Au cours de chimiothérapies, les cellules cancéreuses parviennent fréquemment à échapper aux effets toxiques des médicaments en développant des mécanismes de chimiorésistance qui résultent souvent de la présence d’un système d’efflux de ces médicaments. Cette chimiorésistance est corrélée à un phénomène appelé « phénotype MDR » pour (MultiDrug Resistance) et associé à la surexpression d’ATPases membranaires appartenant aux transporteurs ABC (ATP Binding Cassette). Le transporteur ABCG2 fait partie de cette grande famille de protéines. Un alignement de séquence a permis l’identification chez ABCG2 une séquence spécifique (LSGGE) très semblable à la séquence signature (VSGGE) de tous les transporteurs ABC. La mutation ponctuelle des résidus de cette séquence en alanine a produit une perte importante de fonction des mutants L352A et S353A, observée au niveau du transport et de l’activité ATPasique. Des relations structure-activité établies à partir de différents composés de la famille des flavonoïdes ont permis d’identifier MBLI 97, boéravinone G, MHT et ABI comme des composés puissants et spécifiques, capables d’abolir la résistance à de multiples drogues et chimiosensibiliser la croissance cellulaire. Le ciblage de séquences spécifiques et l'utilisation d'inhibiteurs spécifiques de ces transporteurs constituent des stratégies destinées à contrer la chimiorésistance et augmenter l’efficacité des traitements chimiothérapeutiques. / During chemotherapy, cancer cells frequently succeed to escape the toxic effects of drugs by developing mechanisms of chemoresistance which often result from the presence of an efflux system of these drugs. Such a chemoresistance is correlated to the MDR (MultiDrug Resistance) phenotype and associated to overexpression of membrane ATPases belonging to the ABC (ATP-Binding Cassette) transporters. The ABCG2 transporter belongs to this large family of proteins. Sequence alignment allowed the identification of a specific (LSGGE) sequence in ABCG2, which is quite similar to the canonical sequence signature (VSGGE) of all ABC transporters. Point mutation of these residues into alanine produced a loss of function in L352A and S353A mutants, as observed in transport and on ATPase activity. Structure-activity relationships drawn from some compounds among the family of flavonoids allowed the identification of MBLI 97, boeravinone G, MHT and ABI as potent and ABCG2-specific inhibitors, able to revert multidrug resistance and chemosensitize cell growth. The study of specific sequences and use of specific inhibitors of these transporters constitute strategies to abolish cancer cell chemoresistance and to increase the efficiency of chemotherapeutic treatments.

Face à l'émergence de bactéries multi-résistantes aux antibiotiques, il est nécessaire de trouver de nouvelles molécules, actives contre les bactéries, ou qui inhibent leurs mécanismes de résistance et restaurent ainsi l'activité des antibiotiques existants. Dans ce contexte, nous avons mis en place un système de criblage robotisé à moyen débit permettant d'étudier l'activité de molécules sur des bactéries en milieu liquide. Les composés testés sont des molécules synthétiques, provenant de la Chimiothèque nationale du CNRS, et des extraits naturels de plantes. La collection de bactéries utilisée se compose de souches sensibles et de nombreuses souches résistantes. Dans le cadre de cette étude, nous nous sommes intéressés à la résistance par mécanisme d'efflux actif. Nous avons étudié en particulier deux systèmes d'efflux chez Staphylococcus aureus: la pompe NorA, qui confère une résistance multiple aux antibiotiques, dont les fluoroquinolones, et la pompe Msr(A), qui est spécifique des macrolides. Un premier criblage sur les souches sensibles (Escherichia coli et S. aureus) permet de détecter des molécules ayant une activité antibactérienne. Pour celles-ci, une étude plus approfondie est menée. Les molécules dépourvues d'activité antibactérienne sont ensuite testées sur les deux souches de S. aureus résistantes par efflux, pour déceler une potentielle activité d'inhibiteur de pompe. Cette activité est alors confirmée par des expériences d'accumulation de l'antibiotique. Au cours de cette étude, une nouvelle série de molécules présentant une bonne activité antibactérienne vis-à-vis des deux souches sensibles a été mise en évidence. Des résultats préliminaires indiquent que ces molécules inhibent la synthèse des protéines. Le criblage réalisé vis-à-vis de la pompe d'efflux NorA a mis en évidence trois familles de molécules actives, dont on a vérifié qu'elles permettent de restaurer l'activité de plusieurs antibiotiques efflués par la pompe. Un criblage similaire réalisé sur la protéine Msr(A) a révélé quelques touches qui montrent une synergie avec l'antibiotique efflué; leur activité sur l'accumulation de l'antibiotique doit être vérifiée. Par ailleurs, un modèle tridimensionnel de la protéine Msr(A) a été établi, par homologie avec les pompes cristallisées de la même famille (protéines à ATP-Binding Cassette). Ce modèle est en cours de validation.

