Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-04-28T13:39:52Z No. of bitstreams: 1 2016_AndreiSteccaSteindorff.pdf: 3749164 bytes, checksum: 9a4a5c3bdc4e24bc0a92b9777e8680f2 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-04-28T20:07:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_AndreiSteccaSteindorff.pdf: 3749164 bytes, checksum: 9a4a5c3bdc4e24bc0a92b9777e8680f2 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-28T20:07:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_AndreiSteccaSteindorff.pdf: 3749164 bytes, checksum: 9a4a5c3bdc4e24bc0a92b9777e8680f2 (MD5) / O controle biológico é um processo complexo que inclui diferentes mecanismos e uma diversidade de vias metabólicas. Espécies de Trichoderma harzianum são conhecidas por sua atividade de biocontrole contra patógenos de plantas. Para melhor entender os mecanismos utilizados por T. harzianum no controle biológico, no presente trabalho foi sequenciado o genoma do isolado TR274 usando sequenciamento Illumina, assim como seu respectivo transcritoma na interação direta com Scletotinia sclerotiorum ou na presença de sua parede celular. A montagem do genoma feita utilizando o programa AllPaths-LG cobertura máxima de 100x, resultou em 2282 contigs, tamanho do genoma de 40,8 Mb e um conteúdo GC de 47.7%, similar aos outros genomas de Trichoderma. Um total de 13932 genes foram anotados. Análise do Core Eukariotic Genes Dataset (CEGMA) sugere que o genoma está 100% completo e 97,9% das sequencias de RNA-seq alinharam corretamente no genoma. A análise filogenética usando proteínas ortólogas com todas as espécies de Trichoderma sequenciadas no JGI, confirmam a divisão nas seções Tricoderma (T. asperellum e T. atroviride), Longibrachiatum (T. reesei, T. citrinoviride e T. longibrachiatum) e Pachibasium (T. harzianum e T. virens). Das proteínas ortólogas anotadas, 8242 compõem proteínas compartilhadas por todas as espécies, as proteínas espécie específicas variam de 262 (T. reesei) a 1803 (T. longibrachiatum). Os dois genomas de T. harzianum analisados sugerem uma alta similaridade entre eles, mesmo tendo sido isolados de locais e continentes distintos, um de solo de cerrado no Brasil e outro de solo de jardim na Inglaterra. Análises de genes envolvidos com o metabolismo secundário, CAZymes, transportadores, proteases e fatores de transcrição foram feitas. A seção Pachibasium expandiu virtualmente todas as categorias analisadas quando comparada com as outras seções. Análise CAFE mostrou uma correlação positiva entre estas expansões e o tamanho dos genomas. O subgrupo C1 das quitinases foi completamente perdido pela seção Longibrachiatum. Estes resultados sugerem que estas famílias proteicas tem um importante papel nos seus respectivos fenótipos. As abordagens transcritômicas mostraram que a interação entre T. harzianum e S. sclerotiorum é bem complexa e envolve a produção de metabólitos secundários e síntese de transportadores antes e durante o contato, com uma modulação principalmente de enzimas hidrolíticas após o contato. Dos genes encontrados diferencialmente expressos na condição de crescimento em parede celular, 86,8% foram também encontrados diferencialmente expressos na interação direta. Cerca de 25% de todo o genoma de T. harzianum foi modulado durante a interação com S. sclerotiorum. _________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Biological control is a complex process, which requires many mechanisms and a high diversity of biochemical pathways. Trichoderma harzianum species complex are well known for their biocontrol activity against many plant pathogens. To gain new insights into the biocontrol mechanism employed by T. harzianum, we sequenced genome of the isolate TR274 with its transcriptome during direct interaction with the fungal pathogen Sclerotinia sclerotiorum and its cell wall, using Illumina sequencing. Whole genome assembly was performed using AllPaths-LG, with a maximum coverage of 100x. The assembly resulted in 2282 contigs, with an estimated genome size of 40.8 Mb and GC content of 47.7%, similar to other Trichoderma genomes. Using the JGI Annotation Pipeline we predicted 13,932 genes, with high transcriptome support. Core Eukariotic Genes Dataset (CEGMA) tests suggested 100% genome completeness and 97.9% of RNA-SEQ reads mapped to the genome. The phylogenetic comparison using orthologous proteins with all Trichoderma genomes sequenced at JGI, corroborates the Trichoderma section division described previously (T. asperellum and T. atroviride), Longibrachiatum (T. reesei, T. citrinoviride and T. longibrachiatum) and Pachibasium (T. harzianum and T. virens). A Venn diagram was built with orthologs proteins, with 8242 composing the core protein group and species specific varying from 262 proteins (T. reesei) to 1803 (T. longibrachiatum). The comparison