Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Se estudió la presencia de Trypanosoma cruzi en roedores silvestres y cosmopolitas (reservorios del ciclo silvestre), en sectores de las comunas de Calera de Tango y Til-Til, ubicados a 16 y 59 Km. respectivamente de la ciudad de Santiago. Se capturó un total de 138 roedores incluyendo ejemplares de Octodon degus, Rattus rattus, Phyllotis darwini, Abrothrix olivaceus y Abrocoma bennetti. Se les extrajo 0,5 ml de sangre mediante punción cardiaca, con el objetivo de determinar la frecuencia de T. cruzi por medio de la reacción de la polimerasa en cadena (PCR). Las muestras fueron sometidas a extracción del ADN contenidas en ellas, amplificación y detección de la región hipervariable de los minicírculos del ADNk de T. cruzi. Con el fin de visualizar el producto de la amplificación, se sometieron a electroforesis en gel de agarosa y se observó en transiluminador de luz ultravioleta. Se detectó la presencia de T. cruzi en 19 (14,84%) de las 128 muestras, diez de R. rattus, (7,25%), siete de O. degus, (5,07%), y dos de P. darwini, (1,45%). Los ejemplares de A. olivaceus y A. bennetti resultaron negativos. Estos resultados demostraron la circulación del parásito en la comunidad de micromamíferos, de lo que se puede concluir que los triatominos usan la sangre de roedores (silvestres y sinantrópicos), como alimento lo que asegura el mantenimiento del ciclo silvestre y peridoméstico del parásito, en las zonas rurales estudiadas en el presente trabajo

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En cirugía ortopédica, el uso de factores tróficos que favorezcan la formación de tejido de granulación y eviten o retrasen la formación de nuevo hueso es deseable en resoluciones quirúrgicas de ciertas patologías en pequeños animales. Calreticulina (CRT) es una proteína chaperona que asegura el correcto plegamiento de proteínas y actúa en la regulación del metabolismo del calcio dentro del retículo endoplásmico (RE). Esta proteína ha sido localizada además fuera de la célula donde cumple variadas funciones, entre ellas, favorece la formación de tejido de granulación en piel y además, inhibe la formación de hueso. Es así como, en este estudio se evaluó y se comparó el efecto de CRT recombinante humana (rHuCRT) y parasitaria proveniente de Trypanosoma cruzi (rTcCRT) sobre la regeneración ósea, mediante liberación controlada desde una esponja de quitosano al interior de una lesión circular en hueso cortical de conejo. rHuCRT y rTcCRT demostraron inhibir la regeneración ósea in vivo, sin embrago, rTcCRT demostró ser más eficaz en esta función que su contraparte humana / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 3100021

Memoria para optar al título de Bioquímico / El agente etiológico de la enfermedad de Chagas es el parásito hemoflagelado Trypanosoma cruzi (T. cruzi). Esta enfermedad posee un carácter endémico en América Latina y se estima un promedio de 8 millones de personas infectadas. El ciclo de vida de T. cruzi involucra insectos vectores y mamíferos hospederos, en los cuales se diferencia en tres formas celulares finales: epimastigote (extracelular y replicativa) presente en los vectores triatominos; tripomastigote (extracelular no replicativa e infectiva) que se encuentra tanto en insectos vectores como en hospederos mamíferos; y amastigote (intracelular y replicativa) presente en hospederos mamíferos. En ambos hospederos, T. cruzi se encuentra sometido a la acción de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (ROS/RNS) que dañan su DNA. No obstante, el parásito sobrevive a la acción del estrés oxidativo. En la mayoría de los eucariontes, el daño oxidativo al DNA es reparado principalmente por la vía de reparación por escisión de bases (BER), proceso conservado en el que participan una serie de proteínas con actividad enzimática, siendo fundamentales las endonucleasas apurínicas/apirimidínicas (endonucleasas AP). En el genoma de T. cruzi se identificó la secuencia de la endonucleasa AP TcAP1, homóloga al endonucleasa AP de humano (APE1). Se demostró que la sobrexpresión de esta enzima incrementa la viabilidad de epimastigotes y tripomastigotes expuestos a ROS/RNS y que la inhibición de la actividad de TcAP1 genera el efecto opuesto; es decir, disminuye la viabilidad de los parásitos tratados con agentes oxidantes. Actualmente, se sabe que APE1 humana se relaciona directamente con otras enzimas de la vía BER y modula la expresión de proteínas que participan de otras vías de reparación del DNA. Hasta el momento no se ha determinado si TcAP1 se asocia a otras proteínas, como ocurre con su ortóloga APE1 en humanos. En esta memoria de título se propuso generar herramientas que permitan a futuro identificar las proteínas parasitarias asociadas a la endonucleasa TcAP1 de T. cruzi, las cuales podrían modular o ser moduladas por ella. Para tales efectos, se diseñaron dos construcciones plasmidiales (pTREX-(ha)3-(flag)3-tcap1 y pTREX-cmyc-tcap1) con el objetivo de generar proteínas de fusión de TcAP1 