ABCG2 est un transporteur de la famille ABC impliqué dans le phénotype de résistance aux drogues développé par certaines cellules, par exemple les cellules cancéreuses. Ce transporteur a aussi un rôle physiologique de détoxication de composés endogènes, notamment les porphyrines, molécules indispensables mais qui présentent une toxicité potentielle. Cette toxicité nécessite une prise en charge particulière, évitant à ces composés d'être libres en solution. Dans ce contexte, nous avons fait l'hypothèse qu'ABCG2 pourrait participer à cette détoxication en limitant l'accumulation des porphyrines dans les cellules en les présentant à un partenaire extracellulaire. Nous montrons qu'ABCG2 transporte de l'hème ainsi que certains de ses dérivés et précurseurs et que ces porphyrines, contrairement aux autres substrats d'ABCG2, se fixent sur un domaine extracellulaire spécifique d'ABCG2, ECL3, composé d'environ 70 acides aminés. L'affinité d'ECL3 pour les porphyrines est de 0,5 à 3,5 μM, suffisamment affine pour permettre leur fixation après transport.Nous montrons aussi que l'albumine sérique humaine, impliquée dans la détoxication de l'hème, récupère les porphyrines fixées sur ECL3 par une interaction directe avec ABCG2. L'ensemble de ce travail a donc permis d'une part de mieux comprendre le rôle d'ABCG2 dans la régulation de l'homéostasie des porphyrines, notamment l'hème, et d'autre part, de façon originale, d'identifier le mécanisme moléculaire par lequel cette détoxication s'effectue.

Les transporteurs à ATP binding cassette (ABC) peuvent transporter une grande variété de substrats utilisant l'ATP-Mg2+ comme source d'énergie. Ces transporteurs sont présents dans toutes les formes de vie et sont impliqués dans la résistance aux médicaments, comprenant les anticancéreux et les antibiotiques. Mes travaux de thèse se concentrent sur le transporteur BmrA (130 kDa) de Bacillus subtilis utilisé en tant que système modèle et homologue de la P-glycoprotéine humaine impliquée dans la multirésistance aux anticancéreux. Dans ces travaux nous montrons que la reconstitution de cette protéine dans les lipides de Bacillus subtilis répond aux deux exigences centrales pour RMN: haut rapport signal sur bruit et la stabilité de l'échantillon sur une période de plusieurs années. Les spectres obtenus indiquent une protéine bien repliée et une préparation très homogène, comme en témoignent les lignes de résonance étroites et la dispersion du signal typique de la distribution de structure secondaire attendue de la protéine membranaire. Nous avons adapté la méthode GRecon utilisée dans les études de microscopie électronique pour la reconstitution des protéines membranaires pour la RMN à l'état solide. Nous avons suivi en détail la reconstitution du transporteur ABC BmrA par dialyse comme référence, et établi des conditions optimales de reconstitution en utilisant un gradient combiné de saccharose / cyclodextrine / lipide caractérisant GRecon. Les spectres RMN de l‘échantillon reconstitué par GRecon sont très similaire à ceux obtenus précédemment sur des échantillons reconstitués par dialyse. La préparation d'échantillons par GRecon présente un gain de temps de près d'un ordre de grandeur. Afin d'étudier les états ouvert vers l'intérieur (inward-facing IF) et ouvert vers l'extérieur (outward-facing OF) du transporteur, nous avons développé un protocole reproductible et quantitatif induisant l'état OF. Nous avons enregistré des spectres bidimensionnels RMN à l'état solide avec différents temps de mélange (20 et 200 ms) afin de suivre les changements des déplacements chimiques et d'identifier les résidus par des corrélations séquentielles. L'apparition très apparente de nouveaux signaux concomitants à la grande amplitude des perturbations de déplacement chimique (CSP) met en évidence l'importante flexibilité et les changements conformationnels de la protéine en présence d'ATP: Mg2+. Afin d'identifier les résidus apparaissant dans les spectres, nous avons utilisé le remplacement paramagnétique du co-facteur Mg2+ par du Mn2+. Cette méthode a révélé que les acides aminés apparaissant dans les spectres sont situés à proximité du site de liaison de l'ATP. En outre, les mesures EPR ont confirmé l'état fermé de la protéine en identifiant la distance correspondant à 1,8 nm entre deux atomes de Mn2+. Nous avons étudié les différences conformationnelles entre l'état IF et OF