Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

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Diss. (sammanfattning) Umeå : Umeå universitet, 2010. / Härtill 4 uppsatser.

A faringite estreptocócica desencadeada pelo Streptococcus pyogenes pode resultar em uma série de doenças humanas e complicações como a febre reumática (FR) em indivíduos predispostos não tratados. A FR é uma doença autoimune que afeta mais de 20 milhões de crianças em países em desenvolvimento. A proteína M presente na membrana do S. pyogenes representa o maior fator de virulência da bactéria, e é objetivo de estudos para o desenvolvimento de uma vacina contra essa patologia. Atualmente mais de 200 tipos de proteínas M foram descritos na literatura e a sua porção Cterminal é conservada entre os diferentes tipos. Desenvolvemos um protótipo de vacina que compreende 55 resíduos de aminoácido da porção C-terminal, denominado StreptInCor. Neste trabalho analisamos a resposta humoral e celular específica contra o peptídeo sintético StreptInCor, usando camundongos transgênicos portadores de HLA de classe II humanos DR2, DR4, DQ6 e DQ8. O protocolo de imunização consistiu em administrar 50 g do StreptInCor adsorvido em 300 g de hidróxido de alumínio nos dias 0 e 14. Os grupos controles foram injetados com salina nas mesmas condições. O soro obtido no 28º dia foi testado por ensaio imunoenzimático (ELISA) para verificarmos a presença de anticorpos contra o StreptInCor e os esplenócitos destes animais, obtidos nessa data, foram utilizados para ensaios de proliferação celular na presença do StreptInCor. Testes de segurança foram efetuados e não observamos reação cruzada contra a miosina cardíaca e após 12 meses de acompanhamento, amostras de tecidos desses animais foram submetidas à análise histológica. Em conclusão não verificamos indícios de reações autoimunes nos animais imunizados com o StreptInCor e os resultados obtidos mostram a capacidade do StreptInCor em desencadear uma resposta imune, duradoura e segura em camundongos portadores de moléculas HLA de classe II / Streptococcal pharyngitis triggered by Streptococcus pyogenes throat infection can result in rheumatic fever (RF) and rheumatic heart disease (RHD) in untreated susceptible individuals. RF is an autoimmune disease that affects more than 20 million children in developing countries. M protein is the major factor of virulence of the bacteria, and it has been studied to develop a vaccine. Currently more than 200 M protein types have been described and its Cterminal domain is conserved in many different serotypes. We developed a vaccine epitope (StreptInCor) composed by 55 amino acid residues of the Cterminal portion of the M protein. In the present work we analyze the ability of the StreptInCor of induce immune response in HLA class II transgenic mice. The transgenic mice harboring the HLA Class II DR2, DR4, DQ6 and DQ8 were immunized subcutaneously with 50 g StreptInCor adsorbed onto 300 g of aluminum hydroxide gel on days 0 and 14. Control groups were immunized with vehicle (Saline) in same conditions. The sera were obtained on day 28 and tested by ELISA to verify the presence of antibodies. The specific cellular immune response was evaluated by proliferation assay using splenocytes. No cross reaction with cardiac myosin were observed. Tissue samples from immunized mice followed by 12 months were analyzed in order to verify if StreptInCor induces some histological damage. No autoimmune or deleterious reactions were observed. In conclusion our results indicate that StreptInCor Induces a good and prolonged and safe immune response in HLA class II transgenic mice

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Les néoplasies myéloprolifératives (NMP) sont des maladies hématologiques acquises de la cellule souche hématopoïétique. Une mutation activatrice de la protéine de signalisation JAK2, JAK2V617F, a été identifiée chez la moitié des patients atteints de NMP Philadelphie négatives. Il a été rapporté que les patients avec des NMP avaient une augmentation du risque thrombotique et de la densité microvasculaire dans la rate et la moelle osseuse, sans explication physiopathologique claire. Des travaux récents ont mis en évidence la présence de la mutation JAK2V617F non seulement dans les cellules sanguines mais également dans les cellules endothéliales (CE) de ces patients. Nous faisons l’hypothèse que la présence de JAK2V617F dans les CE pourrait modifier leurs propriétés expliquant l’augmentation de l’angiogenèse dans les NMP. Pour répondre à cette hypothèse, nous avons voulu étudier le phénotype angiogénique des cellules endothéliales portant la mutation JAK2V617F. In vitro, nous