No description available.

Les lymphocytes T cytotoxiques (CTLs) présents au niveau des tumeurs reconnaissent des antigènes présentés par les cellules cancéreuses, mais ne parviennent pas à induire le rejet de ces tumeurs chez les patients cancéreux. Cette observation a amené les immunologistes à étudier les différents mécanismes d'immunosuppression induits par les tumeurs qui permettent aux cellules cancéreuses d'échapper à la reconnaissance et à la destruction immunitaires. L'un des mécanismes contribuant à la résistance des tumeurs aux réponses immunitaires est le recrutement de lymphocytes T CD4+ régulateurs (Tregs). Les Tregs s'accumulent au niveau des sites tumoraux et jouent un rôle important dans la suppression des réponses immunitaires dirigées contre les cellules tumorales. Dans ce travail de thèse, nous rapportons que des épitopes tumoraux dérivés des protéines NY-ESO-1 et TRAG-3 stimulent à la fois des lymphocytes T CD4+ auxiliaires (Th) et des Tregs chez des patients porteurs de mélanome. Grâce à une analyse clonotypique, nous démontrons que, contrairement aux cellules CD4+ Th, les TCR des Tregs dirigés contre NY-ESO-1 et TRAG-3 sont retrouvés à la fois dans le répertoire des Tregs naturels (CD4+CD25high) et dans celui des cellules T CD4+ classiques/Th (CD4+CD25-), au niveau des PBMCs des patients. Cette observation suggère que le recrutement des Tregs spécifiques d'antigènes tumoraux se fait en partie par la conversion des cellules T CD4+ classiques suite à leur stimulation chronique par des antigènes de tumeurs. / Cytotoxic T lymphocytes (CTLs) present in tumors recognize tumor antigens presented by cancer cells but fail to induce tumor rejection in patients. This observation has led immunologists to study the different mechanisms of tumor-induced immunosuppression that allow cancer cells to escape from recognition and destruction by the immune system. One of the mechanisms contributing to tumor resistance to immune responses is the recruitment of CD4+ regulatory T cells (Tregs). Tregs accumulate at tumor sites and play an important role in suppressing immune responses against tumor cells. In this thesis, we report that tumor epitopes derived from the proteins NY-ESO-1 and TRAG-3 stimulate both CD4+ T helper cells (Th) and Tregs in patients with metastatic melanoma. Through clonotypic analysis, we show that, within PBMCs of melanoma patients, tumor antigen-specific Tregs, but not Th cells, share a common TCR usage with naturally-occuring Tregs (CD4+CD25high) and Th cells (CD4+CD25-), suggesting that their recruitment occurs through the peripheral conversion of CD4+CD25- T cells upon chronic antigen exposure. The second part of this thesis consists of the study of inhibitory receptors expressed by CTLs directed against tumor antigens which, upon engagement by their ligands presented on the surface of tumor cells, activate negative regulatory pathways. Here, we report that tumor-induced CTLs directed against a peptide derived from NY-ESO-1 in melanoma patients upregulate the expression of the inhibitory receptors PD-1, Tim-3 and BTLA. Additionaly, the co-expression of PD-1 with Tim-3 and/or BTLA defines populations of dysfunctional tumor antigen-specific CTLs.

