Dans le but d’évaluer l’impact d’une exposition postnatale sur une population spécifique de neurones olfactifs, nous avons exposé au Lyral des souris transgéniques dont les neurones récepteurs olfactifs MOR23 expriment la protéine fluorescente, GFP. Nous avons évalué l’impact d’une exposition précoce sur la population des neurones MOR23, en utilisant plusieurs méthodes. Par des observations anatomiques, nous montrons que le nombre de neurones olfactifs exprimant MOR23 diminue chez les sujets traités. Cette baisse concerne principalement les neurones matures. Ensuite, des analyses en qPCR quantitatives sur de petits échantillons de cellules isolées indiquent que les neurones MOR23 des souris exposées expriment davantage de récepteurs, de canaux couplés aux nucléotides cycliques (CNGA2) et de phosphodiestérase (PDE1C). La surexpression du récepteur MOR23 par neurone est transitoire. Enfin, cette surexpression est corrélée avec les propriétés électriques des neurones en réponse au ligand du récepteur MOR23 étudiées en patch-clamp. Afin d’écarter tout effet aspécifique inhérent à une éventuelle toxicité du Lyral, nous avons réalisé des enregistrements d’électroolfactogramme (EOG), une étude « transcriptomique » (41 gènes) et une étude d’immunohistochimie sur la muqueuse olfactive montrant que l’EO reste intact après exposition de trois semaines au Lyral. Nous montrons également que l’effet est dépendant du couple ligand-récepteur. Enfin, par des observations comportementales, nous montrons que les souris exposées développent une préférence pour le Lyral et passent plus de temps à l’explorer.Ensemble, ces résultats suggèrent que les neurones olfactifs font preuve d’une certaine plasticité et sont capables de s’adapter à l’environnement / In order to investigate the consequences of postnatal odorant exposure on a specific population of olfactory sensory neurons (OSNs), we have taken the following experimental approach. MOR23-GFP mice were daily exposed to Lyral for 21 days starting at birth and three lines of investigations were carried out. Using anatomical analysis we observe that the density of OSNs expressing MOR23 decreases after odorant exposure. This decrease concerns primarily matures OSN (MOR23-OMP+). In order to study molecular changes within individual OSNs, mRNA levels for olfactory signaling pathway components were quantitatively analyzed using qPCR on GFP-labeled neurons (7 per mouse). mRNAs for CNGA2, PDE1C and MOR23 olfactory receptor were up-regulated in exposed mice, whereas ACIII transcript levels remained stable. This effect is not permanent: we observed an anatomical and a molecular recovery. Patch-clamp recordings on MOR23 dendritic knobs correlate with qPCR datas. To exclude any aspecific effect due to a possible Lyral toxicity we performed EOG, immunohistochemistry and qPCR on total olfactory epithelium (OE). These experiments show that 3 weeks of Lyral exposure does not damage the OE. Then qPCR on isolated cells reveals that the effect is couple ligand-receptor dependant: M71 neurons are not affected by acetophenone exposure. Finally, we performed behavioral experiments on mice from both groups. Exposed mice favored their exposure odor in olfactory preference test and spend more time exploring Lyral than non-exposed mice. These observations suggest that the environment can induce plasticity in olfactory sensory neurons

Amyloid PET imaging with [11C]PIB enabled detection of Aβ for the first time in vivo. However, [11C]PIB is a small molecule that binds only the insoluble Aβ plaque. Rather, the soluble Aβ aggregates are considered the cause of Alzheimer’s disease (AD). As such, a more sensitive and specific PET tracer is needed for tracking longitudinal AD pathology. Soluble Aβ aggregates likely interact with the metabotropic glutamate receptor 5 (mGluR5) to cause neurotoxic effects. However, with [11C]ABP688 PET we were unable to detect aberrant mGluR5 binding in AD mouse models, although we find elevated mGluR5 protein levels with immunoblotting. Antibodies are highly specific large molecules that can bind specifically to soluble Aβ aggregates, thus they can be a good marker for AD pathology. Unfortunately, due to their large size they cannot cross the blood-brain barrier (BBB). However, it is possible to shuttle antibodies into the brain by taking advantage of endogenous transporter systems on the BBB. By creating bispecific antibodies binding both to soluble Aβ aggregates and to the transferrin receptor (BBB target), we successfully transported the antibody into the brain and could visually detect soluble Aβ aggregates with PET. Recombinant expression further improved and optimized antibody design, creating smaller bispecific antibody-based constructs that had better pharmacokinetic properties allowing for earlier PET scanning (1 day instead of 3), and more sensitive signal. Lastly, using TCO-tetrazine click chemistry, we indirectly labeled our antibodies with fluorine-18, and could successfully perform PET already 11 h post-injection with a fluorine-18 labeled antibody.