asociadas a diferentes epítopes ((HA)3-(FLAG)3 o c-Myc). Estos vectores de expresión se transfectaron en XIepimastigotes de la cepa Y de T. cruzi, los que se seleccionaron con el antibiótico G-418. Solo se obtuvieron epimastigotes transfectantes que expresaron la proteína de fusión N-cMyc-TcAP1, evidenciado mediante ensayos de Western blot. Utilizando un kit comercial (anti-cMyc), se realizaron ensayos de inmunoprecipitación sobre homogeneizados de proteínas totales obtenidas desde los epimastigotes transfectantes que expresan N-cMyc-TcAP1 y epimastigotes control no transfectados. Las proteínas obtenidas se separaron mediante electroforesis bidimensional en condiciones desnaturantes con el objetivo de evidenciar patrones electroforéticos diferenciales entre parásitos transfectantes y controles. Las proteínas detectadas de manera exclusiva para los parásitos transfectantes se enviaron a identificar mediante espectrometría de masa, sin embargo, no se obtuvieron resultados concluyentes. A pesar de los problemas presentados, esta memoria de título presenta una gran relevancia para nuestro laboratorio, ya que permitió generar herramientas para la futura identificación de proteínas reguladoras de la actividad de TcAP1 o que son reguladas por ella / The etiologic agent of Chagas disease is the hemoflagellate parasite Trypanosoma cruzi (T. cruzi). This disease is endemic in Latin America and an estimated 8 million people are infected. The life cycle of T. cruzi involves triatomine insect vectors and mammalian hosts, in which it differs in three final cellular forms: epimastigote (extracellular and replicative) present in triatomine vectors; trypomastigote (non-replicative and infective extracellular form) found in both, insect vectors and mammalian hosts; and amastigote (intracellular and replicative) present in mammalian hosts only. Inside both hosts, T. cruzi is exposed to reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS) that damage the parasite DNA, however the parasite survives. In most eukaryotes, oxidative DNA damage is repaired mainly by the base excision repair pathway (BER), a conserved mechanism, in which a series of proteins with enzymatic activity participate, being apurinic/apyrimidinic endonucleases (AP endonuclease) essential to this process. In the T. cruzi genome the nucleotide coding sequence for an AP endonuclease (TcAP1), homologous to human AP endonuclease (APE1), was identified. In previous reports it has been demonstrated that the overexpression of this enzyme in T. cruzi, increases the viability of epimastigotes and trypomastigotes exposed to ROS/RNS and that the inhibition of TcAP1 activity generates the opposite effect, decreasing the parasite viability. Currently, human APE1 is known to directly interact with other enzymes of the BER pathway and modulates the expression of proteins involved in other DNA repair pathways. To date, it has not been determined whether T. cruzi TcAP1 is associated with other proteins, similar to those reported for APE1 ortholog human protein. In this work, it was proposed to generate tools that allow the future identification of parasitic proteins that interacts with the TcAP1 endonuclease, which could modulate their activity or or proteins that modulate their activity product of its interaction with TcAP1. For this purpose, two plasmid constructs (pTREX-(ha)3-(flag)3-tcap1 and XIIIpTREX-cmyc-tcap1) were designed with the aim of generating TcAP1 fusion proteins associated with different tags ((HA)3-(FLAG)3 or c-Myc). These expression vectors were transfected into epimastigotes of the T. cruzi Y strain, which were selected with the G-418 antibiotic. Only transfectant epimastigotes expressing the N-cMyc-TcAP1 fusion protein, evidenced by Western blot assays, were obtained. Using a commercial kit (anti-cMyc), immunoprecipitation assays were performed on total protein homogenates obtained from transfectant epimastigotes expressing N-cMyc-TcAP1 and untransfected control epimastigotes. The proteins obtained were separated by two-dimensional electrophoresis under denaturing conditions with the aim of evidencing differential electrophoretic patterns between transfectant and control parasites. The proteins exclusively detected for the transfectant parasites were sent to be identified by mass spectrometry. However, these could not be identified. Despite the presented problems, this title memory presents a great relevance for our laboratory, since it allowed to generate tools for the future identification of proteins that interacts with the TcAP1 enzyme

Orientador: Jussara Marcondes-Machado / Resumo: Não disponível. / Abstract: Not available. / Doutor

