Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / En vista de la toxicidad descrita para triclosán, su uso en diversos productos de higiene per-sonal y los hallazgos descritos en la literatura sobre la presencia de triclosán en aguas resi-duales, las cuales se usan para regadío en zonas agrícolas, se planteó para este estudio el evaluar la bioaccesibilidad de triclosán en dos hortalizas consumidas frecuentemente en Chile. Se eligió la lechuga (Lactuca Sativa L.) como modelo de hortaliza cuya parte comestible no está en contacto con el suelo, y rábano (Raphanus sativus L.) cuya parte comestible se desa-rrolla en contacto directo con el suelo. Para llevar a cabo este objetivo, ambas especies se cultivaron en un medio hidropónico y posteriormente fueron tratadas con solución que contenía triclosán. La bioaccesibilidad del triclosán en el tejido vegetal se estimó mediante una prueba de bioaccesibilidad in vitro basada en la fisiología (PBET). Para el análisis de triclosán se im-plementó y validó un método por cromatografía de gases con detector de micro captura elec-trónica (GC-μECD) para determinar su concentración pseudototal en la matriz vegetal y su concentración en los fluidos gastrointestinales sustitutos. Los resultados señalan que el triclosán puede ser extraído eficientemente desde matrices ve-getales mediante un solvente constituido por agua: acetonitrilo 1:1 y ácido metafosfórico al 2% (p/p) con posterior concentración y limpieza en columnas de extracción en fase sólida (C-18). El método optimizado cumplió con los principales parámetros de validación, entre estos se destacan el ser un método selectivo y sensible, con límites de detección y cuantificación de la técnica de 0,32 y 0,97 μg/L, respectivamente; con un coeficiente de variación de 10,7% en la reproducibilidad y una recuperación de 88,1%. El triclosán puede ser absorbido por plantas de lechuga y rábano cultivadas hidropónicamente. En el caso de lechuga, el triclosán puede ser translocado significativamente a la parte aérea, en tanto que para el rábano el compuesto se acumula en la raíz reservante de la planta. Me-diante una prueba PBET se demuestra que una fracción del triclosán se encuentra en forma bioaccesible en la parte comestible de lechuga y rábano. La concentración bioaccesible en hoja de lechuga de cultivo hidropónico varió en el rango de 0,14-0,45 μg/g, el cual representa una variación en la bioaccesibilidad en el rango de 5,6-16%. En el caso de rábano, los rangos fueron 0,15-0,34 μg/g y 7,9-36,6%, respectivamente / In view of the toxicity of triclosan, the use of this compound in various personal hygiene prod-ucts and information published in other countries about the presence of triclosan in wastewater, which are used for irrigation in agricultural areas, was proposed for this study to evaluate the bioaccessibility of triclosan in two vegetables commonly consumed in Chile. Lettuce (Lactuca sativa L.) was chosen as a model vegetable whose edible portion is not in contact with the soil, and radish (Raphanus sativus L.) whose edible portion is developed in direct contact with the soil. To carry out this goal, both species were grown in a hydroponic medium and subsequently treated with a solution containing triclosan. The bioaccessibility of triclosan in plant tissue was estimated using an in vitro test based on the physiology (PBET). For the analysis of triclosan it was implemented and validated a method by gas chromatography with electron micro capture detector (GC-μECD) to determine the pseudototal concentration in the vegetal matrix and the concentration in the gastrointestinal fluids substitutes. The results indicate that the triclosan can be extracted efficiently from plant matrices using a solvent consisting of water: acetonitrile 1:1 and metaphosphoric acid 2% (w/w) with subsequent concentration and cleaning in columns of solid phase extraction (C-18). The optimized method complies with the main validation parameters, among them are highlighted a selective and sensitive method with limits of detection and quantification of the technique of 0.32 and 0.97 μg/L, respectively, with a coefficient of variation of 10.7% in reproducibility