La maladie d'Alzheimer (MA) est la maladie neurodégénérative la plus répandue à travers le monde et reste actuellement incurable. Le peptide beta amyloïde (Abeta), composant principal des plaques séniles retrouvées dans le cerveau des patients, joue un rôle majeur dans le développement de la MA, d'où l'importance de contrôler sa production et/ou son élimination. Dans cette optique, nous travaillons sur des molécules nommées métalloprotéases matricielles (MMPs). Bien qu'ayant été impliquées à la fois dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques dans système nerveux, leur rôle dans la MA reste encore relativement inexplorée. Nous avons utilisé comme modèle d'étude des souris qui développent les symptômes de la MA (déclin cognitif, mort des neurones). Nous montrons que deux MMPs, MMP-2 et MT1-MMP, augmentent leurs niveaux d'expression avec le vieillissement de l'animal et donc avec l'aggravation de la pathologie. Ceci a lieu dans l'hippocampe, une région du cerveau qui est particulièrement sensible car elle est impliquée dans l'apprentissage et la mémoire. Par la suite nous avons utilisé des cellules HEKswe qui produisent beaucoup d'Abeta et miment d'une certaine manière ce qui se passe dans le cerveau de la souris, afin de mieux appréhender la signification des augmentations de ces MMPs. Nous montrons que la surexpression de MT1-MMP dans ces cellules favorise la formation d'Abeta, alors que MMP-2 l'empêche. Ces résultats montrent pour la première fois une dualité fonctionnelle au sein de la famille des MMPs, et plus important, révèlent une nouvelle molécule amyloïdogénique (MT1-MMP) qui pourrait devenir à terme une cible thérapeutique. / We investigate the role of matrix metalloproteinases in the metabolism of beta amyloid peptide (Abeta) and its amyloid precursor protein (APP) in Alzheimer's disease (AD). Our results in the 5xFAD mouse model of AD indicate a cell-type and age-dependent upregulation of MMP-2 -and MT1-MMP active forms. This is concomitant with the increase of toxic forms of Abeta, but also of cytotoxic C99, a membrane fragment of APP generated by beta-secretase and that gives rise to Abeta after gamma-secretase cleavage. We show in HEK cells overproducing Abeta that while MT1-MMP interacts with APP and boosts C99 and Abeta production, MMP-2 does not interact with APP and degrades Abeta. These results uncover a MMP-specific regulatory crosstalk with amyloid and also MT1-MMP as a new pro-amyloidogenic proteinase. We want now to gain further insight into the mechanisms that support MT1-MMP effects, namely the possible modulation by MT1-MMP of beta- and gamma-secretase activities and/or APP trafficking.