Les pathogènes respiratoires sont parmi les causes majeures de décès dans le monde entier. Déchiffrer les mécanismes d'évasion immune employés par les pathogènes est essentiel pour le développement de stratégies thérapeutiques contre les pathogènes respiratoires. Dans ce contexte, la vole de signalisation PDL-1 (programmed death ligand 1)-PD-1 (programmed death 1) a été impliquée dans l'évasion immune par les cellules tumorales et des virus. Par conséquent, j'ai voulu étudier le rôle de la voie PD-L1 dans la modulation de la réponse immunitaire contre le Mycobacterium tuberculosis et l'Aspergillus fumigatus. J'ai trouvé que l'α-(1,3)-glucan dérivé de l'A. fumigatus activait les cellules dendritiques (CDs) ; la maturation des CDs était partiellement dépendante du Toll like receptor (TLR)-2. L'analyse de la polarisation des cellules T CD4+ a révélé que les CDs éduquées par l'α-(1,3)-glucan induisent la génération de cellules T régulatrices (Treg) CD4+ CD25+FoxP3+, ceci étant en partie lié à l'expression de PD-L1 sur les CDs. De façon importante, le blocage de PD-L1 sur les CDs augmente la sécrétion d'IFN-γ sans moduler la réponse Th17. De manière similaire, PD-L1 induit par M. tuberculosis freine la réponse Th1 sans moduler la réponse Th17. L'analyse des voies de signalisation en aval a indiqué que la voie sonic hedgehog (SHH) en réponse au mycobacterium médiait l'induction de PD-L1 en inhibant des microARNs spécifiques, miR-324-5p et miR-338-5p qui ciblent PD-L1. De plus, SHH induit la cyclooxygénase (COX)-2 qui catalyse la synthèse de la prostaglandine E2 (PGE2) qui agit en synergie avec PD-L1 pour coordonner l'expansion des Treg. / SummaryPulmonary infections caused by respiratory pathogens are among the major causes of death worldwide. The outcome of infection depends on the ability of the host to respond to the challenge posed by the pathogens. Of note, the host needs to sense the pathogen, mount an efficient immune response and finally clear the ensuing inflammatory response to avoid tissue damage. In this context pathogens have adapted numerous strategies that hijack the host mechanisms to dampen the immune response and as a consequence causing infection. The programmed death-ligand 1 (PD-L1) – programmed death 1 (PD-1) pathway is a key pathway involved in mediating self-tolerance thereby maintaining homeostasis. Elegant reports have demonstrated that the PD-L1 – PD-1 pathway is exploited by cancer cells and viruses as an immune evasion mechanism to suppress effector T cell responses. Thus, I aimed at investigating the role of PD-L1 pathway in modulating immune response to Mycobacterium tuberculosis a bacterial pathogen and Aspergillus fumigatus an opportunistic fungal pathogen. I found that A. fumigatus-derived α-(1,3)-glucan induces maturation of DCs and secretion of various immunoregulatory cytokines that was partially dependant on Toll like receptor (TLR)-2. Analysis of CD4+ T cell polarization revealed that α-(1,3)-glucan-educated DCs induced CD4+ CD25+FoxP3+ regulatory T cell (Treg) generation that was in part dependent on the PD-L1 expression on DCs. Importantly, blocking PD-L1 on DCs enhanced IFN-γ secretion without modulating Th17 response. Similarly, M. tuberculosis induced PD-L1 dampened Th1 response without modulating Th17 response. Analysis of downstream signalling pathways indicated that, mycobacterium-responsive sonic hedgehog (SHH) mediated PD-L1 induction by inhibiting specific microRNAs, miR-324-5p and miR-338-5p that target PD-L1. Additionally, SHH induced cyclooxygenase (COX)-2 catalysed the synthesis of prostaglandin E2 (PGE2) that synergize with PD-L1 to coordinate the expansion of Tregs. My results thus demonstrate that respiratory pathogens either directly or by harbouring imuunoregulatory antigens highjack the PD-L1 pathway to suppress the protective Th1 response and orchestrate Treg generation without modulating Th17 response. Importantly, my results provide a rational for exploiting immunotherapeutic approaches that target PD-1 – PD-L1 co-stimulatory axis to restore effector T cell response to respiratory pathogens.

