Doenças tropicais negligenciadas compartilham características que permitem que elas persistam nas condições de pobreza, onde se aglomeram e se sobrepõe frequentemente. Mais de um bilhão de pessoas sofrem de uma ou mais doenças tropicais negligenciadas. Entre estas está a doença de Chagas, resultante da infecção pelo protozoário parasito hemoflagelado Trypanosoma cruzi, tendo insetos triatomíneos como vetores. Topoisomerases são enzimas envolvidas na regulação do superespiralamento do DNA resolvendo problemas topológicos associados com replicação, transcrição, recombinação e reparo. As topoisomerases do tipo II são essenciais para tripanossomatídeos por atuarem na replicação e organização do DNA contido em uma região especializada da mitocôndria denominada cinetoplasto. O estudo da Topoisomerase II Mitocondrial (TcTopoIImit) foi realizado através de análises sequenciais e estruturais de outras topoisomerases para a determinação de construções para a clonagem. As construções para o domínio N-terminal foram clonadas no vetor pTZ57R/T e subclonadas em vetores do sistema pET para expressão proteica em E. coli. Experimentos de expressão foram realizados em diferentes cepas, vetores, soluções tampão e outros parâmetros variáveis visando a obtenção dos produtos recombinantes na forma solúvel, porém, tais resultados não foram obtidos. A flavoproteína Old Yellow Enzyme de Trypanosoma cruzi (TcOYE) é uma oxidoredutase que usa NAD(P)H como cofator. Esta enzima é clinicamente relevante devido ao seu papel no mecanismo de ação de alguns agentes tripanocidas, utilizados no tratamento da doença de Chagas, por produzirem espécies reativas de oxigênio. Neste trabalho, a enzima recombinante TcOYE foi produzida, purificada, cristalizada pelo método de difusão de vapor e sua estrutura cristalográfica, resolvida por substituição molecular e refinada. A TcOYE foi cristalizada nas formas cristalinas P212121 e P21 e os dados de difração foram coletados para o máximo de resolução de 1,27 e 2,00 Å, respectivamente. As coordenadas atômicas e fatores de estrutura das estruturas da TcOYE nas formas cristalinas P212121 e P21 foram depositados no Banco de Dados de Proteínas com os códigos de acesso 4E2B e 4E2D, respectivamente. A TcOYE apresenta um enovelamento canônico em um barril (α/β)8 com o grupo prostético localizado na cavidade maior do sítio ativo. Após a obtenção dos modelos cristalográficos análises sequenciais e estruturais foram realizadas para a TcOYE e outras OYEs. A região 141-156 do subdomínio capping em TcOYE, assim como em outras OYEs, é intrinsecamente desestruturada exibindo altos valores de fatores B. A região mais divergente entre as OYEs é o loop estendido (289-297), que pode variar em comprimento e composição mudando o volume e a acessibilidade ao sítio ativo. / Neglected tropical diseases share features that allow them to persist in conditions of poverty, which clump together and frequently overlap. More than 1 billion people suffer from one or more neglected tropical diseases. Among them is the Chagas disease is an important parasitic disease resulting from infection by the flagellate protozoan parasite Trypanosoma cruzi, with triatomine insects as vectors. Topoisomerases are ubiquitous enzymes involved in the regulation of DNA supercoiling and overcoming topological barriers during replication, transcription, recombination and repair. The type II topoisomerases are essential for trypanosomatids since, in addition to their role in nuclear DNA metabolism, these enzymes might also play an important role in the replication and organization of the DNA contained in the specialized region of the mitochondrion known as the kinetoplast. The study of Mitochondrial Topoisomerase II from T. cruzi (TcTopoIImit) was performed by sequence and structural analyses into topos members for determination of domains constructions for cloning. Constructions for the N-domain were then cloned in pTZ57R/T vector and subcloned into pET system vectors for protein expression in E. coli. The protein expression experiments were performed by different strain cells, vectors, buffers solutions and others adjustable parameters for improve the solubility but recombinant products in soluble form were not obtained. The flavoprotein Old Yellow Enzyme from Trypanosoma cruzi (TcOYE) is an oxidoreductase that uses NAD(P)H as cofactor. This enzyme is clinically relevant due to its role in the action mechanism of some trypanocidal drugs used in the treatment of Chagas disease by producing reactive oxygen species. In this work, the recombinant enzyme TcOYE was produced, purified, crystallized by the vapour diffusion method and its crystallography structure was solved for molecular replacement and refined. TcOYE was crystallized in two crystalline forms, P212121 and P21 and diffraction data were collected to a maximum resolution of 1.27 and 2.00 Å, respectively. The atomic coordinates and structure factors of the TcOYE structure in P212121 and P21 crystalline forms have been deposited in the Protein Data Bank with the accession codes 4E2B and 4E2D, respectively. TcOYE displays a canonical (α/β)8-barrel fold with a FMN prosthetic group located at the large active-site cavity. Afterwards, sequential and structural analyses were carried out for TcOYE and others OYEs. The region 141-156 of the capping subdomain in TcOYE as well as in others OYEs is intrinsically flexible exhibiting high B-factor values. The most divergent region among these OYEs is the extended loop (289-297), which can vary in length and composition changing the volume and accessibility to the active site.