Les modèles animaux jouent un rôle crucial dans les recherches précliniques, mais il existe plusieurs limites. Les états physiologiques et immunologiques chez les murins et les primates non humains sont radicalement différents à ceux de l'homme, en particulier la restriction du CMH, qui ne peut éliminer l'influence de la spécificité de l'espèce dans les expériences précliniques. Le but du travail était de générer un niveau plus élevé de souris transgéniques «HLA humanisées» qui pourraient imiter les réponses immunitaires humaines avec plus de précision et de fiabilité; à viser d’appliquer pour l'évaluation préclinique de la transplantation humaine, à l'identification de nouveaux épitopes et à l'évaluation des vaccins et des médicaments candidats. Dans la première partie. Nous rapportons d’une nouvelles souris transgéniques HLA immunodéficientes «HUMAMICE». Des souris HLA-A2+/+/DR1+/+/H-2-β2m-/-/IAβ-/-/Rag2-/-/IL-2rγ-/-/Perf-/- ont été établies, lesquelles exprimaient des molécules HLA humaines au lieu de H-2 murines et ne présentaient pas de lymphocytes murins. Ce statut immunodéficient a été inversé en transférant les cellules hPBMC HLA appariées fonctionnelles pour produisant ensuite des souris ayant un statut immuno-compétent avec un système immunitaire humain fonctionnel. L'immunisation du vaccin HBsAg a permis d'obtenir une production robuste et reproductible d'anticorpsspécifiques. En conclusion, ces résultats indiquent que le modèle hPBMC-HUMAMICE représente un modèle prometteur pour disséquer les réponses immunitaires humaines aux maladies humaines. Dans la seconde partie de cette étude, les souris HLA-A11+/+/DR1+/+/H-2-β2m-/-/IAβ-/- ont été établies. Cette nouvelle souche de souris possède une caractéristique restreinte par HLA-A11 et une capacité normale à répondre aux antigènes. L'immunisation de souris avec un vaccin recombinant HBsAg contre le VHB ou une protéine recombinante du VIH-1 a entraîné la génération de lymphocytes T cytotoxiques producteurs d'IFN-y et d'anticorps spécifiques. En outre, nous avons identifié deux épitopes restreints par HLA-A11 de la protéine GP EBOV et quatre de la protéine MERS-CoV S. En fin, ce modèle de souris HLA-A11/DR1 pourra faciliter l'identification des épitopes de lymphocytes cytotoxiques et auxiliaires restreints par le HLA-A11 dominants en Chine. Le modèle constituer un nouvel outil technique prometteur pour comprendre les mécanismes immunologiques et les nouveaux vaccins pour les populations d’Asie de l’Est. Durant cette thèse, nous avons créé deux modèles de souris humanisées novateurs et prometteurs portant une restriction HLA humaine qui pourraient servir de modèles d'infection pathogène et étudier les tumeurs, les mécanismes de transplantation et l'invention et l'évaluation des vaccins et des médicaments. / Animal models play critical roles in pre-clinical researches, while there are still several limitations. The physiological and immunological states in murine and non-human primates are radically district from those of mankind, especially the MHC restriction, which cannot eliminate the influence of species specificity in pre-clinical experiments.The aim of our work was to generate a higher level of “humanized” transgenic mice which could mimic human immune responses with more accuracy and reliability; furthermore, to apply the novel models in the evaluation of human transplantation, the identification of new epitopes, and the evaluation of candidate vaccines and drugs.In the first part of the study, novel immuno-deficient HLA transgenic mice "HUMAMICE" (HLA-A2+/+/DR1+/+/ H-2-β2m-/-/IAβ-/-/Rag2-/-/IL-2rγ-/-/Perf-/- mice) were established, which expressed human HLA molecules instead of murine H-2 and present no murine lymphocytes. This immuno-deficient status was reversed by transferring the functional HLA-matched hPBMCs and then producing mice with an immuno-competent status with a functional human immune system, led to high lymphocytes engraftment rates without GvHD. Immunization of HBsAg vaccine resulted in robust and reproducible production of specific antibodies. Inconclusion, these results indicated that the hPBMCs-HUMAMICE model represents a promising model to dissect human immune responses towards human diseases.In the second part of this study, the Chinese/East Asian HLA dominated HLA-A11/DR1(HLA-A11+/+/DR1+/+/H-2-β2m-/-/IAβ-/-) transgenic mouse strain was established. This novel mouse strain possesses HLA-restricted characteristic and a normal ability to respond to antigens. Immunization of mice with a recombinant HBV vaccine or a recombinant HIV-1 protein resulted in the generation of IFN-γ-producing cytotoxic T lymphocytes and specific antibodies. Furthermore, we identified two HLA-A11 restricted epitopes of EBOV GP protein and four of MERS-CoV S protein. Above all, HLA-A11/DR1 mice could facilitate the identification of Chinese dominant HLA-restricted CTL and Th epitopes and provide a new promising technical tool to understand immunological mechanisms and new vaccines.Taken together, we created two novel and promising humanize mouse models carrying human HLA restriction which could apply as pathogen infection models, and study tumors, transplantation mechanism, and the invention and evaluation of vaccines and drugs.