between two Trichoderma harzianum CBS 226.95 and TR274 isolates, suggests a high genome similarity. Analyses of the secondary metabolites, CAZymes, transporters, proteases and transcription factors were performed. The Pachybasium section expanded virtually all categories analyzed compared with the other sections. CAFE analysis showed positive correlation between these families and genome size. The chitinase subgroup C1 was completely absent in Longibrachiatum section members. These results suggest that these proteins families play an important role on their respective phenotypes. Transcriptome analysis suggests that the interaction between T. harzianum and S. sclerotiorum is complex, involving production of secondary metabolites and transporters before and during the contact, with a modulation of CAZymes after contact. A total of 86.8% of differentially expressed genes during growth on Sclerotinia sclerotiorum cell wall were found during direct interaction. Approximately the 25% of whole T. harzianum genome was seen to be modulated during the interaction with S. sclerotiorum.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6489.pdf: 6160107 bytes, checksum: 81c1fddd8e696b53fe5fd98c9174ba24 (MD5) Previous issue date: 2014-08-29 / Financiadora de Estudos e Projetos / The depletion of fossil fuels, the growing energy demand and the great need to reduce carbon emissions gradually increased the demand for new sources of renewable and clean energy. Bioethanol is obtained from the fermentation of lignocellulosic biomass, for example sugar cane, and can be considered a viable alternative. For this biomass can be used it is necessary to degrade the constituent molecules of the cell wall to fermentable sugars through the enzymes called cellulases. Among them there are three classes with different functions: the cellobiohydrolases, endoglucanases and β-glucosidases. In order to contribute to the viability and deployment of ethanol production technologies, purification of two β- glucosidases of the fungus Trichoderma harzianum was performed, named in this work as ThBgl1 e ThBgl2, as well as their biophysical and biochemical characterization. Clones in study were obtained by a cloning platform, expression and purification of recombinant proteins in high performance and expressed in bacteria Escherichia coli. Through the functional characterization of proteins under study it was found that they had the optimum pH in the range of 5.5 and optimum temperature around 40ºC. Results of enzyme kinetics showed that ThBgl1 has higher preference (specificity) by cellobiose, while in ThBgl2 cellobiose is a substrate having low specificity. In ThBgl2 specificity is higher by fucosideos. Furthermore, it was observed the occurrence of transglycosylation catalyzed by β-glucosidases in study and the action of some inhibitors on its enzymatic activity. The three-dimensional analysis of these proteins revealed the presence of the barrel tim typical of family 1 of glycoside hydrolases. / O esgotamento das fontes de combustíveis fósseis, a crescente demanda energética e a grande necessidade de redução da emissão de carbono fizeram com que aumentasse gradativamente a procura por novas fontes de energia renováveis e limpas. O bioetanol obtido da fermentação de biomassas lignocelulósicas, como o bagaço de cana-de-açúcar, pode ser considerado uma alternativa viável. Para que essa biomassa possa ser utilizada, faz-se necessário a degradação das moléculas constituintes da parede celular a açúcares fermentáveis por meio das enzimas chamadas celulases. Dentre elas existem três classes com diferentes funções: as celobiohidrolases, as endoglucanases e as β-glicosidades. Com o objetivo de contribuir para a viabilização e implantação de tecnologias de produção de etanol, foi realizada a purificação de duas β-glicosidases do fungo Trichoderma harzianum, denominadas nesse trabalho como ThBgl1 e ThBgl2, bem como sua caracterização bioquímica e biofísica. Os clones em estudo foram obtidos por meio de uma plataforma de clonagem, expressão e purificação de proteínas recombinantes em alto desempenho e expressos na bactéria Escherichia coli. Através da caracterização funcional das proteínas em estudo, verificou-se que elas apresentaram o pH ótimo na faixa de 5,5 e temperatura ótima em torno de 40ºC. Os resultados de cinética enzimática mostraram que ThBgl1 tem maior preferência (especificidade) por celobiose, enquanto na ThBgl2 a celobiose é um substrato com baixa especificidade. Na ThBgl2 a especificidade é maior por fucosídeos. Além disso, constatou-se a ocorrência de transglicosilação catalisada pelas β-glicosidases em estudo e a ação de alguns inibidores em sua atividade enzimática. A análise tridimensional dessas proteínas revelou a presença de um barril tim típico das hidrolases de glicosídeos da família 1.

