Made available in DSpace on 2016-01-15T01:05:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000477024-Texto+Completo-0.pdf: 18287406 bytes, checksum: a76247b63c9874ac8f9c628b100c9e0b (MD5) Previous issue date: 2015 / Dendritic cells (DCs) are the major antigen-presenting cells. They provide three main signals to fully activate T cells. Signal one is when the complex peptide:MHC (p:MHC) expressed by DC is recognized by T cell receptor; signal two is the expression of co-stimulatory molecules from the B7 family (CD80 and CD86). The third signal consists in the cytokines produced by DCs, which will bias the quality of T cell response. Once one of this signal is blocked/interrupted, T cells are not fully activated. T cells are involved in the eradication of pathogens, but also in the pathogenesis of several disorders and, strategies that modulate signal two are being used to treat these disorders. Novel therapies that inhibit the second signal (checkpoint blockade) or T cell modulation by these molecules have being used/tested to manage tumors, autoimmune disorders and transplant rejection. Our group demonstrated that the M. tuberculosis protein DnaK (prokaryote Hsp70) has an immunosuppressive role on DCs, and can suppress rejection in a murine skin allograft model. Nevertheless, the molecular mechanism involved in this response need to be further elucidated. In the present work, we demonstrated that the treatment of murine DC with DnaK could decrease the basal levels TNF-α, IFN-γ and MCP-1 produced by these cells. This modulation was concomitant with a downregulation of the transcription factors C/EBPβ and C/EBPδ in a TLR2-ERK-STAT3-IL-10-dependent way. Beyond the signal three, DnaK could also downregulate the expression of MHC II (signal one) and CD86 (signal theree) on DCs, through the induction of a molecule called MARCH1. We developed an-situ treatment of skin grafts with DnaK prior the transplant. We observed that this treatment prolongs allograft survival with a decreased alloimmunity, and this dependent on MARCH1.The molecular pathway TLR2-ERK-STAT3-IL-10 was required for MARCH1 induction by DnaK. Moreover, we found that DnaK modulates a specific skin migratory DC – the CD103+ DCs. This is the major subset involved in skin allograft rejection. We tested in which innate receptors DnaK could bind and found that DnaK could not bind directly on TLR2, but in the LOX-1 and Siglec-E receptor, in a LOX-1/Siglec-E/TLR2 complex. Finally, from the data obtained we patented a new formulation and method to treat allografts prior the transplantation. Thus, DnaK tolerizes dendritic cells through the modulation of the three signals required to activate T cells. We believe that consists an innovative strategy to treat inflammatory disorders, rejection, asthma and sepsis. / Células dendríticas (DCs) são as principais células apresentadoras de antígenos e fornecem três sinais principais para a ativação completa das células T. O primeiro sinal consiste na apresentação do complexo peptídeo:MHC; o segundo sinal é a expressão de moléculas co-estimulatórias da família B7, como o CD80 e CD86, e o terceiro consiste no conjunto de citocinas produzidas pelas DCs que irão moldar o tipo de resposta T que será gerada. Uma vez que algum desses dois sinais é interrompido as células T não são ativadas de forma completa e, ainda, podem entrar em anergia ou apoptose. As células T estão envolvidas não apenas em respostas de defesa, mas também em uma série de patologias, e estratégias que visam sua ativação ou inibição vem sendo usadas no manejo dessas doenças. Terapias que visam a inibição do segundo sinal (checkpoint blockade) ou a modulação das células T pelas moléculas co-inibitórias tem sido testadas e utilizadas para tumores, autoimunidade e transplantes. Nosso grupo demonstrou que a proteína DnaK (Hsp70 procariótica) de M. tuberculosis tem papel imunossupressor em células dendríticas e in vivo, podendo diminuir a rejeição de transplantes cutâneos em camundongos. Porém, os mecanismos envolvidos nessa resposta ainda precisam ser elucidados. No presente trabalho, mostramos que a DnaK foi capaz de diminuir a expressão basal de TNF-α, IFN-γ e MCP-1 em DCs de camundongos. Essa modulação foi concomitante com a diminuição de dois fatores de transcrição – C/EBPβ e C/EBPδ – de maneira dependente da via molecular TLR2-ERK-STAT3-IL-10 nas DCs. Além do terceiro sinal, a DnaK pode modular a expressão dos níveis de MHC II (primeiro sinal) e CD86 (segundo sinal) nas DCs, através da indução de uma molécula chave chamada MARCH1. Em um modelo murino de aloenxerto cutâneo, o tratamento local com a DnaK, antes do transplante, prolongou a sobrevida do enxerto e diminuiu a aloimunidade de maneira dependente de MARCH1.A indução de MARCH1 pela DnaK foi dependente da via molecular TLR2-ERK-STAT3-IL-10 nas DCs. Além disso, demonstramos que a DnaK modula exclusivamente um subtipo de DC migratório da pele – as DCs CD103+. Também observamos que esse subtipo de DC é o principal subtipo celular envolvido na rejeição de transplantes de pele, gerando um conceito biológico novo nessa área. Mapeamos os receptores inatos nos quais a DnaK pode se ligar. Testamos dez receptores inatos e vimos que essa proteína não se liga diretamente no TLR2, mas sim nos receptores LOX-1 e Siglec-E, formando o complexo LOX-1/Siglec-E/TLR2. Finalmente, a partir dos dados obtidos nessa tese, formulamos uma composição e um método para a modulação do enxerto antes da realização do transplante, e depositamos uma patente junto ao INPI. Portanto, a DnaK pode tolerizar as células dendríticas através da modulação dos três sinais necessários para a ativação das células T. Acreditamos que essa estratégia pode ser utilizada no tratamento de patologias inflamatórias, incluindo a rejeição a transplantes.