disposons des particules lentivirales permettant d’obtenir des CE JAK2V617F par transduction lentivirale. In vivo, nous disposons des souris transgéniques exprimant la mutation JAK2V617F de manière conditionnelle (JAK2V617F/WT) grâce à la stratégie Cre-lox. Pour répondre à notre hypothèse, il été nécessaire de travailler avec des modèles murins exprimant la mutation JAK2V617F spécifiquement dans les CE sans atteinte concomitante de la lignée hématopoïétique. Dans un premier temps, nous avons voulu caractériser deux modèles endothéliaux inductibles couramment utilisés, Cdh5(PAC)-CreERT2 et Pdgfb-iCreERT2, en termes d’efficacité et de spécificité de recombinaison dans les cellules endothéliales vis-à-vis du compartiment hématopoïétique. Nous avons démontré que les souris adultes Cdh5(PAC)-CreERT2 pouvaient être utilisées comme modèles endothéliaux spécifiques, avec toutefois la mise en garde que la recombinaison est très variable entre les souris. Nous avons constaté que les souris PDGFB-iCreERT2 sont appropriées pour cibler les cellules endothéliales dans une large gamme d’organes à l'exception du foie, et devraient être utilisées dans les quatre premières semaines qui suivent l'induction, pour cibler un gène d’intérêt au niveau des cellules endothéliales, sans qu’il ait une atteinte concomitante dans la lignée hématopoïétique. Nous avons ensuite étudié les propriétés angiogéniques des cellules endothéliales JAK2V617F, in vitro en utilisant des HUVEC transduites avec un lentivirus permettant l’expression de JAK2V617F, et in vivo avec les souris Pdgfb-iCreERT2;JAK2V617F/WT. Nous avons démontré que les HUVEC JAK2V617F avaient un profil proangiogénique lié à une capacité proliférative élevée, résultant de l’activation de la voie JAK2/STAT3/PI3K. L’avantage hyperprolifératif que confère la mutation JAK2V617F aux cellules endothéliales a été confirmé in vivo avec le modèle de la vascularisation post-natale de la rétine, avec toutefois une diminution de la densité du réseau vasculaire due à une augmentation de la régression vasculaire au niveau de la rétine des souris Pdgfb-iCreERT2;JAK2V617F/WT. / Myeloproliferative neoplasms (MPNs) are acquired hematopoietic stem cell disorders. An activating mutation in the JAK2 signaling protein, JAK2V617F, was identified in half of the patients with Philadelphia chromosome-negative MPNs. It has been reported that patients with MPN had an increased risk of thrombosis but also an increased microvessel density in the spleen and bone marrow with no clear pathophysiological explanation. Several recent studies have demonstrated the presence of JAK2V617F mutation not only in blood cells but also in endothelial cells (EC) in MPN patients. We hypothesized that the presence of JAK2V617F in EC could change their properties leading to an increased angiogenesis process in MPNs. To address this question, our aim was to study the angiogenic phenotype of endothelial cells carrying the JAK2V617F mutation. For the in vitro experiments, we used lentiviral transduction of human JAK2V617F in EC. For the in vivo approach, we used transgenic mice (JAK2V617F/WT) that conditionally express JAK2V617F through Cre-lox strategy. To investigate our hypothesis, it was necessary to work with mice that express JAK2V617F specifically in EC without concomitant expression in hematopoietic cells. We first characterized two commonly-used inducible endothelial models, Cdh5(PAC)-CreERT2 and Pdgfb-iCreERT2, in terms of efficiency and specificity of recombination in endothelial cells. We showed that adult Cdh5(PAC)-CreERT2 mice can be used as specific endothelial model with however the wariness that recombination is highly variable among mice. We found that Pdgfb-iCreERT2 mice are appropriate to target endothelial cells in a wide range of organs except liver, and should be used within the four weeks after induction of Cre-mediated recombination to target a gene of interest in endothelial cells, without having a concomitant expression in hematopoietic lineage. We then studied the angiogenic properties of JAK2V617F endothelial cells, in vitro using JAK2V617F transduced HUVECs, and in vivo using Pdgfb-iCreERT2;JAK2V617F/WT mice. We observed that JAK2V617F HUVECs had a proangiogenic profile that was related to a highly proliferative potency, and that this phenotype results from a constitutive activation of JAK2/STAT3/PI3K pathway. The hyperproliferative advantage conferred by JAK2V617F to endothelial cells was confirmed in vivo using the postnatal vascularization model of the retina, with however a decrease in the density of the vascular network due to an increased vascular regression in Pdgfb-iCreERT2;JAK2V617F/WT mice’s retinas.