Made available in DSpace on 2015-12-06T22:54:33Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A imunização genética com um DNA plasmidial, contendo o gene que codifica a proteína 2 da superfície de amastigotas (ASP-2), é capaz de proteger parte dos camundongos altamente suscetíveis A/Sn contra uma infecção letal pelo Trypanosoma cruzi. Com base neste resultado, a hipótese central desta tese foi a de que se poderia melhorar racionalmente a eficácia da vacinação contra a infecção experimental pelo T. cruzi, utilizando diferentes formulações vacinais e/ou esquemas de vacinações. Para tal, empregaram-se protocolos de imunização e reforço homólogo ou heterólogo, usando DNA plasmidial, proteínas recombinantes, e vírus recombinantes da ASP-2 de T. cruzi. Inicialmente, testou-se se o reforço heterólogo com a proteína ASP-2 recombinante aumentava a eficácia da vacinação com o DNA plasmidial (pIgSPCl.9). Este protocolo não se mostrou mais eficaz, mas abriu a possibilidade de que a imunização com a proteína ASP-2 recombinante pudesse ser utilizada como um protocolo vacinal alternativo. Com esta abordagem, descreveu-se que a administração de 3 doses de uma proteína recombinante (GST-P4P7), representando os aminoácidos 261-500 da ASP-2 em fusão com a glutationa S-transferase, na presença dos adjuvantes alum e CpG ODN 1826, era capaz de induzir altos níveis de proteção. Neste modelo experimental, observou-se que a imunidade protetora foi de longa duração e dependente dos linfócitos CD8 específicos para o epítopo imunodominante TEWETGQI. Determinou-se também que o adjuvante CpG ODN 1826 melhorou a eficácia da imunidade protetora, e que linfócitos T CD4 específicos são importantes para a indução dos linfócitos CD8 protetores. Como o protocolo de vacinação com a proteína recombinante GST-P4P7 exigia o uso de três doses, testou-se então a possibilidade de que um adenovírus recombinante, expressando a ASP-2 (AdASP-2), pudesse ser utilizado num protocolo de imunização e reforço homólogo ou heterólogo (somente duas doses). Na comparação dos protocolos de vacinação homólogos ou heterólogos com pIgSPCl.9 e AdASP-2, observou-se que, nos animais A/Sn, tanto a imunização homóloga quanto a heteróloga, usando o AdASP-2, proporcionaram um alto grau de imunidade protetora contra a infecção pelo T. cruzi. Os estudos utilizando o protocolo heterólogo (pIgSPCl.9 seguido por AdASP-2), que protege 80-100% dos camundongos, mostraram que a imunidade era de longa duração e dependente dos linfócitos T CD4 e CD8. Esta imunidade protetora se correlacionou com a atividade citotóxica específica in vivo, antes do desafio com o T. cruzi. Com base nestes resultados, analisou-se a imunidade protetora após a vacinação heteróloga em camundongos com deficiência de um importante mediador da citotoxicidade, a perforina. Os animais deficientes (KO) da expressão de perforina vacinados se mostraram suscetíveis à infecção experimental. Uma análise da resposta imune celular destes camundongos mostrou que eles apresentavam uma menor produção de IFN-γ por esplenócitos re-estimulados in vitro, na presença do antígeno recombinante. Na análise dos linfócitos T CD8 específicos observou-se que havia: i) uma expansão numérica normal; ii) uma redução numérica significativa dos linfócitos multifuncionais, capazes de expressar simultaneamente IFN-γ/CD107a e IFN-γ/TNF-α.; iii) baixa citotoxicidade in vivo; iv) baixa expressão de CD44 e de KLRG-1. Por fim, para definir a importância relativa do IFN-γ e da citotoxicidade na proteção contra a infecção pelo T. cruzi após a vacinação heteróloga, camundongos IFN-γ KO foram imunizados com pIgSPCl.9 seguido por AdASP- 2. Estes animais apresentaram um alto grau de citotoxicidade in vivo, mas nenhuma imunidade protetora detectável. Em resumo, ao longo deste trabalho obtiveram-se evidências que confirmam a hipótese inicial de que, utilizando diferentes formulações vacinais e/ou esquemas de vacinações, se poderia melhorar racionalmente a eficácia da vacinação contra a infecção experimental pelo T. cruzi. Pela utilização de depleções in vivo e de animais geneticamente deficientes, definiu-se a importância dos linfócitos T CD4 e CD8, da perforina e do IFN-γ na imunidade gerada pela vacinação com a ASP-2 de T. cruzi. Acredita-se que os dados obtidos no decorrer desta tese serviram para: i) uma melhor compreensão dos mecanismos imunológicos de resistência à infecção pelo T. cruzi e dos seus antígenos alvos; ii) o desenvolvimento de vacinas recombinantes contra infecções por protozoários intracelulares em geral e, especificamente, contra a doença de Chagas; iii) o desenvolvimento de vacinas recombinantes capazes de induzir uma potente resposta imune mediada por linfócitos T. / Genetic immunization with plasmidial DNA containing the gene encoding the amastigote surface protein 2 (ASP-2) protects part of the highly susceptible A/Sn mice against a lethal challenge with Trypanosoma cruzi. Based on these results, in this thesis, we tested the hypothesis that the efficacy of the vaccination against T. cruzi experimental infection could be rationally improved by the use of different vaccine formulations and/or vaccinations strategies. For that purpose, we employed homologous or heterologous priming and boosting strategies, with plasmidial DNA, recombinant proteins, and adenovirus expressing T. cruzi ASP-2. Initially, we tested whether boosting with a recombinant