Orientador: Maria Beatriz Puzzi, Maria Helena Stangler Kraemer / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-04T03:54:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souto_LuisRicardoMartinhao_M.pdf: 2402921 bytes, checksum: a79b6ae181ce1b24d01ec608815d8bf7 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: A obtenção de uma pele humana que apresente derme e epiderme, reconstruída a partir de células isoladas de pacientes, possibilita a realização de enxertos autólogos de pele reconstruída em laboratório (in vitro) em pacientes com áreas doadoras escassas além de permitir ensaios com substâncias químicas e drogas in vitro e não mais in vivo. A partir da cultura de fibroblastos humanos, é possível obter um número suficiente de células que podem ser injetadas em uma matriz de colágeno bovino tipo I que, mantida imersa em meio de cultura, específico para fibroblastos, permite a formação de uma derme humana reconstruída in vitro. Sobre essa derme, através de cultura de queratinócitos e melanócitos humanos, forma-se uma epiderme diferenciada levando à formação de uma pele humana reconstruída in vitro, constituída de derme e epiderme associadas. Essa pele humana formada é, histologicamente, semelhante à pele humana in vivo. Na derme, identifica-se o tecido colágeno, com suas células, e a matriz extracelular organizados paralelamente à epiderme. Esta se desenvolve em várias camadas. Não há distinção entre derme e epiderme no experimento controle, onde não foi utilizado o colágeno bovino tipo I / Abstract: The technique to obtain human skin presenting dermis and epidermis reconstructed from cells isolated from patients allows the performance of autologous grafts of skin reconstructed in laboratory (in vitro) on patients with scarce donor sites, in addition to permitting trials with chemical substances and drugs no more in vivo, but in vitro. It is possible to obtain a sufficient number of cells from human fibroblast culture that can be injected in bovine collagen type I matrix and kept submerged in a specific culture medium for fibroblasts. This will permit the formation of human dermis reconstructed in vitro. On this dermis, through culture of human keratinocytes and melanocytes, a differentiated epidermis is formed, leading to the creation of human skin reconstructed in vitro, composed of associated dermis and epidermis. This human skin is histologically formed in the same way as human skin in vivo. Collagen tissue can be identified in the dermis, with its cells and extracellular matrix organized in parallel to the epidermis, which is developed in several layers / Mestrado / Patologia Clinica / Mestre em Ciências Médicas

Extensas lesões na pele expõem o organismo a uma série de agentes agressores, dificultando a reparação espontânea da pele e muitas vezes levando o paciente a óbito. Nesse caso, se não houver áreas doadoras de autoenxertos, pode se utilizar aloenxertos. Neste tipo de enxerto, os tecidos são processados em Bancos de Tecidos, onde se pode empregar a radiação ionizante como método de esterilização. De acordo com estudos in vitro, a radiação gama, em doses acima de 25 kGy, provoca desestruturação das fibrilas de colágeno I da derme conservada em glicerol na concentração de 85%, reduzindo significativamente a resistência à tração dos tecidos irradiados. Observações clínicas sugerem, ainda, integração mais rápida da derme humana, conservada em glicerol e submetida à radiação ionizante, com os tecidos do receptor, quando comparada à derme somente conservada em glicerol. Para verificar se essas alterações relatadas in vitro, comprometeriam o emprego in vivo, de amostras de pele humana, submetidas à radiação gama, foram realizados transplantes de peles humanas, irradiadas ou não, em camundongos Nude. A pele dos camundongos foi submetida à análise macroscópica, imagens de tomografia de coerência óptica, histologia e ensaios biomecânicos. Foi possível concluir que os enxertos irradiados a 25 kGy promoveram uma contração inicial maior, mas essa alteração não interferiu na dimensão da área final de reparação, ainda, os animais que receberam esses enxertos apresentaram mais rápido fechamento da ferida em comparação com os demais, além disso o emprego de enxertos irradiados (25 e 50 kGy) promoveu a formação de um processo de reparação mais organizado e sem efeitos significantes nas propriedades biomecânicas. / Extensive skin lesions expose the body to damaging agents, which makes spontaneous regeneration difficult and, in many cases, leads patient to death. In such cases, if there are no donating areas for autograft, allografts can be used. In this type of graft, tissue is processed in tissue banks, where it can be subjected to radiosterilization. According to in vitro studies, gamma radiation, in doses higher than 25 kGy, induces alterations in skin preserved in glycerol at 85%, reducing the tensile strength of irradiated tissue. Clinical observation also suggests faster integration of such graft with the receptors tissue. In order to assess if the alterations observed in vitro, would compromise in vivo use, transplants of human tissue, irradiated or not, were performed in Nude mice. The skin of the mice was subjected to macroscopic analysis, optical coherence tomography imaging, histological and biomechanical assays. It was possible to conclude that grafts irradiated with 25 kGy promoted greater initial contraction, without alteration of the final dimensions of the repair area, also displaying a faster closing of the wound. Moreover, the use of irradiated grafts (25 and 50 kGy) enabled the formation of a more organized healing process without significant effects on biomechanical properties.