La Néphropathie à IgA est la glomérulonéphrite primitive la plus fréquente, responsable d’une évolution vers l’insuffisance rénale terminale dans 10 à 30% des cas après 20 ans d’évolution. Les déterminants de cette maladie sont nombreux, impliquant de multiples acteurs de l’inflammation, qu’ils soient cellulaires ou humoraux. La physiopathologie générale de la maladie est actuellement considérée comme se déroulant en quatre « coups », (i) la production d’IgA1 polymériques présentant un déficit de galactosylation de la région charnière, (ii) l’existence d’un élément circulant capable de complexer ces IgA1 anormales, pouvant être une IgG anti-glycane ou la portion soluble du récepteur de type I aux IgA (sCD89), (iii) la constitution de complexes immuns circulants et (iv) le dépôt glomérulaire de ces complexes, générant des lésions inflammatoires puis cicatricielles responsables de l’évolution vers la maladie rénale chronique. La médiation inflammatoire est impliquée à différents niveaux comprenant entre autres le rôle de l’infiltration de macrophages dans le tissu rénal, l’orchestration de cette réponse inflammatoire glomérulaire par les sous-populations de lymphocytes T et l’importance de l’activation du complément sur le déterminisme des lésions glomérulaires inflammatoires médiées par les complexes immuns déposés. Au cours de ce travail de thèse, l’implication de ces différents acteurs a été explorée. Les macrophages expriment le récepteur de type I aux IgA (CD89, issu du gène FCAR), dont une mutation de la portion intracytoplasmique modifie in vitro la transduction du signal. La première étude a visé à évaluer sur une grande cohorte rétrospective l’impact de cette mutation sur le risque d’occurrence de la maladie ainsi que son impact pronostique. Le rôle des sous-populations T a été abordé au cours d’une seconde étude, suivant l’hypothèse que l’orientation pro inflammatoire au cours de la NIgA pourrait être liée à un déficit de régulation par une sous-population de lymphocytes T, les Tregs. Cette étude prospective a évalué la représentation de la sous-population CD4+CD25+CD127low et le profil d’expression génique de gènes prototypiques des sous-populations Th1, Tregs et Th17. Le rôle du complément comme médiateur inflammatoire à l’interface entre les complexes immuns à IgA1 et les cellules mésangiales a été exploré par une étude in vitro. La mutation 844 A->G de FCAR n’a pas été associée à un risque supplémentaire de développer la maladie et n’impactait pas le pronostic des patients. L’étude des lymphocytes T n’a pas montré de différence de quantité de cellulesCD4+CD25+CD127low entre patients et volontaires sains et ne suggérait qu’une tendance en faveur d’un déficit fonctionnel de régulation (plus faible expression des gènes FoxP3, IL10, TGFβ chez les patients). Enfin, des fragments issus de l’activation et de la protéolyse par le facteur I de C3 ont été mis en évidence par immunoblot et spectrométrie de masse au sein des complexes immuns générés artificiellement en présence de serum. Ces études suggèrent qu’une modification du rôle fonctionnel du CD89 n’impacte pas le devenir de la NIgA, ce qui est en défaveur d’un rôle critique de ce récepteur dans la pathogénie de la maladie. La tendance au déficit fonctionnel Tregs nécessite d’être confirmée au sein d’un effectif plus conséquent et présentant une forme plus active de la maladie, mais elle corrobore deux autres études comparables dans leur méthodologie. Enfin, le rôle du complément se situe à l’interface entre les complexes immuns et les effecteurs inflammatoires glomérulaires tels que les cellules mésangiales / IgA Nephropathy (IgAN) is the most common primary glomerulonephritis, leading to end stage renal failure in 10 to 30% of cases after 20 years. This disease is determined by numerous inflammatory players, including cells and molecules. The pathogeny of the disease is likely to be driven by a 4 « hits » model, (i) increased systemic production of aberrantly O galactosylated polymeric IgA1, (ii) the existence of circulating abnormal IgA1 binding element, which could be either an anti-glycan IgG or the soluble fragment of the main IgA receptor (sCD89), (iii) the formation of circulating immune complexes, and (iv) the glomerular deposition of these complexes, that accounts for a variable local inflammation leading to scarring processes and finally to the chronic kidney disease. Inflammatory mechanisms operate at several levels, including the macrophage cells infiltration in the kidney tissue, the orchestration of the immune response by T-cells subsets, including regulatory T-cells, and the role of complement activation to induce the glomerular inflammatory response from the immune complexes deposition. In the present work, we aimed to explore the implication of these inflammation response players. Macrophages express the type I IgA receptor (CD89, downstream from its gene FCAR), whose function can be affected in vitro by a common mutation of its intracytoplasmic portion. A first study evaluated the impact of this mutation on the risk to develop the disease as well as on the global prognosis. A second study evaluated the role of T-cell subsets during IgAN, following the hypothesis that the pro-inflammatory balance of the disease could be a consequence of a defect in the immune regulation by the Tregs. This prospective