstramos que o hormônio melatonina é capaz de aumentar a concentração de IP3 neste parasita. Com o uso de uma coluna de afinidade ao IP3 tentamos encontrar proteínas candidatas ao receptor de IP3 em P. falciparum. Este trabalho também estuda a enzima heme oxigenade de P. falciparum (PfHO). Testamos a capacidade desta enzima em converter biliverdina (BV) em bilirubina (BR), a modulação desta atividade na presença de diversas metaloprotoporfirinas e o potencial destes compostos como antimaláricos. Reportamos que a biliverdina é capaz de modular o ciclo intraeritrocítico de P. falciparum e apresentamos a proteína enolase de P. falciparum como candidato ao sensor de BV neste parasita. / We demonstrate that P. falciparum within the erythrocyte is able to use the cellular signaling pathway dependent on inositol triphosphate (IP3). We investigated the intracellular Ca2+ stores sensitive to IP3 and explore parasite sensitivity to IP3 at different stages in the intraerythrocytic cycle. We demonstrate that melatonin hormone is capable of increasing the IP3 concentration on this parasite. Using an IP3 affinity column, we tried to find candidate proteins for IP3 receptor in P. falciparum. This work also studies the enzyme P. falciparum heme oxygenase (PfHO). We tested the ability of this enzyme to convert biliverdin (BV) in bilirubin (BR), the modulation of this activity in the presence of various metalloprotoporphyrins and the potential of these compounds as antimalarials. We reported that biliverdin is capable of modulating the intraerythrocytic cycle of P. falciparum and present P. falciparum enolase as candidate for BV sensor on this parasite.

MicroRNAs são pequenos RNAs não codificadores de proteínas envolvidos na regulação pós-transcricional da expressão gênica. Análises de expressão em larga escala identificaram aumento da expressão de miR-146b-5p no carcinoma papilífero (PTC), o subtipo mais prevalente do câncer de tiróide. Uma análise in silico apontou SMAD4, um membro da via de sinalização de TGFbeta, como potencial alvo de miR-146b-5p. A via de TGFbeta é uma via inibitória da proliferação da célula folicular, contudo o mecanismo de escape do sinal inibitório de TGFbeta pela célula tumoral tiroideana permanence não esclarecido. A expressão de miR-146b-5p em linhagem normal PCCL3 diminuiu os níveis de SMAD4, conferindo resistência ao sinal anti-proliferativo de TGFbeta e aumentando a proliferação celular. A inibição de miR-146b-5p em linhagens de PTC aumentou os níveis de SMAD4, restaurou a resposta ao sinal anti-proliferativo de TGFbeta, diminuindo a proliferação celular. Os dados obtidos neste trabalho revelam o papel oncogênico de miR-146b-5p como um regulador negativo da via de TGFbeta. / MicroRNAs are small non-coding RNAs involved in post-transcriptional gene regulation. Large-scale analyses revealed that miR-146b-5p is overexpressed in papillary carcinomas (PTC), the most prevalent form of thyroid cancer. A computational analysis indicated SMAD4, an important member of the TGF-<font face=\"Symbol\">b signaling pathway, as a putative target of miR-146b-5p. The TGFbeta pathway is a negative regulator of thyroid follicular cell growth, and the mechanism by which thyroid cancer cells evade its inhibitory signal remains unclear. The overexpression of miR-146b-5p in normal follicular PCCL3 cells decreased SMAD4 levels, conferred resistance to TGFbeta anti-proliferative signal and increased cell proliferation. The specific inhibition of miR-146b-5p in papillary carcinoma cell lines significantly increased SMAD4 levels, restored the TGFbeta signal transduction and decreased cell growth. Altogether, our data confirm the oncogenic role of miR-146b-5p in thyroid follicular cells as a negative regulator of TGFbeta signaling pathway.

O gene SLC2A4 codifica a proteína GLUT4, fundamental na homeostasia glicêmica. OBJETIVO: Investigar o efeito do diabetes na expressão do GLUT4 pela atividade contrátil. MÉTODOS: Músculos sóleos de ratos não diabéticos (ND) e diabéticos tratados com insulina (DI) ou salina (DS) foram incubados e contraídos. A expressão de GLUT4, pAMPK e CAMKII foram analisados por PCR e Western blotting, e a atividade de MEF2D, GEF, HIF-1<font face=\"Symbol\">a e TR<font face=\"Symbol\">a1 por gel shift. Células C2C12 transfectadas com plasmídeos contendo os sítios de ligação para MEF2, HIF, e TR foram tratadas com AICAR ou cafeína. RESULTADOS: Em animais ND e DI, a contração aumentou o conteúdo de GLUT4, mas não nos DS. Em animais ND, a contração aumentou a atividade da AMPK e dos fatores MEF2D, GEF e TR<font face=\"Symbol\">a1, mas não nos DS. Em animais ND, os inibidores de AMPK e CAMKII aboliram o aumento do GLUT4 e da atividade de MEF2D e GEF. Em células C2C12 a cafeína e a AMPK ativaram os 3 sítios. CONCLUSÃO: O diabetes abole o aumento da expressão do GLUT4 sob a atividade contrátil devido a redução da atividade de MEF2D, GEF e TR<font face=\"Symbol\">a1 e AMPK. / The SLC2A4 gene encodes the GLUT4 protein, which is essential in glucose homeostasis. OBJECTIVE: To investigate the diabetes effect on muscle contraction-induced in SLC2A4 gene expression. METHODS: Soleus muscles of Non diabetic rats (ND) and diabetic treated with insulin (DI) or saline (DS) were incubated and contracted. The GLUT4, pAMPK and CAMKII expressions were analyzed by PCR and Western blotting, and the MEF2D, GEF, HIF-1<font face=\"Symbol\">a and TR<font face=\"Symbol\">a1 activity by gel shift. C2C12 cells transfected with plasmids containing the binding sites for MEF2, HIF, and TR were treated with AICAR or caffeine. RESULTS: Contraction increased the GLUT4 amount in animals ND and DI, but not in DS. In ND animals, contraction increased AMPK, MEF2D, GEF and TR<font face=\"Symbol\">a1 activity, but not in DS. In ND animals, AMPK and CAMKII inhibitors abolished the GLUT4 increase as like MEF2D and GEF activity. In C2C12 cells AMPK and caffeine activated the 3 sites. CONCLUSION: Diabetes abolishes the muscle contraction-induced GLUT4 increase due to reduced of MEF2D, GEF, TR<font face=\"Symbol\">a1 and AMPK activity.