protein of ASP-2 could improve the efficacy of the priming vaccination with plasmidial DNA (pIgSPCl.9). This protocol was not more efficient, but opened the possibility that the immunization with the recombinant protein could be used as an alternative vaccine strategy. Using this approach, we described that the administration of 3 doses of a recombinant protein representing the amino acids 261-500 of ASP-2 in fusion o the gluthatione Stransferase (GST-P4P7), in the presence of the adjuvants alum and CpG ODN 1826, was capable of eliciting high levels of protective immunity. In this experimental model, protective immunity was: i) long-lasting; and ii) dependent on the effector CD8 T lymphocytes specific for the immunodominant epitope TEWETGQI. We also established that the adjuvant CpG ODN 1826 improved the efficacy of protective immunity, and that CD4 T lymphocytes were important for the induction of protective CD8 T cells. Because the vaccination strategy employing the recombinant protein GST-P4P7 required 3 doses, we tested the possibility that a recombinant adenovirus expressing ASP-2 (AdASP-2) could be used in a homologous or heterologous priming and boosting protocol with two doses only. By comparing homologous or heterologous priming and boosting with pIgSPCl.9 and AdASP- 2, we found that homologous or heterologous immunizations with AdASP-2 led to a high degree of protective immunity against T. cruzi infection, in highly susceptible A/Sn mice. Follow up studies using the heterologous priming and boosting strategy (pIgSPCl.9 followed by AdASP-2), which protects 80-100% of the mice, showed that protective immunity was long-lived and dependent on the activation of CD4 or CD8 T cells. Protective immunity correlated with antigenspecific in vivo cytotoxic activity prior to the challenge with T. cruzi. Based on this observation, we evaluated the protective immunity following the heterologous vaccination in mice genetically deficient for an important mediator of cytotoxicity, perforin. Vaccinated perforin knock-out (KO) mice were extremely susceptible to the experimental infection. The analyses of the immune response of these mice showed that their splenocytes produced less IFN-γ when re-stimulated in vitro with recombinant antigen. Analysis of specific CD8 T lymphocytes showed: i) a normal numeric expansion; ii) a significantly lower frequency of polyfunctional cells expressing simultaneously IFN-γ/CD107a or IFN-γ/TNF-α.; iii) lower in vivo cytotoxicity; iv) lower expression of CD44 and KLRG-1. Finally, to define the relative importance of IFN-γ and cytotoxic T lymphocytes in the protection against T. cruzi infection following heterologous vaccination, IFN-γ KO mice were immunized with pIgSPCl.9 followed by AdASP-2. These mice developed a high level of in vivo cytotoxicity, but no detectable protective immunity. In summary, during this work we gathered evidences that confirmed our initial hypothesis that we could rationally improve the efficacy of vaccination against T. cruzi experimental infection using different vaccine formulations and/or vaccination strategies. Using in vivo depletions and KO mice, we defined the importance of CD4 cells, CD8 cells, perforin and IFN-γ during immunity generated by vaccination with ASP-2 of T. cruzi. We believe that our findings will provide: i) a better understanding of the immunologic mechanisms and the target antigens during the resistance to T. cruzi infection; ii) to aid the development of recombinant vaccines against intra-cellular parasitic protozoan infections in general and Chagas’ disease, specifically; iii) to aid the development of recombinant vaccines capable of eliciting potent immune response mediated by T lymphocytes. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Este estudio fue desarrollado para investigar los mecanismos de reducción y reactividad de una nueva familia 5-Nitroindazoles. Estos compuestos poseen actividad radicalaria a partir de su grupo nitro, razón por la cual son candidatos a presentar una posible actividad tripanocida. Para evaluar esta capacidad tripanocida se recurrió a técnicas voltamperometricas y espectroscópicas además de un estudio biológico de toxicidad sobre parásitos. La formación del anión radical nitro fue estudiada por medio de voltametría cíclica, donde se determinó un mecanismo electrónico simple caracterizado por un par redox único dando como resultado una reacción cuasireversible. Además a través de la misma técnica se evaluó el efecto de un antioxidante natural, como es glutatión, sobre la generación radicalaria. También se utilizó la espectroscopía de espín electrónica para caracterizar los radicales generados, donde se determinó un patrón hiperfino común para toda la serie de compuestos. Por último se recurrió a un estudio biológico de toxicidad realizado en células murinas y parásitos epimastigotes, mostrando variados resultados en la serie, por lo que se recurrió a una fase exploratoria para determinar aquellos que poseían mayores facultades como agentes tripanocidas.