The prevention and treatment of obesity is a major problem of health care systems in affluent societies. Metabolism of adipose tissue belongs to the therapeutical targets, since accumulation of adipose tissue is the basis of obesity development. Experiments using transgenic mice with ectopic expression of brown- fat uncoupling protein 1 (UCP1) in white adipose tissue (WAT), verified a concept that obesity could be ameliorated by increasing energy expenditure in WAT. The goal of the experiments of this PhD Thesis was to characterize in detail the phenotype of this unique animal model of obesity resistance. We have shown that mitochondrial uncoupling in WAT resulted in increased oxidation of fatty acids (FA), in face of decreased lipogenesis and induced mitochondrial biogenesis in this tissue. In further studies, we aimed to modulate propensity to obesity be increasing FA oxidation in WAT in response to physiological stimuli. This could be accomplished in response to the combination treatment using n-3 polyunsaturated fatty acids (n-3 PUFA) and mild calorie restriction in mice fed high-fat diet. Synergistic induction of mitochondrial oxidative capacity and lipid catabolism in epididymal WAT was associated with suppression of low-grade inflammation of WAT, which is typical for obesity. The improvement of lipid...

Le but de la première partie de ce travail était de mieux comprendre la tumorigenèse thyroïdienne à<p>partir de modèles murins transgéniques développant des tumeurs de la thyroïde. Nous avons ainsi<p>analysé par microarrays l’expression génique au sein de thyroïdes de souris Tg-RP3 exprimant le<p>réarrangement RET/PTC3, responsable de cancers papillaires de la thyroïde chez l’homme (PTC), et<p>de souris Tg-E7 exprimant l’oncogène E7, responsable de cancers du col de l’utérus chez la femme.<p>Ces deux gènes étaient exprimés exclusivement dans la thyroïde grâce à un promoteur thyroglobuline.<p>Nous avons comparé les profils d’expression entre les différents génotypes (sauvages, Tg-RP3 et Tg-<p>E7) mais également entre différents âges (2, 6 et 10 mois). Sur le plan histologique, les souris Tg-E7<p>développaient d’énormes goitres avec une dysplasie de plus en plus marquée, mais n’ont pas démontré<p>de réelles lésions de carcinomes aux différents âges étudiés. Les thyroïdes de souris Tg-RP3<p>démontraient quand à elle une prolifération cellulaire et une croissance plus modérées, mais des<p>remaniements tissulaires plus importants, présents dès 2 mois, avec apparition de lésions de carcinome<p>chez de nombreux animaux essentiellement à 6 et 10 mois. Les résultats de l’analyse de l’expression<p>génique par microarrays rejoignaient ces observations histologiques. Dans les thyroïdes E7, ce sont<p>essentiellement les gènes impliqués dans le cycle cellulaire qui ont démontré une surexpression<p>significative. Dans les thyroïdes RP3, les processus cellulaires les mieux représentés par les gènes<p>surexprimés étaient déjà décrits comme des processus ayant un rôle important dans la tumorigenèse<p>thyroïdienne humaine :l’inflammation, le remodelage du milieu extracellulaire et l’angiogenèse. De<p>plus, plusieurs gènes classiquement surexprimés dans les PTC humains, l’étaient également dans les<p>thyroïdes RP3. Parmi ceux-ci le récepteur de la vitamine D (VDR) et la 1-alpha-hydroxylase<p>(CYP27B1), responsable de la conversion de la 25-hydroxyvitamine D3 en 1,25-dihydroxyvitamine<p>D3, ont particulièrement retenu notre attention étant donné une littérature croissante sur les effets antiprolifératifs<p>et immuno-modulateurs de la 1,25-dihydroxyvitamine D3 (calcitriol). Nous avons donc<p>étudié dans la deuxième partie de notre travail les effets anti-prolifératifs et transcripionnels du<p>calitriol sur plusieurs modèles thyroïdiens in vitro