and with a 88.1% recovery. Triclosan can be absorbed by lettuce and radish grown hydroponically. In the case of lettuce, triclosan can be translocated to the aerial part significantly, while for radish, compound accu-mulates in the storage organ of the plant. Through a PBET test it shows that a fraction of triclo-san is bioaccessible in the edible part of lettuce and radish. The bioaccessible concentrations in lettuce leaves varied in the range 0.14-0.45 μg/g, which represents a variation in the bioac-cessibility in the range 5.6-16%. In the case of radish, the ranges were 0.15-0.34 μg/g and 7.9-36.6%, respectively / Proyectos ENL-4/12 de la Vicerrectoría de Investigación de la Universidad de Chile y por Proyectos Transversales en Investigación y Desarrollo 2014 de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de Chile

Memoria para optar el título de Bioquímico / Triclosán es un agente antibacteriano ampliamente utilizado en productos cosméticos y de higiene oral (jabones, desodorantes, dentífricos, colutorios, etc.) como agente desinfectante. Sin embargo, estudios recientes han sugerido que este fármaco podría tener un papel en el control de la inflamación y retrasar el avance de la enfermedad periodontal. La inflamación crónica en esta patología y la destrucción de los tejidos periodontales, pueden estar asociadas a la elevada activación de plasminógeno a plasmina mediada por Uroquinasa (uPA), una serin-proteasa altamente expresada en esta enfermedad, involucrada en la remodelación tisular y activación de diversas otras proteasas que participan en la degradación de la matriz extracelular (MEC). Por otra parte, en la enfermedad periodontal se encuentra una mayor presencia de especies reactivas de oxígeno (ROS), niveles elevados de metaloproteasas y citoquinas proinflamatorias como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), lo que en conjunto con los demás factores, contribuyen a la destrucción de la MEC. En el presente estudio se estudió la capacidad de Triclosán para interferir la actividad y producción de uPA y ROS en cultivos primarios de fibroblastos gingivales humanos (FGH) estimulados con TNF-α y peróxido de hidrógeno (H2O2), además de determinar la relación entre la actividad y expresión de uPA con la inducción de vías de señalización intracelulares NFkB, JNK y MEK/ERK1/2, la activación de plasminógeno, el estado redox intracelular y la modulación de estas por Triclosán. Las células fueron estimuladas con TNF-α y Terbutil Peróxido (t-BOOH) un análogo orgánico de H2O2 de mayor estabilidad y con capacidad de penetrar membranas celulares. Se utilizaron distintos inhibidores específicos para las diferentes rutas; de la actividad de MAPquinasas se utilizó PD98095, inhibidor selectivo de MEK1 y SP600125, inhibidor selectivo de JNK. Para inhibir la activación de la vía NF-kB se ocupó el péptido SN50 y su péptido control SN50M. Además de utilizó el inhibidor de la enzima productora del radical superóxido NADH/NAD(P)H oxidasa (DPI), el antioxidante intracelular y precursor de glutatión (NAC), la enzima convertidora de H2O2 catalasa y por último Triclosán, con el fin de interferir la actividad y producción de uPA. Esta fue analizada por zimografía y Western-blot respectivamente. La expresión del ARNm de uPA fue evaluada a través de RT-PCR. La activación de las vías de señalización intracelulares JNK y ERK-1/2 fueron analizadas por Western-blot. La activación de NF- B fue analizada por inmunofluorescencia. Se evaluó la producción intracelular de ROS utilizando el fluoróforo DCHF-DA. Se comprobó que TNF-α es un fuerte estímulo para la producción y actividad de uPA. Triclosán disminuyó la actividad de esta (de forma dosis dependiente) y su expresión (ARNm y proteína), además de inhibir la conversión de plasminógeno a plasmina estimuladas por TNF-α. Se observó también que la actividad de uPA estimulada con esta citoquina es dependiente de las rutas de señalización asociadas a NF-kB y JNK. TNF-α indujo la fosforilación de JNK y producción del factor de transcripción río debajo de JNK c-Jun, las cuales fueron inhibidas por Triclosán, sin embargo no se observaron cambios en la activación de la