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-10-02T15:19:11Z No. of bitstreams: 1 Michelle Casal Fernandes.pdf: 12707205 bytes, checksum: 040075e6235acdaf47b50c64d61e086a (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-02T15:19:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Michelle Casal Fernandes.pdf: 12707205 bytes, checksum: 040075e6235acdaf47b50c64d61e086a (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, representa um sério problema de Saúde Pública na América Latina, cujo tratamento clínico é insatisfatório. Nesse contexto, muitos esforços têm sido dirigidos para o desenvolvimento de novas drogas visando o tratamento desta doença negligenciada. Na medicina popular, produtos naturais ricos em naftoquinonas têm sido utilizados no combate de diferentes doenças parasitárias. Nosso grupo vem investigando a atividade de naftoquinonas e derivados sobre formas tripomastigotas de T. cruzi. No presente estudo, dentre 32 hidroxinaftoquinonas que tiveram sua atividade tripanocida avaliada, o composto 1C foi o mais ativo (IC50/24h=77,3 ±6,8 μM). Estudos prévios do nosso grupo com outra classe de derivados de naftoquinonas apontaram para a naftoquinona triazólica (NT) como um composto promissor, sendo esta mais ativa que a droga padrão benznidazol. Nesta dissertação, o mecanismo de ação de NT foi estudado, sendo observados danos ultraestruturais em epimastigotas como a ruptura dos reservosomos, blebbing da membrana flagelar, desorganização do Golgi, aparecimento de estruturas membranares concêntricas no citosol e parasitos anormais com múltiplos flagelos. Diferentemente do tratamento com outras naftoquinonas, NT não induziu alterações na mitocôndria, dado este confirmado pela análise do potencial de membrana mitocondrial (Δm) por citometria de fluxo. Pela mesma técnica, ainda foram demonstrados o efeito de NT no bloqueio da mitose e no aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs). O principal fenótipo induzido pelo tratamento com essa naftoquinona foi o aparecimento de perfis de retículo endoplasmático envolvendo organelas, que juntamente com o aumento da marcação com monodansilcadaverina (MDC) observado, sugere a autofagia como parte do mecanismo de ação tripanocida da NT. O T. cruzi apresenta-se em três diferentes formas evolutivas e durante seu ciclo de vida é exposto a condições físico-químicas adversas como variações no pH e escassez de nutrientes. A avaliação do efeito de tais condições se constituiu em um dos objetivos deste estudo. Análises por citometria de fluxo demonstraram que epimastigotas submetidos a estresse de pH e escassez nutricional apresentaram um aumento na produção de EROs, sendo também observada uma queda do Δm apenas após estresse de pH. A microscopia eletrônica de transmissão revelou um inchaço mitocondrial com desorganização das cristas, presença de estruturas membranares concêntricas citosólicas e no interior de organelas, perfis de retículo endoplasmático envolvendo estruturas subcelulares, perda de eletrondensidade dos reservosomos com invaginação da sua membrana e intensa vacuolização citoplasmática. Estes fenômenos característicos de autofagia, reforçados pela ausência de ruptura de membrana plasmática, de fragmentação do DNA e pelo aumento na marcação de MDC, indicam que esta via participa da resposta do protozoário aos diferentes tipos de estresses induzidos. / Chagas’ disease, caused by the protozoa Trypanosoma cruzi, represents a severe Public Health problem in Latin America, being its clinical treatment unsatisfactory. In this framework, several efforts have been directed for the development of novel drugs for the treatment of this negllected disease. In the folk medicine, natural products containing naphthoquinones have been employed for the treatment of different parasitic illnesses. Our research group has been investigating the activity of naphthoquinones and derivatives against T. cruzi bloodstream trypomastigotes. In the present study, among 32 hydroxinaphthoquinones, evaluated for their trypanocidal activity, compound 1C was the most effective (IC50/24h=77,3 ± 6,8 μM). Previous studies by our group with another naphthoquinones class of derivatives, pointed to the triazolic naphthoquinone (NT) as a promising compound, being more active than the reference drug benznidazol (IC50/24h=103,6 ± 0,6 μM). In this work, the mechanism of action of NT was also studied, being many ultrastructural damage described in epimastigotes such as the rupture of the reservosomes membrane, blebbing in the flagellar membrane, Golgi disruption, the formation of concentric membranous structures in the cytosol and the appearance of abnormal parasites with multiple flagella. Differently from the treatment with other naphthoquinones, NT did not induce mitochondrial alterations, data confirmed by mitochondrial membrane potential (Δm) by flow cytometry. By the same technique, it was also demonstrated the effect of NT on mitosis blockage and in the increase in reactive oxygen species (ROS) production. The main phenotype induced by the treatment with this naphthoquinone was the appearance of endoplasmic reticulum profiles surrounding organelles associated with the increase in monodansylcadaverine (MDC) labeling observed, suggests that autophagy is involved in the trypanocidal effect of NT. T. cruzi presents three different evolutive forms, and during its life cycle is exposed to adverse physico-chemical conditions such as pH variation and the shortage of nutrients, being the evaluation of the effect of these conditions one of the goals of this study. Flow cytometric analysis demonstrated that epimastigotes submitted to pH stress and nutritional scarcity presented an increase in ROS generation, being also observed a decrease in Δm detected only after the pH stress. The transmission electron microscopy revealed the mitochondrial swelling with crists disorganization, the formation of membranous concentric structures in the cytosol or inside organelles, the appearance of endoplasmic reticulum profiles surrounding subcellular structures, loss of reservosome electrondensity with the invagination of its membrane, and the intense citoplasmic vacuolization. Such characteristic phenomena of autophagy, reinforced by the absence of the plasma membrane rupture, DNA fragmentation and increase in MDC labeling, indicate that this pathway participates in the protozoa response to different types of induced stresses.