O presente estudo foi realizado para esclarecer o surgimento de vesículas subepidérmicas em enxertos de pele comumente descritos como áreas enxertadas. Devido à discrepância existente entre a literatura, que afirma surgirem vesículas nessas áreas, e a nossa experiência clínica, onde não observamos tal fato, decidimos investigar o problema. Para isso, estudamos a transição dermoepidérmica (TDE), em 23 pacientes submetidos à enxertia de pele, para verificar se há ou não alteração dessa estrutura que pudesse justificar a formação de vesículas. Nos 23 pacientes estudados foram feitas duas biópsias: a primeira, imediatamente antes da excisão do enxerto, na área doadora - pele sã, considerada como amostra padrão normal da TDE - Amostra Padrão AD. Após 10 dias, realizou-se uma segunda biópsia, com o mesmo vazador, próxima à área da primeira biópsia - Amostra Teste - ENX. Cada amostra foi dividida em 2 partes iguais (46 amostras) e estudadas por microscopia de luz e por imunofluorescência direta (imunomapeamento), pesquisando-se a possível alteração da zona da membrana basal (ZMB) na TDE através dos antígenos penfigóide bolhoso, laminina, colágeno IV e colágeno VII. Na microscopia de luz estudou-se, em cada biópsia, a relação entre a medida linear do relevo da trasição dermoepidérmica e a medida linear do relevo da superfície da camada granulosa, logo abaixo da camada córnea, equivalente a medida linear da superfície da pele. Nas 46 amostras as análises por microscopia de luz e de imunomapeamento para os quatro antígenos evidenciou-se a manutenção do mesmo padrão morfológico. Não houve diferença no imunomapeamento. Observou-se relações lineares das medidas com médias de 1,17 para a amostra AD e 1,44 para a amostra ENX, diferença que foi estatisticamente significativa, porém conservando a manutenção do padrão da TDE em relação à pele normal. Foi observada a manutenção do padrão do relevo da TDE no enxerto, em relação à pele sã, doadora. / SUMMARY: The present study has been done to elucidate the onset of subepidermal blisters in skin grafts, usually mistaken as grafted sites. Due to the discrepancy between literature - assigning this onset of blisters in grafts and our experience opposite we have decided to carry out this study. To do so we have studied the dermal-epidermal junction in 23 burned patients who underwent skin grafting so that we could verify whether or not there could be any alteration in the dermal-epidermal junction structure that may explain this fact. Among the 23 studied patients, two biopsies were carried out: the first one just before harvesting the skin graft from donor site healthy skin. The so called sample was regarded as an ordinary standard one of the dermal-epidermal junction STANDARD SAMPLE - DS. After graft take, by ten days, a second biopsy was performed with the same punch, close to the first biopsy TEST SAMPLE GS. Both samples were split into two equal parts (46 samples) and studied using light microscopy and direct immunofluorescence (immune mapping), searching for possible alterations in basement membrane zone in the dermal-epidermal junction through bullous pemphigoid, laminin and types IV and VII collagen antigens. On light microscopy, relation between the linear measure of dermal-epidermal junction projection and that of stratum granulosum surface, just underneath the stratum corneum, corresponding to skin surface, was studied in each biopsy. The four analyses of the antigens by light microscopy and direct immunofluorescence in the 46 samples clearly showed the keeping of the same pattern, either for STANDARD SAMPLE DS or TEST SAMPLE GS. There were no differences on the immune mapping. Regarding the relation of the linear measures it was noted a mean of 1.17 for STANDARD SAMPLE DS and a mean of 1.44 for TEST SAMPLE GS. Such difference was statistically significant. Nevertheless, it maintained the keeping of the same pattern of dermal-epidermal junction when compared to healthy skin.