de BmrA. L'observation de nombreux CSP, ainsi que l'apparition de nouveaux signaux sont observés pour un mutant ne pouvant pas hydrolyser l'ATP, indiquant que l'hydrolyse n'est pas nécessaire pour la transition IF à OF dans BmrA. Nous avons également analysé le mécanisme lié au motif X-loop décrit comme étant impliqué dans la communication entre deux domaines de la protéine. Nous avons observé pour une protéine mutante dans laquelle le transport est aboli mais qui reste ATPase active, une transition incomplète puisque seul un sous-ensemble de CSPs est observé, ainsi qu'un manque de rigidification. Ces mesures suggèrent que la flexibilité semble être le point central dans la transmission des changements conformationnels nécessaires de la partie motrice à la partie d'exportation de molécules. Ces observations montrent que ce système serait semblable à un moteur tournant à plein régime qui ne serait pas connecté de manière rigide à un arbre de transmission le reliant au système de transport / ATP binding cassette (ABC) transporters can translocate a variety of molecules by coupling drug/lipid efflux with an ATP-Mg2+ fuelled engine. They are found in all forms of life and they are involved in a number of drug resistances including anti-cancer drugs and antibiotics. My studies focus on the drug exporter BmrA (130 kDa) from Bacillus subtilis as a model system and homologue of the human P-glycoprotein that is involved in multidrug resistance in cancer. We show that the reconstitution of this protein in lipids from Bacillus subtilis at a lipid-protein ratio of 0.5 m/m allows an optimal protein insertion into lipid bilayer as well as it complies with the two central NMR requirements: high signal-to-noise in the spectra and sample stability over a time period of years. The obtained spectra point to a well-folded protein and a highly homogenous preparation, as witnessed by the narrow resonance lines and the signal dispersion typical of the expected secondary structure distribution of the membrane protein. In the same time, we adapted the GRecon method used in electron microscopy studies for membrane protein reconstitution to the needs of solid-state NMR sample preparation. We followed in detail the reconstitution of the ABC transporter BmrA by dialysis as a reference, and established optimal reconstitution conditions using the combined sucrose/cyclodextrin/lipid gradient characterizing GRecon. NMR spectra recorded on a sample produced by GRecon showed a highly similar fingerprint as those recorded previously on samples reconstituted by dialysis. GRecon sample preparation presents a gain in time of nearly an order of magnitude for reconstitution. In order to study the inward-facing (IF) and the outward-facing (OF) state of the transporter, we developed a reproducible and quantitative protocol of ATP:Mg2+:VO43- addition inducing the OF state. We used selectively labelled samples obtained by the addition of natural abundance residues in the bacterial medium in order to reduce the number of signals in the spectra of this large protein. We recorded solid-state NMR two-dimensional spectra with different mixing times (20 and 200 ms) in order to follow chemical shift changes and identify residues by sequential correlations. The very noticeable apparition of new signals concomitant with the large amplitude of chemical shift perturbations (CSPs) highlight the important flexibility and conformational changes of the protein in presence of ATP:Mg2+:VO43- substrate. In order to identify the residues appearing in the spectra, we use paramagnetic replacement by Mn2+ of the Mg2+ acting as a co-factor in the active site. The paramagnetic relaxation enhancements caused the Mn2+ revealed that the amino acids appearing in the spectra are located in proximity to the ATP binding pocket. Besides, EPR measurements confirmed the closed state of the protein by identifying the corresponding 1.8 nm distances between two Mn2+. We investigate on the conformational differences identified between the IF and OF state in the ABC transporter BmrA reconstituted in its natural lipids. The observation of numerous CSPs, as well as the apparition new signals are observed for a hydrolysis-incompetent mutant on addition of ATP, indicating that hydrolysis is not required for the IF to OF transition in BmrA. We also analyze the mechanistic of the X-loop motif described to be involved in the communication between two domains of the protein. We observe for a mutant protein in which transport is abolished, but which remains ATPase active, an incomplete transition since only a subset of CSPs is observed, as well as lack of rigidification. This suggests that the change in dynamics might be central for transmitting the relevant conformational changes to the part of the protein driving transport, concomitant of an engine which is turning an input shaft, but which fails to connect in a rigid manner, trough adequate gears, with the output shaft driving the pump