MAIA, Allan Rodrigo Soares. Detecção do DNA de Trypanosoma cruzi por PCR-MULTIPLEX em sangue de pacientes com suspeita de doença de chagas crônica e em dejetos de triatomíneos utilizados para xenodiagnóstico. 2012. 132 f. Dissertação (Mestrado em Patologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2012. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-05-10T13:57:06Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_arsmaia.pdf: 16319469 bytes, checksum: 8f535bd4a6023cd28e1ae58d18a5c058 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2013-05-16T13:39:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_arsmaia.pdf: 16319469 bytes, checksum: 8f535bd4a6023cd28e1ae58d18a5c058 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-16T13:39:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_arsmaia.pdf: 16319469 bytes, checksum: 8f535bd4a6023cd28e1ae58d18a5c058 (MD5) Previous issue date: 2012 / A doença de Chagas é causada pelo parasito intracelular Trypanosoma cruzi e afeta em torno de 17 milhões de pessoas na América Latina. A fase crônica da doença caracteriza-se por baixo nível de parasitemia e alto nível de anticorpos Anti-T.cruzi e o diagnóstico é feito preferencialmente utilizando-se métodos sorológicos, incluindo imunofluorescência indireta (IFI), hemaglutinação indireta (HAI) e imunoensaio enzimático (ELISA). São testes que apresentam alta sensibilidade, mas sofrem de baixa especificidade, e um variável número de indivíduos apresenta testes sorológicos inconclusivos. Nos últimos anos, muitos estudos têm usado a tecnologia da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para detectar sequências de DNA de T. cruzi em sangue de pacientes chagásicos crônicos. A alta especificidade da PCR tem apontado para sua aplicação como método confirmatório no diagnóstico de pacientes com provas sorológicas inconclusivas. O objetivo desse trabalho foi realizar uma análise comparativa entre a PCR e os métodos convencionais mais utilizados para o diagnóstico - sorologia e xenodiagnóstico, na detecção da infecção por T. cruzi, em indivíduos com doença de Chagas crônica. Sangue de 67 pacientes chagásicos crônicos, ambos os sexos, provenientes do ambulatório de doença de Chagas do Hospital Universitário Walter Cantídio, da Universidade Federal do Ceará, foram avaliados para T. cruzi, utilizando testes sorológicos (IFI, HAI e ELISA), PCR-Multiplex e xenodiagnóstico. Além disso, foi avaliado também a PCR-Multiplex em dejetos de triatomíneos provenientes do xenodiagnóstico destes pacientes. De acordo com o resultado dos testes sorológicos, os pacientes foram classificados em 3 grupos: 1°. Sorologia positiva (quando 2 ou 3 resultados dentre os 3 testes sorológicos foram positivos), 2°. Sorologia inconclusiva ou indeterminado (apenas 2 resultados foram negativos) e 3°. Sorologia negativa (quando os 3 resultados foram negativos). Dentre as 59 amostras com sorologia positiva foram obtidos 18 (30,5%) resultados positivos de PCR-Multiplex em sangue periférico e 41 (69,5%) resultados negativos. Nos PCR-Multiplex em dejetos de triatomíneos foram obtidos 20 (33,9%) resultados positivos e 39 (66,1%) resultados negativos. As 2 amostras com sorologia inconclusiva foram negativas na PCR-Multiplex, tanto em sangue periférico como em dejetos de triatomíneos. As amostras com sorologia negativa (n=6) apresentaram 2 resultados positivos (33,3%) na PCR-Multiplex em sangue e 4 resultados negativos (66,7%). Nos dejetos de triatomíneos, as 6 amostras com sorologia negativa foram negativas na PCR-Multiplex. Estes resultados mostraram que o ensaio da PCR-Multiplex em amostras de sangue periférico e em dejetos de triatomíneos, empregando iniciadores para regiões diferentes, no caso, DNA nuclear e DNA do cinetoplasto, podem ser aplicados para o diagnóstico da doença de Chagas crônica (mesmo com diferentes metodologias de extração de DNA total). Os dados mostraram também que a PCR-Multiplex em dejetos de triatomíneos é mais sensível que o ensaio do xenodiagnóstico.

CANUTO, J. A. Efeitos da Violaceína sobre as formas evolutivas de Trypanosoma cruzi. 2016. 78 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-06-13T12:12:37Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_jacanuto.pdf: 1383413 bytes, checksum: 294fb79f391911aa314db8d5184e0e10 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-06-13T12:12:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_jacanuto.pdf: 1383413 bytes, checksum: 294fb79f391911aa314db8d5184e0e10 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-13T12:12:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_jacanuto.pdf: 1383413 bytes, checksum: 294fb79f391911aa314db8d5184e0e10 (MD5) Previous issue date: 2016-02-19 / The World Health Organization estimates that about 7 to 8 million people are infected with Trypanosoma cruzi in the world. Treatment of Chagas disease has limited efficacy and side effects that limit tolerability and patient compliance. The search for new therapeutic alternatives from bioactive substances has grown significantly in recent years. Violacein (VIO), a bacterial pigment produced by Chromobacterium violaceum has shown several biological actions, among them, antiulcer action, antitumor, antiviral, and antiparasitic. In this paper, we studied the effects of VIO on the evolutionary forms of Trypanosoma cruzi. Epimastigotes were