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Devido à sua importante atividade celulolítica, o fungo Trichoderma harzianum possui um grande potencial de aplicação na hidrólise da biomassa. No entanto, as celulases deste fungo filamentoso ainda não foram caracterizadas em profundidade. A celobiohidrolase I (CBHI) é a principal enzima celulolítica produzida por Trichoderma sp. e atualmente é uma das celulases mais investigadas para aplicações de biocombustíveis. A CBHI hidrolisa celulose cristalina à unidades solúveis de celobiose, o que a torna uma enzima chave para a produção de açúcares fermentáveis a partir da biomassa. O objetivo deste trabalho foi purificar e caracterizar a CBHI de Trichoderma harzianum (ThCBHI) bioquímica, biofísica e estruturalmente. Primeiramente foi estabelecido um protocolo de purificação eficiente da proteína a partir da expressão homóloga no fungo. A caracterização bioquímica ThCBHI mostrou que a proteína possui uma massa molecular de 66 kDa, pI de 5,23 e o pH e a temperatura de atividade ótima foram 5,0 e 50 ºC, respectivamente. A influência do pH e temperatura sobre as estruturas secundárias e terciárias e atividade enzimática da ThCBHI foram analisados por espectroscopia de CD, fluorescência e SAXS, e os resultados mostraram que as perturbações de pH e de temperatura afetam a estabilidade por dois mecanismos diferentes. As variações de pH podem modificar a protonação dos resíduos, afetando diretamente sua atividade, levando a desestabilização estrutural apenas em limites extremos de pH, como pH 9,0. A temperatura, por outro lado, tem uma influência direta sobre enovelamento e compactação da enzima, fazendo com que na temperatura em torno de 60 ºC ocorra perda da estrutura secundária, e terciária. Quando as análises foram realizadas na presença do produto de reação e também inibidor competitivo, celobiose, a estabilidade térmica da ThCBHI aumentou significativamente de 61,5 para 65,9 ºC. Os estudos estruturais e simulações de dinâmica molecular mostraram que a flexibilidade do resíduo Tyr260, em comparação com a Tyr247 do homólogo de T. reesei CBHI (TrCBHI), é aumentada devido às cadeias laterais curtas adjacentes de Val216 e Ala384 criando uma abertura adicional na face lateral do túnel catalítico. A ThCBHI também apresenta um loop encurtado na entrada do túnel de interação com a celulose, o que tem sido descrito como o responsável por interagir com o substrato de TrCBHI. Estas características estruturais podem explicar por que a ThCBHI apresenta maior valor de kcat e menor inibição pelo produto em comparação com TrCBHI. / Trichoderma harzianum is a fungus that has a considerable potential in biomass hydrolysis application due to its elevated cellulolytic activity. Cellulases from Trichoderma reesei have been widely used as model in studies of cellulose breakdown. However, cellulases from Trichoderma harzianum are less-studied enzymes which have not been characterized biophysically and biochemically as yet. CBHI, a cellobiohydrolase I, is the major cellulolytic enzyme produced by Trichoderma sp. and is currently one of the most investigated cellulases for biofuel applications. CBHI hydrolyzes crystalline cellulose to soluble cellobiose units, which turns it into a key enzyme for producing fermentable sugars from biomass. The aim of this work was to purify and characterize the CBHI of Trichoderma harzianum (ThCBHI). We established an efficient purification protocol of ThCBHI, from the homologous expression. The biochemical characterization of ThCBHI showed that the protein has a molecular mass of 66 kDa, a pI of 5,23, and the optimum pH and temperature for its activity are 5,0 and 50 ºC, respectively. The effect of pH and temperature on secondary and tertiary structure and enzymatic activity of ThCBHI were analyzed by CD and Fluorescence spectroscopy and showed that they affect protein stability by two distinct mechanisms. Variations of pH modify protonation of the residues, affecting directly its activity, leading to structural destabilization only at extreme pH values, such as pH 9, 0. On the other hand, temperature has direct influence on mobility, fold and compactness of the folding enzyme, at temperatures above 60 ºC, there is loss of secondary and tertiary structure. When the assays were conducted in the presence of the cellobiose, a competitive inhibitor, thermal stability of ThCBHI was significantly increased to 61,5 to 65,9 ºC. Structural studies and molecular dynamics simulations showed that the flexibility of Tyr260, in comparison to the Tyr247 from the homologous T. reesei CBHI, is enhanced due to the short side chains of adjacent Val216 and Ala384 residues and creates an additional gap at the side face of the catalytic tunnel. In addition, CBHI of T. harzianum has a shortened loop at the entrance of the cellulose-binding tunnel, which has been described to interact with the substrate in T. reesei CBHI. These structural features might explain why T. harzianum enzyme displays higher kcat value and lower product inhibition on both glucosides and lactosides substrates in comparison to T. reesei CBHI.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5135.pdf: 1934880 bytes, checksum: 392e2dc3d6c55b9eb87de4bb33adec6d (MD5) Previous issue date: 2013-02-05 / Universidade Federal de Sao Carlos / The sugarcane bagasse is a lignocellulosic material that can be converted into ethanol by action of cellulases and xylanases. These enzymes act synergistically to convert cellulose and hemicellulose into glucose. In order to obtain an enzyme that can perform dual function, a chimeric enzyme cellulase-xylanase denominated ThEg3Xyn3, was constructed by gene fusion in our laboratory. The fusion was performed by binding the C-terminus of an endoglucanase from Trichoderma harzianum to the N-terminus of a xylanase of the same fungus, separated by a linker. The chimeric enzyme was recombinantly produced in Pichia pastoris and purified for kinetic and biochemical characterization. The chimera demonstrated activity of both enzymes with maximum activity at 38 °C and pH 6.0, under these conditions, cellulolytic and xylanolytic activity was greater than of the parental enzymes. The results demonstrate that the chimeric enzyme can be efficient in hydrolysis of the biomass and satisfactory for the production of ethanol by the process of simultaneous saccharification and fermentation. / O bagaço da cana-de-açúcar é um material lignocelulósico que pode ser convertido em etanol pela ação de celulases e xilanases. Essas enzimas atuam sinergicamente para converter celulose e hemicelulose em glicose. A fim de obter uma enzima capaz de realizar dupla função, uma enzima quimérica celulase-xilanase denominada ThEg3Xyn3, foi construída em laboratório. A fusão foi realizada pela ligação do C-terminal de uma endoglucanase do fungo Trichoderma harzianum ao N-terminal de uma xilanase do mesmo fungo, separadas por um linker. A enzima quimérica foi recombinantemente produzida em Pichia pastoris e purificada para caracterização cinética e bioquímica. A quimera demonstrou atividade de ambas as enzimas com atividade máxima a 38 °C e pH 6,0, sob estas condições, a atividade celulolítica e xilanolítica foi maior do que das enzimas parentais. Os resultados demonstram que a enzima quimérica pode ser eficiente na hidrólise da biomassa e satisfatória para a produção de etanol pelo processo de sacarificação e fermentação simultâneas.

Devido à sua importante atividade celulolítica, o fungo Trichoderma harzianum possui um grande potencial de aplicação na hidrólise da biomassa. No entanto, as celulases deste fungo filamentoso ainda não foram caracterizadas em profundidade. A celobiohidrolase I (CBHI) é a principal enzima celulolítica produzida por Trichoderma sp. e atualmente é uma das celulases mais investigadas para aplicações de biocombustíveis. A CBHI hidrolisa celulose cristalina à unidades solúveis de celobiose, o que a torna uma enzima chave para a produção de açúcares fermentáveis a partir da biomassa. O objetivo deste trabalho foi purificar e caracterizar a CBHI de Trichoderma harzianum (ThCBHI) bioquímica, biofísica e estruturalmente. Primeiramente foi estabelecido um protocolo de purificação eficiente da proteína a partir da expressão homóloga no fungo. A caracterização bioquímica ThCBHI mostrou que a proteína possui uma massa molecular de 66 kDa, pI de 5,23 e o pH e a temperatura de atividade ótima foram 5,0 e 50 ºC, respectivamente. A influência do pH e temperatura sobre as estruturas secundárias e terciárias e atividade enzimática da ThCBHI foram analisados por espectroscopia de CD, fluorescência e SAXS, e os resultados mostraram que as perturbações de pH e de temperatura afetam a estabilidade por dois mecanismos diferentes. As variações de pH podem modificar a protonação dos resíduos, afetando diretamente sua atividade, levando a desestabilização estrutural apenas em limites extremos de pH, como pH 9,0. A temperatura, por outro lado, tem uma influência direta sobre enovelamento e compactação da enzima, fazendo com que na temperatura em torno de 60 ºC ocorra perda da estrutura secundária, e terciária. Quando as análises foram realizadas na presença do produto de reação e também inibidor competitivo, celobiose, a estabilidade térmica da ThCBHI aumentou significativamente de 61,5 para 65,9 ºC. Os estudos estruturais e simulações de dinâmica molecular mostraram que a flexibilidade do resíduo Tyr260, em comparação com a Tyr247 do homólogo de T. reesei CBHI (TrCBHI), é aumentada devido às cadeias laterais curtas adjacentes de Val216 e Ala384 criando uma abertura adicional na face lateral do túnel catalítico. A ThCBHI também apresenta um loop encurtado na entrada do túnel de interação com a celulose, o que tem sido descrito como o responsável por interagir com o substrato de TrCBHI. Estas características estruturais podem explicar por que a ThCBHI apresenta maior valor de kcat e menor inibição pelo produto em comparação com TrCBHI. / Trichoderma harzianum is a fungus that has a considerable potential in biomass hydrolysis application due to its elevated cellulolytic activity. Cellulases from Trichoderma reesei have been widely used as model in studies of cellulose breakdown. However, cellulases from Trichoderma harzianum are less-studied enzymes which have not been characterized biophysically and biochemically as yet. CBHI, a cellobiohydrolase I, is the major cellulolytic enzyme produced by Trichoderma sp. and is currently one of the most investigated cellulases for biofuel applications. CBHI hydrolyzes crystalline cellulose to soluble cellobiose units, which turns it into a key enzyme for producing fermentable sugars from biomass. The aim of this work was to purify and characterize the CBHI of Trichoderma harzianum (ThCBHI). We established an efficient purification protocol of ThCBHI, from the homologous expression. The biochemical characterization of ThCBHI showed that the protein has a molecular mass of 66 kDa, a pI of 5,23, and the optimum pH and temperature for its activity are 5,0 and 50 ºC, respectively. The effect of pH and temperature on secondary and tertiary structure and enzymatic activity of ThCBHI were analyzed by CD and Fluorescence spectroscopy and showed that they affect protein stability by two distinct mechanisms. Variations of pH modify protonation of the residues, affecting directly its activity, leading to structural destabilization only at extreme pH values, such as pH 9, 0. On the other hand, temperature has direct influence on mobility, fold and compactness of the folding enzyme, at temperatures above 60 ºC, there is loss of secondary and tertiary structure. When the assays were conducted in the presence of the cellobiose, a competitive inhibitor, thermal stability of ThCBHI was significantly increased to 61,5 to 65,9 ºC. Structural studies and molecular dynamics simulations showed that the flexibility of Tyr260, in comparison to the Tyr247 from the homologous T. reesei CBHI, is enhanced due to the short side chains of adjacent Val216 and Ala384 residues and creates an additional gap at the side face of the catalytic tunnel. In addition, CBHI of T. harzianum has a shortened loop at the entrance of the cellulose-binding tunnel, which has been described to interact with the substrate in T. reesei CBHI. These structural features might explain why T. harzianum enzyme displays higher kcat value and lower product inhibition on both glucosides and lactosides substrates in comparison to T. reesei CBHI.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao de mestrado completa Amanda A Souza.pdf: 994299 bytes, checksum: 8cf098dd70299abaf08a216436f38888 (MD5) Previous issue date: 2011-06-29 / Trichoderma harzianum is a saprophytic fungus, known for its potential as a biological control agent of different phytopathogens that causes losses in crops. Its action is based on different mechanisms like volatile and non-volatile antibiotics production, competition for nutrient and space, production of hydrolytic enzymes and mycoparasitism. This fungus also plays an important role in the release of carbon, nitrogen and phosphorus from insoluble macromolecules to the medium, favoring the growth of plants. Phosphorus is a limiting nutrient for plant growth, however, over 80% of the phosphorus applied to the soil, it becomes unavailable, due to its adsorption, precipitation or conversion to organic form. One way to obtain phosphate compounds in soil is through the action of enzymes called phosphatases, which catalyze the hydrolysis of phosphate esters producing soluble phosphorus. High levels of acid phosphatase (ACP) were produced by Trichoderma harzianum ALL42. This study evaluated the ability of T. harzianumALL42produce acid phosphatases(ACPs) in minimal medium modified by varying the concentration of glucose and phosphate (KH2PO4). The results showed that the concentration of glucose and phosphate in the culture medium regulated the production of ACPs T. harzianum ALL42. Thisfungusproducedanacid phosphatase(ACPII) inculture mediumcontainingglucose0.5% and0.04% phosphate. Theenzymewaspartiallypurifiedby hydrophobic interaction chromatography on Phenyl Sepharose. A typical procedure provided 2,0 fold purification with 32.65 % yield. It was optimally active in the pH range 5,2 and at 50°C. The enzyme was heat-stable, retaining approximately 60% of its activity after heating for 60 min at 60°C. Kinetic parameters calculated for the hydrolysis of p-nitrophenyl phosphate by acid phosphatase were Km= 0,054 M and Vmax= 2,058 units.min-1. The enzyme was strongly inhibited by KH2PO4, FeCl3 and sodium tungstate. The enzyme is inhibited by KH2PO4 and sodium tungstate through mixed inhibition. The acid phosphatase hydrolyzed a number of phosphate esters ATP, ADP, AMP, D-glucose-1-phosphate, D-fructose-6-phosphate, includingphytic acid, showinganactivityofphytase. / Trichoderma harzianum é um fungo saprofítico, conhecido pelo seu grande potencial como agente de controle biológico de diferentes fitopatógenos. Sua ação é baseada em diferentes mecanismos como a produção de antibióticos voláteis e não-voláteis, competição por espaço e nutrientes, produção de enzimas hidrolíticas e o micoparasitismo. Esse fungo também desempenha um importante papel na liberação de carbono, nitrogênio e fósforo, a partir de macromoléculas insolúveis, para o meio, favorecendo o crescimento de plantas. O fósforo é um nutriente limitante para o crescimento da planta, entretanto, mais de 80% do fósforo aplicado diretamente no solo, torna-se indisponível, devido a sua adsorção, precipitação ou conversão para forma orgânica. Uma forma de se obter compostos fosfatados no solo é através da ação de enzimas denominadas fosfatases, que catalisam a hidrólise de ésteres fosfatados produzindo fósforo solúvel. Altos níveis de fosfatase ácida foram produzidos por Trichoderma harzianum ALL42. Neste trabalho avaliou-se a capacidade de T. harzianum ALL42 produzir fosfatases ácidas (ACPs) em meio mínimo modificado, variando a concentração de glicose e fosfato (KH2PO4). Os resultados obtidos demonstraram que, a concentração de glicose e fosfato no meio de cultura regulou a produção de ACPs por T. harzianum ALL42. Esse fungoproduziu uma fosfatase ácida (ACPII) em meio de cultura contendo glicose 0,5% e fosfato 0,04%. A enzima foi parcialmente purificada através da cromatografia de interação hidrofóbica Phenyl-Sepharose. O processo de purificação obteve um fator de purificação de 2,0 e rendimento de 32,65%. A atividade ótima encontrada foi na faixa de pH 5,2 e a 50 ºC. A enzima foi termoestável, mantendo aproximadamente 60% de sua atividade após incubação por 60 min a 60 ºC. Os parâmetros cinéticos calculados pela hidrólise de ƿ-nitrofenilfosfato pela fosfatase ácida foram de Km = 0,054 µmol e Vmáx = 2,028U.min-1. A enzima foi fortemente inibida por KH2PO4,FeCl3 e tungstato de sódio. A enzima foi inibida por KH2PO4 e tungstato de sódio por inibição mista. A fosfatase ácida hidrolisou todos os ésteres fosfatados testados (ATP, ADP, AMP, D-glicose-1-fosfato, D-frutose-6-fosfato, fenil fosfato de sódio), inclusive ácido fítico, demonstrando uma atividade de fitase.

Ce projet industriel porte sur la production de biopesticides actifs sur les nématodes à galles des cultures intensives de tomates sous abris au Maroc. Les travaux portent sur (i) l’isolement de souches de champignons filamenteux nématophages provenant des sols des cultures infectées par les nématodes, (ii) la réalisation de cultures de ces souches sur un milieu adapté à la Fermentation en Milieu Solide, technique optimale à la biologie des champignons filamenteux et présentant des avantages technologiques et économiques exploitables à une échelle industrielle, (iii) la production de biomasse et de molécules actives extrapolable à une échelle semi-industrielle, (iv) la mise en œuvre d’essais agronomiques pour valider l’efficacité d’un biopesticide produit par FMS dans des dispositifs innovants.24 souches de champignons filamenteux nématophages ont été isolées à partir des sols des cultures intensives de tomate sous serre au Maroc, mais également à partir de produits commerciaux. Le milieu FMS composé de sous-produits agro-industriels permettant une production de l’ordre de 1010 spores par gramme de substrat PS a été validé, et les conditions de cultures des souches établies. 4 dispositifs de Fermentation en Milieu Solide dont un à usage unique, de 300 à 5 000 g ont été mis au point, et ont été protégés par 3 brevets. Enfin, des essais agronomiques de différentes tailles (quelques billons à plusieurs hectares de tomates) ont été mis en place au Maroc de manière à valider l’utilisation de champignons filamenteux actifs contre les nématodes à galles comme étant une alternative écologique à l’utilisation de produits chimiques. / This industrial project involves the production of biopesticides active against root knot nematodes of intensive greenhouse tomato cultures in Morocco. This work focuses on (i) the isolement of nematophagous filamentous fungi from agricultural soils infected with nematodes, (ii) the cultures of these strains on a suitable medium for Solid State Fermentation (SSF), which is the optimal cultural technique for filamentous fungi, presenting technological and economical benefits at an industrial scale, (iii) the production of biomass and active molecules at a semi-industrial scale, (iv) the installation of agronomic assays to validate the effectiveness of a biopesticide production by SSF in innovative devices.24 nematophagous filamentous fungi strains were isolated from intensive greenhouse tomato culture soils, but also from commercial products. The SSF medium composed of agro-industrial by-products allowing a production of about 1010 spores per gram of DW substrate was validated, and the culture conditions of these strains were established. 4 SSF devices including one at single use, from 300 to 5 000 g DW substrate were developed, and were protected by 3 patents. Finally, agronomic assays of different sizes (from few lines to several hectares of tomatoes) were carried out in Morocco in order to validate the use of active filamentous fungi against root-knot nematodes as an ecological alternative to the use of chemical products.

Made available in DSpace on 2017-06-01T18:20:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_adriana_lima.pdf: 7041201 bytes, checksum: 00f3f7db548b1395dca70e5eccf2aa13 (MD5) Previous issue date: 2008-02-28 / Considering the biotechnological potential of Trichoderma harzianum in the xenobiotic metabolization and its resistance to heavy metals, the aim of this work was to evaluate the utrastructural and biochemical behavior related to cadmium tolerance and removal. The microorganism was grown in different media, containing 1mM, 2mM and 3mM of cadmium. Aspects of the growth profile was obtained by biomass production, glucose consumption, acid and alkaline phosphatase activities, morphology by optical microscopy, ultrastructure by scanning electron microscopy, total protein profile, polyphosphate acumulation and metal removal were evaluated. The results obtained revealed the inhibitory effects of the heavy metal on the microbial growth and the aspects of the tolerance to cadmium. The glucose consumption and the enzymes activities were also affected by cadmium and its different concentrations. The morphological analysis revealed variations related to hyphae thickness, branching pattern, texture and homogenity, electrondensity, and presence of granular structures. The ultrastructural aspects revealed alterations related to cell electrondensity, mycelia density, branching pattern and reduced chlamidospores number. The grown in presence of the metal induced a reduction in the total protein content related to cadmium concentration. The isolate was able to accumulate polyphosphate, and its grown in cadmium induced the polymer degradation. The cadmium removal was observed and revealed variations related to metal concentrations. The results for the first time revealed the effects of cadmium on T. harzianum polyphosphate accumulation and its potential application in the metal remediation / Considerando o potencial biotecnológico do fungo Trichoderma harzianum no processo de metabolização de compostos xenobióticos e sua resistência a metais pesados, o presente trabalho teve como finalidade estabelecer conhecimentos bioquímicos e ultraestruturais associados ao processo de remoção de cádmio. O microrganismo foi cultivado em meio contendo diferentes concentrações de cádmio: 1mM, 2mM e 3mM. O perfil de crescimento foi estabelecido em função da biomassa produzida, do consumo de glicose e fosfato, conteúdo intracelular de polifosfato, atividade das enzimas fosfatases ácida e alcalina, perfil de proteínas totais e remoção do metal. Os resultados obtidos sugerem efeitos do metal sobre o crescimento do organismo em diferentes meios de cultura. O crescimento em meio padrão revela a tolerância do organismo frente a altas concentrações de cádmio, e que tal cultivo induz variações no consumo de glicose e atividade das fosfatases. A utilização da microscopia óptica revelou variação na morfologia do organismo como resposta a variação do meio de cultivo e da presença e ausência do metal. Modificações relativas a processo de ramificação, textura e espessura das hifas foram visualizadas. Os aspectos ultraestruturais através de varredura demonstraram que T. harzianum cultivado na presença de cádmio apresentou variações associadas a eletrondensidade, densidade micelial, maior ramificação e menor número de clamidósporos. A análise do perfil de proteínas totais revelou que o cultivo em cádmio induziu a diminuição do conteúdo de proteínas dependendo da concentração. O isolado foi capaz de acumular polifosfato, e a presença do metal induziu a degradação do polímero em função da concentração. A remoção de cádmio do meio foi avaliada, revelando variação em função da concentração. Os resultados demonstram o efeito do cádmio sobre T. harzianum, pela primeira vez, e demonstram o potencial do microrganismo em acumular polifosfato e sua possível aplicação na remediação de metais pesados

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