vía NF-kB. Además, NAC, DPI y catalasa inhibieron la actividad y producción de uPA estimulada por TNF-α. El pro-oxidante t-BOOH indujo la actividad y producción de uPA de forma dosis dependiente y activó la vía ERK-1/2. Triclosán y el inhibidor de ERK-1/2 PD98059 inhibieron la producción y activación de uPA estimuladas con t−BOOH. Se observó que Triclosán posee la capacidad de inhibir la activación de la vía ERK-1/2 estimulada por t BOOH, además de reducir los niveles de ROS intracelulares estimulados con TNF-α, de forma similar que NAC y DPI. Estos resultados sugieren que Triclosán puede tener un efecto protector en la enfermedad periodontal al disminuir la inflamación y destrucción tisular asociados a la actividad de uPA y producción de ROS con la consiguiente remodelación del tejido conectivo gingival. Se sugiere entonces que Triclosán posee una actividad antioxidante intracelular no descrita antes en la literatura, lo que junto con lo anterior podría explicar en parte su efecto protector previamente reportado en estudios clínicos, y sugiere que estos pueden ser aspectos adicionales de su efecto clínico en la destrucción periodontal

Tesis presentada para optar al grado de Magíster en Química área de Especialización en Medio Ambiente y Memoria para optar al Título de Químico / Chile se ubica en el primer lugar de Latinoamérica en lo que se refiere al procesamiento de aguas residuales, lo cual ha posibilitado paulatinamente la descontaminación de los cursos de aguas superficiales y marítimos. El tratamiento de las aguas residuales trae consigo la generación de biosólidos, los cuales pueden ser utilizados como fertilizantes, mejoradores de los suelos, y también como materia prima para la generación de biogás. Aunque el plan de saneamiento de aguas servidas mejora significativamente la calidad del agua, no todos los contaminantes son capaces de ser completamente eliminados y pueden llegar al medioambiente a través del agua tratada o por la aplicación de biosólidos a los suelos. Los productos farmacéuticos y de cuidado personal (PPCPs) son contaminantes orgánicos que permanecen en los biosólidos, entre éstos se encuentran el Triclosán (TCS) y hormonas, como 17α-etinilestradiol (EE2). El TCS es un agente antimicrobiano usado en jabones, detergentes, pasta de dientes, cosméticos y productos farmacéuticos. El 17α-etinilestradiol es un estrógeno sintético usado como un ingrediente activo de los anticonceptivos orales y suplementos hormonales. El riesgo ambiental de los compuestos orgánicos contenidos en los biosólidos depende de su concentración, de su persistencia, su capacidad para incorporarse a la cadena trófica, su labilidad y su biotoxicidad. Por lo que se plantea como hipótesis que la adsorción de 17α-Etinilestradiol y de Triclosán en el suelo aumentaría con el incremento de materia orgánica aportada por el biosólido y por tanto disminuiría la biodisponibilidad de los contaminantes a las plantas de trigo. El objetivo general de este estudio fue evaluar el efecto de la aplicación de biosólidos en relación a la adsorción de hormonas esteroidales (17α-Etinilestradiol) y agentes bactericidas (triclosán) en suelos y la biodisponibilidad de estos compuestos determinada mediante ensayos con plantas de trigo. Para el estudio de biodisponibilidad se utilizó arena y dos series de suelos de la Región Metropolitana: Lampa y Lo Prado además de un biosólido de una planta de tratamiento de aguas residuales de la misma Región. Se realizó una caracterización física y química tanto de los suelos, como del biosólido, a través de pH, carbono orgánico (CO) y textura (determinada sólo para los suelos). La arena y suelos utilizados fueron tratados con una dosis de 0 y 90 Mgha-1 de biosólido. Se determinó la concentración de EE2 y TCS en el biosólido, a través de una extracción con acetato de etilo utilizando baño de ultrasonido, encontrándose concentraciones de 0,54 ± 0,06 y 8,31 ± 0,19 mgkg-1 respectivamente. La determinación de ambos se realizó por medio de cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masas (GC-MS). Para los ensayos con plantas de trigo, las muestras fueron extraídas y determinadas con la misma técnica. Los