Orientador: Fernanda Ramos Gadelha / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-15T15:48:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_ThiagoMirandada_M.pdf: 571506 bytes, checksum: c09f01f1f6bb2c2777c4387f5674f71c (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas (DC), cujo tratamento é feito através do uso do nifurtimox e benzonidazol. Esses medicamentos não são efetivos tornando a busca para novos alvos para o desenvolvimento de uma terapia mais específica uma prioridade. O alto grau de heterogeneidade existente entre as cepas representa um desafio para o desenvolvimento desta terapia, tornando a compreensão da biologia do parasita essencial nessa busca. O objetivo deste trabalho foi avaliar a funcionalidade do complexo I da cadeia respiratória de epimastigotas de T. cruzi ao longo da curva de proliferação (fases log, estacionária e estacionária tardia). Deste modo foi avaliado em duas cepas (Tulahuen 2 e Y) o consumo de oxigênio, potencial de membrana mitocondrial (??) e a atividade da enzima succinato desidrogenase (SDH), utilizando-se diferentes substratos respiratórios (malato/piruvato (M/P) malato/piruvato + malonato (MPM) ou succinato (SUC)). De um modo geral, em ambas as cepas o consumo de oxigênio foi maior na fase estacionária tardia em relação à log. A utilização de diferentes substratos não resultou em diferenças significativas nas taxas de respiração em ambas as cepas. Tulahuen 2 exibiu maiores taxas de consumo de oxigênio em relação à Y. Não foram observadas diferenças significativas nos valores de controle respiratório (-1,7) nas duas cepas, nas diferentes fases de proliferação. Na presença de um desacoplador da fosforilação oxidativa, as taxas não variaram na cepa Y, enquanto na Tulahuen 2 ocorreu um aumento em direção à fase estacionária tardia. A administração de malonato, inibidor competitivo da SDH, rendeu padrões diferenciados de inibição com a respiração sustentada por diferentes substratos que não variaram quando as células foram submetidas a um "jejum" (incubadas em PBS / 1 raM MgCb) por 3 horas. A atividade da SDH diminuiu em ambas as cepas na fase estacionária em relação à log, justificando a queda das taxas de inibição pelo malonato. Não foram registradas diferenças significativas com o aumento da concentração deste inibidor. A adição de cianeto de potássio não inibiu completamente a respiração, não importando o substrato utilizado ou a fase de proliferação, indicando que outras fontes além da cadeia respiratória estão consumindo oxigênio. Interessantemente, o ?? não variou entre as cepas em nenhuma fase de proliferação. Estes resultados fornecem novos dados sobre a cadeia respiratória do parasita, além de indicarem que não foi possível estabelecer a funcionalidade do complexo I, uma vez que o malonato não é um inibidor eficiente do complexo II. / Abstract: Trypanosoma cruzi is the etiological agent of Chagas' disease, where nifurtimox and benznidazole are used in treatment. These drugs are not efficient turning the search for new targets to be used in the development of a more effective therapy a priority. The high degree of heterogeneity among strains represents a challenge for the development of this therapy, and the comprehension of the parasite biology becomes essential in this search. The aim of this work was to evaluate the functionality of the respiratory chain complex I along the growth curve in T. cruzi epimastigotes. In this way it was analyzed in two strains (Tulahuen 2 and Y) the oxygen consumption, mitochondrial membrane potential (??) and succinate dehydrogenase (SDH) activity, using different respiratory chain substrates (Malate/Pyruvate, Malate/Piruvate + Malonate or Succinate). Generally, in both strains oxygen consumption was higher in the late stationary phase in relation to the log phase. The use of different substrates for the respiratory chain did not lead to significant variations in the respiratory rates in both strains. Tulahuen 2 showed higher oxygen consumption rates than the Y strain. No significant differences were observed in the respiratory control rates (~1,7) in both strains along the growth curve. In the presence of an uncoupler, the respiration rates did not vary in the Y strain while in Tulahuen 2 an increase towards the late stationary phase was observed. Addition of malonate, a SDH competitive inhibitor, resulted in distinct inhibition patterns when respiration was sustained by different substrates and did not change when cells were "starved" (incubated in PBS / 1 mM MgCb) for 3 hours. SDH activity decreased in both strains in the stationary phase in relation to log phase that could explain the decrease in the inhibition rates induced by malonate. No significant differences were observed with higher inhibitor concentration. Addition of potassium cyanide did not completely inhibit respiration in both strains regardless the substrate or growth phase, suggesting that other sources beyond the respiratory chain consume oxygen. Interestingly, ?? were similar between strains in all growth phases. These results provide new data about the parasite's respiratory chain indicating that complex I functionality was not possible to determine, once malonate is not a good inhibitor of complex II. / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Fernanda Ramos Gadelha / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T13:57:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MoralesNeto_Raphael_M.pdf: 499454 bytes, checksum: de4a1750fcb9184b1cfcef4f5e0cc3ee (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da doença de Chagas, exibe um notável grau de heterogeneidade estrutural e funcional, o qual pode modular sua patogenicidade, sobrevivência e adaptação. Em eucariotos superiores, mecanismos de fosforilação e desfosforilação são fundamentais para a regulação de uma ampla variedade de eventos celulares. Por essa razão, um melhor entendimento da atividade de fosfatases em T. cruzi pode ser útil para a identificação de potenciais alvos para o desenvolvimento de terapias mais específicas. Neste trabalho, analisou-se o perfil das fosfatases, em homogenatos de duas cepas de T. cruzi, Tulahuen 2 e Y. A atividade de fosfatases foi determinada espectrofotometricamente utilizando-se o p-nitrofenilfosfato (p-NPP) como substrato. Na cepa Tulahuen 2, que apresenta maior resistência ao estresse oxidativo gerado pelo peróxido de hidrogênio (H2O2), foi observada uma atividade de fosfatase sete vezes maior quando comparada a cepa Y. Em relação ao pH ótimo a Tulahuen 2 mostrou uma expressiva atividade em pH 4,0, a qual foi aumentada na presença de Mg2+ exógeno em uma ampla faixa de pH (5,0 - 8,0). A cepa Y, embora em menores níveis, exibiu o mesmo perfil sem a adição de Mg2+, apresentando na presença desse íon um pico de atividade em pH 7,0. A adição de Ca2+ ao meio reacional afetou significativamente a cepa Tulahuen 2 em pH 8,0 e inibiu a atividade das fosfatases na cepa Y nos pHs 7,0 e 8,0. Inibidores clássicos de fosfatase ácida, bem como inibidores de proteína tirosina fosfatase e fosfatase alcalina, mostraram padrões distintos de inibição em ambas as cepas, reforçando a heterogeneidade entre os isolados de T. cruzi / Abstract: Trypanosoma cruzi, the etiological agent of Chagas'disease, displays a remarkably high degree of both, structural and functional intraspecific heterogeneity, which could modulate its pathogenicity, survival and adaptability. In higher eukaryotes, phosphorylation and dephosphorylation are fundamental pathways that regulate a wide variety of cellular events. Therefore, a better understanding of phosphatases activities in T. cruzi could be useful to identify potential targets for the development of a more specific therapy. In this work, we analysed the phosphatase activity profile in T. cruzi homogenates of two strains (Tulahuen 2 and Y). The phosphatase activities was determined spectrophometricaly using p-nitrophenylphosphate (p-NPP) as substrate. In the strain more resistant to the oxidative stress generated by H2O2, Tulahuen 2, it was observed a seven-fold higher phosphatase activity when compared to the other strain. In relation to optimum pH and substrate specificity, Tulahuen 2 had an expressive acid phosphatase activity (optimum pH at 4.0), which was even higher in the presence of Mg2+ and had a broad range (pH 5-8). Y strain, although at lower levels, showed the same activity profile in the presence or absence of Mg2+. The presence of calcium showed significant effect on the Tulahuen 2 strain only at pH 8.0 and had an inhibitory effect on phosphatase activity in the Y strain at pHs 7-8. Classical inhibitors of acid phosphatases, as well as inhibitors of phosphotyrosine phosphatase, showed distinct patterns of effects in phosphatases from both strains / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

As doenças denominadas como negligenciadas têm causado nos últimos anos uma preocupação muito acentuada na comunidade científica e para as autoridades de saúde, relacionada às suas terapêuticas, no sentido de que os medicamentos existentes não se apresentam totalmente eficazes, além de determinarem efeitos colaterais extremamente elevados. Nesse perfil se encaixam a doença de Chagas e as Leishmanioses, etiologias determinadas respectivamente por Trypanosoma cruzi e parasitas do gênero Leishmania. Como proposta de encontrarmos uma alternativa para o tratamento dessas parasitoses, avaliamos o potencial terapêutico de três estatinas (sinvastatina, pravastatina e mevastatina), comercialmente encontradas para o tratamento de níveis elevados de colesterol e triglicérides, baseado no princípio de que a rota bioquímica para a formação de colesterol é semelhante à do ergosterol, componente da membrana plasmática desses protozoários. Foram realizadas avaliações in vitro e in vivo das estatinas puras e de suas associações com o benzonidazol, medicamento de referência no tratamento da doença de Chagas e com a anfotericina B, medicamento de referência no tratamento das leishmanioses, partindo do pressuposto que a substituição do benzonidazol / anfotericina B ou a diminuição de suas doses em combinação com as estatinas, atuando como coadjuvantes, pudessem auxiliar no tratamento e diminuir os efeitos colaterais provocados pela medicação. Observou-se nos ensaios com T. cruzi in vitro boa atividade antiparasitária, com valores de porcentagem de lise celular mais altos ou comparados aos encontrados para o benzonidazol, já in vivo, apenas a mevastatina apresentou redução da parasitemia em relação ao controle positivo e às outras estatinas testadas. Nos ensaios com L. braziliensis e L. major não foi observado resultado significante, tanto in vitro como in vivo, apesar de em algumas situações