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

ABCG2 est un transporteur de la famille ABC impliqué dans le phénotype de résistance aux drogues développé par certaines cellules, par exemple les cellules cancéreuses. Ce transporteur a aussi un rôle physiologique de détoxication de composés endogènes, notamment les porphyrines, molécules indispensables mais qui présentent une toxicité potentielle. Cette toxicité nécessite une prise en charge particulière, évitant à ces composés d’être libres en solution. Dans ce contexte, nous avons fait l’hypothèse qu’ABCG2 pourrait participer à cette détoxication en limitant l’accumulation des porphyrines dans les cellules en les présentant à un partenaire extracellulaire. Nous montrons qu’ABCG2 transporte de l’hème ainsi que certains de ses dérivés et précurseurs et que ces porphyrines, contrairement aux autres substrats d’ABCG2, se fixent sur un domaine extracellulaire spécifique d’ABCG2, ECL3, composé d’environ 70 acides aminés. L’affinité d’ECL3 pour les porphyrines est de 0,5 à 3,5 μM, suffisamment affine pour permettre leur fixation après transport.Nous montrons aussi que l’albumine sérique humaine, impliquée dans la détoxication de l’hème, récupère les porphyrines fixées sur ECL3 par une interaction directe avec ABCG2. L’ensemble de ce travail a donc permis d’une part de mieux comprendre le rôle d’ABCG2 dans la régulation de l’homéostasie des porphyrines, notamment l’hème, et d’autre part, de façon originale, d’identifier le mécanisme moléculaire par lequel cette détoxication s’effectue. / ABCG2 belongs to the ABC-transporter family, involved in drug resistance developed by cells, notably cancer cells. This transporter has also a physiological role of endobiotic detoxification, in particular porphyrins that are essential but potentially toxic molecules. This toxicity implies a specific handle, to avoid them to remain free in solution. In that context, we hypothesized that ABCG2 participate to this detoxification, limiting the intracellular porphyrin accumulation by presenting them to an extracellular partner. We show that ABCG2 transports heme and some of its derivatives and precursors. Interestingly, these porphyrins, unlike other ABCG2 (non-porphyric) substrates, can bind to an extracellular domain, specific of ABCG2, ECL3, 70 residues-long. ECL3 displays affinities for porphyrins in the range of 0.5 to 3.5 μM, high enough to allow their binding after transport. We also show that human serum albumin, implicated in heme detoxification, releases porphyrins bound to ECL3 by a direct interaction with ABCG2. This work established a better comprehension of ABCG2 role in porphyrin and in particular heme homeostasis regulation. In addition, our results contribute to elucidate part of the molecular mechanism by which such regulation is carried out.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Les lactones macrocycliques (LM) sont des anthelminthiques (AH) à effet paralysant très utilisés chez les animaux et les humains contre les nématodes parasites. Cependant, leur succès thérapeutique est compromis par la résistance croissante aux LM, qui pourrait être en partie dû aux ABC transporteurs P-glycoprotéines (Pgps) sélectionnés et surexprimés chez les nématodes résistants aux LM. Dans ce travail, nous avons étudié plus précisément la P-glycoprotéine 13 du parasite de petits ruminants, Haemonchus contortus. Son orthologue chez le modèle nématode C. elegans, Cel-Pgp-13, est exprimé dans les amphides, structures qui ont été associées à la sensibilité aux AH chez C. elegans et H. contortus. Pour prédire la capacité des Pgps de nematode à transporter des drogues, incluant des LM et autres AH, nous avons développé un modèle de docking in silico. Nous avons utilisé la structure cristallographique de C. elegans Pgp-1 (Cel-Pgp-1), et nous