INTRODUÇÃO: Os ferimentos descolantes nos membros inferiores frequentemente se apresentam como lesões graves. Há dificuldade na decisão sobre o tratamento mais adequado, o reposicionamento e sutura do retalho ou o emagrecimento e enxertia da pele avulsionada. Este estudo avaliou os pacientes com ferimentos descolantes nos membros inferiores, analisando o perfil epidemiológico e a evolução dos pacientes de acordo com o tratamento realizado. Após a análise dos dados e a revisão da literatura, propõe-se um protocolo para padronização do atendimento. MÉTODOS: Foram avaliados retrospectivamente 42 pacientes vitimas de ferimentos descolantes em membros inferiores atendidos no HC-FMUSP entre julho de 2003 e junho de 2007. Os pacientes foram divididos de acordo com o tratamento em 2 grupos: grupo 1 (n = 21; reposicionamento do retalho) e grupo 2 (n = 21; ressecção do retalho e enxertia imediata). Os pacientes do grupo 1 foram atendidos inicialmente em outros serviços e referenciados ao HC-FMUSP com mais de 24 horas após o trauma (16 pacientes) ou foram atendidos pela cirurgia do trauma do HC-FMUSP (5 pacientes) sem a participação da cirurgia plástica nas primeiras 24 horas. Os pacientes do grupo 1 foram tratados com limpeza, reposicionamento e sutura do retalho avulsionado à posição original. Os pacientes do grupo 2 tiveram como tratamento limpeza e desbridamento da ferida, ressecção do retalho avulsionado e emagrecimento do retalho até a espessura de pele e enxertia desta pele no atendimento inicial. RESULTADOS: Dezenove pacientes do grupo 1 (90%) apresentaram necrose e perda total do retalho reposicionado, necessitando tratamento adicional com desbridamento da necrose e enxertia de pele. Dois pacientes (10%) do grupo 1 tiveram evolução favorável, não necessitando de tratamento adicional. Os pacientes dos grupos 1 e 2 apresentaram dados estatisticamente similares em relação à enxertia de pele (G1 = 81%; G2 = 86%; p > 0,999), enxertia de pele complementar (G1 = 48%; G2 = 71%; p = 0,208), cobertura com retalho cirúrgico (G1 = 14%; G2 = 19%; p > 0,999), complicações clínicas (G1 = 33%; G2 = 24%; p = 0,734), complicações cirúrgicas (G1 = 14%; G2 = 33%; p = 0,277), taxa de amputação (G1 = 10%; G2 = 29%; p = 0,238) e taxa de óbito (G1 = 0; G2 = 14%; p = 0,232). Houve diferença estaticamente significativa no tempo de internação, com os pacientes do grupo 1 permanecendo mais tempo internados (G1 = 46,2 dias; G2 = 32,5 dias; p < 0,001). CONCLUSÕES: Houve alto índice de necrose do retalho avulsionado ! nos pacientes que receberam o tratamento de reposicionamento e sutura do retalho ao leito de origem (90%; grupo 1). O tratamento de ressecção do retalho avulsionado, emagrecimento até a espessura de pele e enxertia imediata (grupo 2) proporcionou melhor evolução com relação ao tempo de permanência hospitalar. / INTRODUCTION: Lower extremity degloving injuries are often characterized as serious injuries. There is difficulty in deciding on the most appropriate treatment, whether flap repositioning and suturing or converting the avulsed flap to split-thickness skin grafting. This study assessed patients with degloving injuries in lower extremities, reviewing the epidemiological profile and patient outcome related to the performed treatment. After data analyzing and literature reviewing, a treatment protocol is proposed for standardization of care. METHODS: Forty-two patients were retrospectively evaluated, grouped in 2 groups according with the treatment performed: group 1 (n = 21; flap repositioning) and group 2 (n = 21; flap resection and skin grafting). Group 1 was cared initially in other hospitals (16 patients) or by trauma surgery team in our hospital (5 patients) and it had treatment with washing, repositioning and suturing of avulsed flap to the original position. Group 2 had treatment with washing, debridement, resection of avulsed flap and converting the flap to split-thickness graft in the first care. RESULTS: Nineteen patients in the group 1 (90%) followed necrosis and total flap loss. These patients had additional surgery for skin grafting. Patients of groups 1 and 2 had similar finds with relation to skin grafting (G1 = 81%; G2 = 86%; p > 0,999), complementary skin grafting (G1 = 48%; G2 = 71%; p = 0,208), surgical flap (G1 = 14%; G2 = 19%; p > 0,999), clinical complications (G1 = 33%; G2 = 24%; p = 0,734), surgical complications (G1 = 14%; G2 = 33%; p = 0,277), amputation rate (G1 = 10%; G2 = 29%; p = 0,238) and death rate (G1 = 0; G2 = 14%; p = 0,232). There was statistical significant difference in length of hospital stay, with patients of group 1 staying longer inhospital (G1 = 46,2 days; G2 = 32,5 days; p < 0,001). CONCLUSIONS: There was high rate of flap necrosis in group 1 (90%) that had repositioning and suturing of avulsed flap. Group 2, with resection, defatting and immediate skin grafting, had better outcome in relation to inhospital stay.