resultados obtenidos de la extracción de EE2 y TCS de las plantas de trigo, indicaron que los compuestos se concentran mayoritariamente en la raíz de la planta que en la parte aérea. Además, se obtuvo que la biodisponibilidad de los compuestos en las plantas depende exclusivamente de las propiedades de los contaminantes y del suelo. Los estudios de adsorción muestran que el incremento de materia orgánica en los suelos aumenta la adsorción de TCS y EE2 en estos sustratos, y que ambos compuestos siguen el modelo de adsorción de Freundlich. La desorción indica, que la movilidad y disponibilidad en un periodo de 24 horas tanto de TCS como de EE2 depende del tipo de suelo, ya que fue mínima en el caso del suelo Lampa, con y sin aplicación de biosólido, en cambio en el suelo Lo Prado se observó una desorción de casi un 50% de TCS / Chile is ubicated in first place regarding to the wastewater treatment in Latin America, which has gradually enabled the decontamination of surface and sea water courses. The wastewater treatment entails the generation of biosolids, which could be used as fertilizers, soil improvers, and also as a feedstock for biogas generation. Although the wastewater treatment plan significantly improves water quality, there are contaminants that are not completely eliminated and may reach the environment through treated water or due the biosolids application to soils. Biosolids may contain inorganic and organic contaminants, among the latter are the pharmaceutical and personal care products (PPCPs), which have given rise to a series of emerging contaminants, among these are triclosan (TCS) and hormones, such as 17α-ethinylestradiol (EE2). The TCS is an antimicrobial agent used in soaps, detergents, toothpastes, cosmetics and pharmaceuticals. The 17α-ethinylestradiol is a synthetic estrogen used as an active ingredient in oral contraceptives and hormone supplements. The environmental risk of organic compounds in biosolids depends on their concentration, persistence, ability to enter the food chain, its lability and biotoxicity. As hypothesis, It is proposed that the adsorption of 17α-ethinylestradiol and triclosan in the soil would increase with increasing of organic matter provided by the biosolids and thereby would decrease the bioavailability of pollutants to the wheat plants. The general aim of the present study was to evaluate the effect of biosolids application in relation to the adsorption of steroid hormones (17α-ethinylestradiol) and antibacterial agents (TCS) in soils and their bioavailability through testing with wheat plants. For the bioavailability study, sand and two soil series of Metropolitan Region were used: Lampa and Lo Prado. The biosolid was obtained from wastewater treatment plant in the same Region. Both soils and biosolid were characterized through pH, organic carbon (OC) and, for soil only, texture. The sand and soils were treated with two biosolid rates (0 and 90 Mg ha-1). The EE2 and TCS concentration in biosolids was determined through ethyl acetate extraction using ultrasonic bath, finding concentrations of 0.54 ± 0.06 and 8.31 ± 0.19 mgkg-1 respectively. The determination of both compound was carried out through gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS). The same extraction technique and determination was used for wheat plant assays. The results of the extraction of EE2 and TCS from wheat plants indicated that the compounds are mainly concentrated in roots more than shoots. Furthermore, it was found that the bioavailability of the compounds in plants depends exclusively on the properties of the contaminants and the soil. Adsorption studies showed that the increase of organic matter in the soil increases the adsorption of TCS and EE2 on these substrates, and both compounds follow the Freundlich adsorption model. The desorption indicates that the mobility and availability within 24 hours for both TCS and EE2 depends on soil type, because it was minimum in the case of soil Lampa, with and without biosolids application, while in the soil Lo Prado an increase of almost 50% in the case of TCS was observed

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