avons montré la liaison avec une forte affinité de plusieurs ligands décrits comme activateurs de sa fonction ATPasique. Nous avons aussi décrit une forte affinité des LM, et un site spécifique de liaison de ces composés à Cel-Pgp-1. Cette approche représente un outil important pour prédire les interactions entre AH, et pour concevoir rationnellement de nouveaux inhibiteurs compétitifs des Pgps de nématode, dans le but d'améliorer les stratégies thérapeutiques. Sur la base de cette approche, nous avons prédit la structure 3D de Hco-Pgp-13 à partir du cristal de Cel-Pgp-1 afin d'étudier son intéraction avec des substrats potentiels, en particulier les LM. Nous avons trouvé des affinités similaires pour différents composés précédemment testés sur Cel-Pgp-1. In vitro, la mesure de l'activité ATPasique montre que l'actinomycine D est un substrat de Hco-Pgp-13. Nos données démontrent la présence possible d'un domaine de reconnaissance multispécifique sur ce transporteur de parasite. La détermination par immunofluorescence de l'expression de Hco-Pgp-13 a montré une distribution tissulaire large indiquant que Hco-Pgp-13 pourrait jouer un role important dans le transport de substrats endogènes et/ou exogènes. En conclusion, ce travail permet de mieux comprendre le rôle des Pgps de nématodes dans le transport de médicaments AH, tant au niveau de l'organisme modèle C. elegans que du nématode parasite H. contortus. Cette étude suggère la conservation de la fonction de tranporteur ABC multidrogue dans ces espèces. La localisation de Hco-Pgp-13 sur les structures amphidiales, et son éventuelle implication dans la résistance aux médicaments et à la survie de H. contortus à l'exposition à des composés AH, restent à préciser. / Macrocyclic lactones (ML) are paralyzing anthelmintics used in animals and humans against parasite nematodes. However, their therapeutic success is compromised by the spread of ML resistance. This might be at least partly due to P-glycoproteins (Pgps) ABC transporters that are selected and overexpressed in ML-resistant nematodes. Deciphering the role of the 10 Pgps expressed in the parasite of small ruminants Haemonchus contortus is thus of major importance to guaranty anthelmintic (AH) efficacy of various drugs. Here we focused on Hco-Pgp-13 due to the expression in the amphids of its closest ortholog in the model nematode C. elegans. Indeed, the amphids represent a putative entry route of drugs to reach AH targets in the nervous system and have been linked to AH susceptibility in C. elegans and H. contortus. In order to predict the capacity of nematode Pgps to transport drugs, including ML and otherAH, we have developed an in silico drug docking model. We have used C. elegans Pgp-1 (Cel-Pgp-1) crystal structure and have showed a high affinity binding of several ligands that have been shown to be activators of its ATPase function. ML were also found to bind with high affinity to Cel-Pgp-1, on a specific binding site. This approach provides a valuable tool to predict drug-drug interactions and to rationally design new competitive inhibitors of nematode Pgps, in order to improve anthelmintic therapeutics. We then predicted a putative 3D structure of Hco-Pgp-13 based on the recently released crystal of Cel-Pgp-1, with which it presented a high homology. This allowed the study of the interaction of Hco-Pgp-13 with potential substrates, in particular ML. We found similar affinities for various drugs previously tested on Cel-Pgp-1, supporting the good homology of these two proteins. Together with in vitro ATPase assay experiments that confirmed the substrate status of actinomycin D, this indicates a possible multispecifc recognition capacity of this parasitic transporter. The determination of Hco-Pgp-13 localization using immunohistochemistry showed a wide tissue expression consistent with a critical role for Hco-Pgp-13 in endogenous and/or exogenous substrate transport. In conclusion, this work provides insights into the role of nematode Pgps in transporting AH drugs, both at the level of the model organism C. elegans and of the parasitic nematode H. contortus. This suggests a high homology of function conserved between ABC tranporters in these species. The localization of such protein on amphidial structures and its possible involvement in drug resistance and survival of H. contortus to exposure to AH compounds remain to be precised.