encontrarmos resultados próximos ao controle positivo. / Over recent years, neglected diseases has been a problem to the scientific community and health associations due the absence of total efficacy of drugs, and by their potential side effects. Chagas\' disease and Leishmaniasis - both caused respectively by Trypanosoma cruzi and by parasites the genus Leishmania fit on this profile. Aiming to find an alternative treatment of these parasitosis we evaluated the potential therapeutic of three statins (simvastatin, pravatatin, and mevastatin) which are commercially employed for treatment of high levels of cholesterol and triglycerides, based on the similarity of the biochemical route of cholesterol and ergosterol formation, being the ergosterol a component of plasmatic membrane of these protozoa. In vitro and in vivo evaluation were made by the association of these statins with benznidazole and amphotericin B used for Chagas\' disease and Leishmaniasis treatment respectively, hypothesizing that the replacement of benznidazole/amphotericin B or the reduction of the doses in combination with statins as coadjuvants could provide better treatment and side effects reduction caused by the commercial drugs. In vitro assays under T. cruzi showed significant antiparasitic activity when compared with benzonidazole to all statins. On the other hand in vivo assays showed parasitic reduction only by mevastatin when it was compared with positive control. L. braziliensis and L. major in in vivo assay didn´t show significant results despite the results have been similar to the positive control.

Orientadores: João Aristeu da Rosa, Mário Steindel / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T12:48:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ribeiro_AlineRimoldi_D.pdf: 21726449 bytes, checksum: 28ac88cc86cc90e738eb70f9dca45f0b (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Trypanosoma cruzi, protozoário que faz parte da família Trypanosomatidae é o agente causador da doença de Chagas que afeta 6-8 milhões de pessoas na América Latina. A origem dessa família pode ser estudada por meio de técnicas moleculares, como a investigação da região V7V8 - SSUrRNA. Trypanosoma cruzi é subdividido em seis grupos independentes TcI-TcVI denominados Unidades Discretas de Tipagem (DTUs). A caracterização biológica e molecular de onze cepas de T. cruzi pertencentes aos grupos TcI (Bolívia; Tlenti; Tmelanocephala; SC90), TcII (Famema; SC96; SI8; Y) e TcIII (QMM3; QMM5; SI5) isoladas de cinco espécies de triatomíneos esclarece fatores biológicos por parâmetros como a cinética de crescimento, curva parasitêmica, taxa de infeção celular, caracterização molecular, ação de metaloproteinases, perfil protéico e sorologia. O objetivo do trabalho foi a caracterização biológica e molecular de cepas de T. cruzi isoladas de triatomíneos da Bahia, Rio Grande do Sul, Santa Catarina e São Paulo. O grupo TcII de T. cruzi mostrou maior capacidade multiplicativa em formas epimastigotas durante a cinética de crescimento, seguido por TcI e TcIII. A curva parasitêmica evidenciou variabilidade entre os camundongos Balb/c, contudo ao comparar os grupos TcI, TcII e TcIII de T. cruzi o perfil parasitêmico mostrou-se equivalente. Acrescentando os dados biológicos estudou-se a taxa de infecção de T. cruzi em linhagens celulares J774 e macrófagos peritoneais. O grupo TcI de T. cruzi apresentou maior taxa de infecção e menor tempo exigido para a multiplicação de formas amastigotas, assim como macrófagos peritoneias mostraram-se mais atrativos para T. cruzi. A caracterização molecular, por meio da região V7V8, mostrou que essas cepas pertencem às DTUs TcI, TcII e TcIII. A separação dos grupos torna-se evidente ao comparar o perfil protéico em formas epi e tripomastigotas de T. cruzi. O grupo TcI apresentou mais proteínas nos géis de acrilamida, particularidade que pode ser associada a intra-específicidade de TcI. A ação de metaloproteinases foi observada em formas epi e tripomastigotas sugerindo presença ativa e estável durante parte do ciclo do parasito. A reatividade sorológica foi comprovada nos grupos TcI, TcII e TcIII, por meio de ELISA em diluições de 1/100 até 1/12.800. A adição da técnica de Western Blotting aos ensaios por SDS-PAGE em soros de animais infectados após 50 dias mostrou o perfil protéico da cepa Y em membrana de nitrocelulose. Em conjunto, os resultados mostraram que as onze cepas de T. cruzi apresentaram diferenças entre os grupos do parasito. O grupo TcI mostrou maior taxa de infecção em células; TcII, os maiores valores para a cinética de crescimento e TcIII filogenéticamente próximo a TcV, grupo híbrido. A associação parasito-hospedeiro pode explicar diferenças biológicas e moleculares em cepas de T. cruzi, neste sentido o estudo de onze cepas isoladas de diferentes hospedeiros pode agregar informações a literatura e esclarecer alguns aspectos biológicos desse patógeno / Abstract: Trypanosoma cruzi, a protozoan from the family Trypanosomatidae, is responsible for Chagas disease which affects about 6 to 8 million people in Latin America. The origin of this family can be studied through molecular techniques, for instance the investigation of the region V7V8 ¿ SSurRNA. The protozoan is subdivided in six independents groups TcI-TcVI known as Discrete Typing of Units (DTUs). The biological and molecular characterization