cultured in LIT at 28 ° C in the presence of VIO (0.97; 1.9; 3.9; 7.8; 15.62; 31.25; 62.5; 125; 250 ; 500; 1000μM) for 24, 48 and 72 hours. The trypomastigotes were obtained after infection in LLC-MK2 cells resuspended in DMEM 2% FBS and incubated with VIO (0.97; 1.9; 3.9; 7.8; 15.62; 31,25μM ) for 24h. amastigotes were cultivated on circular coverslips within culture plates containing LLC-MK2 cells and treated with violacein (4.97 and 9.94 mM). Cytotoxicity on LLC-MK2 mammalian cells was assessed using the MTT reduction assay, after incubation with VIO (3.9; 7.8; 15.62; 31.25; 62.5; 125; 250; 500μM ) for 24h. The evaluation of the process of cell death was made from the marking epimastigotes with 7AAD and Annexin V-PE after treatment with VIO (51.39 and 102,78μM). To determine the production of reactive oxygen species, epimastigotes were incubated with VIO (51.39 and 102,78μM). In determining the effect on the mitochondrial membrane potential, it was used Rhodamine 123 marker in epimastigotes treated with VIO (102,78μM). In epimastigotes, the substance showed trypanocidal action, with IC50 value of 51.39; 104.7 67,78μM and 24, 48 and 72h of treatment, respectively. In trypomastigotes, the IC 50 was 4,97μM in 24 hours. The analysis of amastigotes reduced the percentage of infected cells and the survival rate of these, at 24 and 48 hours at concentrations of 4.97 and 9.94 uM. In determining the cytotoxic effect on LLC-MK2, there was obtained an IC50 of 47,91μM. The analysis of the mechanisms of cell death allowed to infer that the VIO cause death in parasites predominantly by apoptosis. It was observed the production of reactive oxygen species (ROS), which can contribute to the aforementioned type of death. It was also observed a reduction in the mitochondrial membrane potential in the treated groups. All experiments were performed in triplicate (n = 3). For comparison of the experimental groups, the ANOVA was used, with post-test Dunnett, using p <0.05 as significance criterion. Thus, VIO presented trypanocidal effects on all of the evolutionary cycle of the parasite forms, suggesting involvement of reactive oxygen species and changes in mitochondrial membrane potential in the process of cell death by apoptosis. / A Organização Mundial de Saúde estima que aproximadamente 7 a 8 milhões de pessoas encontram-se infectadas pelo Trypanosoma cruzi no mundo. O tratamento da doença de Chagas apresenta eficácia limitada e efeitos colaterais que limitam a tolerabilidade e a adesão dos pacientes. A busca de novas alternativas terapêuticas a partir de substâncias bioativas cresceu bastante nos últimos anos. A violaceína (VIO), um pigmento bacteriano produzido por Chromobacterium violaceum tem mostrado diversas ações biológicas, dentre elas, ações antiulcerogênica, antitumoral, antiviral e antiparasitária. No presente trabalho, estudamos os efeitos da VIO sobre as formas evolutivas do Trypanosoma cruzi. As formas epimastigotas foram cultivadas em meio LIT, a 28°C, na presença de VIO (0,97; 1,9; 3,9; 7,8; 15,62; 31,25; 62,5; 125; 250; 500; 1000μM) por 24, 48 e 72h. As formas tripomastigotas, foram obtidas após infecção em células LLC-MK2, ressuspensas em meio DMEM 2% de SBF e incubadas com VIO (0,97; 1,9; 3,9; 7,8; 15,62; 31,25μM) por 24h. Formas amastigotas foram cultivadas em lamínulas circulares no interior de placas de cultura contendo células LLC-MK2 e tratadas com violaceína (4,97 e 9,94 μM). A citotoxicidade sobre células de mamíferos LLC-MK2 foi avaliada por meio do ensaio de redução do MTT, após incubação com VIO (3,9; 7,8; 15,62; 31,25; 62,5; 125; 250; 500μM) por 24h. A avaliação do processo de morte celular foi feita a partir da marcação de formas epimastigotas com 7AAD e Anexina V-PE após tratamento com VIO (51,39 e 102,78μM). Para a determinação da produção de espécies reativas de oxigênio, formas epimastigotas foram incubadas com VIO (51,39 e 102,78μM). Na determinação do efeito sobre o potencial de membrana mitocondrial, foi utilizado o marcador Rodamina 123 em formas epimastigotas tratadas com VIO (102,78μM). Em formas epimastigotas, a substância demonstrou ação tripanocida, com valor de CI50 igual a 51,39; 104,7 e 67,78μM em 24, 48 e 72h de tratamento, respectivamente. Em formas tripomastigotas, a CI50 foi de 4,97μM em 24h. A análise sobre formas amastigotas reduziu o percentual de células infectadas e o índice de sobrevivência destes, nos tempos de 24 e 48h, nas concentrações de 4,97 e 9,94 μM. Na determinação do efeito citotóxico sobre LLC-MK2, obteve-se uma CI50 de 47,91μM. A análise dos mecanismos de morte celular permitiu inferir que a VIO causa morte nos parasitos predominantemente por apoptose. Foi observado a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), que podem contribuir para o tipo de morte supracitado. Foi ainda observada a redução do potencial de membrana mitocondrial nos grupos tratados. Todos os experimentos foram realizados em triplicata (n=3). Para comparação dos grupos experimentais, foi utilizado o teste estatístico ANOVA, com pós-teste de Dunnet, utilizando p<0,05 como critério de significância. Dessa forma, a VIO apresentou efeitos tripanocida em todas as formas do ciclo evolutivo do parasito, sugerindo envolvimento de espécies reativas de oxigênio e alterações no potencial de membrana mitocondrial no processo de morte celular por apoptose.