A leptina é um mediador tanto de respostas neuroendócrinas como imunes, e tem sido associada a diversas autoimunidades. O nosso objetivo foi estudar a importância da leptina na modulação da resposta imunológica no transplante experimental, com ênfase em seu papel na plasticidade de linfócitos T e de células dendríticas (DC). Observamos que os animais deficientes em leptina têm uma sobrevida aumentada do enxerto de pele e uma menor frequência de células Th1 e maior T reguladoras (Treg), Th2 e Th17. Ademais, células T CD4+ naive diferenciam-se mais eficientemente em células Treg e Th17 tanto com DC como sem DC, na ausência de leptina. Nossos dados indicam que BMDC, imaturas e maduras, é comprometida na ausência de leptina, induzindo menor proliferação de linfócitos CD4+ e maior geração/expansão de células Treg, Th17 e Th2. Assim, a ausência de leptina resultou num predomínio de células Treg um padrão Th2 que, em conjunto com o perfil tolerogênico das DC, poderiam ser um dos mecanismos responsáveis pelo aumento da sobrevida do enxerto alogenêico de pele. / Leptin is a mediator of both neuroendocrine and immune responses, and has been associated with several autoimmune diseases. Our objective was to study the importance of leptin in modulating the immune response in experimental transplantation, with emphasis on its role in the plasticity of T lymphocytes and dendritic cells (DC). We observed that animals leptin deficient had an increased skin graft survival and lower frequency of Th1 and increased regulatory (Treg), Th2 and Th17 T cells. Furthermore, naive CD4+ T cells differentiate more efficiently in Treg and Th17 cells, with DC and without DC, in the absence of leptin. Our data indicate that BMDC, mature and immature, is compromised in the absence of leptin, leading to less proliferation of CD4+ and increased generation / expansion of Treg cells, Th2 and Th17. Thus, the lack of leptin resulted in a predominance of Th2 and Treg T cells, which together with the profile of tolerogenic DC could be one of the mechanisms responsible for increased survival of allograft skin.

Submitted by Setor de Tratamento da Informa??o - BC/PUCRS (tede2@pucrs.br) on 2016-01-14T11:44:34Z No. of bitstreams: 1 TES_THIAGO_DE_JESUS_BORGES_COMPLETO.pdf: 18287406 bytes, checksum: a76247b63c9874ac8f9c628b100c9e0b (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-14T11:44:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TES_THIAGO_DE_JESUS_BORGES_COMPLETO.pdf: 18287406 bytes, checksum: a76247b63c9874ac8f9c628b100c9e0b (MD5) Previous issue date: 2015-11-27 / Dendritic cells (DCs) are the major antigen-presenting cells. They provide three main signals to fully activate T cells. Signal one is when the complex peptide:MHC (p:MHC) expressed by DC is recognized by T cell receptor; signal two is the expression of co-stimulatory molecules from the B7 family (CD80 and CD86). The third signal consists in the cytokines produced by DCs, which will bias the quality of T cell response. Once one of this signal is blocked/interrupted, T cells are not fully activated. T cells are involved in the eradication of pathogens, but also in the pathogenesis of several disorders and, strategies that modulate signal two are being used to treat these disorders. Novel therapies that inhibit the second signal (checkpoint blockade) or T cell modulation by these molecules have being used/tested to manage tumors, autoimmune disorders and transplant rejection. Our group demonstrated that the M. tuberculosis protein DnaK (prokaryote Hsp70) has an immunosuppressive role on DCs, and can suppress rejection in a murine skin allograft model. Nevertheless, the molecular mechanism involved in this response need to be further elucidated. In the present work, we demonstrated that the treatment of murine DC with DnaK could decrease the basal levels TNF-?, IFN-? and MCP-1 produced by these cells. This modulation was concomitant with a downregulation of the transcription factors C/EBP? and C/EBP? in a TLR2-ERK-STAT3-IL-10-dependent way. Beyond the signal three, DnaK could also downregulate the expression of MHC II (signal one) and CD86 (signal theree) on DCs, through the induction of a molecule called MARCH1. We developed an-situ treatment of skin grafts with DnaK prior the transplant. We observed that this treatment prolongs allograft survival with a decreased alloimmunity, and this dependent on MARCH1. The molecular pathway TLR2-ERK-STAT3-IL-10 was required for MARCH1 induction by DnaK. Moreover, we found that DnaK modulates a specific skin migratory DC ? the CD103+ DCs. This is the major subset involved in skin allograft rejection. We tested in which innate receptors DnaK could bind and found that DnaK could not bind directly on TLR2, but in the LOX-1 and Siglec-E receptor, in a LOX-1/Siglec-E/TLR2 complex. Finally, from the data obtained we patented a new formulation and method to treat allografts prior the transplantation. Thus, DnaK tolerizes dendritic cells through the modulation of the three signals required to activate T cells. We believe that consists an innovative strategy to treat inflammatory disorders, rejection, asthma and sepsis. / C?lulas dendr?ticas (DCs) s?o as principais c?lulas apresentadoras de ant?genos e fornecem tr?s sinais principais para a ativa??o completa das c?lulas T. O primeiro sinal consiste na apresenta??o do complexo pept?deo:MHC; o segundo sinal ? a express?o de mol?culas co-estimulat?rias da fam?lia B7, como o CD80 e CD86, e o terceiro consiste no conjunto de citocinas produzidas pelas DCs que ir?o moldar o tipo de resposta T que