of eleven strains of T. cruzi from the group TcI (Bolivia; Tlenti; Tmelanocephala; SC90), TcII (Famema; SC96; SI8; Y) and TcIII (QMM3; QMM5; SI5) isolated from five different species of triatomine are able to elucidate biological factors through the kinetic growth, parasitemic curve, cell infection rate, molecular characterization, metalloproteinase action, proteic and serological profile. This investigation was conducted to provide a biological and molecular characterization of T. cruzi isolated from specimens of triatomines. The group TcII of T. cruzi demonstrated higher replicative capacity in epimastigotes forms during the kinetic growth curve, followed by TcI and TcIII. The parasitemic curve demonstrated variability between Balb/c mice; however, the groups TcI, TcII and TcIII showed equivalent parasitemic profile. Furthermore, the cell infection rate in J774 cellular lineages and peritoneal macrophages was used to corroborate the biological data. The group TcI of T. cruzi demonstrated higher infection rate and less time to amastigotes forms multiplication and the peritoneal macrophages showed more attractive to T. cruzi. The molecular characterization through the V7V8 region indicated that these strains belong to DTUs TcI, TcII and TcIII. The groups segregation is important to compare the proteic profile of epimastigotes and tripomastigotes forms of T. cruzi. The groups TcI presented more proteins in acrylamide gels, which can be associated with intra-specif of TcI. The metalloproteinase action was observed in epimastigotes and tripomastigotes forms, demonstrating active and stable presence at the parasite life cycle. The serological reactivity was proven in the groups TcI, TcII and TcIII through ELISA dilutions of 1/100 to 1/12.800. Moreover, the Western Blotting technique was added to SDS-PAGE experiments in infected animals¿ serum after 50 dias and the proteic profile of Y strain was observed in nitrocellulose membrane. The results demonstrated that these eleven strains of T. cruzi have differences between the groups of the parasite. The group TcI showed higher infection rate in cells; TcII, higher value for kinetic growth and TcIII is phylogenetically closer to TcV, which is a hybrid group. The association between parasite and host is able to explain the biological and molecular differences in T. cruzi strains; for this reason, the study of eleven strains isolated from different hosts can add information to the literature and clarify some of the biological aspects of the parasite / Doutorado / Parasitologia / Doutora em Parasitologia

A tripanossomíase ainda representa importante endemia nas Américas refletindo-se no sentido sócio-econômico onde é responsabilizada pelas taxas de aposentadoria precoce, como conseqüência direta da doença. As terapias até então utilizadas não promovem a cura total da doença além de provocarem efeitos colaterais danosos ao organismo do hospedeiro. É de conhecimento que os esteróides gonadais exercem profunda influência no curso das infecções, e no caso especifico da doença de Chagas, a orquiectomia leva a um estado de maior resistência do hospedeiro a \'Trypanosoma cruzi\'. O DHEA através de suas ações imuno-regulatórias promove o direcionamento da resposta celular do hospedeiro, que por sua vez é efetiva no controle da replicação de distintos patógenos como vírus, bactérias e protozoários. Portanto, a proposta do trabalho é inédita, pois avaliou o sinergismo entre a administração do DHEA e a orquiectomia no direcionamento da resposta imune do hospedeiro no decurso da infecção chagásica experimental em ratos Wistar machos infectados com a cepa y de \'T. cruzi\'. A parasitemia sofreu drástica redução para os grupos orquiectomizados e sujeitos a terapia com DHEA. Da mesma forma os parâmetros imunológicos analisados apresentaram aumento significante das concentrações de IFN-g, IL-12 e NO bem como do número de macrófagos. A histopatologia nos revelou que a orquiectomia e o tratamento com DHEA promoveram melhor reorganização do tecido cardíaco, bem como redução do número e tamanho dos ninhos de amastigotas existentes. Todos esses dados nos levam a crer que a ação sinérgica da terapia associada à orquiectomia promoveu direcionamento da resposta imune do tipo Th1 reduzindo os processos patológicos desencadeados pela infecção chagásica. / The ability of the gonadal hormones to influence and induce diverse immunological functions during the course of several parasitic infections has been extensively studied in the latest decades. Dehydroepiandrosterone and its sulphate are the most abundant steroid hormones secreted by the human adrenal cortex and are considered potent immune-activators. In this experiment, it was examined the effects of orchiectomy on the course of Trypanosoma cruzi infection in rats, treated and untreated with DHEA, by comparing blood and cardiac parasitism, macrophages number, Nitric Oxide and IFN-g levels. Orchiectomy led animals to enhanced resistance against infection by elevated number of macrophages, enhanced concentrations of NO and IFN-g and reduced amastigote burdens in heart when compared to control animals. DHEA replacement exerted a synergic effect, up-modulating the immune. Certainly male sex steroids play fundamental role in determining the fate of disease, through the regulation and modulation of the activity of the immune response.