MENEZES, R. R. P. P. B. Efeito tripanocida do (-)-alfa-bisabolol sobre a cepa y de Trypanosoma cruzi. 2017. 140 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-06-22T13:04:55Z No. of bitstreams: 1 2017_tese_rrppbmenezes.pdf: 4168282 bytes, checksum: 729abccf6685a2e429ae740a5713d070 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-06-22T13:05:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_tese_rrppbmenezes.pdf: 4168282 bytes, checksum: 729abccf6685a2e429ae740a5713d070 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-22T13:05:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_tese_rrppbmenezes.pdf: 4168282 bytes, checksum: 729abccf6685a2e429ae740a5713d070 (MD5) Previous issue date: 2017 / Chagas disease is a major public health problem, and the drugs available possess limited efficacy and great toxicity. In this way, there is a pungent need of new drugs. The aim of this work was to evaluate the trypanocidal effect of (-)-α-bisabolol (BIS) over the life forms of Trypanosoma cruzi and investigate its selectivity and mechanism of action. BIS cytotoxicity over mammalian cells was evaluated over LLC-MK2 cells, using MTT assay. BIS caused cytotoxic effect only at 1000 and 500 µM, with CC50 = 528 ± 34 µM. Then the antiparasitic effect was investigated over epimastigote, which demonstrated a progressive and time- and concentration-dependent effect, with IC50/24h = 285 ± 20 µM; IC50/48h = 144.7 ± 8.6 µM; IC50/72h = 97.33 ± 3.25 µM; e IC50/96h = 59.8 ± 4.5 µM. Over trypomastigotes, BIS caused effect at all tested concentrations, with LC50 = 20 ± 3.84 µM. Using CC50 and LC50 values, selectivity index was estimated at 26.5. BIS also presented antiamastigote activity, with decrease on the percentage of infected cells, the number of amastigotes per infected cells and survival index. Besides, BIS caused its effects even when incubated by few time periods, as shown by growth recovery experiments. By flow cytometry, it was demonstrated that BIS trypanocidal effect was associated with apoptosis induction, increase on reactive oxygen species and loss of mitochondrial transmembrane potential. Also, swelling of reservosomes was present al late stages. Scanning electronic microscopy evaluation showed parasites with loss of typical format and with membrane pores. Finally, the interaction of BIS with tcGAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from T. cruzi) was evaluated by both theoretical and experimental methods. Docking simulation demonstrated possible interaction between tcGAPDH and BIS, which it was confirmed by enzymatic assay. In conclusion, it was demonstrated that BIS possess antiparasitic effect over Trypanosoma cruzi strain Y life forms, with possible induction of apoptosis and oxidative stress. Also, inhibition on tcGAPDH appears to be associated with this effect. / A doença de Chagas constitui um importante problema de saúde pública, e os fármacos disponíveis para tratamento apresentam eficácia limitada e efeitos colaterais importantes. Assim, há necessidade de novas estratégias terapêuticas eficazes e seguras. Assim, o objetivo do presente trabalho foi avaliar o potencial tripanocida do (-)-α-bisabolol (BIS) sobre as formas evolutivas de Trypanosoma cruzi e investigar sua seletividade e mecanismo de ação. A citotoxicidade de BIS foi avaliada em células LLC-MK2 pelo método do MTT. BIS causou efeito citotóxico nas duas maiores concentrações testadas, com CC50 = 528 ± 34 µM. Foi investigado o efeito de BIS sobre epimastigotas, que demonstrou efeito progressivo e dependente de tempo e concentração, com IC50/24h = 285 ± 20 µM; IC50/48h = 144,7 ± 8,6 µM; IC50/72h = 97,33 ± 3,25 µM; e IC50/96h = 59,8 ± 4,5 µM. Em tripomastigotas, BIS causou efeito em todas as concentrações, com LC50 = 20 ± 3,84 µM. A partir dos valores de CC50 e LC50 obtidos, foi estimado índice de seletividade de 26,5. BIS também apresentou efeito antiamastigota, com redução do percentual de células infectadas, da contagem média de amastigotas/células infectadas e do índice se sobrevivência. Além disso, foi observado efeito antiparasitário em pequenos períodos de tempo, através do ensaio de recuperação de crescimento. Por citometria de fluxo, foram observadas alterações sugestivas de morte celular por apoptose, com aumento das espécies reativas de oxigênio citoplasmáticas e redução do potencial transmembrânico mitocondrial. Adicionalmente, foi observado hipertrofia de reservossomos de forma tardia. Por microscopia eletrônica de varredura, foram observadas algumas alterações ultraestruturais, como alteração no formato típico e aparecimento de poros. Finalmente, foi avaliado o potencial de inibição da enzima tcGAPDH (gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de T. cruzi). O estudo de docking demonstrou possível interação entre BIS e o sítio catalítico de tcGAPDH. A confirmação foi realizada por ensaio colorimétrico. Em conclusão, o (-)-α-bisabolol apresenta efeito antiparasitário sobre as formas evolutivas de T. cruzi, com possível indução de apoptose e stress oxidativo. Além disso, a inibição da enzima tcGAPDH parece estar associada ao efeito biológico encontrado.