study aimed to assessing the frequency of CD4+CD25+CD127low cells in peripheral blood and the characteristic gene expression profile from Th1, Th17 and Tregs subsets. The role of complement as an inflammatory player at the interface between IgA1 containing immune complexes and mesangial cells was explored by an in vitro study. The single nucleotide polymorphism 844 A->G of FCAR had no impact neither on disease risk of occurrence neither on the renal survival. The T-cell subsets study failed to demonstrate any difference in the proportion of CD4+CD25+CD127low cells and only suggested a defect in functional activity of Tregs, according to a lower expression of FoxP3, IL10, TGFβ genes. The third in vitro study demonstrated by immunoblot and mass spectrometry the presence of C3 breakdown products accompanying IgA1 based engineered immune complexes formed in presence of normal immunoglobulin depleted serum. The lack of effect of the mutation of FCAR on the IgAN prognosis is not in favour to a critical role of this receptor on the pathogeny of the disease. The trend in the functional defect of Tregs subset needs to be confirmed in a larger study, including patients with a more severe form of their disease. This result is however consistent with two other studies displaying a similar methodology. The role of complement is confirmed to be a key player, as it is likely to act at the interface between the IgAN particular immune complexes and mesangial cells

Le virus d’Epstein-Barr (EBV) est le premier virus transformant à avoir été identifié chez l’Homme. Il infecte plus de 90% de la population adulte mondiale, persistant sous forme épisomale dans le compartiment B mémoire tout au long de la vie de l’hôte. Lors de la primo-infection et lors de phases de réactivation du virus, les cellules B immortalisées sont en programme de latence III, aussi appelée phase de prolifération, où l’ensemble des protéines de latence sont exprimées. Lorsque les hôtes sont immunocompétents, un équilibre entre hôte et virus s’établit et la plupart des cellules B infectées sont éliminées par le système immunitaire de l’hôte, principalement par les lymphocytes T cytotoxiques. En cas de déficit immunitaire, il peut y avoir émergence de lymphomes, tels que les désordres lymphoprolifératifs des patients immunodéprimés (PTLDs), les lymphomes non-Hodgkiniens (LNH) et Hodgkiniens (LH). Les travaux antérieurs du laboratoire ont permis de révéler que l’immuno-inhibiteur PD-L1/B7-H1/CD274 est surexprimé à la surface des lymphocytes B en latence III de l’EBV. L’interleukine-10 (IL-10) est également sécrétée par ces cellules. Ces caractéristiques sont communes aux cellules B régulatrices (Bregs). Le but de ma thèse était d’interroger les caractéristiques immuno-modulatrices des cellules B en latence III de l’EBV, dans le cadre des propriétés des Bregs. Nous montrons que les cellules B en latence III de l’EBV possèdent les déterminants antigéniques communs aux Bregs immatures (CD24High CD38High PD-L1High), associée à une surexpression des cytokines immunosuppressives cardinales des Bregs (IL-10, TGF-β1 et IL-35). Nous montrons que les cellules B en latence III de l’EBV peuvent conduire à la mort des cellules T CD4 autologues, ainsi qu’à l’inhibition de la prolifération des lymphocytes T CD4 et CD8, au profit de l’expansion de lymphocytes T régulateurs (Tregs). Nous avons trouvé que cette expansion est médiée par l’axe PD-1/PD-L1. Ces travaux mettent en évidence un nouveau mécanisme de l’EBV concernant le détournement du système immunitaire de l’hôte, augmentant ses capacités oncogéniques. / The Epstein-Barr virus (EBV) is the first transforming virus discovered in humans. It infects more than 90% of the global adult population, persisting in an episomal form in the memory B-cell compartment throughout the life of the host. During primo-infection and during phases of viral reactivation, immortalized B-cells are in latency III, also called the proliferation program, in which the full range of latency proteins are expressed. In immunocompetent subjects, a balance between virus and host is established, and most infected B-cells are eliminated by the host’s immune system, mainly by cytotoxic T lymphocytes. Deficit of the immune system may lead to lymphomagenesis, such as post-transplantation lymphoproliferative disorders (PTLDs), non-Hodgkin’s (NHL) or Hodgkin’s lymphomas (HL). Previous studies in the lab revealed that the immuno-inhibitor PD-L1/B7-H1/CD274 was overexpressed on the surface of EBV latency III B-cells. Interleukin-10 (IL-10was also secreted by these cells. These features are shared with regulatory B-cells (Bregs). Our objective was to examine the immunomodulatory features of EBV latency III B-cells, in the frame of Bregproperties. We found that EBV latency III B-cells possessed the antigenic determinants common to immature Bregs (CD24High CD38High PD-L1High), associated with overexpression of Breg immunosuppressive cytokines (IL-10, TGF-β1 and IL-35). EBV latency III B-cells led to death of autologous CD4 T-cells, as well as inhibition of CD4 and CD8 T-lymphocyte proliferation, favoring regulatory T-cell (Treg) expansion. We found that this expansion was mediated by the PD-1/PD-L1 axis. This study highlights a new mechanism of EBV for t diversion of the host immune system thereby increasing its oncogenic properties.