A dehidroepiandrosterona (DHEA) tem sido considerada como o esteróide de múltiplas ações e vem interessando pesquisadores da área médica. Trabalhos demonstram a estimulação imunológica induzida pelo DHEA em animais de laboratório e humanos, como terapia alternativa e imunomoestimuladora nas infecções virais, bacterianas e parasitárias. O presente projeto avaliou os efeitos terapêuticos da administração de DHEA em ratos Wistar machos e fêmeas infectados com a cepa Y de Trypanosoma cruzi durante a fase aguda da infecção chagásica. Os parâmetros analizados foram o número de parasitas sangüíneos e teciduais, bem como produção de citocinas (TNF-, IFN-, IL-2, IL-12, IL-10, IL-4 e TGF-) e populações celulares (CD3+, CD4+ e CD8+), análise de glicose, colesterol e triglicérides, produção de anticorpos líticos, óxido nítrico, contagem global de leucócitos e macrófagos. Através dos resultados obtidos podemos concluir que o DHEA quando utilizado como tratamento na infecção chagásica experimental é parcilamente eficaz, pois reduz o número de parasitas sanguíneos e teciduais em ratos machos e fêmeas. Os diferentes parâmetros imunológicos analisados na vigência da terapia com DHEA revelou uma ação parcialmente efetiva sobre a resposta imunológica, o que favoreceu o controle da evolução da fase aguda da infecção experimental, deve ser levado em conta que a utilização deste hormônio não assume caráter curativo, apenas propicia melhores condições ao hospedeiro de direcionar sua resposta imunológica de forma a controlar a replicação parasitária, sem causar no hospedeiro os efeitos colaterais danosos ocasionados pelas drogas tripanossomicidas disponíveis atualmente no mercado. / Dehidroepiandrosterone (DHEA) has been considered for many researchers as the steroid of multiple functions. The immunologic stimulation triggered by DHEA has been demonstrated not only in animal models but also in humans. DHEA has been used as an alternative therapy to up-modulate immune response in host bearing viral, bacterial and parasitic infections. The present work evaluate the therapeutic effects of DHEA administration in male and female Wistar rats infected with the Y strain of T. cruzi during the acute phase of infection. The evaluated parameters were the blood and tecidual parasitic intensity, cytokines and cellular population, glucose analysis, cholesterol and triglycerides, percentage of lytic antibodies, nitric oxide, global counting of leukocytes and macrophages. DHEA, when used as a treatment of experimental T. cruzi infection is efficient; reducing the number of blood and tissue parasites of both genders. The therapy with DHEA demonstrated cellular and humoral immune stimulation for the control of the evolution of the acute phase. It has to be emphasized that DHEA therapy is not curative, but improves to the host immunological response to control the parasitic burden, without the harmful collateral effects caused by the available T. cruzi drugs in the market.