et in vivo. Si nous n’avons pu démontrer d’effets<p>concluants sur des lignées de cancers thyroïdiens humains, nous avons par contre démontré un effet<p>anti-prolifératif, le plus souvent dose-réponse, du calcitriol sur des cultures primaires de thyroïdes de<p>souris sauvages, Tg-RP3, Tg-E7 et humaines. Seule la 24-hydroxylase, intervenant dans l’inactivation<p>de la vitamine D, et le récepteur à la TSH ont démontré une surexpression significative en présence de<p>calcitriol par RTQ-PCR. Une étude d’expression génique par microarrays sur des cultures primaires de<p>thyroïdes RP3 et humaines traitées par éthanol (contrôle) ou calcitriol a permis de mettre en évidence<p>3 gènes significativement régulés dans le même sens, en l’occurrence sous-exprimés, en présence de<p>calcitriol :la nébulette, la thymopoïétine et la cycline E2. Le rôle exact joué par ces trois protéines<p>dans l’effet anti-prolifératif observé reste à déterminer. Les études in vivo de carence alimentaire en<p>vitamine D de souris Tg-RP3 n’ont pas démontré de différences significatives entre le groupe carencé<p>et non carencé que ce soit en termes de croissance glandulaire ou d’expression génique, après 2 ou 6<p>mois de carence. Seule la 1-alpha-hydroxylase est apparue significativement surexprimée après 2<p>mois, surexpression disparaissant après 6 mois. Cette régulation pourrait témoigner d’un mécanisme<p>d’adaptation de la thyroïde qui tente de contrer la carence en vitamine D circulante en augmentant la<p>concentration locale de vitamine D active. Ce phénomène disparaissant à 6 mois, il serait intéressant<p>de prolonger la carence au-delà de 6 mois pour assurer une réelle carence locale en 1,25-<p>dihydroxyvitamin D3. Nous avons ensuite traité des souris Tg-RP3 puis Tg-E7 par des doses variables<p>de CD578, un analogue « non calcimimétique » du calcitriol. Il est apparu que la dose ayant un effet<p>significatif au niveau transcriptionnel (surexpression de la 24-hydroxylase) était également la dose la<p>plus toxique, entrainant une hypercalcémie parfois létale. Le protocole principal a du être écourté en<p>raison d’un excès de mortalité. Le petit nombre d’animaux ayant survécu ne nous a pas permis de<p>conclure à une différence d’expression significative du Ki67 dans les thyroïdes de souris traitées par<p>CD578 par rapport aux souris contrôles. De nouvelles expériences devront donc être réalisées aux<p>doses les moins toxiques, administrées sur une plus longue période et sur un plus grand nombre<p>d’animaux, afin d’augmenter la probabilité d’observer un effet sur la prolifération, voire la<p>différenciation tissulaire. / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Pancreatic insulin-secreting beta cell failure is central to the development of diabetes. Therapeutic applications targeted at understanding and manipulating beta cell destruction mechanisms should enhance the preservation of functional beta cell mass and prevent diabetes. To this end, we have demonstrated that diabetogenic assaults (e.g., endoplasmic reticulum stress, glucolipotoxicity, and pro-inflammatory cytokines) attenuate the activation of beta cell pro-survival signaling pathways via a stress-inducible molecule called Mitogen-inducible gene 6 (Mig6). We discovered that the overabundance of Mig6 exacerbates stress-induced beta cell apoptosis and inhibits insulin secretion. Conversely, the deficiency of Mig6 partially protected beta cells from DNA damage-induced cell death. Further, we established that Mig6 haploinsufficient mice retained islet integrity and function and exhibited greater beta cell mass recovery following treatment with multiple low doses of the beta cell toxin streptozotocin. These data suggest that Mig6 may be a therapeutic target for beta cell preservation in diabetes.

La polykystose rénale autosomique dominante (PKRAD) est une maladie génétique rénale qui se manifeste par le développement de kystes au rein. Elle résulte de mutations dans le gène PKD1/polycystine-1 (PC-1), contenant un motif coiled-coil et dans le gène PKD2/PC-2 dont les fonctions restent à élucider. À partir d’un chromosome artificiel bactérien, le gène Pkd1 murin (BAC-Pkd1) a été modifié afin de générer 4 lignées de souris transgéniques délété du motif coiled-coil Pkd1Δcoiled-coil et 3 lignées contrôles Pkd1TAG possédant 1-35 copies du transgène. Ces 2 transgènes ont un profil d’expression identique à l’endogène et le niveau dépend du nombre de copies. Alors que les souris Pkd1TAG développent la PKRAD de sévérité proportionnelle au niveau d’expression, les lignées Pkd1Δcoiled-coil en sont épargnées. Ces résultats démontrent l’importance du motif coiled-coil dans la maladie. Les souris Pkd1Δcoiled-coil croisées par Pkd1-/- (létale à la naissance), Pkd1-/- ; Pkd1Δcoiled-coil survivent après la naissance et permettent d’analyser in vivo les interactions, la signalisation et le rôle physiologique du motif coiled-coil. Ces souris Pkd1-/- ; Pkd1Δcoiled-coil avec une copie du transgène présentent des kystes rénaux et meurent ~2 semaines alors que celles à hautes copies n’ont aucun phénotype comme les Pkd1TAG. Les résultats génétiques et biochimiques démontrent que Pc-1Δcoiled-coil est hypomorphe. Bien que Pc-1Δcoiled-coil subit son clivage autoprotéolytique, l’analyse du transport intracellulaire de Pc1Δcoiled-coil montre un délai de maturation. Alors qu’in vitro le trafic Pc-1/Pc-2 dépend du motif coiled-coil pour leur interaction, in vivo une interaction Pc-1Δcoiled-coil/Pc-2 est détectée, suggérant un site d’interaction distinct. Nos études in vivo démontrent que le motif coiled-coil de Pc-1 joue un rôle clé dans sa maturation et l’existence d’un nouveau partenaire de Pc-1 pour son transport intracellulaire. / Autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) is the most prevalent genetic disorder that is characterize by the formation of bilateral renal cysts and leads to kidney failure. It results from mutations in the PKD1/polycystin-1(PC-1) gene, containing a coiled-coil motif, and in the PKD2/PC-2 gene, the functions of which remain to be elucidated. From a bacterial artificial chromosome, the murine Pkd1 gene (Pkd1-BAC) was modified in order to obtain 4 transgenic mouse lines deleted from it coiled-coil motif (Pkd1Δcoiled-coil) and 3 Pkd1TAG control lines possessing 1-35 copies of the transgene. These two transgenes have an expression profile identical to the endogenous gene and their expression depends on the number of copies. While Pkd1TAG mice develop ADPKD with a severity proportional to the level of expression, the Pkd1Δcoiled-coil lines are spared. These results demonstrate the importance of the coiled-coil motif in the disease. Pkd1Δcoiled-coil mice crossed by Pkd1-/- (lethal by birth), Pkd1-/-; Pkd1Δcoiled-coil survive after birth and allow the interactions, signaling and physiological role of the coiled-coil motif to be analyzed in vivo. These Pkd1-/-; Pkd1Δcoiled-coil mice with one copy of the transgene show kidney cysts and die ~ 2-weeks while high-copy ones have no phenotype as opposed to Pkd1-/-; Pkd1TAG who eventually develop cyst after 1 year. The genetic and biochemical results demonstrate that Pc-1Δcoiled-coil is hypomorphic. Although Pc-1Δcoiled-coil undergoes its autoproteolytic cleavage, analysis of the intracellular transport of Pc-1Δcoiled-coil shows a delay in maturation. While Pc-1 and Pc-2 appear to interact in vitro through their coiled-coil motif and co-transport, a Pc-1Δcoiled-coil -Pc-2 interaction is conserved in the kidney, suggesting a distinct mechanism of interactions in vivo. Thus, our results show that the coiled-coil motif of Pc-1 in vivo is involved in the maturation independently of Pc-2, highlighting the existence of a critical partner in intracellular transport.

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