Regulatory T cells (Treg) play a crucial role in controlling immune homeostasis. Several inflammatory diseases including multiple sclerosis and inflammatory bowel disease have been associated with dysfunctional and/or reduced numbers of Treg. While several mechanisms of action have been discovered by which Treg can exert their function, disease-specific Treg requirements remain unknown. The Treg pool consists of highly diverse subpopulations, indicating that there is a potential to optimise Treg-targeted therapies if disease-relevant mechanisms can be established. Microarray data from our lab suggests a marked upregulation of the integrin αv as well as the IL-33 receptor ST2 in Treg retrieved from the inflamed central nervous system (CNS) during experimental autoimmune encephalomyelitis compared to peripheral lymphoid organs. These two molecules were further investigated within this PhD project with the aim to understand their role in Treg function during chronic inflammatory disease. αvβ integrins have been reported to be needed for effector T cell migration to inflamed sites through binding of extracellular matrix components and are involved in TGF-β activation by a variety of cell types. Conditional knockout mice lacking the integrin αv specifically in Foxpγ+ Treg were generated to address the role of αv integrins on regulatory T cells in inflammatory disease. αv-/- Treg showed a deficiency in activating latent TGF-β, but were able to suppress responder T cell proliferation in vitro as well as in vivo. αv-/- Treg were also able to migrate to the inflamed CNS during EAE and resolve disease. However, αv-/- Treg were detected at significantly lower numbers and proportions in the inflamed gut during a curative T cell transfer model of colitis; this led to a quantitative impairment in the ability of αv-/- Treg to cure colitis when compared to wild-type (WT) Treg. Whether this is a deficit in migration, survival, proliferation, or Foxp3 stability, remains to be investigated. IL-33 acts as an alarmin and is best studied as a cytokine released upon tissue damage that induces a potent type 2 immune response by acting on a multitude of immune cells. Expression of the IL-33 receptor ST2 on Treg has recently been associated with positive metabolic parameters in visceral adipose tissue, protection from gut inflammation, and tissue-restorative function in other inflamed tissues such as injured muscle or lung. This project showed that in steady state, ST2+ Treg expressed high levels of several markers which have been associated with potent regulatory function. When stimulated in vitro, ST2+ Treg showed a better survival and expansion rate compared to their ST2- counterparts, even more so in the presence of IL-33. T-bet deficiency in Treg resulted in an increased ST2+ Treg pool, and T-bet-associated cytokine IFN-γ was found to antagonise IL-33-induced expansion of the ST2+ Treg pool in a T-bet-independent manner. When ST2+ and ST2- Treg were tested for their respective suppressive capacity in vivo, ST2+ Treg were able to suppress responder T cell expansion despite being found only at low numbers in secondary lymphoid organs compared to ST2- Treg. However, in a curative model of T cell transfer colitis, ST2+ Treg were less capable of controlling the ongoing immune response than ST2- Treg. A possible explanation for the superiority of ST2- Treg in this setting can be found in the fact that injected ST2- Treg acquired a distribution of ST2 expression reminiscent of WT Treg over the course of disease. On the other hand, an increased starting pool of ST2+ Treg as occurs in T-bet-/- Treg significantly enhanced the capacity of Treg to control colitis compared to WT Treg. In conclusion, both ST2- and ST2+ Treg are likely to have a distinct, non-redundant role in suppressing T cell activation in secondary lymphoid organs and controlling ongoing inflammation in peripheral tissue, respectively.