A replicação do DNA tem início nas origens de replicação que são licenciadas na transição das fases M/G1, pelo complexo de pré-replicação (CPR), e ativadas apenas na fase S. Existem diversas origens de replicação no genoma, mas apenas parte destas origens é disparada em diferentes momentos de S, havendo assim origens early (disparadas no início de S) e late (disparadas mais tardiamente). Em trypanosomas as origens de replicação são reconhecidas por um CPR formado por Orc1/Cdc6 e pelo complexo MCM2-7. Em T. cruzi observamos que existem dois mecanismos diferentes para controlar a replicação do DNA. Durante o ciclo celular da forma epimastigota, as proteínas do CPR são sempre expressas e ligadas ao DNA, mas durante o ciclo de vida Orc1/Cdc6 se liga ao DNA apenas nas formas que replicam, e Mcm7 não é expressa nas que não replicam. Também foi analisado o perfil das forquilhas de replicação em T. brucei utilizando a técnica de SMARD onde vimos que a velocidade da forquilha é semelhante a dos demais eucariontes, além de encontrarmos a primeira origem de replicação late. / The DNA replication starts at the origins of replication, which are licensed at M/G1 transition, by the pre replication complex (PRC), and are activated just at S phase. There are many origins of replication along genome, but some of them are fired at different moments of S phase. So there are early and late origins fired at the beginning or later in S phase, respectively. The PRC of trypanosomes is composed of Orc1/Cdc6 and Mcm2-7. We could observe that in T. cruzi there are two distinct ways to control DNA replication. Whereas in epimastigote cell cycle the PRC are expressed and bound to DNA in all phases, during T. cruzi life cycle Orc1/Cdc6 is bound to DNA only in replicative forms and Mcm7 is absent in the non-replicative forms. We also analyzed the fork profile in T. brucei through SMARD technique. We found that the speed of replication fork is similar from other eukaryotes and that different replication origins are fired every cell cycle. Finally, we found a new origin of replication that is the first late origin described in this organism.

O nosso grupo está explorando como alternativa para a identificação de novas estratégias de tratamento o reposicionamento de drogas. Nesse contexto, nosso laboratório mostrou que memantina, um antagonista de receptores de glutamato NMDA, apresenta uma atividade tripanocida no ciclo de vida do T. cruzi, in vitro. Com base nessas informações, avaliamos o efeito da memantina em animais infectados com a cepa Y. O tratamento apresentou uma redução da parasitemia (40%) no 8º dpi e redução da carga parasitária no tecido cardíaco no 15º dpi. Uma vez que a cepa Y invade preferencialmente macrófagos, avaliamos o efeito de memantina em células RAW 264.7. Memantina diminuiu a produção de NO por células estimuladas com LPS, diminuiu o Ca2+i, e não houve uma redução de EROs. Memantina também interferiu no ciclo intracelular do parasita, reduzindo o número de células infectadas. Nossos resultados sugerem que o tratamento com memantina pode direcionar o sistema imune de modo a modular os receptores de tipo NMDA, através de um efeito direto ou indireto produzido pelo tratamento. / The search for new therapeutic targets has been of extreme importance for the specific treatment of Chagas disease. Our group is exploring as an alternative, a strategy for drug repurposing. In this context, our laboratory showed that memantine, an antagonistic of NMDA glutamate receptors, has a trypanocidal activity along the life cycle of T. cruzi, in vitro. Based on this information, we evaluated the effect of memantine in animals infected with Y strain. The treatment showed a reduction of parasitemia (40%) in 8th dpi and reduced parasitic load in cardiac tissues at 15th dpi. As the Y strain preferably invades macrophages, we evaluated the effect of memantine in RAW 264.7 cells. Memantine decreased NO production by cells stimulated with LPS, decreased Ca2+i, and did not cause a reduction in ROS. Memantine also interfere with the intracellular parasite cycle, reducing the number of infected cells. Our results suggest that treatment with memantine can target the immune system to modulate the NMDA receptor, through direct or indirect effect caused by the treatment.

Foi demonstrado que a L-prolina é fundamental para o metabolismo das formas intracelulares de T.cruzi e está envolvida em processos de resistência a diferentes condições de estresse. O ácido L-tiazolidina-4-carboxílico (T4C) age como inibidor competitivo do transporte de prolina para o interior do parasita, desta forma, pode-se assumir que, quando aplicado como agente terapêutico simula uma situação de hipoprolinemia no hospedeiro mamífero. Sobre esta base, propomos que a prolinemia poderia estar relacionada com a severidade da infecção pelo T. cruzi, portanto, decidimos inverter o racional e obter nesse trabalho um modelo de hiperprolinemia. Inicialmente foi estabelecido um modelo murino de hiperprolinemia transiente. Camundongos da linhagem BALB/c que foram tratados com prolina, por via intraperitonial (i.p), em 30 minutos já apresentaram concentrações plasmáticas de 1,359 ± 0,121 mM, porém, após 3 horas seus níveis plasmáticos retornaram ao normal, 0,4361 ± 0,03496. Utilizando este modelo, foi avaliado o efeito da hiperprolinemia transiente em camundongos infectados pelo T.cruzi. Em três ensaios de um total de seis foi observado um aumento significativo da parasitemia em camundongos tratados, sem nenhuma diferença na mortalidade e na carga parasitária de diversos tecidos. Essa inconsistência observada no perfil