Rasa3 est un membre de la famille GAP1 des GTPase activating proteins. Cette protéine stimule la fonction GTPase intrinsèque des petites protéines G telles que Ras et Rap. Rasa3 présente une haute affinité pour l’Ins(1,3,4,5)P4 et le PtdIns(4,5)P2, et est principalement exprimée dans les cellules du système hématopoïétique chez la souris.<p>Dans le but d’étudier chez la souris le rôle physiologique de Rasa3 dans les cellules hématopoïétiques, nous avons d’une part généré et analysé des souris transgéniques surexprimant une forme normale (TgN) ou mutée et catalytiquement inactive (TgM) de la protéine Rasa3 dans les lymphocytes B et/ou T. D’autre part, nous avons reçu des souris Rasa3+/- exprimant une protéine Rasa3 tronquée et catalytiquement inactive. Comme les souris Rasa3-/- meurent pendant la gestation, des transferts de cellules hématopoïétiques souches de foie fœtal d’embryons Rasa3-/- ont été réalisés dans des souris SCID. Les souris SCID après reconstitution développent le système hématopoïétique des souris Rasa3-/-.<p>Nous avons découvert que l’expression de Rasa3 est régulé au niveau de l’ARNm et de la protéique après activation des lymphocytes B par la voie du récepteur aux antigènes (BCR).<p>L’analyse des souris Rasa3 TgN a permis de mettre en évidence une diminution de la survie des lymphocytes B in vitro et une diminution de la réponse immune à un antigène T-indépendant (TI) in vivo. Les souris TgM présentent un phénotype inverse aux souris TgN.<p>Six à 8 semaines après reconstitution, les souris SCID Rasa3-/- présentent un phénotype opposé à celui des souris TgN :leurs lymphocytes B ont une meilleure survie in vitro et une meilleure réponse immune à un antigène TI in vivo. On observe également chez ces souris SCID Rasa3-/- une augmentation du nombre de lymphocytes B dans certaines sous-populations spléniques.<p>L’observation prolongée des souris SCID Rasa3-/- a mis en évidence une diminution de leur survie. A l’autopsie, 90% d’entre elles développent une splénomégalie reflétant une hématopoïèse extra-médullaire. Soixante pourcents d’entre-elles présentent de l’ostéosclérose dans de la cavité médullaire du fémur, associée à une augmentation du pourcentage de mégacaryocytes. D’un point de vue sanguin, les souris SCID Rasa3-/- développent une thrombocytopénie sévère. Des hémorragies et une anémie régénérative ont également été observées. Les causes exactes de la thrombocytopénie doivent encore être investiguées dans le cadre de ce travail.<p>Enfin, environ 15 % des souris SCID Rasa3-/- ont montré une infiltration massive de la rate et de la moelle osseuse par des cellules progénitrices CD117+, suggérant qu’une fraction d’entre-elles développent une leucémie myéloïde aigue.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les phosphoinositides (PI) sont impliqués dans de nombreux processus biologiques cellulaires, tels que la régulation du cytosquelette d'actine, le trafic vésiculaire membranaire et les voies de signalisation médiées par des récepteurs membranaires. Le métabolisme des phosphoinositides est un processus hautement régulé par un ensemble de PI-kinases et PI-phosphatases. Des mutations dans ces enzymes sont associées à des maladies tels que le syndrome de Lowe, le diabète de type 2, les désordres bipolaires et le cancer.<p>\ / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La cellule de Purkinje constitue la seule sortie du cortex cérébelleux. En étudiant les caractéristiques de sa décharge spontanée sur l’animal éveillé, nous pouvons avoir un aperçu de l’intégration par le cortex cérébelleux de ses deux entrées excitatrices, les fibres moussues et les fibres grimpantes. Les souris transgéniques constituent une opportunité réelle de mieux comprendre le fonctionnement et les dysfonctionnements du cortex cérébelleux. Dans ce travail, nous décrivons la décharge spontanée des cellules de Purkinje chez l’animal normal et dans différents modèles de souris ataxiques. Nous avons ainsi mis en évidence différents patterns d’activité correspondant à différents degrés d’ataxie. Ainsi, sur les souris consommant chroniquement de l’éthanol et sur les souris SCA1, qui présentent un très léger trouble de la coordination motrice, nous avons trouvé une fréquence de décharge diminuée des spikes simples et des spikes complexes, sans augmentation de la rythmicité ni émergence d’oscillation du potentiel de champ de local. Les souris déficientes en calbindine, en calrétinine, en parvalbumine, en Ube 3A maternelle, ou ayant subi in utero un syndrome d’alcoolisme fœtal présentent un trouble de la coordination plus net, mais nécessitant toujours des tests adaptés pour être mis en évidence. Ces