ser? gerada. Uma vez que algum desses dois sinais ? interrompido as c?lulas T n?o s?o ativadas de forma completa e, ainda, podem entrar em anergia ou apoptose. As c?lulas T est?o envolvidas n?o apenas em respostas de defesa, mas tamb?m em uma s?rie de patologias, e estrat?gias que visam sua ativa??o ou inibi??o vem sendo usadas no manejo dessas doen?as. Terapias que visam a inibi??o do segundo sinal (checkpoint blockade) ou a modula??o das c?lulas T pelas mol?culas co-inibit?rias tem sido testadas e utilizadas para tumores, autoimunidade e transplantes. Nosso grupo demonstrou que a prote?na DnaK (Hsp70 procari?tica) de M. tuberculosis tem papel imunossupressor em c?lulas dendr?ticas e in vivo, podendo diminuir a rejei??o de transplantes cut?neos em camundongos. Por?m, os mecanismos envolvidos nessa resposta ainda precisam ser elucidados. No presente trabalho, mostramos que a DnaK foi capaz de diminuir a express?o basal de TNF-?, IFN-? e MCP-1 em DCs de camundongos. Essa modula??o foi concomitante com a diminui??o de dois fatores de transcri??o ? C/EBP? e C/EBP? ? de maneira dependente da via molecular TLR2-ERK-STAT3-IL-10 nas DCs. Al?m do terceiro sinal, a DnaK pode modular a express?o dos n?veis de MHC II (primeiro sinal) e CD86 (segundo sinal) nas DCs, atrav?s da indu??o de uma mol?cula chave chamada MARCH1. Em um modelo murino de aloenxerto cut?neo, o tratamento local com a DnaK, antes do transplante, prolongou a sobrevida do enxerto e diminuiu a aloimunidade de maneira dependente de MARCH1. A indu??o de MARCH1 pela DnaK foi dependente da via molecular TLR2-ERK-STAT3-IL-10 nas DCs. Al?m disso, demonstramos que a DnaK modula exclusivamente um subtipo de DC migrat?rio da pele ? as DCs CD103+. Tamb?m observamos que esse subtipo de DC ? o principal subtipo celular envolvido na rejei??o de transplantes de pele, gerando um conceito biol?gico novo nessa ?rea. Mapeamos os receptores inatos nos quais a DnaK pode se ligar. Testamos dez receptores inatos e vimos que essa prote?na n?o se liga diretamente no TLR2, mas sim nos receptores LOX-1 e Siglec-E, formando o complexo LOX-1/Siglec-E/TLR2. Finalmente, a partir dos dados obtidos nessa tese, formulamos uma composi??o e um m?todo para a modula??o do enxerto antes da realiza??o do transplante, e depositamos uma patente junto ao INPI. Portanto, a DnaK pode tolerizar as c?lulas dendr?ticas atrav?s da modula??o dos tr?s sinais necess?rios para a ativa??o das c?lulas T. Acreditamos que essa estrat?gia pode ser utilizada no tratamento de patologias inflamat?rias, incluindo a rejei??o a transplantes.

Extensas lesões na pele expõem o organismo a uma série de agentes agressores, dificultando a reparação espontânea da pele e muitas vezes levando o paciente a óbito. Nesse caso, se não houver áreas doadoras de autoenxertos, pode se utilizar aloenxertos. Neste tipo de enxerto, os tecidos são processados em Bancos de Tecidos, onde se pode empregar a radiação ionizante como método de esterilização. De acordo com estudos in vitro, a radiação gama, em doses acima de 25 kGy, provoca desestruturação das fibrilas de colágeno I da derme conservada em glicerol na concentração de 85%, reduzindo significativamente a resistência à tração dos tecidos irradiados. Observações clínicas sugerem, ainda, integração mais rápida da derme humana, conservada em glicerol e submetida à radiação ionizante, com os tecidos do receptor, quando comparada à derme somente conservada em glicerol. Para verificar se essas alterações relatadas in vitro, comprometeriam o emprego in vivo, de amostras de pele humana, submetidas à radiação gama, foram realizados transplantes de peles humanas, irradiadas ou não, em camundongos Nude. A pele dos camundongos foi submetida à análise macroscópica, imagens de tomografia de coerência óptica, histologia e ensaios biomecânicos. Foi possível concluir que os enxertos irradiados a 25 kGy promoveram uma contração inicial maior, mas essa alteração não interferiu na dimensão da área final de reparação, ainda, os animais que receberam esses enxertos apresentaram mais rápido fechamento da ferida em comparação com os demais, além disso o emprego de enxertos irradiados (25 e 50 kGy) promoveu a formação de um processo de reparação mais organizado e sem efeitos significantes nas propriedades biomecânicas. / Extensive skin lesions expose the body to damaging agents, which makes spontaneous regeneration difficult and, in many cases, leads patient to death. In such cases, if there are no donating areas for autograft, allografts can be used. In this type of graft, tissue is processed in tissue banks, where it can be subjected to radiosterilization. According to in vitro studies, gamma radiation, in doses higher than 25 kGy, induces alterations in skin preserved in glycerol at 85%, reducing the tensile strength of irradiated tissue. Clinical observation also suggests faster integration of such graft with the receptors tissue. In order to assess if the alterations observed in vitro, would compromise in vivo use, transplants of human tissue, irradiated or not, were performed in Nude mice. The skin of the mice was subjected to macroscopic analysis, optical coherence tomography imaging, histological and biomechanical assays. It was possible to conclude that grafts irradiated with 25 kGy promoted greater initial contraction, without alteration of the final dimensions of the repair area, also displaying a faster closing of the wound. Moreover, the use of irradiated grafts (25 and 50 kGy) enabled the formation of a more organized healing process without significant effects on biomechanical properties.