Le diabète de type 1 (DT1) est une maladie auto-immune qui résulte en la destruction des cellules (ß des îlots de Langerhans par les cellules du système immunitaire. Des travaux précédents de notre laboratoire ont identifié la cytokine "Thymic Stromal Lymphopoietin" (TSLP) comme étant un stimulus tolérogénique pour les cellules dendritiques (DCs) chez le modèle murin du DT1, la souris "Non Obese Diabeiic" (NOD). Les DCs conditionnées à la TSLP (TSLP-DCs) présentent un phénotype semi-mature, sont capables d’induire une réponse Th2 ainsi qu’une conversion et une expansion des lymphocytes T régulateurs (Tregs) in vitro et protègent les souris NOD contre le DT1. Ces observations nous ont amené à investiguer les mécanismes qui entraînent cette protection contre le DT1. Les travaux décrits dans ce mémoire montrent que les TSLP-DCs injectées chez les souris NOD migrent vers la rate, de manière privilégiée. Ces observations nous ont amené à étudier l’influence des TSLP-DCs sur la réponse Th1/Th2 au niveau de la rate. Nous avons observé que les splénocytes CD4[indice supérieur +] et CD8[indice supérieur +] de souris injectées avec des TSLP-DCs exprimaient moins d’IFN? par rapport au souris témoins (splénocytes des souris injectées avec des LPS-DCs). Ces résultats suggèrent une diminution de la réponse Th1 chez ces splénocytes. Par contre, les résultats obtenus avec l’IL-10 ne nous ont pas permis de conclure quant à l’influence des TSLP-DCs sur la réponse Th2. Cependant, nous avons confirmé la capacité des TSLP-DCs à induire la conversion des lymphocytes T CD4[indice supérieur +]CD25[indice supérieur -] en Tregs CD4[indice supérieur +]CD25[indice supérieur +]Foxp3[indice supérieur +]. Nous avons aussi montré que ces Tregs partiellement convertis inhibent la prolifération de lymphocytes T 8.3-CD8[indice supérieur +] diabétogènes, et empêchent la production d’IFN?. Les Tregs convertis en présence de TSLP-DCs ou de LPS-DCs ont également été injectés à des souris 8.3-NOD.RAG2[indice supérieur -/-]. Les résultats ont révélé que seuls les Tregs différenciés en présence de TSLP-DCs ont la capacité d’empêcher le développement du DT1. Nos travaux suggèrent que la diminution de la réponse Th1 et l’induction d’une population efficiente de lymphocytes Tregs font partie des mécanismes utilisés par les TSLP-DCs pour protéger les souris NOD contre le DT1.

Από την δεκαετία του '70 είναι γνωστό ότι οι αλλογενείς μεταγγίσεις αίματος (ABT) προκαλούν ανοσοκαταστολή, ωστόσο, μετά το 1990 έγινε γνωστό ότι για το φαινόμενο αυτό ευθύνεται ο Τ λεμφοκυτταρικός πληθυσμός των ρυθμιστικών κυττάρων (Tregs). Στην παρούσα εργασία, μελετήθηκε η επίδραση της μετάγγισης σε ασθενείς που είχαν υποβληθεί σε ολική ή μερική αρθροπλαστική γόνατος ή ισχίου, στον πληθυσμό των φυσικών (nTreg) και επαγώγιμων (iTreg) Τ ρυθμιστικών κυττάρων. Στους ίδιους ασθενείς μελετήθηκε και η αλλαγή προτύπου στην έκκριση των κυτταροκινών. Συλλέχθηκαν δείγματα ολικού αίματος από 46 ασθενείς, 7 άντρες και 39 γυναίκες. Από αυτούς, οι 36 ασθενείς έλαβαν μετάγγιση (Group1) ενώ οι 10, δεν έλαβαν. Η συλλογή των δειγμάτων έγινε πριν την εγχείρηση (BS), αμέσως μετά το χειρουργείο (Day0), μια εβδομάδα μετά (Day7), ένα μήνα μετά (1month) και κατά τον επανέλεγχο των ασθενών (>3months). Στα δείγματα έγινε απομόνωση των PBMC και καθορίστηκε το ποσοστό των CD4+CD25+Foxp3+ και CD4+CD25high/+CD127low/- Tregs με την μέθοδο FACS ενώ στο πλάσμα καθορίστηκαν τα επίπεδα των κυτταροκινών με τις μεθόδους Cytometric Bead Array (CBA) και ELISA. Επιπρόσθετα, μελετήθηκε η λειτουργικότητας των Treg από δείγμα αίματος ασθενών μέσα στην πρώτη εβδομάδα μετά το χειρουργείο. Καλλιεργήθηκαν διάφοροι λόγοι Tregs: Teff για 72 ώρες, παρουσία PHA και CFSE. Με την μέθοδο Cytometric Bead Array (CBA) καθορίστηκαν τα επίπεδα των κυτταροκινών IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, TNF-α, IFN-γ ενώ με την μέθοδο της ELISA καθορίστηκαν τα επίπεδα των TNF-α και των υποδοχέων TNF-RI(p55/p60) και TNF-RII(p75/p80) καθώς επίσης και οι TGF-β1 και TGF-β2. Από τα πειράματα προέκυψε ότι οι πληθυσμοί τόσο των φυσικών CD4+CD25+Foxp3+ όσο και των επαγώγιμων CD4+CD25high/+CD127low/- Tregs, αυξάνονται μετά το χειρουργείο (day 0), μετά την μετάγγιση, ενώ μειώνονται την πρώτη εβδομάδα μετά το χειρουργείο. Αντίθετα αποτελέσματα παρατηρήθηκαν στους ασθενείς οι οποίοι υποβλήθηκαν σε χειρουργείο αλλά δεν μεταγγίστηκαν. Με τα πειράματα λειτουργικότητας, φάνηκε ότι τα Tregs ήταν λειτουργικά και ικανά να προκαλούν αναστολή του πολλαπλασιασμού των Teff. Σχεδόν όλες οι κυτταροκίνες που αναλύθηκαν, οι IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, TNF-α, IFN-γ, ο υποδοχέας TNF-RI(p55/p60) και TNF-RII(p75/p80) και TGF-β2 εμφάνισαν αύξηση μετά το χειρουργείο, μετά την μετάγγιση. Ωστόσο, μόνο η αύξηση της IL-6, και των υποδοχέων TNF-RI(p55/p60) και TNF-RII(p75/p80) ήταν στατιστικώς σημαντική μετά το χειρουργείο, μετά την μετάγγιση. Τα επίπεδα του TGF-β1 μειώθηκαν μετά το χειρουργείο, μετά την μετάγγιση (Th3 απόκριση). Συμπερασματικά, τα ποσοστά των Tregs αυξήθηκαν στους ασθενείς που υποβλήθηκαν σε αρθροπλαστική και μεταγγίστηκαν. Οι πληθυσμοί των Tregs παρέμειναν αυξημένοι μέχρι και τον πρώτο μήνα μετά το χειρουργείο. Τα Tregs είναι λειτουργικά και ικανά να καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των Teff, παρουσία PHA. Μετά το χειρουργείο, ύστερα από μετάγγιση, τα επίπεδα των IL-6, TNF-RI και TNF-RII αυξάνονται ως αντίδραση κατά του μοσχεύματος. Μετά την εγχείρηση (day 0) και μετά από μετάγγιση, οι ασθενείς αναπτύσσουν Th1 απόκριση και πολλαπλασιασμό των Tregs. Σταδιακά, τα Tregs καταστέλλουν τις προφλεγμονώδης αποκρίσεις μέχρι να επανέλθει η ισορροπία των ληπτών μετά την εγχείρηση. / Clinical and experimental studies have established that allogeneic blood transfusion (ABT) can cause immunosuppression. In this work we determined whether and to which extend Tregs contribute to this effect. Material and methods: Heparinized peripheral blood samples were collected from 46 patients (7 male and 39 female, age 28-88 years) that underwent joint replacement surgery. The samples were collected immediately before surgery (BS) and after surgery (AS) on days 0, 7, 1 month, and 3 months to 1 year. Thirty six patients received ABT and 10 did not. PBMC were isolated and the numbers and % of CD4+CD25+Foxp3+ Tregs and CD4+CD25high/+CD127low/- Tregs were determined by FACS. Tregs and T effectors (Teff) were isolated from patients on days 0-7 and Treg functional assays were performed by culturing Tregs with PHA-stimulated Teff at different ratios for 72h with CFSE, and analyzed by FACS. Cytokine serum level determined with Cytometric Bead Array (CBA) for IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, TNF-α, IFN-γ and ELISA for TNF-α, the receptor TNF-RI(p55/p60) and II(p75/p80), TGF-β1 and β2. Results: Both, natural (CD4+CD25+Foxp3+) and inducible (CD4+CD25high/+CD127low/-) Tregs increased in day 0 and decreased in day 7 until BS levels, after ABT. Opposite results (small reduction) observed in patients without ABT. With functional assays proved that Tregs are functional and suppress the T-cell proliferation. IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, TNF-α, IFN-γ, the receptor TNF-RI(p55/p60) and II(p75/p80), TGF-β1 and β2 increased after the surgery, after ABT. IL-6, TNF-RI(p55/p60) and II(p75/p80) levels increased with SSD after the surgery, after ABT. TGF-β1 levels decreased in day 0 until BS levels (Th3 response). Th3 cells growth from CD4+CD25- FoxP3- Th0 peripheral cells. Th3 prevents maturation of DCs, Th2 T-cells. Induce the TGF-β secretion and inhibit IL-2 and antibodies secretion. Conclusion: In patients underwent scheduled joint replacement surgery, Tregs increased after ABT until 1 month and are functional and suppress Teff proliferation under PHA condition. IL-6, TNF-RI and TNF-RII are activation markers of immune system and suppressed after ABT. In day 0, IL-6, TNF-RI and II levels increased as a reaction graft against host’s antigen. After surgery (day 0), patients develop Th1 response and Tregs proliferation, after ABT. Gradually, Tregs suppress the proinflammatory responses until the balance in the recipient, after the surgery.