souris présentent une oscillation rapide soutenue par la décharge rythmique et synchrone des cellules de Purkinje. Cette oscillation est synchronisée dans l’axe des fibres parallèles, et est inhibée par les inhibiteurs des gap junctions, des récepteurs GABAA et NMDA. Par contre, les souris BK-/- dont l’ataxie est évidente même en conditions standards, présentent une oscillation lente synchronisée dans les axes sagittal et frontal, en phase avec les bursts des cellules de Purkinje et avec la décharge des cellules de Golgi. L’existence de ces différents patterns qui regroupent des conditions physiopathologiques qui n’ont pas d’autre point commun qu’un même niveau de déficit de la coordination motrice suggère que les troubles cérébelleux puissent être classifiés en un nombre limité de catégories permettant ainsi une approche thérapeutique plus ciblée. / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Nous avons généré des souris déficientes pour les gènes codant pour les échangeurs Na/Ca de type I (NCX1) et de type III (NCX3) afin d'étudier, in vivo, le rôle de ces deux protéines.<p>L‘analyse phénotypique des souris adultes totalement déficientes pour le gène Ncx1 (Ncx1-/-) n'a pu être menée étant donné que ces souris décèdent au cours du développement embryonnaire.<p>Les souris déficientes pour le gène Ncx3 (Ncx3-/-) sont viables et fertiles. Nous avons analysé l'effet de l'inactivation du gène Ncx3 dans le muscle squelettique et plus particulièrement au niveau de la jonction neuromusculaire.<p>L'analyse histologique des muscles squelettiques de souris Ncx3-/- a révélé des altérations des fibres musculaires caractérisées par la présence de foyers de fibres nécrotiques et d'infiltrats de cellules mononuclées.<p>L'analyse électromyographique classique a montré un électromyogramme anormal du muscle gastrocnémien de souris Ncx3-/-, révélant une affection neuromusculaire pré- et post-synaptique caractérisée par (i) la petitesse de l'amplitude de la réponse M au repos, (ii) le décrément après stimulation répétitive à basse fréquence, (iii) l'incrément après stimulation répétitive à haute fréquence et (iv) la facilitation post-exercice. L'électromyographie à fibre unique a révélé une MCD élevée et des blocages anormaux de la transmission neuromusculaire, reflétant une atteinte post-synaptique de la jonction neuromusculaire chez les souris Ncx3-/-. L'ensemble de ces anomalies électromyographiques sont les caractéristiques du syndrome myasthénique de Lambert-Eaton.<p>Finalement, pour déterminer les conséquences de l'inactivation du gène Ncx3 sur l'activité physique des souris Ncx3-/-, nous avons réalisé des tests comportementaux sur ces souris. Ces tests ont permis de détecter un épuisement et une faiblesse musculaire accrus à l'effort chez ces souris.<p>En conclusion, nos observations montrent que les souris Ncx3-/- présentent des anomalies électromyographiques similaires à celles du syndrome myasthénique de Lambert-Eaton. Ces résultats suggèrent que l'échangeur NCX3 est peut-être impliqué dans la pathogenèse de certaines formes de cette maladie.<p>Des études supplémentaires afin de confirmer notre hypothèse devront donc être réalisées.<p>/<p>We produced and analyzed mice deficient for Na/Ca exchanger 3 (NCX3), a protein which mediates cellular Ca2+ efflux (forward mode) or Ca2+ influx (reverse mode) and thus controls intracellular Ca2+ concentration. NCX3-deficient mice (Ncx3-/-) present a skeletal muscle fiber necrosis and a defective neuromuscular transmission, reflecting the absence of NCX3 in the sarcolemma of the muscle fibers and at the neuromuscular junction. The defective neuromuscular transmission is characterized by the presence of electromyographic abnormalities including low compound muscle action potential amplitude, a decremental response at low frequency nerve stimulation, an incremental response and a prominent post-exercise facilitation at high frequency nerve stimulation as well as neuromuscular blocks. The analysis of quantal transmitter release in Ncx3-/- neuromuscular junctions revealed an important facilitation superimposed on the depression of synaptic responses and an elevated delayed release during high frequency nerve stimulation. It is suggested that Ca2+ entering nerve terminals is cleared relatively slowly in the absence of NCX3, thereby enhancing residual Ca2+ and evoked and delayed quantal transmitter release during repetitive nerve stimulation. Our findings indicate that NCX3 plays an important role in vivo in the control of Ca2+ concentrations in the skeletal muscle fibers and at the neuromuscular junction.<p> / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished