O protozoário flagelado, Trichomonas vaginalis, causa a tricomonose, a doença sexualmente transmissível (DST) não viral mais comum no mundo. Metronidazol e tinidazol são os dois fármacos de escolha recomendados pelo Food and Drug Administration (FDA, USA) para o tratamento da tricomonose humana. Entretanto, isolados de T. vaginalis clínicos ou laboratoriais resistentes e reações adversas comuns têm sido reportados. Sabe-se que fungos produzem moléculas bioativas podendo ser uma fonte em potencial de novas moléculas antiparasitárias, sendo assim, a busca por compostos naturais bioativos em basidiomicetos pode ser uma abordagem interessante para descoberta de fármacos alternativos. O objetivo desse estudo foi investigar a presença, purificar e identificar substâncias com atividade anti-Trichomonas no meio de cultivo de micélios de basidiomicetos. Para a obtenção dos compostos bioativos, os basidiomicetos Amauroderma camerarium, família Ganodermataceae, e Gymnopilus pampeanus, família Cortinariceae, foram cultivados em meio caldo extrato de malte (CEM) com variação da fonte de nitrogênio e tempo de cultivo. O extrato bruto com maior atividade anti-T. vaginalis para A. camerarium (CEM + KNO3 28 dias de cultivo) foi escolhido para ensaios de purificação e caracterização, que indicaram que o composto bioativo é de natureza protéica. Uma proteína sem alta identidade com outra proteína foi purificada e foi denominada amaurocina. Amaurocina apresenta atividade contra isolados clínicos de T. vaginalis – TV LACH1 e TV LACM2 – (CIM= 62,4 μg/mL), sendo um isolado resistente ao metronidazol (TV LACM2), e contra o isolado ATCC 30236 (CIM= 31,2 μg/mL). A Amaurocina também apresenta atividade próinflamatória por induzir aumento da liberação de óxido nítrico de neutrófilos, o qual é um importamente mecanismo de defesa do hospedeiro durante a infecção parasitária. Para G. pampeanus, os extratos mais ativos foram produzidos em meio CEM + KNO3 por 28 dias de cultivo e CEM + KNO3 por 21 dias de cultivo, porém a purificação desses extratos é necessária. Esses resultados estão em concordância com o alto potencial de produção de biocompostos dos basidiomicetos, o qual tem sido reportado na literatura por décadas. / The flagellated protozoan, Trichomonas vaginalis, causes trichomonosis, the most common non-viral sexual transmitted disease (STD) in the world. Metronidazole and tinidazole are two drugs of choice recommended by Food and Drug Administration (FDA, USA) for treatment of human trichomonosis. However, clinical or laboratory-generated drug-resistant isolates of T. vaginalis and common adverse reactions have been reported. It is known that fungi produce bioactive molecules and they can be a potential source of new antiparasitic molecules. Thus, in order to improve the current chemotherapy of T. vaginalis infection, the search for natural bioactive compounds in basidiomycetes can be an interesting approach to discover alternative drugs. The aim of this study was to investigate the presence, to purify and to identify substances in cultivation of basidiomycetes’ mycelia, which have anti-Trichomonas activity. Mycelia of basidiomycete Amauroderma camerarium, family Ganodermataceae, and Gymnopilus pampeanus, family Cortinariceae, were transferred to flasks containing malt extract broth (MEB) medium with variation of the nitrogen source and time of growth. The preparation with higher anti-T. vaginalis activity (MEB + KNO3 28 days of growth) for A. camerarium basidiomycete was chosen for purification and characterization assays, that indicated that the bioactive compound is a protein-like molecule. A protein without high homology with any other protein was found and was named amaurocine. Amaurocine presents activity against clinical isolates of T. vaginalis – TV LACH1 and TV LACM2 – (MIC=62.4 μg/mL), one of these a metronidazole-resistant isolate, and it presents activity against the T. vaginalis ATCC 30236 isolate (MIC=31.2 μg/mL). Amaurocine also presents proinflamatory activity. Since it was able to enhance nitric oxide release from neutrophils, which is an important host defense mechanism during the parasitic infection. For G. pampeanus, the most active extracts were produced in MEB + KNO3 28 days of growth and MEB + KNO3 21 days of growth, but further steps of purification are necessary. These results are in agreement with the high potential of biocompounds production of basidiomycetes that has been reported in the literature for decades.

Trichomonas vaginalis é o protozoário flagelado que parasita o sistema urogenital humano causando a tricomoníase, a doença sexualmente transmissível não viral mais comum no mundo, sendo registrados aproximadamente 276 milhões de novos casos a cada ano. O sucesso da colonização das células hospedeiras e desenvolvimento da infecção envolve um complexo processo que culmina em citoaderência e citotoxicidade. Nucleotídeos e nucleosídeos são liberados para o espaço extracelular por células em situações de estresse ou lesão tecidual e desencadeiam seus efeitos sinalizadores através da ativação de purinoceptores. Ainda, a hidrólise sequencial de nucleotídeos pelas ectonucleotidases, nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase (NTPDase) e ecto-5’-nucleotidase leva à formação de nucleosídeos que são essenciais para o metabolismo de purinas do parasito. Efeitos antagônicos são desencadeados por nucleotídeos e nucleosídeos, respectivamente próinflamatórios e anti-inflamatórios, na mediação de respostas imunes. A atividade dessas enzimas sobre os nucleotídeos da guanina e o efeito de restrição metabólica sobre a hidrólise de nucleotídeos foi avaliada. Além disso, a participação da sinalização mediada pelos nucleotídeos e nucleosídeos também foi avaliada em um modelo de citotoxicidade. Os resultados demonstram que os nucleotídeos GTP, GDP e GMP são substratos para as ectonucleotidases de T. vaginalis com parâmetros cinéticos compatíveis para enzimas dessa família. A condição de restrição de soro aumentou a atividade da NTPDase e da ecto-5’-nucleotidase e o aumento da expressão gênica das TvNTPDase 2 e 4 pode justificar o aumento da atividade. A recaptação de guanosina extracelular foi menor do que a recaptação de adenosina, demonstrada pela razão isotópica C12/C13 no nucleosídeo detectada no DNA dos parasitos. A fim de investigar um possível papel biológico para o acúmulo de guanosina extracelular, bem como avaliar o envolvimento da sinalização purinérgica na citotoxicidade mediada pelo parasito, diferentes isolados de T. vaginalis foram testados frente à capacidade de promover citólise. Todos os isolados foram capazes de promover efeito citolítico em alguma proporção, com destaque para o isolado TV-LACM6, que apresenta um perfil de hidrólise ATP, GTP > AMP > GMP. Quando nucleotídeos e nucleosídeos foram testados, o efeito citotóxico produzido pelo isolado foi potencializado na presença de ATP e GTP. Por outro lado, o efeito foi revertido na presença de eritro-9-(2-hidroxi-3-nonil) adenina (EHNA), um inibidor da adenosina deaminase. Importante, guanosina não foi capaz de reverter o efeito citotóxico produzido pelos trofozoítos, resultado que corrobora com o perfil de hidrólise de nucleotídeos e acúmulo de guanosina exracelular, sendo uma vantagem para o parasito. A possível participação dos receptores de adenosina foi avaliada, entretando os receptores ADORA1 e ADORA2A não parecem estar envolvidos no efeito protetor mediado pela adenosina. Considerando o potencial farmacológico desempenhado por essas enzimas no metabolismo de purinas em protozoários bem como no controle de respostas imunes, a modulação da hidrólise de nucleotídeos pode ser um alvo terapêutico importante e representar um mecanismo sinérgico na atividade antiparasiária de compostos ativos. Nesse sentido, o estudo demonstrou a atividade anti-T. vaginalis de três compostos, e em especial o isoaustrobrasilol B, com IC50 de 38 μM. O composto não apresentou efeitos hemolíticos frente a eritrócitos humanos e apesar de ter demonstrado efeito citotóxico in vitro frente à linhagem de células epiteliais vaginais humanas (HMVII), nenhuma citotoxicidade foi demonstrada no modelo in vivo. Isoaustrobrasilol B foi o único composto que inibiu significativamente as atividades da NTPDase e ecto-5’-nucleotidase e o efeito imune atribuído ao acúmulo extracelular de nucleotídeos foi avaliado. A produção de espécies reativas de oxigênio e interelucina-6 (IL-6) por neutrófilos estimulados por T.vaginalis não foi afetada pelo tratamento com o composto. Por outro lado, a liberação de interleucina-8 (IL-8), a principal interleucina produzida por neutrófilos na tricomoníase, foi aumentada. O efeito sinérgico de redução de viabilidade de trofozoítos e modulação da NTPDase e ecto-5’-nucleotidase pode aumentar a suscetibilidade do T. vaginalis frente à resposta imune do hospedeiro e consequentemente, sua eliminação do sítio de infecção. / Trichomonas vaginalis is a flagellate protozoan that parasitizes the human urogenital tract causing trichomoniasis, the most common non-viral sexually transmitted disease, infecting approximately 276 million people worldwide annually. To achieve success in parasitism trichomonads develop a complex process against the host cells that culminate in cytoadherence and cytotoxicity. Nucleotides and nucleosides are released into the extracellular space by cells under stress or injury and they exert their signaling effects through activation of the purinoceptors. Moreover, the ectonucleotidases, nucleoside triphosphate diphosphohydrolase (NTPDase) and ecto-5'-nucleotidase, are capable of hydrolyzing the nucleotides producing nucleosides that are essential to the parasite purine metabolism. The enzymatic cascade mediated by ectonucleotidases is relevant in controlling nucleotides and nucleosides levels as these molecules play antagonistic roles in inflammation, as proinflamatory and anti-inflammatory mediators, respectively. This study investigated the hydrolysis profile of guanine nucleotides in T. vaginalis as the effect of serum limitation condition in the enzymatic cascade. Furthermore, we investigated the influence of extracellular nucleotides and nucleosides on the modulation of the host cell cytotoxicity mediated by T. vaginalis. Results show that guanine nucleotides GTP, GDP, GMP are substrates for T. vaginalis ectonucleotidases, with expected kinetic parameters for this enzyme family. The metabolic restriction condition enhanced NTPDase and ecto-5’-nucleotidase activities and the highest gene expressions found for TvNTPDase 2 and 4 which may explain the enzymatic activity enhance. The extracellular guanosine uptake was lower than that observed for adenosine into parasite DNA measured by isotopic ratio C12/C13 of the nucleosides. In order to investigate the possible biological role for extracellular guanosine accumulation as well as to evaluate the involvment of purinergic signaling in the citotoxicity promoted by the parasite, a collection of T. vaginalis isolates were tested against a human epithelial vaginal cell line (HMVII). Fresh clinical T. vaginalis isolates produced cytolytic effect against human vaginal epithelial cells in a heterogeneous profile. The most cytotoxic isolate, TV-LACM6, presents the hydrolysis profile ATP, GTP > AMP > GMP. When the nucleotides and nucleosides were tested, the cytotoxic effect elicited by TV-LACM6 was increased in presence of nucleotides ATP and GTP. In contrast, the cytotoxicity was reversed by adenosine in presence of erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl) adenine (EHNA), but not by guanosine, which is in agreement with the accumulation of extracellular guanosine and the hydrolysis profile, acting as an advantage for the parasite. ADORA1 and ADORA2A are not involved in the protective mechanism of adenosine. Considering the pharmacological potential that ectonucleotidases play in the context of purine metabolism and in the imune response modulation, nucleotide hydrolysis may represent a therapeutic target as an additional mechanism in association with anti T.vaginalis compounds. The study demonstrated promissing activities for three derivatvies with isoaustrobrasilol B the most activity compound with IC50 38 μM. The compound did not demonstrate any hemolytic activity and although induced cytotoxicity against human epithelial vaginal cells (HMVII), absence of toxicity was obtained when in vivo model was studied. Isoaustrobrasilol B was the only compound that significantly inhibited NTPDase and ecto-5’-nucleotidase activities and the immune modulation attributed to extracellular nucleotide accumulation was evaluated. Reactive oxygen species production and interleukin-6 (IL-6) release by T.vaginalis stimulated neutrophils were not affected by phloroglucinol treatment. On the other hand, interleukin-8 (IL-8), the primarily cytokine produced by neutrophils during trichomoniasis, was significantly enhanced. The associative mechanism of trophozoites death and NTPDase and ecto-5’-nucleotidase modulation may increase the susceptibility of T. vaginalis to host immune responses and, consequently, the elimination from the infection site.

Trichomonas vaginalis é o protozoário flagelado que parasita o trato urogenital humano causando a tricomonose, doença sexualmente transmissível (DST) de origem não viral mais comum no mundo. Durante a infecção a aquisição de nutrientes, como nucleotídeos púricos, pirimidínicos e ferro é essencial à sobrevivência do parasito. T. vaginalis não sintetiza de novo purinas e pirimidinas, dependendo de vias de salvação para aquisição destas moléculas. O ferro desempenha um papel crucial na patogenicidade da tricomonose, influenciando a expressão de múltiplos genes envolvidos na virulência. Nucleotídeos extracelulares, especialmente o ATP, são liberados em situações de estresse, anoxia ou injúria, atuando como sinalizadores pró-inflamatórios ao sistema imune. As enzimas NTPDase e ecto-5'-nucleotidase degradam ATP à adenosina, esta com ação anti-inflamatória. A enzima adenosina deaminase (ADA) degrada adenosina à inosina. A presença desta cadeia enzimática em T. vaginalis sugere a modulação das concentrações nucleotídeos/nucleosídeos durante a inflamação. A atividade da ADA foi caracterizada em T. vaginalis, porém há poucos relatos sobre a participação desta enzima na sobrevivência do parasito, bem como, a localização celular e o efeito de nutrientes essenciais na atividade enzimática e na expressão gênica. O estudo da localização da ADA em T. vaginalis foi realizado, indicando a presença da enzima na membrana celular e no citoplasma do trofozoíto. Avaliando-se o perfil da ADA de diferentes isolados de T. vaginalis em uma condição de limitação de soro bovino, o qual representa a fonte de adenosina aos trofozoítos, não se observou diferenças significativas na deaminação da adenosina à inosina. Na avaliação do efeito de diferentes fontes de ferro ou a privação deste cátion na atividade e na expressão gênica da ADA foi possível verificar uma diminuição da atividade e um aumento na expressão gênica após a privação do ferro, reforçando a hipótese que este elemento pode modular a atividade das enzimas envolvidas na sinalização purinérgica. Os resultados obtidos nesta dissertação permitem a avaliação de importantes aspectos da ADA, contribuindo para o melhor entendimento do sistema purinérgico em T. vaginalis e seu papel no estabelecimento e manutenção da infecção e consequente sobrevivência do parasito. / Trichomonas vaginalis is a flagellate protozoan that parasitizes the urogenital human tract causing trichomonosis, the non-viral sexually transmitted disease (STD) most common in the world. During infection the acquisition of nutrients such as purine and pyrimidine nucleotides, and iron is essential to the parasite survival. T. vaginalis lacks de novo purines and pyrimidines synthesis depending on the salvation pathway for the acquisition of these molecules. Iron plays a crucial role in trichomonosis pathogenesis, influencing the expression of multiple genes involved in virulence. Extracellular nucleotides, especially ATP, are released during stress, injury or anoxia, acting as a pro-inflammatory signaling to the immune system. The enzymes NTPDase and ecto-5'-nucleotidase degrade ATP to adenosine with anti-inflammatory action. The adenosine deaminase (ADA) enzyme degrades adenosine to inosine. The presence of this enzymatic chain in T. vaginalis suggests the modulation of nucleotides/nucleosides concentrations during inflammation. The ADA activity was characterized in T. vaginalis, but there are few reports on the participation of this enzyme in the parasite survival, as well as the cellular localization and the effect of essential nutrients on enzyme activity and gene expression. The study of ADA localization in T. vaginalis was performed, indicating the presence of the enzyme on trophozoite cell membrane and cytoplasm. Evaluating the ADA profile in different T. vaginalis isolates in bovine serum limitation condition, which is the source of adenosine for the trophozoites, no significant differences were observed in the deamination of adenosine to inosine. Regarding the effect of different iron sources or iron deprivation in activity and gene expression of ADA, it was observed a decrease in activity and an increase in gene expression after iron deprivation, reinforcing the hypothesis that this element can modulate the activity of enzymes involved in the purinergic signaling. The results obtained in this study allow the assessment of important aspects of ADA, contributing to a better understanding of the purinergic system in T. vaginalis and its role in the establishment and maintenance of infection and consequent survival of the parasite.

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Trichomonas vaginalis é o protozoário flagelado que parasita o sistema urogenital humano causando a tricomoníase, a doença sexualmente transmissível não viral mais comum no mundo, sendo registrados aproximadamente 276 milhões de novos casos a cada ano. O sucesso da colonização das células hospedeiras e desenvolvimento da infecção envolve um complexo processo que culmina em citoaderência e citotoxicidade. Nucleotídeos e nucleosídeos são liberados para o espaço extracelular por células em situações de estresse ou lesão tecidual e desencadeiam seus efeitos sinalizadores através da ativação de purinoceptores. Ainda, a hidrólise sequencial de nucleotídeos pelas ectonucleotidases, nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase (NTPDase) e ecto-5’-nucleotidase leva à formação de nucleosídeos que são essenciais para o metabolismo de purinas do parasito. Efeitos antagônicos são desencadeados por nucleotídeos e nucleosídeos, respectivamente próinflamatórios e anti-inflamatórios, na mediação de respostas imunes. A atividade dessas enzimas sobre os nucleotídeos da guanina e o efeito de restrição metabólica sobre a hidrólise de nucleotídeos foi avaliada. Além disso, a participação da sinalização mediada pelos nucleotídeos e nucleosídeos também foi avaliada em um modelo de citotoxicidade. Os resultados demonstram que os nucleotídeos GTP, GDP e GMP são substratos para as ectonucleotidases de T. vaginalis com parâmetros cinéticos compatíveis para enzimas dessa família. A condição de restrição de soro aumentou a atividade da NTPDase e da ecto-5’-nucleotidase e o aumento da expressão gênica das TvNTPDase 2 e 4 pode justificar o aumento da atividade. A recaptação de guanosina extracelular foi menor do que a recaptação de adenosina, demonstrada pela razão isotópica C12/C13 no nucleosídeo detectada no DNA dos parasitos. A fim de investigar um possível papel biológico para o acúmulo de guanosina extracelular, bem como avaliar o envolvimento da sinalização purinérgica na citotoxicidade mediada pelo parasito, diferentes isolados de T. vaginalis foram testados frente à capacidade de promover citólise. Todos os isolados foram capazes de promover efeito citolítico em alguma proporção, com destaque para o isolado TV-LACM6, que apresenta um perfil de hidrólise ATP, GTP > AMP > GMP. Quando nucleotídeos e nucleosídeos foram testados, o efeito citotóxico produzido pelo isolado foi potencializado na presença de ATP e GTP. Por outro lado, o efeito foi revertido na presença de eritro-9-(2-hidroxi-3-nonil) adenina (EHNA), um inibidor da adenosina deaminase. Importante, guanosina não foi capaz de reverter o efeito citotóxico produzido pelos trofozoítos, resultado que corrobora com o perfil de hidrólise de nucleotídeos e acúmulo de guanosina exracelular, sendo uma vantagem para o parasito. A possível participação dos receptores de adenosina foi avaliada, entretando os receptores ADORA1 e ADORA2A não parecem estar envolvidos no efeito protetor mediado pela adenosina. Considerando o potencial farmacológico desempenhado por essas enzimas no metabolismo de purinas em protozoários bem como no controle de respostas imunes, a modulação da hidrólise de nucleotídeos pode ser um alvo terapêutico importante e representar um mecanismo sinérgico na atividade antiparasiária de compostos ativos. Nesse sentido, o estudo demonstrou a atividade anti-T. vaginalis de três compostos, e em especial o isoaustrobrasilol B, com IC50 de 38 μM. O composto não apresentou efeitos hemolíticos frente a eritrócitos humanos e apesar de ter demonstrado efeito citotóxico in vitro frente à linhagem de células epiteliais vaginais humanas (HMVII), nenhuma citotoxicidade foi demonstrada no modelo in vivo. Isoaustrobrasilol B foi o único composto que inibiu significativamente as atividades da NTPDase e ecto-5’-nucleotidase e o efeito imune atribuído ao acúmulo extracelular de nucleotídeos foi avaliado. A produção de espécies reativas de oxigênio e interelucina-6 (IL-6) por neutrófilos estimulados por T.vaginalis não foi afetada pelo tratamento com o composto. Por outro lado, a liberação de interleucina-8 (IL-8), a principal interleucina produzida por neutrófilos na tricomoníase, foi aumentada. O efeito sinérgico de redução de viabilidade de trofozoítos e modulação da NTPDase e ecto-5’-nucleotidase pode aumentar a suscetibilidade do T. vaginalis frente à resposta imune do hospedeiro e consequentemente, sua eliminação do sítio de infecção. / Trichomonas vaginalis is a flagellate protozoan that parasitizes the human urogenital tract causing trichomoniasis, the most common non-viral sexually transmitted disease, infecting approximately 276 million people worldwide annually. To achieve success in parasitism trichomonads develop a complex process against the host cells that culminate in cytoadherence and cytotoxicity. Nucleotides and nucleosides are released into the extracellular space by cells under stress or injury and they exert their signaling effects through activation of the purinoceptors. Moreover, the ectonucleotidases, nucleoside triphosphate diphosphohydrolase (NTPDase) and ecto-5'-nucleotidase, are capable of hydrolyzing the nucleotides producing nucleosides that are essential to the parasite purine metabolism. The enzymatic cascade mediated by ectonucleotidases is relevant in controlling nucleotides and nucleosides levels as these molecules play antagonistic roles in inflammation, as proinflamatory and anti-inflammatory mediators, respectively. This study investigated the hydrolysis profile of guanine nucleotides in T. vaginalis as the effect of serum limitation condition in the enzymatic cascade. Furthermore, we investigated the influence of extracellular nucleotides and nucleosides on the modulation of the host cell cytotoxicity mediated by T. vaginalis. Results show that guanine nucleotides GTP, GDP, GMP are substrates for T. vaginalis ectonucleotidases, with expected kinetic parameters for this enzyme family. The metabolic restriction condition enhanced NTPDase and ecto-5’-nucleotidase activities and the highest gene expressions found for TvNTPDase 2 and 4 which may explain the enzymatic activity enhance. The extracellular guanosine uptake was lower than that observed for adenosine into parasite DNA measured by isotopic ratio C12/C13 of the nucleosides. In order to investigate the possible biological role for extracellular guanosine accumulation as well as to evaluate the involvment of purinergic signaling in the citotoxicity promoted by the parasite, a collection of T. vaginalis isolates were tested against a human epithelial vaginal cell line (HMVII). Fresh clinical T. vaginalis isolates produced cytolytic effect against human vaginal epithelial cells in a heterogeneous profile. The most cytotoxic isolate, TV-LACM6, presents the hydrolysis profile ATP, GTP > AMP > GMP. When the nucleotides and nucleosides were tested, the cytotoxic effect elicited by TV-LACM6 was increased in presence of nucleotides ATP and GTP. In contrast, the cytotoxicity was reversed by adenosine in presence of erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl) adenine (EHNA), but not by guanosine, which is in agreement with the accumulation of extracellular guanosine and the hydrolysis profile, acting as an advantage for the parasite. ADORA1 and ADORA2A are not involved in the protective mechanism of adenosine. Considering the pharmacological potential that ectonucleotidases play in the context of purine metabolism and in the imune response modulation, nucleotide hydrolysis may represent a therapeutic target as an additional mechanism in association with anti T.vaginalis compounds. The study demonstrated promissing activities for three derivatvies with isoaustrobrasilol B the most activity compound with IC50 38 μM. The compound did not demonstrate any hemolytic activity and although induced cytotoxicity against human epithelial vaginal cells (HMVII), absence of toxicity was obtained when in vivo model was studied. Isoaustrobrasilol B was the only compound that significantly inhibited NTPDase and ecto-5’-nucleotidase activities and the immune modulation attributed to extracellular nucleotide accumulation was evaluated. Reactive oxygen species production and interleukin-6 (IL-6) release by T.vaginalis stimulated neutrophils were not affected by phloroglucinol treatment. On the other hand, interleukin-8 (IL-8), the primarily cytokine produced by neutrophils during trichomoniasis, was significantly enhanced. The associative mechanism of trophozoites death and NTPDase and ecto-5’-nucleotidase modulation may increase the susceptibility of T. vaginalis to host immune responses and, consequently, the elimination from the infection site.

Trichomonas vaginalis é o protozoário flagelado que parasita o trato urogenital humano causando a tricomonose, doença sexualmente transmissível (DST) de origem não viral mais comum no mundo. Durante a infecção a aquisição de nutrientes, como nucleotídeos púricos, pirimidínicos e ferro é essencial à sobrevivência do parasito. T. vaginalis não sintetiza de novo purinas e pirimidinas, dependendo de vias de salvação para aquisição destas moléculas. O ferro desempenha um papel crucial na patogenicidade da tricomonose, influenciando a expressão de múltiplos genes envolvidos na virulência. Nucleotídeos extracelulares, especialmente o ATP, são liberados em situações de estresse, anoxia ou injúria, atuando como sinalizadores pró-inflamatórios ao sistema imune. As enzimas NTPDase e ecto-5'-nucleotidase degradam ATP à adenosina, esta com ação anti-inflamatória. A enzima adenosina deaminase (ADA) degrada adenosina à inosina. A presença desta cadeia enzimática em T. vaginalis sugere a modulação das concentrações nucleotídeos/nucleosídeos durante a inflamação. A atividade da ADA foi caracterizada em T. vaginalis, porém há poucos relatos sobre a participação desta enzima na sobrevivência do parasito, bem como, a localização celular e o efeito de nutrientes essenciais na atividade enzimática e na expressão gênica. O estudo da localização da ADA em T. vaginalis foi realizado, indicando a presença da enzima na membrana celular e no citoplasma do trofozoíto. Avaliando-se o perfil da ADA de diferentes isolados de T. vaginalis em uma condição de limitação de soro bovino, o qual representa a fonte de adenosina aos trofozoítos, não se observou diferenças significativas na deaminação da adenosina à inosina. Na avaliação do efeito de diferentes fontes de ferro ou a privação deste cátion na atividade e na expressão gênica da ADA foi possível verificar uma diminuição da atividade e um aumento na expressão gênica após a privação do ferro, reforçando a hipótese que este elemento pode modular a atividade das enzimas envolvidas na sinalização purinérgica. Os resultados obtidos nesta dissertação permitem a avaliação de importantes aspectos da ADA, contribuindo para o melhor entendimento do sistema purinérgico em T. vaginalis e seu papel no estabelecimento e manutenção da infecção e consequente sobrevivência do parasito. / Trichomonas vaginalis is a flagellate protozoan that parasitizes the urogenital human tract causing trichomonosis, the non-viral sexually transmitted disease (STD) most common in the world. During infection the acquisition of nutrients such as purine and pyrimidine nucleotides, and iron is essential to the parasite survival. T. vaginalis lacks de novo purines and pyrimidines synthesis depending on the salvation pathway for the acquisition of these molecules. Iron plays a crucial role in trichomonosis pathogenesis, influencing the expression of multiple genes involved in virulence. Extracellular nucleotides, especially ATP, are released during stress, injury or anoxia, acting as a pro-inflammatory signaling to the immune system. The enzymes NTPDase and ecto-5'-nucleotidase degrade ATP to adenosine with anti-inflammatory action. The adenosine deaminase (ADA) enzyme degrades adenosine to inosine. The presence of this enzymatic chain in T. vaginalis suggests the modulation of nucleotides/nucleosides concentrations during inflammation. The ADA activity was characterized in T. vaginalis, but there are few reports on the participation of this enzyme in the parasite survival, as well as the cellular localization and the effect of essential nutrients on enzyme activity and gene expression. The study of ADA localization in T. vaginalis was performed, indicating the presence of the enzyme on trophozoite cell membrane and cytoplasm. Evaluating the ADA profile in different T. vaginalis isolates in bovine serum limitation condition, which is the source of adenosine for the trophozoites, no significant differences were observed in the deamination of adenosine to inosine. Regarding the effect of different iron sources or iron deprivation in activity and gene expression of ADA, it was observed a decrease in activity and an increase in gene expression after iron deprivation, reinforcing the hypothesis that this element can modulate the activity of enzymes involved in the purinergic signaling. The results obtained in this study allow the assessment of important aspects of ADA, contributing to a better understanding of the purinergic system in T. vaginalis and its role in the establishment and maintenance of infection and consequent survival of the parasite.

O protozoário flagelado, Trichomonas vaginalis, causa a tricomonose, a doença sexualmente transmissível (DST) não viral mais comum no mundo. Metronidazol e tinidazol são os dois fármacos de escolha recomendados pelo Food and Drug Administration (FDA, USA) para o tratamento da tricomonose humana. Entretanto, isolados de T. vaginalis clínicos ou laboratoriais resistentes e reações adversas comuns têm sido reportados. Sabe-se que fungos produzem moléculas bioativas podendo ser uma fonte em potencial de novas moléculas antiparasitárias, sendo assim, a busca por compostos naturais bioativos em basidiomicetos pode ser uma abordagem interessante para descoberta de fármacos alternativos. O objetivo desse estudo foi investigar a presença, purificar e identificar substâncias com atividade anti-Trichomonas no meio de cultivo de micélios de basidiomicetos. Para a obtenção dos compostos bioativos, os basidiomicetos Amauroderma camerarium, família Ganodermataceae, e Gymnopilus pampeanus, família Cortinariceae, foram cultivados em meio caldo extrato de malte (CEM) com variação da fonte de nitrogênio e tempo de cultivo. O extrato bruto com maior atividade anti-T. vaginalis para A. camerarium (CEM + KNO3 28 dias de cultivo) foi escolhido para ensaios de purificação e caracterização, que indicaram que o composto bioativo é de natureza protéica. Uma proteína sem alta identidade com outra proteína foi purificada e foi denominada amaurocina. Amaurocina apresenta atividade contra isolados clínicos de T. vaginalis – TV LACH1 e TV LACM2 – (CIM= 62,4 μg/mL), sendo um isolado resistente ao metronidazol (TV LACM2), e contra o isolado ATCC 30236 (CIM= 31,2 μg/mL). A Amaurocina também apresenta atividade próinflamatória por induzir aumento da liberação de óxido nítrico de neutrófilos, o qual é um importamente mecanismo de defesa do hospedeiro durante a infecção parasitária. Para G. pampeanus, os extratos mais ativos foram produzidos em meio CEM + KNO3 por 28 dias de cultivo e CEM + KNO3 por 21 dias de cultivo, porém a purificação desses extratos é necessária. Esses resultados estão em concordância com o alto potencial de produção de biocompostos dos basidiomicetos, o qual tem sido reportado na literatura por décadas. / The flagellated protozoan, Trichomonas vaginalis, causes trichomonosis, the most common non-viral sexual transmitted disease (STD) in the world. Metronidazole and tinidazole are two drugs of choice recommended by Food and Drug Administration (FDA, USA) for treatment of human trichomonosis. However, clinical or laboratory-generated drug-resistant isolates of T. vaginalis and common adverse reactions have been reported. It is known that fungi produce bioactive molecules and they can be a potential source of new antiparasitic molecules. Thus, in order to improve the current chemotherapy of T. vaginalis infection, the search for natural bioactive compounds in basidiomycetes can be an interesting approach to discover alternative drugs. The aim of this study was to investigate the presence, to purify and to identify substances in cultivation of basidiomycetes’ mycelia, which have anti-Trichomonas activity. Mycelia of basidiomycete Amauroderma camerarium, family Ganodermataceae, and Gymnopilus pampeanus, family Cortinariceae, were transferred to flasks containing malt extract broth (MEB) medium with variation of the nitrogen source and time of growth. The preparation with higher anti-T. vaginalis activity (MEB + KNO3 28 days of growth) for A. camerarium basidiomycete was chosen for purification and characterization assays, that indicated that the bioactive compound is a protein-like molecule. A protein without high homology with any other protein was found and was named amaurocine. Amaurocine presents activity against clinical isolates of T. vaginalis – TV LACH1 and TV LACM2 – (MIC=62.4 μg/mL), one of these a metronidazole-resistant isolate, and it presents activity against the T. vaginalis ATCC 30236 isolate (MIC=31.2 μg/mL). Amaurocine also presents proinflamatory activity. Since it was able to enhance nitric oxide release from neutrophils, which is an important host defense mechanism during the parasitic infection. For G. pampeanus, the most active extracts were produced in MEB + KNO3 28 days of growth and MEB + KNO3 21 days of growth, but further steps of purification are necessary. These results are in agreement with the high potential of biocompounds production of basidiomycetes that has been reported in the literature for decades.

O protozoário flagelado, Trichomonas vaginalis, causa a tricomonose, a doença sexualmente transmissível (DST) não viral mais comum no mundo. Metronidazol e tinidazol são os dois fármacos de escolha recomendados pelo Food and Drug Administration (FDA, USA) para o tratamento da tricomonose humana. Entretanto, isolados de T. vaginalis clínicos ou laboratoriais resistentes e reações adversas comuns têm sido reportados. Sabe-se que fungos produzem moléculas bioativas podendo ser uma fonte em potencial de novas moléculas antiparasitárias, sendo assim, a busca por compostos naturais bioativos em basidiomicetos pode ser uma abordagem interessante para descoberta de fármacos alternativos. O objetivo desse estudo foi investigar a presença, purificar e identificar substâncias com atividade anti-Trichomonas no meio de cultivo de micélios de basidiomicetos. Para a obtenção dos compostos bioativos, os basidiomicetos Amauroderma camerarium, família Ganodermataceae, e Gymnopilus pampeanus, família Cortinariceae, foram cultivados em meio caldo extrato de malte (CEM) com variação da fonte de nitrogênio e tempo de cultivo. O extrato bruto com maior atividade anti-T. vaginalis para A. camerarium (CEM + KNO3 28 dias de cultivo) foi escolhido para ensaios de purificação e caracterização, que indicaram que o composto bioativo é de natureza protéica. Uma proteína sem alta identidade com outra proteína foi purificada e foi denominada amaurocina. Amaurocina apresenta atividade contra isolados clínicos de T. vaginalis – TV LACH1 e TV LACM2 – (CIM= 62,4 μg/mL), sendo um isolado resistente ao metronidazol (TV LACM2), e contra o isolado ATCC 30236 (CIM= 31,2 μg/mL). A Amaurocina também apresenta atividade próinflamatória por induzir aumento da liberação de óxido nítrico de neutrófilos, o qual é um importamente mecanismo de defesa do hospedeiro durante a infecção parasitária. Para G. pampeanus, os extratos mais ativos foram produzidos em meio CEM + KNO3 por 28 dias de cultivo e CEM + KNO3 por 21 dias de cultivo, porém a purificação desses extratos é necessária. Esses resultados estão em concordância com o alto potencial de produção de biocompostos dos basidiomicetos, o qual tem sido reportado na literatura por décadas. / The flagellated protozoan, Trichomonas vaginalis, causes trichomonosis, the most common non-viral sexual transmitted disease (STD) in the world. Metronidazole and tinidazole are two drugs of choice recommended by Food and Drug Administration (FDA, USA) for treatment of human trichomonosis. However, clinical or laboratory-generated drug-resistant isolates of T. vaginalis and common adverse reactions have been reported. It is known that fungi produce bioactive molecules and they can be a potential source of new antiparasitic molecules. Thus, in order to improve the current chemotherapy of T. vaginalis infection, the search for natural bioactive compounds in basidiomycetes can be an interesting approach to discover alternative drugs. The aim of this study was to investigate the presence, to purify and to identify substances in cultivation of basidiomycetes’ mycelia, which have anti-Trichomonas activity. Mycelia of basidiomycete Amauroderma camerarium, family Ganodermataceae, and Gymnopilus pampeanus, family Cortinariceae, were transferred to flasks containing malt extract broth (MEB) medium with variation of the nitrogen source and time of growth. The preparation with higher anti-T. vaginalis activity (MEB + KNO3 28 days of growth) for A. camerarium basidiomycete was chosen for purification and characterization assays, that indicated that the bioactive compound is a protein-like molecule. A protein without high homology with any other protein was found and was named amaurocine. Amaurocine presents activity against clinical isolates of T. vaginalis – TV LACH1 and TV LACM2 – (MIC=62.4 μg/mL), one of these a metronidazole-resistant isolate, and it presents activity against the T. vaginalis ATCC 30236 isolate (MIC=31.2 μg/mL). Amaurocine also presents proinflamatory activity. Since it was able to enhance nitric oxide release from neutrophils, which is an important host defense mechanism during the parasitic infection. For G. pampeanus, the most active extracts were produced in MEB + KNO3 28 days of growth and MEB + KNO3 21 days of growth, but further steps of purification are necessary. These results are in agreement with the high potential of biocompounds production of basidiomycetes that has been reported in the literature for decades.

Trichomonas vaginalis é o protozoário flagelado que parasita o trato urogenital humano causando a tricomonose, doença sexualmente transmissível (DST) de origem não viral mais comum no mundo. Durante a infecção a aquisição de nutrientes, como nucleotídeos púricos, pirimidínicos e ferro é essencial à sobrevivência do parasito. T. vaginalis não sintetiza de novo purinas e pirimidinas, dependendo de vias de salvação para aquisição destas moléculas. O ferro desempenha um papel crucial na patogenicidade da tricomonose, influenciando a expressão de múltiplos genes envolvidos na virulência. Nucleotídeos extracelulares, especialmente o ATP, são liberados em situações de estresse, anoxia ou injúria, atuando como sinalizadores pró-inflamatórios ao sistema imune. As enzimas NTPDase e ecto-5'-nucleotidase degradam ATP à adenosina, esta com ação anti-inflamatória. A enzima adenosina deaminase (ADA) degrada adenosina à inosina. A presença desta cadeia enzimática em T. vaginalis sugere a modulação das concentrações nucleotídeos/nucleosídeos durante a inflamação. A atividade da ADA foi caracterizada em T. vaginalis, porém há poucos relatos sobre a participação desta enzima na sobrevivência do parasito, bem como, a localização celular e o efeito de nutrientes essenciais na atividade enzimática e na expressão gênica. O estudo da localização da ADA em T. vaginalis foi realizado, indicando a presença da enzima na membrana celular e no citoplasma do trofozoíto. Avaliando-se o perfil da ADA de diferentes isolados de T. vaginalis em uma condição de limitação de soro bovino, o qual representa a fonte de adenosina aos trofozoítos, não se observou diferenças significativas na deaminação da adenosina à inosina. Na avaliação do efeito de diferentes fontes de ferro ou a privação deste cátion na atividade e na expressão gênica da ADA foi possível verificar uma diminuição da atividade e um aumento na expressão gênica após a privação do ferro, reforçando a hipótese que este elemento pode modular a atividade das enzimas envolvidas na sinalização purinérgica. Os resultados obtidos nesta dissertação permitem a avaliação de importantes aspectos da ADA, contribuindo para o melhor entendimento do sistema purinérgico em T. vaginalis e seu papel no estabelecimento e manutenção da infecção e consequente sobrevivência do parasito. / Trichomonas vaginalis is a flagellate protozoan that parasitizes the urogenital human tract causing trichomonosis, the non-viral sexually transmitted disease (STD) most common in the world. During infection the acquisition of nutrients such as purine and pyrimidine nucleotides, and iron is essential to the parasite survival. T. vaginalis lacks de novo purines and pyrimidines synthesis depending on the salvation pathway for the acquisition of these molecules. Iron plays a crucial role in trichomonosis pathogenesis, influencing the expression of multiple genes involved in virulence. Extracellular nucleotides, especially ATP, are released during stress, injury or anoxia, acting as a pro-inflammatory signaling to the immune system. The enzymes NTPDase and ecto-5'-nucleotidase degrade ATP to adenosine with anti-inflammatory action. The adenosine deaminase (ADA) enzyme degrades adenosine to inosine. The presence of this enzymatic chain in T. vaginalis suggests the modulation of nucleotides/nucleosides concentrations during inflammation. The ADA activity was characterized in T. vaginalis, but there are few reports on the participation of this enzyme in the parasite survival, as well as the cellular localization and the effect of essential nutrients on enzyme activity and gene expression. The study of ADA localization in T. vaginalis was performed, indicating the presence of the enzyme on trophozoite cell membrane and cytoplasm. Evaluating the ADA profile in different T. vaginalis isolates in bovine serum limitation condition, which is the source of adenosine for the trophozoites, no significant differences were observed in the deamination of adenosine to inosine. Regarding the effect of different iron sources or iron deprivation in activity and gene expression of ADA, it was observed a decrease in activity and an increase in gene expression after iron deprivation, reinforcing the hypothesis that this element can modulate the activity of enzymes involved in the purinergic signaling. The results obtained in this study allow the assessment of important aspects of ADA, contributing to a better understanding of the purinergic system in T. vaginalis and its role in the establishment and maintenance of infection and consequent survival of the parasite.

Deterministic models for the transmission dynamics of HIV/AIDS and trichomonas vaginalis (TV) in a human population are formulated and analysed. The models which assumed standard incidence formulations are shown to have globally asymptotically stable (GAS) disease-free equilibria whenever their associated reproduction number is less than unity. Furthermore, both models possess a unique endemic equilibrium that is GAS whenever the associated reproduction number is greater than unity. An extended model for the co-infection of TV and HIV in a human population is also designed and rigorously analysed. The model is shown to exhibit the phenomenon of backward bifurcation, where a stable disease-free equilibrium (DFE) co-exists with a stable endemic equilibrium whenever the associated reproduction number is less than unity. This phenomenon can be removed by assuming that the co-infection of individuals with HIV and TV is negligible. Furthermore, in the absence of co-infection, the DFE of the model is shown to be GAS whenever the associated reproduction number is less than unity. This study identifies a sufficient condition for the emergence of backward bifurcation in the model, namely TV-HIV co-infection. The endemic equilibrium point is shown to be GAS (for a special case) when the associated reproduction number is greater than unity. Numerical simulations of the model, using initial and demographic data, show that increased incidence of TV in a population increases HIV incidence in the population. It is further shown that control strategies, such as treatment, condom-use and counselling of individuals with TV symptoms, can lead to the effective control or elimination of HIV in the population if their effectiveness level is high enough. / Dissertation (MSc)--University of Pretoria, 2017. / DST-NRF SARChI Chair in Mathematical Models and Methods in Biosciences and Bioengineering (M3B2) / Mathematics and Applied Mathematics / MSc / Unrestricted