Presentation of antigenic peptides on MHC-II molecules is essential for induction of tolerance to self and for effective immunity against foreign pathogens. The non- classical MHC-II molecule DO (HLA-DO in humans, H2-O in mice) functions in selection of MHC-II epitopes by competitively inhibiting the peptide exchange factor DM. Previous studies have suggested a role for DO in development of autoimmunity and in the immune response to retroviral infection, presumably via modulation of the MHC-II peptidome, but the precise effect of DO has been difficult to discern. Through characterization of the full spectrum of peptides from DO-sufficient and DO-deficient cells, we demonstrate that DO functions to broaden the diversity of peptide species presented on MHC-II. DO is regulated differently from other components of the MHC-II processing machinery, with expression limited to B cell and dendritic cell subsets, as well as thymic epithelial cells, suggesting a role for DO in mediating central tolerance. In a mouse model lacking DO, we show that selection of T regulatory cells (Tregs) is increased and that DO- deficient Tregs are more activated and exert greater suppressive capacity. Despite augmented Treg function, mice lacking DO display enhanced susceptibility to autoimmunity, with altered germinal center (GC) Tregs and B cells indicative of an aberrant GC reaction. These data suggest that DO expression serves to fine-tune the immunopeptidome in order to promote self-tolerance to a wide spectrum of epitopes and to select a Treg population with appropriate specificity for self- antigens.

Vitiligo is an autoimmune disease of the skin characterized by epidermal depigmentation that results from CD8+ T cell-mediated destruction of pigment producing melanocytes. Vitiligo affects up to 1% of the population and current treatments are moderately effective at facilitating repigmentation by suppressing cutaneous autoimmune inflammation to promote melanocyte regeneration. In order to cause disease, CD8+ T cells must overwhelm the mechanisms of peripheral tolerance in the skin and if we understand the suppressive mechanisms that are compromised during vitiligo, we can potentially use this information to improve existing treatments or engineer novel interventions. Therefore, my goal is to characterize the regulatory factors in the skin that suppress depigmentation during vitiligo. Our lab has developed a mouse model of vitiligo that accurately reflects human disease and I used this model to demonstrate that regulatory T cells suppress CD8+ T cell-mediated depigmentation and interact with CD8+ T cells in the skin during vitiligo. In this model of disease, I investigated the molecules involved in regulatory T cell function and observed that the chemokine receptors CCR5 and CCR6 play different roles in regulatory T cell suppression. While CCR6 facilitates regulatory T cell migration to the skin, CCR5 is dispensable for migration but required for optimal regulatory T cell function. Additionally, I used our mouse model to demonstrate that Langerhans cells suppress the incidence of disease during vitiligo. Taken together the results from these studies provide novel insights into the mechanisms of suppression during vitiligo.