da parasitemia redirecionou os experimentos para um modelo de hiperprolinemia hereditário previamente estabelecido. Interessantemente, foram observados diminuições na parasitemia, porém, a mortalidade foi aumentada. Foi hipotetizado que, diferentemente do que acontece com a hiperprolinemia transiente, com os níveis plasmáticos aumentados de maneira estável, as formas intracelulares de T.cruzi teriam acesso ao aminoácido em quantidades e tempo maiores. No entanto, não se pode descartar como hipótese complementar, que a hiperprolinemia possa afetar a resposta imune e por sua vez, imunossuprimir ou imunoestimular o hospedeiro mamífero. Por esse motivo, avaliaram-se alguns parâmetros da resposta imune ex vivo. Ensaios ex vivo mostraram que tratamento com prolina diminui a produção de NO sob ativação por LPS, no entanto quando células peritoneais não ativadas por LPS são infectadas por T. cruzi, o tratamento com prolina não altera o perfil de NO. A expressão gênica da óxido nítrico sintase induzível (iNOS) das células peritoneais diminui quando elas são cultivadas na presença de prolina, confirmando esses resultados. Mostrou-se dessa maneira que a hiperprolinemia pode interferir com a resposta imune do hospedeiro, o que levaria a uma eventual imunossupressão. Observou-se que, tanto células peritoneais infectadas como não infectados tratadas com prolina apresentam redução de seu volume celular o que poderia ser indício de sinal apoptótico. Ensaios de infecção (ex vivo) em células peritoneais de camundongos BALB/c com tripomastigotas da cepa MJL superexpressando o transportador de prolina apresentaram aumento da taxa de infecção enquanto que as infectadas por tripomastigotas da cepa Y superexpressando o mesmo transportador de prolina apresentaram diminuição da taxa de infeçção, quando comparadas aos controles, mostrando que a reposta de redução ou aumento da taxa de infecção ao tratamento com prolina é determinada também pela cepa de T. cruzi. Análises da prolinemia em soro de pacientes com sintomas de cardiopatia chagásica severa mostraram menores níveis de prolina sérica quando comparados aos controles (pacientes não infectados). Juntos, todos esses resultados colocam a prolina como um fator de severidade na infecção pelo T. cruzi. / It was shown that L-proline is essential for the metabolism of the intracellular forms of T. cruzi and is involved in resistance to different stress conditions. L-thiazolidine-4-carboxylic acid (T4C) acts as a competitive inhibitor of the proline transport to the inside of parasite, thus it can be assumed that when T4C is applied as a therapeutic agent simulates a hipoprolinemia situation in the mammalian host. On this basis, we propose that prolinemia could be related to the severity of T. cruzi infection, then, in this work we decided to reverse the rational and obtain a hyperprolinemia model. As a starting point, it was established a mouse transient hyperprolinemia model. BALB/c mice were intraperitoneally injected with proline showed an increased proline levels in sera after 30 min (1,359 ± 0,121 mM). However, these increased levels were diminished to normal levels after 3 h (0,4361 ± 0,03496 mM). Once established this model, was initially used to evaluate the effect of transient hyperprolinemia in mice infected by T.cruzi. In three out of six experiments an increase in parasitemia but not in mortality or in tissue parasite loads was observed. In the remaining three experiments no differences were detected. These inconsistencies directed the work to the search to a previously established hereditary model of mouse hyperprolinemia model. Interestingly, in this new model, a diminished parasitemia was recorded, however, mortality was higher. From this information it was hypothesized that, differently to what happens in the transient hyperprolinemia, a permanent hyperprolinemia exposes the T. cruzi infected cells (and so, the intracellular parasites) to higher concentrations of proline as well as for longer times. In addition, it cannot be disregarded the complementary hypothesis that hyperprolinemia could be affecting the immune response and, at the same time of its action on the parasite, it could be immunosupresing or immunostimulating the mammalian host. This possibility led us to evaluate some parameters of the immune response both, in vivo and ex vivo. Ex vivo assays showed that proline-treated LPS-activated peritoneal cells had a diminished production of NO while proline-treatment of T. cruzi infected, non-LPS-activated peritoneal cells did not affect their NO production. This data showed that hyperprolinemia could interfer the immune response leading the host to an eventual immunosupresion. In addition, both, infected and non-infected macrophages had their cellular volume diminished when treated with proline, which could be attributed to the iniciation of an apoptotic process. Infection assays (ex vivo) of perioneal cells from BALB/c mice with MJL strain trypomastigotes overexpressing a proline transporter had an increased infection rate, while the same type of cells infected with Y strain trypomastigotes overexpressing the same proline transporter showed a diminution in the infection rate. These results show that changes in the infection rate as a function of intracellular proline availability depends on T. cruzi strain. The analysis of prolinemia in patients serum with symptoms of Severe Chronic Chagasic Cardiopathy showed tat proline levels were diminished in comparison to control (non-infected patients). Taken together, these results prompt proline as a factor modulating the severity of T. cruzi infection.