INTRODUÇÃO: Os ferimentos descolantes nos membros inferiores frequentemente se apresentam como lesões graves. Há dificuldade na decisão sobre o tratamento mais adequado, o reposicionamento e sutura do retalho ou o emagrecimento e enxertia da pele avulsionada. Este estudo avaliou os pacientes com ferimentos descolantes nos membros inferiores, analisando o perfil epidemiológico e a evolução dos pacientes de acordo com o tratamento realizado. Após a análise dos dados e a revisão da literatura, propõe-se um protocolo para padronização do atendimento. MÉTODOS: Foram avaliados retrospectivamente 42 pacientes vitimas de ferimentos descolantes em membros inferiores atendidos no HC-FMUSP entre julho de 2003 e junho de 2007. Os pacientes foram divididos de acordo com o tratamento em 2 grupos: grupo 1 (n = 21; reposicionamento do retalho) e grupo 2 (n = 21; ressecção do retalho e enxertia imediata). Os pacientes do grupo 1 foram atendidos inicialmente em outros serviços e referenciados ao HC-FMUSP com mais de 24 horas após o trauma (16 pacientes) ou foram atendidos pela cirurgia do trauma do HC-FMUSP (5 pacientes) sem a participação da cirurgia plástica nas primeiras 24 horas. Os pacientes do grupo 1 foram tratados com limpeza, reposicionamento e sutura do retalho avulsionado à posição original. Os pacientes do grupo 2 tiveram como tratamento limpeza e desbridamento da ferida, ressecção do retalho avulsionado e emagrecimento do retalho até a espessura de pele e enxertia desta pele no atendimento inicial. RESULTADOS: Dezenove pacientes do grupo 1 (90%) apresentaram necrose e perda total do retalho reposicionado, necessitando tratamento adicional com desbridamento da necrose e enxertia de pele. Dois pacientes (10%) do grupo 1 tiveram evolução favorável, não necessitando de tratamento adicional. Os pacientes dos grupos 1 e 2 apresentaram dados estatisticamente similares em relação à enxertia de pele (G1 = 81%; G2 = 86%; p > 0,999), enxertia de pele complementar (G1 = 48%; G2 = 71%; p = 0,208), cobertura com retalho cirúrgico (G1 = 14%; G2 = 19%; p > 0,999), complicações clínicas (G1 = 33%; G2 = 24%; p = 0,734), complicações cirúrgicas (G1 = 14%; G2 = 33%; p = 0,277), taxa de amputação (G1 = 10%; G2 = 29%; p = 0,238) e taxa de óbito (G1 = 0; G2 = 14%; p = 0,232). Houve diferença estaticamente significativa no tempo de internação, com os pacientes do grupo 1 permanecendo mais tempo internados (G1 = 46,2 dias; G2 = 32,5 dias; p < 0,001). CONCLUSÕES: Houve alto índice de necrose do retalho avulsionado ! nos pacientes que receberam o tratamento de reposicionamento e sutura do retalho ao leito de origem (90%; grupo 1). O tratamento de ressecção do retalho avulsionado, emagrecimento até a espessura de pele e enxertia imediata (grupo 2) proporcionou melhor evolução com relação ao tempo de permanência hospitalar. / INTRODUCTION: Lower extremity degloving injuries are often characterized as serious injuries. There is difficulty in deciding on the most appropriate treatment, whether flap repositioning and suturing or converting the avulsed flap to split-thickness skin grafting. This study assessed patients with degloving injuries in lower extremities, reviewing the epidemiological profile and patient outcome related to the performed treatment. After data analyzing and literature reviewing, a treatment protocol is proposed for standardization of care. METHODS: Forty-two patients were retrospectively evaluated, grouped in 2 groups according with the treatment performed: group 1 (n = 21; flap repositioning) and group 2 (n = 21; flap resection and skin grafting). Group 1 was cared initially in other hospitals (16 patients) or by trauma surgery team in our hospital (5 patients) and it had treatment with washing, repositioning and suturing of avulsed flap to the original position. Group 2 had treatment with washing, debridement, resection of avulsed flap and converting the flap to split-thickness graft in the first care. RESULTS: Nineteen patients in the group 1 (90%) followed necrosis and total flap loss. These patients had additional surgery for skin grafting. Patients of groups 1 and 2 had similar finds with relation to skin grafting (G1 = 81%; G2 = 86%; p > 0,999), complementary skin grafting (G1 = 48%; G2 = 71%; p = 0,208), surgical flap (G1 = 14%; G2 = 19%; p > 0,999), clinical complications (G1 = 33%; G2 = 24%; p = 0,734), surgical complications (G1 = 14%; G2 = 33%; p = 0,277), amputation rate (G1 = 10%; G2 = 29%; p = 0,238) and death rate (G1 = 0; G2 = 14%; p = 0,232). There was statistical significant difference in length of hospital stay, with patients of group 1 staying longer inhospital (G1 = 46,2 days; G2 = 32,5 days; p < 0,001). CONCLUSIONS: There was high rate of flap necrosis in group 1 (90%) that had repositioning and suturing of avulsed flap. Group 2, with resection, defatting and immediate skin grafting, had better outcome in relation to inhospital stay.

O presente estudo foi realizado para esclarecer o surgimento de vesículas subepidérmicas em enxertos de pele comumente descritos como áreas enxertadas. Devido à discrepância existente entre a literatura, que afirma surgirem vesículas nessas áreas, e a nossa experiência clínica, onde não observamos tal fato, decidimos investigar o problema. Para isso, estudamos a transição dermoepidérmica (TDE), em 23 pacientes submetidos à enxertia de pele, para verificar se há ou não alteração dessa estrutura que pudesse justificar a formação de vesículas. Nos 23 pacientes estudados foram feitas duas biópsias: a primeira, imediatamente antes da excisão do enxerto, na área doadora - pele sã, considerada como amostra padrão normal da TDE - Amostra Padrão AD. Após 10 dias, realizou-se uma segunda biópsia, com o mesmo vazador, próxima à área da primeira biópsia - Amostra Teste - ENX. Cada amostra foi dividida em 2 partes iguais (46 amostras) e estudadas por microscopia de luz e por imunofluorescência direta (imunomapeamento), pesquisando-se a possível alteração da zona da membrana basal (ZMB) na TDE através dos antígenos penfigóide bolhoso, laminina, colágeno IV e colágeno VII. Na microscopia de luz estudou-se, em cada biópsia, a relação entre a medida linear do relevo da trasição dermoepidérmica e a medida linear do relevo da superfície da camada granulosa, logo abaixo da camada córnea, equivalente a medida linear da superfície da pele. Nas 46 amostras as análises por microscopia de luz e de imunomapeamento para os quatro antígenos evidenciou-se a manutenção do mesmo padrão morfológico. Não houve diferença no imunomapeamento. Observou-se relações lineares das medidas com médias de 1,17 para a amostra AD e 1,44 para a amostra ENX, diferença que foi estatisticamente significativa, porém conservando a manutenção do padrão da TDE em relação à pele normal. Foi observada a manutenção do padrão do relevo da TDE no enxerto, em relação à pele sã, doadora. / SUMMARY: The present study has been done to elucidate the onset of subepidermal blisters in skin grafts, usually mistaken as grafted sites. Due to the discrepancy between literature - assigning this onset of blisters in grafts and our experience opposite we have decided to carry out this study. To do so we have studied the dermal-epidermal junction in 23 burned patients who underwent skin grafting so that we could verify whether or not there could be any alteration in the dermal-epidermal junction structure that may explain this fact. Among the 23 studied patients, two biopsies were carried out: the first one just before harvesting the skin graft from donor site healthy skin. The so called sample was regarded as an ordinary standard one of the dermal-epidermal junction STANDARD SAMPLE - DS. After graft take, by ten days, a second biopsy was performed with the same punch, close to the first biopsy TEST SAMPLE GS. Both samples were split into two equal parts (46 samples) and studied using light microscopy and direct immunofluorescence (immune mapping), searching for possible alterations in basement membrane zone in the dermal-epidermal junction through bullous pemphigoid, laminin and types IV and VII collagen antigens. On light microscopy, relation between the linear measure of dermal-epidermal junction projection and that of stratum granulosum surface, just underneath the stratum corneum, corresponding to skin surface, was studied in each biopsy. The four analyses of the antigens by light microscopy and direct immunofluorescence in the 46 samples clearly showed the keeping of the same pattern, either for STANDARD SAMPLE DS or TEST SAMPLE GS. There were no differences on the immune mapping. Regarding the relation of the linear measures it was noted a mean of 1.17 for STANDARD SAMPLE DS and a mean of 1.44 for TEST SAMPLE GS. Such difference was statistically significant. Nevertheless, it maintained the keeping of the same pattern of dermal-epidermal junction when compared to healthy skin.